Summary
본 프로토콜은 개선된 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석을 사용하여 단백질 인산화를 정량화하기 위한 샘플 준비 및 데이터 분석을 기술한다.
Abstract
인산화는 단백질 기능을 조절하고 세포 신호 전달 결과를 지시하는 필요한 번역 후 변형입니다. 단백질 인산화를 측정하는 현재의 방법은 개별 단백질에 걸친 인산화에서 이질성을 보존할 수 없다. 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석은 유리 커버슬립 상의 단백질의 면역침전을 통해 거대분자 복합체의 조성을 조사하기 위해 개발되었으며, 이어서 단일 분자 이미징이 뒤따랐다. 현재의 기술은 단일 분자 수준에서 전장 막 수용체의 인산화 상태의 강력한 정량화를 제공하는 SiMPull의 적응입니다. 이러한 방식으로 수천 개의 개별 수용체를 이미징하면 단백질 인산화 패턴을 정량화 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 샘플 준비에서 이미징에 이르기까지 최적화된 SiMPull 절차를 자세히 설명합니다. 유리 제제 및 항체 고정 프로토콜의 최적화는 데이터 품질을 더욱 향상시킵니다. 현재 프로토콜은 샘플 내에서 인산화된 수용체의 분획을 계산하는 단일 분자 데이터 분석을 위한 코드를 제공합니다. 이 연구는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 인산화에 초점을 맞추는 반면, 프로토콜은 다른 막 수용체 및 세포질 신호 분자로 일반화 될 수 있습니다.
Introduction
막-관련 신호전달은 리간드-유도된 막 수용체 활성화 및 신호를 전파하는 하류 부속 단백질의 모집의 조합에 의해 조정된다. 수용체 세포질 꼬리에서 주요 티로신의 인산화는 신호전달 복합체 또는 신호전달복합체 1,2의 형성을 개시하는데 매우 중요하다. 따라서 생물학에서 중요한 질문은 신호 전달 파트너를 모집하고 세포 결과를 지시하기 위해 인산화 패턴을 만들고 유지하는 방법입니다. 이는 시그널 로솜 3,4,5,6,7의 조성을 지시함으로써 신호전달 출력을 조작하는 수단을 제공할 수 있는 풍부하고 특정한 포스포티로신 패턴 모두에서 수용체 인산화의 이질성을 이해하는 것을 포함한다. 그러나, 단백질 인산화를 심문하는 현재의 방법에는 한계가 있다. 웨스턴 블롯 분석은 단백질 인산화의 경향을 설명하는 데 탁월하지만 반 정량적8이며 수천 ~ 수백만 개의 수용체가 함께 평균화되기 때문에 시스템의 이질성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 웨스턴 블롯은 특정 티로신에 대한 포스포 특이적 항체를 사용하여 샘플을 프로빙하는 것을 허용하지만, 동일한 단백질 내의 다중 부위 인산화 패턴에 대한 정보를 제공 할 수는 없습니다. 정량적 인포프로테오믹스는 포스포티로신 풍부도에 대해 보고하지만, 관심있는 잔기가 효소적 소화에 의해 생성되는 동일한 펩티드(전형적으로 7-35개 아미노산) 내에 위치할 필요가 있기 때문에 다중 부위 인산화를 검출하는 데는 한계가 있다 9,10,11.
상기 언급된 한계를 극복하기 위해, 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석은 단일 분자 수준에서 무손상 수용체의 인산화 상태를 정량화하도록 적응되었다. SiMPull은 Jain et al.12,13에 의해 거대 분자 복합체를 심문하기위한 강력한 도구로 처음 입증되었습니다. SiMPull에서, 거대분자 복합체를 항체-기능화된 유리 커버슬립 상에서 면역침전 (IP)시킨 다음, 단백질 서브유닛 수 및 복합 성분12를 갖는 co-IP에 대한 단일 분자 현미경을 통해 분석하였다. SiMBlot이라고 불리는 Kim et al.14의 변형은 변성 단백질의 인산화를 분석하기 위해 SiMPull의 변형을 사용한 최초의 사례였다. SiMBlot 프로토콜은 NeutrAvidin-코팅된 커버슬립을 사용하여 비오티닐화된 세포 표면 단백질을 포획하는 데 의존하며, 이 커버슬립은 포스포 특이적 항체 표지(14)로 인산화를 위해 프로브된다. 이러한 발전에도 불구하고, 번역 후 변형의 정량화를보다 강력하고 광범위한 단백질에 적용 할 수 있도록 개선이 필요했습니다.
본 프로토콜은 다양한 리간드 조건 및 종양원성 돌연변이(15)에 반응하여 무손상 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 인산화 패턴을 정량화하는데 사용된 최적화된 SiMPull 접근법을 기술한다. 이 연구는 EGFR에 초점을 맞추는 반면,이 접근법은 양질의 항체를 사용할 수있는 모든 막 수용체 및 관심있는 세포질 단백질 (POI)에 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 샘플 자동 형광을 줄이는 단계, 최대 20개의 샘플을 동시에 준비하여 최소한의 시료 부피를 필요로 하는 샘플 어레이 설계, 항체 표지 및 고정 조건 최적화가 포함됩니다. 데이터 분석 알고리즘은 인산화된 단백질의 단일 분자 검출 및 정량화를 위해 개발되었다.
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Protocol
1. 커버슬립 준비
참고 :이 단계에서는 니트릴 장갑, 안전 안경 또는 안면 보호막의 이중 레이어와 실험실 코트가 포함 된 개인 보호 장비 (PPE)를 착용해야합니다.
- 피라냐 에칭을 수행하여 유리에서 유기 파편을 제거하십시오.
주의: 피라냐 용액은 강한 산화제로서 유기물과 접촉할 때 부식성이 강하고 반응성이 높습니다. 유기 파편과의 반응은 발열성이며 폭발 가능성이 있습니다. 따라서 절차는 새시를 낮추는 화학 흄 후드에서 수행되어야합니다. Pyrex 유리 제품은 피라냐 솔루션을 처리하는 데 필요합니다.- 화학 흄 후드 안에 작업 공간을 준비하십시오. 커버슬립을 4L 유리 비이커인 "반응" 비이커의 바닥에 겹치지 않고 배열하고, 반응 비커를 부드러운 열로 핫플레이트 위에 놓습니다. 유리 제품을 10 분 동안 따뜻하게하십시오. "폐기물" 1 L 유리 비이커를 500 mL의ddH2O근위 반응 비이커에 놓는다.
- 49 mL의 12 N 황산 (H2SO4)을 유리 혈청학적 피펫으로 반응 비이커에 천천히 첨가한다. 폐기하기 전에 폐기물 비이커에서 피펫을 헹구십시오.
- 21 mL의 30% 과산화수소(H2O2)를 유리 혈청학적 피펫으로 반응 비이커에 적가한다. H2O2액적을 반응 플라스크의 바닥에 고르게 천천히 분산시켜 피라냐 에칭 반응의 국부적인 담금질을 방지한다. 폐기하기 전에 폐기물 비이커에서 피펫을 헹구십시오.
주의: 항상 H2O2를H2SO4에 첨가하고, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. - 피라냐는 커버슬립을 30분 동안 에칭합니다. 5분마다 반응 비커의 내용물을 부드럽게 교반한다.
- 폐비이커의 내용물을 반응 비이커에 붓고 피라냐 용액을 켄칭한다. 액체를 반응 비이커의 벽 아래로 천천히 옮겨 튀는 것을 최소화하십시오. 핫플레이트에서 반응 비커를 분리합니다.
- 반응물이 급냉되고 냉각될 때, 피라냐 용액을 다시 폐기물 비이커에 부어 중화를 위해 반응 비이커로부터 에칭된 커버슬립을 제거하지 않는다.
- 약한 염기의 점진적 첨가로 피라냐 용액을 중화하십시오. 예를 들어, 과도한 질량 20g의 중탄산나트륨(NaHCO3)/100mL 피라냐 용액을 사용한다.
주의: 피라냐 용액을 밀폐된 폐기물 용기에 보관하지 마십시오. 용액은 폐기 전에 항상 중화되어야합니다. 중화 반응은 격렬한 기포를 생성하고, 약한 염기의 점진적인 첨가에 의해 제어되지 않으면 폭발적일 수 있다. - 중화 된 용액을 유리 교반봉으로 저어주고 2 시간 동안 반응하게하십시오. pH를 >4로 올리고 용액을 폐기하십시오.
- 피라냐 용액에 약한 염기를 첨가하는 사이에, 반응 비이커로부터 에칭된 커버슬립을 유리 교반 막대가 있는 부흐너 깔때기로 옮기고ddH2O를 실행하면서 5분 동안 헹구십시오.
참고: 다음 단계로 즉시 진행하거나 피라냐 에칭된 커버슬립을 ddH2O에 최대2주 동안 밀봉된 유리 용기 또는 페트리 접시에 보관하십시오(밀봉 필름으로 감싸기, 재료 표 참조).
- 아래 단계에 따라 커버 슬립을 유기 용제에 넣고 초음파 처리하십시오.
- 커버슬립을 유리 코플린 항아리( 표 참조)에 넣고 메탄올(CH3OH)로 덮으십시오. 뚜껑을 씰링 필름으로 항아리에 밀봉하고 10 분 동안 목욕 초음파 처리하십시오. 조심스럽게 메탄올을 코플린 항아리에서 유리 저장 병에 붓습니다.
- 코플린 항아리를 아세톤 (C3H6O)으로채우고 뚜껑을 밀봉하고 10 분 동안 목욕 초음파 처리하십시오. 조심스럽게 코플린 항아리에서 아세톤을 유리 저장 병에 붓습니다.
주의: 메탄올은 가연성이며 매우 독성이 있습니다. 화학 흄 후드에 사용하십시오. 아세톤은 가연성이며 자극제입니다. 따라서 유리에 취급하고 보관하고 화학 흄 후드에 사용하십시오. 현지 규정 및 지침에 따라 유해 폐기물로 폐기하십시오.
참고: 메탄올과 아세톤은 각각 최대 다섯 번까지 재사용할 수 있습니다.
- 실란 기능화를 위해 커버슬립 표면을 활성화합니다.
- 20 분 동안 1 M 수산화 칼륨 (KOH)으로 목욕 초음파 처리. 코플린 항아리에서 KOH를 조심스럽게 50mL 원뿔형 튜브에 부어 재사용합니다.
주의: KOH는 부식성이 있고 자극성이 있습니다. 화학 흄 후드에 사용하고 유리에 보관하지 마십시오. 폴리프로필렌 튜브에 보관하십시오. 현지 규정 및 지침에 따라 유해 폐기물로 폐기하십시오.
참고: KOH는 최대 다섯 번까지 재사용할 수 있습니다. - 커버슬립에서 ddH2O. 드레인ddH2O로두 번 헹구고 번젠 버너의 화염을 통해 흔들어 각 커버슬립을 가열하여 모든 표면 수분을 제거합니다. 커버 슬립을 마른 코플린 병에 넣으십시오.
- 20 분 동안 1 M 수산화 칼륨 (KOH)으로 목욕 초음파 처리. 코플린 항아리에서 KOH를 조심스럽게 50mL 원뿔형 튜브에 부어 재사용합니다.
- 커버슬립 아미노실란화를 수행한다.
- 원뿔형 플라스크에서 메탄올 69.4 mL와 아세트산 3.6 mL(CH3COOH)를 혼합하여 아미노실란 용액을 제조하였다. 720μL의 N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란(아미노실란)을 첨가하고 잘 섞 는다(물차표 참조).
주의: 아세트산은 가연성 및 부식성입니다. 유리 피펫으로 취급하고 유리에 보관하십시오. 화학 흄 후드에서 아세트산으로 작업하십시오. 아미노실란은 급성 독성 흡입 위험, 감작제 및 자극제입니다. 그것은 수생 생물에 해롭다. 화학 흄 후드에 사용하십시오. 화학 물질을 현지 규정 및 지침에 따라 유해 폐기물로 폐기하십시오.
참고: 아미노실란은 감광성이며 물속에서 빠르게 가수분해됩니다. 이 시약을 사용한 모든 단계는 활성을 유지하기 위해 최소한의 조명 조건에서 수행되어야합니다. 병을 질소 가스로 퍼지고 어두운 데시케이터에 보관하기 전에 밀봉 필름을 바르십시오. 6-9 개월마다 교체하십시오. - 아미노실란 용액을 즉시 코플린 항아리에 첨가하십시오. 씰링 필름을 덮고 적용하여 빛으로부터 계속 보호하십시오.
- 커버슬립을 아미노실란 용액에서 10분 동안 실온(RT)에서 암흑 속에서 인큐베이션한다. 목욕 - 초음파 처리 1 분 동안 그리고 또 다른 10 분 동안 인큐베이션. 아미노실란 용액을 미량 아미노실란 및 CH3COOH로CH3OH로 지정된 폐기물 용기에 조심스럽게 붓는다.
- 커버슬립을 메탄올로 헹구고 용액을 메탄올로 지정된 폐기물 용기에 붓습니다.
- 커버슬립을 각각 2분 동안 세 번 헹구고 ddH2 O.커버슬립을 배수하고, 과도한 수분을 닦아내고, 10분 동안 완전히 건조시킵니다.
- 원뿔형 플라스크에서 메탄올 69.4 mL와 아세트산 3.6 mL(CH3COOH)를 혼합하여 아미노실란 용액을 제조하였다. 720μL의 N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란(아미노실란)을 첨가하고 잘 섞 는다(물차표 참조).
- 커버슬립의 어레이 제제/비오틴-PEG 기능화를 수행한다.
- 84.5 mg의 NaHCO3를ddH2O1 mL에 용해시켜 1 M NaHCO3 (pH 8.5) 작업 스톡을 제조하였다. 10 mM NaHCO3의 최종 농도에 대해, 1 M NaHCO3를 ddH2O (1:100)로 희석한다.
- 소수성 배리어 펜( 재료 표 참조)으로 건조한 아미노실란화 커버슬립에 그리드 어레이를 그리고 잉크가 건조될 때까지 기다립니다. 커버 슬립에 식별자를 작성하여 적절한 방향을 표시하십시오. 커버 슬립을 가습 챔버에 놓습니다.
참고: 배열은 16-20개의 사각형, 약 4mm x 4mm 크기로 구성되어야 합니다. - 비오틴-PEG 숙신이미딜 발레레이트(biotin-PEG)/mPEG 숙신이미딜 발레레이트(mPEG) 용액을 만들기 위해, 먼저 냉동실에서 mPEG 및 비오틴-PEG( 물질 표 참조)를 제거하고 RT로 평형화시킨다. 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 mPEG 153mg과 비오틴-PEG 3.9mg(∼1:39 biotin-PEG:mPEG)을 첨가하고, 부드러운 피펫팅을 통해 10mM NaHCO3의 609μL에 재현탁시킨다. RT에서 1분 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 기포를 제거하였다.
참고: pH 8.5 완충액에서 숙신이미딜 발레레이트의 가수분해 반감기는 ~30분이다. mPEG에 완충액을 첨가한 후, 가능한 한 빨리 다음 단계를 진행한다. 이 단계는 매우 중요합니다. - 비오틴-PEG/mPEG 용액을 적용하여 커버슬립 어레이의 각 사각형(일반적으로 제곱당 10-15μL)을 완전히 덮습니다. 액체가 정의된 공간을 넘치지 않도록 하십시오. 커버 슬립을 어둠 속의 습도 챔버에 보관하여 RT에서 3-4 시간 동안 보관하십시오.
- 커버슬립을 풍부한 양의 물로 세척하여 ddH2O로 채워진 3x 250 mL 유리 비커에 순차적으로 침지하여 각각 10초 동안세척한다.
- 질소 가스로 커버 슬립에서 모든 습기를 제거하십시오. 커버슬립을 -20°C에서 밀봉 필름으로 감싸인 질소가 채워진 50 mL 원뿔형 튜브에 백투백으로 보관한다.
참고: 즉시 2단계로 진행하거나 커버슬립을 사용하기 전에 최대 1주일 동안 -20°C에서 보관하십시오.
2. SiMPull 용해물의 제조
주의: 프로토콜의 나머지 단계에 필요한 PPE는 니트릴 장갑, 안전 안경 및 실험실 코트입니다.
주: 용해물을 EGFR-GFP를 발현하는 부착성 CHO 세포로부터 제조하였다. 세포를 60 mm 조직 배양 (TC60) 접시에 밤새12,13 플레이팅하였다. CHO 세포를 10% 소 태아 혈청, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 500 ng/mL의 제네티신으로 보충된 DMEM에서 배양하였다(물질의 표 참조). 다른 부착성 세포주 또는 현탁액 세포가 또한 사용될 수 있다.
- 아래 단계에 따라 세포를 플레이트화하십시오.
- 배양 접시 (세포 함유)를 1 mL의 1x PBS로 세척한다. 1x 트립신 1 mL를 첨가하고, 세포를 분리하기 위해 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 피펫을 사용하여 분리된 세포를 접시에서 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 10 μL의 트리판 블루를 취하여 별도의 원심분리 튜브에서 10 μL의 세포 현탁액과 혼합한다. 제조업체의 지침에 따라 자동 셀 카운터에서 10μL의 세포 혼합물을 사용하여 세포 계수를 계산 합니다(표 참조).
- 플레이트 8 x 105 세포를 TC60 페트리 접시에서 하룻밤 동안 플레이트. 조건 당 한 접시를 접시에 담으십시오.
참고: 본 연구를 위해, 세포를 처리하지 않거나 단계 2.4.1에 기재된 바와 같이 퍼바나데이트 및 EGF로 처리하였다.
- 세포 용해물 준비를 위해 다음 용액을 준비하십시오.
- 얼음처럼 차가운 1x PBS (pH 7.4)를 준비하십시오.
- 50 mM Tris-HCl (pH 7.2) 및 프로테아제 / 포스파타제 억제제 (PPI) (재고 1:100)로 보충 된 150 mM NaCl에 1 % 비 이온성, 비 변성 세제 용액 ( 자료 표 참조)의 용해 버퍼를 준비하십시오. 튜브를 너트 레이터에 놓고 버퍼를 15 분 동안 혼합하십시오. 준비된 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
- 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 1 mMCaCl2, 10 mM HEPES (pH7.2), 20 mM 글루코스 및 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA)의 최종 농도에 대해 티로데스 완충액을 제조하였다 ( 물질의 표 참조). 용액을 37°C로 가온한다.
- 1 mM 퍼바나데이트 처리-인산화를 위한 양성 대조군을 준비한다.
참고: 이 단계는 선택 사항입니다. Pervandate는 바나데이트의 과산화 된 형태입니다 - 단백질 티로신 포스파타제16의 억제제입니다. 포스파타제 활성을 억제함으로써 단백질 탈인산화를 방지하면 고도로 인산화된 샘플이 생성됩니다.- 200 mM 스톡의 활성화된 소르토바나데이트 나트륨 (Na3VO4)을 준비한다.
- 100 mL 용액을 제조하기 위해, 3.89 g의Na3VO4(물질 표 참조)를 90 mL의 ddH2O에 첨가하고,교반하면서 용해시킨다. HCl 또는 NaOH를 적가하여 pH를 10으로 조정한다. HCl을 추가하면 용액이 노란색으로 바뀝니다.
- ddH2 O.로 부피를 100 mL로가져 와서 전자 레인지에서 가열하여 용액을 끓입니다. 끓인 후, 용액은 무색이 될 것입니다.
- 용액을 RT로 냉각하고 pH를 10으로 재조정합니다. pH가 10에서 안정화될 때까지 끓임, 냉각 및 pH 조정을 두 번 내지 네 번 더 반복한다. 분취량을 -20°C에서 보관한다.
- 20.4 μL의 3% H2O2와 100 μL의200 mM Na3VO4및546.8 μL의 ddH2O (등몰 농도의H2O2및 활성화된Na3VO4)를 혼합함으로써 30 mM 퍼바나데이트 (PV)의 스톡을 제조하였다. 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 티로데의 완충액에 1 mM PV를 준비하십시오. 10 mL 용액의 경우, 0.33 mL의 30 mM PV 스톡을 9.67 mL의 37°C 티로데스 완충액에 첨가한다. 세포를 즉시 치료하십시오.
- 티로데 버퍼 3mL로 세포를 한 번 씻으십시오. 3 mL의 1 mM PV를 티로데스 완충액에 세포에 첨가하고, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 200 mM 스톡의 활성화된 소르토바나데이트 나트륨 (Na3VO4)을 준비한다.
- 리간드 자극을 수행한다.
- 적절한 농도, 시간 및 온도를 사용하여 관심있는 리간드로 세포를 자극하십시오. 최대 EGFR 자극을 위해, 37°C에서 5분 동안 티로드 완충액 중의 50 nM 표피 성장 인자 (EGF, 표 참조) + 1 mM의 PV 중 1 mL의 PV와 함께 인큐베이션한다.
- 세포 용해를 수행하십시오.
- 원하는 세포 처리 후, 접시를 얼음 위에 놓고 얼음처럼 차가운 1x PBS로 세척한다. 피펫을 사용하여 PBS의 전체 부피를 완전히 제거하였다.
- 180 μL의 용해 완충액 (단계 2.2.2)을 플레이트에 첨가한다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트 주위에 버퍼를 당겨 세포를 완전히 덮으십시오. 배양 표면 전체에 걸쳐 세포 스크래퍼와 견고하고 일관된 압력을 가하여 세포를 완전히 용해시킵니다.
참고 : 높은 단백질 농도를 보장하기 위해 용해 완충액의 부피를 최소한으로 유지해야합니다. - 용해된 세포를 피펫팅하고 이를 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 튜브를 얼음 위에 30 분 동안 보관하십시오. 소용돌이는 5 분마다 용해됩니다.
참고: POI가 여러 서브유닛으로 구성되거나 해리에 민감한 경우, 용해물을 와류하지 마십시오. - 용해된 세포를 4°C에서 20분 동안 16,000 x g 에서 원심분리한다. 피펫을 사용하여 상청액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 이것은 총 단백질 용해물을 함유한다.
- 용해물 10 μL를 예비하고, 이를 비신코닌성 비색 분석(BCA) 분석을 위해 용해 완충액 90 μL로 희석한다(17). 나머지 총 단백질 용해물을 -80°C에서 보관한다.
- BCA 분석을 사용하여 용해물 총 단백질 농도를 확인합니다 ( 물질 표 참조).
참고: 총 단백질 용해물은 실험 당일에 제조되어 신선하게 사용되거나 최대 12주 동안 -80°C에서 일회용 분취량으로 저장될 수 있다. 동결 / 해동하지 마십시오.
3. 비오티닐화 항체를 사용한 어레이의 기능화
- 다음 해결 방법을 준비합니다.
- T50 완충액, 10 mM 트리스-HCl (pH 8.0) 및 50 mM NaCl의 용액. 이 솔루션은 RT에서 1 개월 동안 안정적입니다.
- T50-BSA는 T50 버퍼에 0.1 mg/mL의 BSA를 보충합니다. 준비된 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
- 10 mg/mL의 소듐 보로하이드라이드 (NaBH4) 1x PBS에서. 사용 직전에 준비하십시오.
- 0.2 mg/mL의 NeutrAvidin ( 물질 표 참조)을 T50 완충액에 담았습니다.
주의:NaBH4 는 환원제이며 가연성입니다. 사용 후 항상 질소 가스로 용기를 정화하고 건조기에 보관하십시오.
- 어레이를 비오티닐화 항체로 기능화한다.
- PEG-비오틴 기능화된 어레이를 냉동실에서 제거하고 개방 전에 원뿔형 튜브를 RT로 평형화시킨다. 커버슬립을 위로 향하게 한 어레이를 100 mm 조직 배양 (TC100) 디쉬가 늘어선 밀봉 필름 위에 놓습니다.
참고: 오버헤드 조명을 최소화하십시오. 모든 용액은 소수성 배열에 의해 정의 된 사각형에 "비드 업"해야합니다. 적절한 부피의 용액을 추가하여 각 사각형 (일반적으로 10-15 μL)을 완전히 덮고 액체가 정의 된 공간을 오버플로하지 않도록하십시오. 액체를 신속하게 제거하려면 진공 플라스크에 부착 된 사내 진공 라인을 사용하여 폐기물을 포집하십시오. NaBH4가 화학 흄 후드에서 튜브를 열어 두어 폐기 전에 1 시간 동안 탈기되도록 허용하십시오. NaBH4 처리는 배경 자가형광을 감소시키고, 이로써 위양성 단일 분자 검출을 감소시키기 위해 필요하다. - 어레이의 각 사각형을 RT에서4 분 동안 1x PBS 중의 10 mg/mL의 NaBH4로 처리하십시오. PBS로 세 번 세척하십시오.
- T50에서 0.2 mg/mL의 NeutrAvidin과 함께 5분 동안 각 사각형을 인큐베이션한다. T50-BSA로 세 번 씻으십시오.
참고: NeutrAvidin은 PEG-비오틴에 결합하고 비오티닐화 항체12,13,15에 대한 결합 부위를 제공한다. - T50-BSA 중의 2 μg/mL의 비오티닐화 POI 특이적 항체와 함께 10분 동안 각 사각형을 인큐베이션하고; T50-BSA로 세 번 씻으십시오.
참고: 본 프로토콜은 EGFR-GFP를 포획하기 위해 비오티닐화 항-EGFR IgG ( 물질의 표 참조)를 사용한다.
- PEG-비오틴 기능화된 어레이를 냉동실에서 제거하고 개방 전에 원뿔형 튜브를 RT로 평형화시킨다. 커버슬립을 위로 향하게 한 어레이를 100 mm 조직 배양 (TC100) 디쉬가 늘어선 밀봉 필름 위에 놓습니다.
4. 전체 세포 용해물로부터의 POI의 SiMPull
참고: 나머지 SiMPull 준비를 위해 기능화된 SiMPull 어레이의 TC100 접시를 얼음 위에 놓습니다. 이 단계는 총 단백질 용해물로부터 POI를 풀다운하는 단계이다. 용해물은 해동 후 재사용해서는 안됩니다.
- 다음 해결 방법을 준비합니다.
- 1x PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA)/0.1% 글루타르알데히드(GA)를 준비합니다.
주의: PFA와 GA는 독성 화학 정착제와 잠재적 발암 물질입니다. PPE를 착용하십시오. 화학 물질을 현지 규정 및 지침에 따라 유해 폐기물로 폐기하십시오. - 10 mM 트리스-HCl, pH 7.4를 준비한다.
- 1x PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA)/0.1% 글루타르알데히드(GA)를 준비합니다.
- 해동하고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 용해물을 혼합하십시오. 얼음 위에 보관하십시오.
- 용해물 1μL를 빙냉 T50-BSA/PPI 100μL에 희석합니다.
참고: 필요한 경우, 어레이에 희석 범위를 적용하여 전체 단백질 용해물의 적절한 희석 계수를 결정하십시오. 어레이 면적 당 SiMPull 수용체의 최적 밀도는 0.04-0.08/μm2이다. 용해물 희석물은 단계 6(데이터 분석)에서 평가될 수 있다. - 용해물을 어레이 상에서 10분 동안 인큐베이션하고; 그런 다음 얼음처럼 차가운 T50-BSA / PPI로 네 번 씻으십시오.
- AF647 접합된 항-포스포티로신 항체( 물질 표 참조)를 빙냉 T50-BSA/PPI에 희석하고 어레이 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 본 프로토콜에서, 팬 항-pTyr (PY99)-AF647 IgG는 EGFR-GFP의 인산화된 집단을 확인하기 위해 사용된다. 직접 표지된 항체를 사용하면 이차 항체의 필요성이 없어지고 표지 옵션이 증가하고 결과의 일관성이 향상됩니다. 형광-표지된 항체는 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 상업적으로 입수가능하지 않은 경우, 항체는 표준 바이오컨쥬게이션 기술을 사용하여 맞춤 표지될 수 있고, 상업적 바이오컨쥬게이션 키트가 이용가능하다. 형광 표지된 항체의 각 배치는 용량 곡선을 측정하고 포화점을 찾기 위해 SiMPull을 수행하여 최적의 표지 조건을 시험할 필요가 있다. - 얼음처럼 차가운 T50-BSA로 총 6-8 분 동안 6 번 씻으십시오.
- 얼음처럼 차가운 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
- 항체 해리를 방지하기 위해 어레이를 4% PFA/0.1% GA 용액으로 10분 동안 인큐베이션한다.
- 고정제를 불활성화시키기 위해 각각 10 mM Tris-HCl, pH 7.4/PBS로 5분 동안 두 번 세척한다.
참고: 하나 이상의 항체를 사용한 실험(예를 들어, 다수의 포스포티로신 부위 검출)의 경우, 단계 4.5-4.9를 반복한다. 두 항체 사이의 입체 장애를 결정하는 방법에 대한 정보는 단계 6.2.9를 참조한다.
5. 이미지 수집
참고: 단일 분자 이미지 수집은 150x TIRF 대물렌즈와 emCCD 카메라의 특정 사분면에 있는 각 스펙트럼 채널을 캡처하는 이미지 스플리터를 사용하여 수행됩니다( 재료 표 참조). 캘리브레이션 이미지는 먼저 3 ~ 1 μm (총 크기 ~ 60 μm ± 60 μm)의 구멍 내 거리에서 20 x 20 어레이 (200 ± 50 nm 구멍으로 구성된 나노 패턴 채널 정렬 그리드 (나노 그리드)× 채널 등록 및 카메라 이득 교정을 허용하기 위해 획득됩니다.
- 아래 단계에 따라 채널 등록을 수행합니다.
참고: 이미터의 공동 현지화를 올바르게 계산하려면 정확한 채널 등록이 필요합니다. 이 단계는 매우 중요합니다.- 오일 목표를 청소하고 목표에 기름 한 방울을 입금하십시오. 나노 그리드를 이미징 무대에 놓습니다. 전송 된 백색광을 사용하여 그리드 패턴에 중점을 둡니다.
참고: 나노그리드를 사용한 이미지는 나노그리드를 통과하고 모든 스펙트럼 채널에서 검출되는 투과광을 사용하여 획득됩니다. 대안적으로, 각 채널에서 검출된 형광을 방출하는 다중 형광 비드를 사용할 수 있다. 이미지 수집은 각 현미경 설정에 따라 최적화되어야 합니다. - 그리드의 일련의 20 이미지를 가져옵니다. 픽셀이 포화되지 않았는지 확인하십시오. 이미지 시리즈를 "신탁"으로 저장합니다.
- 나노그리드의 초점을 해제하여 통풍이 잘되는 패턴(18)을 생성한다. 게인 보정을 위해 일련의 20개의 이미지를 획득합니다. 이미지를 "게인"으로 저장합니다.
- 모든 빛이 카메라로 이동하지 못하도록 차단하여 카메라 오프셋을 위해 일련의 20개의 이미지를 획득합니다. 이미지를 "배경"으로 저장하십시오.
- 오일 목표를 청소하고 목표에 기름 한 방울을 입금하십시오. 나노 그리드를 이미징 무대에 놓습니다. 전송 된 백색광을 사용하여 그리드 패턴에 중점을 둡니다.
- SiMPull 이미지를 가져옵니다.
참고: 커버슬립 어레이를 이미징하기 전에 Tris 솔루션을 T50-BSA로 교환하고 어레이를 RT로 평형화하십시오.- 오일 목표를 청소하고 목표에 추가 오일을 입금하십시오. 커버슬립 어레이를 현미경 스테이지에 고정합니다.
- 각 형광단의 여기 능력, TIRF 각도 및 카메라 통합 시간을 최적화합니다. 목표는 샘플의 광표백을 최소화하면서 가장 높은 신호 대 잡음을 달성하는 것입니다. 향후 측정에서 일관성을 유지하기 위해 레이저 파워를 기록하십시오.
참고: 본 연구에서는 원거리 적색 채널의 경우 300ms, 녹색 채널의 경우 1ms의 노출 시간을 사용했습니다. 642nm 레이저는 약 500μW 레이저 출력으로 사용되었고, 488nm 레이저는 튜브 렌즈 전에 측정된 860μW에서 사용되었습니다. - 각 샘플에 대한 이미지를 가져옵니다. 원거리 적색 채널을 먼저 이미지화한 다음, 광표백을 줄이기 위해 각각의 더 낮은 파장의 형광단을 이미지화한다. 각 샘플에 사용되는 부피가 적기 때문에 30-45분마다 버퍼 레벨을 확인하고 필요에 따라 보충하십시오.
6. 데이터 분석
- 데모 코드를 다운로드합니다.
참고: 제공된 데모 코드 및 예제 데이터 세트는 전체 데이터 분석 워크플로(보충 코딩 파일 1-4)를 보여줍니다. SiMPullMain.m에 나열된 시스템 요구 사항은 보충 코딩 파일 1에 나와 있습니다.-
압축을 풀 고 개인 문서/MATLAB(MacOS/Linux) 또는 문서\MATLAB(Windows) 디렉토리에 저장합니다 .
참고: 이렇게 하면 네 개의 새 폴더가 생성됩니다: SiMPull_class, 스마이트, 샘플 데이터, 샘플 분석 출력. - ReadMe_Setup.txt 폴더에 있는 "SiMPull_class" 파일을 엽니다.
- MATLAB 및 MATLAB 도구 상자: 곡선 피팅 도구 상자, 병렬 컴퓨팅 도구 상자, 통계 및 기계 학습 도구 상자를 설치합니다.
- 다운로드 지침에 따라 DipImage19 를 설치합니다.
- ReadMe_setup.txt에 설명된 대로 "스마이트" 단일 분자 분석 패키지를 설치합니다.
참고: "smite"는 GitHub 리포지토리에서 사용할 수 있습니다(자료 표 참조). - 파일을 MATLAB 창으로 드래그하여 SiMPull_class 폴더에 있는 SiMPullMain.m을 엽니다.
- 폴더 찾아보기 아이콘을 클릭하고 폴더를 선택하여 디렉터리를 ...\MATLAB\샘플 데이터\로 변경합니다.
-
압축을 풀 고 개인 문서/MATLAB(MacOS/Linux) 또는 문서\MATLAB(Windows) 디렉토리에 저장합니다 .
- 데이터 처리 단계 개요
- SiMPullMain.m을 실행 - 각 섹션에 대한 지침을 따릅니다. 해당 섹션에 커서를 놓고 섹션 실행 아이콘을 클릭하여 각 섹션을 개별적으로 실행합니다.
참고: 데이터 분석을 위한 일반적인 단계는 이 섹션에 설명되어 있습니다. 자세한 지침은 함께 제공되는 SiMPullMain.m 코드에서 찾을 수 있습니다. - "초기화" 섹션을 실행하여 스펙트럼 채널과 이미지 크기를 정의하는 경로를 설정합니다.
- "카메라 게인 및 오프셋 찾기" 섹션을 실행하여 게인 및 배경 데이터 세트를 사용하여 카메라 게인을 광자로 변환합니다.
- "채널 등록" 섹션을 실행하여 이미지 등록에 사용되는 로컬 가중 평균 변환을 계산합니다.
- 데이터의 서식을 지정하고 큐레이트합니다. "순차적 채널을 쿼드 이미지로 결합" 섹션을 실행합니다. "잘못된 프레임 제거"를 실행하십시오.
- "단일 분자를 맞추고 겹치는 분자 찾기"섹션을 실행하십시오.
참고: 이 섹션에서는 여러 함수를 실행하여 각 채널의 단일 분자를 지역화하고 스펙트럼 채널 간의 공동 지역화 이벤트를 결정합니다. - 실제 GFP 적합당 최소 광자 수를 결정하려면 "최소 광자 임계값 최적화"를 실행하십시오. 이것은 반복적 인 프로세스입니다.
- 먼저 smf를 설정합니다. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] 섹션을 실행합니다. 메시지가 표시되면 "빈 데이터" 파일을 선택합니다. "CHO-EGFR-GFP" 파일로 반복합니다.
- 두 히스토그램을 비교하여 적절한 최소 임계값을 선택합니다. smf를 설정합니다. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] 섹션을 다시 실행하십시오.
- "FR 신호에 대해 GFP 적합 백분율 계산" 섹션을 실행하여 배경 현지화를 수정하고 최종 값을 계산합니다.
- 실험적 필요에 따라 옵션 1(6.2.10단계) 또는 옵션 2(6.2.11단계)를 수행합니다.
- 옵션 1: 참조15에 기재된 바와 같이 리간드 결합을 위해 원형질막에서 이용가능한 수용체의 수를 정확하다.
- 먼저, 표면 수용체를 형광 NHS 에스테르 염료의 포화 수준으로 표지한다(NHS-AF647, 표 참조). 그런 다음 SiMPull 실험을 수행하여 AF647과 공동 지역화하는 GFP 국부화의 비율을 결정합니다.
참고: 이것은 NHS 표지에 사용할 수 있는 수용체의 분획과 표면 상의 수용체의 비율(SR)의 추정치를 제공한다. - 최종 계산에 SR 보정을 적용합니다: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, NGFP는 GFP 현지화의 보정된 수, NBG는 배경 현지화 번호, NLC는 총 현지화입니다.
참고: 본 예에서, 이러한 보정은 퍼바나데이트가 막 투과성(16 )이기 때문에 적용되지 않으며, 따라서, 포스파타제 억제의 작용은 표면 수용체에 제한되지 않는다.
- 먼저, 표면 수용체를 형광 NHS 에스테르 염료의 포화 수준으로 표지한다(NHS-AF647, 표 참조). 그런 다음 SiMPull 실험을 수행하여 AF647과 공동 지역화하는 GFP 국부화의 비율을 결정합니다.
- 옵션 2: 다중 부위 인산화 측정의 경우, 두 항체를 사용할 때 입체 장애의 가능성을 고려하십시오.
참고: 입체 장애는 항체 1 단독(P1)에 비해 항체 2(P12)의 존재 하에 있을 때 항체 1에 대한 인산화된 수용체의 관찰된 백분율의 감소를 야기할 수 있다.- SiMPull을 사용하여 P1 및 P12를 결정하고 이전에 발표 된 참조15에 따라 입체 장애에 대한 보정 계수를 계산하십시오.
- SiMPullMain.m을 실행 - 각 섹션에 대한 지침을 따릅니다. 해당 섹션에 커서를 놓고 섹션 실행 아이콘을 클릭하여 각 섹션을 개별적으로 실행합니다.
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Representative Results
SiMPull 프로세스를 묘사하는 만화가 그림 1A에 나와 있습니다. 커버슬립은 비오티닐화 항-EGFR 항체의 앵커로서 NeutrAvidin을 사용하여 총 단백질 용해물로부터 EGFR-GFP를 포획하여 기능화된다. 결합되지 않은 단백질을 세척한 후, 인산화된 수용체는 항-포스포티로신(anti-PY) 항체15로 표지된다. 도 1B 는 소수성 어레이의 이미지를 보여주며, 여기서 다수의 샘플이 동일한 커버슬립 상에서 제조되고 이미지화될 수 있다. 이 샘플 홀더의 한 가지 장점은 ~10μL의 최소 샘플 부피가 필요하다는 것입니다. 커버 슬립은 현미경 스테이지에 직접 배치하여 이미징 할 수 있습니다. 그러나 커버슬립 홀더를 사용하여 커버슬립을 안정화하는 것이 도움이 됩니다. 그림 1B 에 표시된 커버슬립 홀더는 3D 프린터를 사용하여 만들어졌으며 청사진은 보충 코딩 파일 5에 제공됩니다. 소수성 잉크의 자가형광은 샘플의 초점면을 찾는 데 유용한 가이드입니다(그림 1C). 다중 채널 원시 이미지의 예가 그림 1D에 나와 있습니다. 원시 녹색 및 원간 채널의 오버레이가 그림 1E에 나와 있습니다.
그림 2에서는 분석 워크플로를 간략하게 설명하고 대표 데이터를 제공합니다. 데이터 수집은 먼저 개별 스펙트럼 채널 데이터를 오버레이하는 데 사용되는 채널 등록을 위한 신탁을 획득하는 것으로 시작됩니다(그림 2A). 밝은 필드 이미지는 백색광을 전달하는 나노그리드 패턴을 사용하여 촬영되며 이미지 스플리터(도시되지 않음)의 각 스펙트럼 채널에서 검출됩니다. 녹색 채널은 참조 채널 역할을 하고 원거리 빨간색 채널은 시프트된 채널입니다. 로컬 가중 평균 변환은 MATLAB의 fitgeotrans20 함수를 사용하여 계산되며 원거리 적색 좌표를 녹색 채널의 좌표 프레임으로 이동하는 데 사용됩니다. 이 변환은 모든 제어점에서 두 번째 차수 다항식 모델을 사용합니다. 그런 다음 SiMPull 배열의 다중 채널 데이터가 수집됩니다. 이 워크플로는 반자동 획득으로 구성되었으며, 여기서 특정 샘플 사각형에 대해 시작 ROI가 선택되고 이 영역 주변의 세 영역이 이미지화되어 각 데이터 세트에 세 개의 독립적인 ROI의 전체 쿼드 뷰 이미지가 포함되었습니다(그림 1D). 각 스펙트럼 채널에서, 이미터 후보 위치들은 이미지에 가우시안 필터의 차이를 적용하고 로컬 맥시마를 식별함으로써 발견된다. 서브 영역들(박스들, 그림 2B)은 로컬 맥시마 주위에 그려지고, 이미터 광자 카운트는 각 서브 영역이 단지 하나의 이미터만을 포함한다고 가정함으로써 추정된다. 광자 수가 최소값 이상인 이미터 후보를 보유하는 하위 영역은 피팅을 위해 유지됩니다. 가우시안 포인트 확산 함수(PSF)는 각 이미터를 중심으로 대략 중심을 둔 작은 하위 영역 내의 각 이미터 후보에 적합합니다. 결과 현지화는 광자 수, 배경, 적합 좌표의 Cramér-Rao 하한, PSF 분산(즉, PSF 폭) 및 PSF 모델의 적합도를 설명하는 p-값을 기준으로 임계값이 지정됩니다. 각 스펙트럼 채널에 대해 가우시안 이미지가 생성되며, 균일한 강도의 가우시안 얼룩이 각 양호한 핏의 좌표에 배치됩니다(그림 2C). 공국재화는 피두시얼 샘플로부터 계산된 변환을 사용하여 각 스펙트럼 채널로부터의 가우시안 이미지를 오버레이함으로써 시각화된다(도 2D). 세포 용해물이 존재할 때 표면에 항포스포티로신 항체의 비특이적 결합이 여전히 존재하기 때문에 확인을 위해 수용체를 형광 표지하는 것이 중요하다. EGFR-GFP(녹색 채널)는 수용체 위치의 마스크를 생성하는데 사용되며, 그 마스크 내에서 AF647-anti-PY 신호(원-적색 채널)만이 계수된다(도 2D). 1픽셀(106.7nm 픽셀 크기) 내의 쌍은 공지역화된 것으로 간주되어 참조 채널 좌표가 포함된 목록에 저장됩니다. GFP와 공동국소화된 AF647의 백분율은 인산화된 수용체의 분획을 결정하기 위해 계산된다(도 2E).
좋은 데이터 품질을 보장하기 위한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 하나의 그러한 노력은 녹색 채널에서 자가형광을 켄칭하기 위해 프로토콜에 기재된 바와 같이 커버슬립 어레이를 NaBH4와 함께 인큐베이션하는 것이다. 이러한 자가형광은 단일 또는 공액 π 결합(21)을 함유하는 유리 상의 가능한 불순물로 인한 비특이적 신호를 지칭한다. 이러한 불순물은 기능화 공정에서 사용되는 아미노실란 및 PEG 시약으로부터 잠재적으로 또는 공기로부터의 먼지로부터, 녹색 스펙트럼 채널에서 형광화되는 경향이 있다. 유리를 질소 아래에 저장하려는 노력에도 불구하고, 이들 분자는 또한 저장에서 발생하는 산화를 통해 생성될 수 있다. NaBH4는 또한 실란 코팅(16)을 갖는 것을 포함하는 슬라이드 및 마이크로어레이 상의 불순물로부터의 형광을 감소시키는데 사용되어 왔다. 도 3A는 피라냐 에칭 유리가 NaBH4로 처리될 때 발생하는 배경 검출 수의 감소를 보여준다. NaBH4는 배경 형광을 극적으로 감소시키지만, 일부 방출기는 여전히 녹색 채널에서 검출된다. 용해물이 없는 샘플에서 배경 이미지를 획득하고(그림 3D) GFP 함유 샘플에서 배경 현지화의 평균 수를 빼서 이를 수정할 수 있습니다. 불순물로부터의 형광은 원적색 채널에서 검출되지 않았다. 수용체 밀도가 너무 높은 경우, 다중 GFP 방출기는 단일 회절-제한 스폿 내에서 발견될 수 있다(데이터는 나타내지 않음). 스텝 광표백을 사용하여 스팟당 GFP의 수를 확인하면서, 우리는 0.04-0.08 단백질/μm2 사이의 수용체 밀도가 스폿 당 다중 방출기를 찾는 가능성을 제거하기 위해 단일 방출기 사이에 충분한 간격을 제공한다는 것을 발견하였다12. 수용체 밀도는 유리 표면에 결합된 IP 항체의 양 또는 첨가된 용해물의 양을 변화시킴으로써 최적화될 수 있다. POI를 표적화하는 항체가 포화 수준에서 사용되도록 하는 것이 중요하다. 적절한 표지 조건을 결정하기 위해 인산화된 샘플에 대한 항체 농도 곡선을 획득하는 것이 좋습니다 (그림 3B). 또한, 항체의 포스포-특이성은 휴지 샘플 및/또는 단백질 특이적 키나제 억제제를 사용한 치료로 검증될 필요가 있다(도 3B). 항체는 이미징 시간 윈도우 동안 수용체로부터 해리될 것이다. PFA와 GA의 조합으로 샘플을 처리하면 신호 손실을 방지할 수 있었습니다(도 3C).
마지막으로, 단일 분자 피팅 파라미터를 최적화하는 것이 중요하다. 잠재적 이미터 후보를 식별하는 첫 번째 "상자 찾기" 단계(그림 2B)는 많은 후보가 가우시안 피팅을 받을 수 있도록 관대해야 합니다. 따라서, 박스 발견을 위한 최소 광자 임계값은 모든 실제 이미터들 및 일부 배경 스폿들을 캡처하기 위해 상대적으로 낮을 수 있다. 상자 크기와 겹침 허용치를 너무 작게 설정하지 않는 것도 중요합니다. 상자 크기를 5-7 픽셀 이내로 유지하고 두 픽셀 겹침을 허용하는 것은 권장 밀도의 이미터에 이상적입니다. 상자 찾기 후 피팅 단계에서 최소 광자 임계값을 최적화해야 합니다. 최소 광자 파라미터는 어떤 가우시안 적합 이미터가 실제 적합으로 통과하는지 결정하는 데 기여합니다. 진정한 GFP 적합에 대한 적절한 최소 광자 역치를 결정하기 위해 코드에는 배경(세포 용해물 없음)과 GFP 함유(세포 용해물 포함) 샘플 모두에서 광자/국소화를 검사하는 히스토그램 플로팅 기능이 포함되어 있습니다(그림 3D). 이 단계는 NaBH4가 불순물로부터 형광의 양을 감소시키는 반면, 모든 배경 국소화를 제거하지는 못하기 때문에 중요하다. 그림 3D는 불순물로부터의 검출 횟수를 줄이기 위해 최소 광자 임계값을 설정해야 할 필요성을 보여준다. 이 역치를 결정하기 위해, 배경 방출기 강도의 히스토그램은 세포 용해물에 노출되지 않은 샘플을 이미징으로부터 계산한다(도 3D, 왼쪽 상단). 대부분의 배경 방출기는 475 광자 미만의 값을 갖는 것으로 밝혀졌다. 비교하여, 진정한 GFP 방출기를 함유하는 샘플은 475 이상의 분포의 유의한 분획을 나타내었다 (도 3D, 오른쪽 상단). 임계값은 용해물 샘플에서 신호 손실의 양을 최소화하면서 가능한 한 많은 배경 카운트를 제거하기 위해 검사에 의해 선택됩니다(그림 3D, 하단 행). 이 임계값에서의 나머지 배경 카운트 밀도는 정량적 분석에서 설명된다.
그림 1: 샘플 준비 개요. (A) SiMPull 접근 방식을 묘사한 만화. 커버슬립은 POI를 인식하는 항체로 기능화되어 전체 세포 용해물로부터 POI를 포획한다. 유리는 먼저 PEG 및 비오틴-PEG로 코팅된다. 뉴트라비딘은 이어서 비오틴-PEG에 결합하고 비오티닐화된 항-POI 항체에 대한 앵커로서 작용한다. 인산화된 단백질은 이어서 형광 표지된 항-PY 항체로 검출된다. (B) 커버슬립 어레이가 제자리에 있고 현미경 스테이지에 장착된 커버슬립 홀더(빨간색)의 사진. 다중 샘플 어레이는 소수성 잉크를 사용하여 생성되어 단일 유리 커버슬립에 최대 20개의 개별 샘플 사각형을 생성합니다. 커버슬립은 60 mm x 24 mm이다. (C) 소수성 잉크 자가형광(마젠타) 및 형광 비드(녹색)의 실시예 이미지. 소수성 잉크의 자기 형광은 커버슬립 표면에서 초점면을 찾는 데 유용한 가이드입니다. (d) 쿼드뷰 이미지 스플리터에 의해 카메라 칩 상에서 분리된 스펙트럼 채널을 갖는 원시 데이터 이미지의 예. 쿼드 뷰 필터 세트에는 파란색(445/45nm), 녹색(525/45nm), 빨간색(600/37nm), 원거리(685/40nm) 등의 방출 필터가 포함되어 있습니다. (E) 녹색 및 원접 채널의 원시 오버레이. 흰색 상자는 도 2B-D에서 추가로 조사된 영역을 나타낸다. 배율 막대(C-E) = 2μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 데이터 분석 워크플로우 . (A) 채널 등록은 먼저 나노그리드에서 획득한 이미지에 대해 수행됩니다. 관심있는 두 스펙트럼 채널 (여기, 녹색 및 원-빨강)을 자른 후 각 채널에 대한 신탁 이미지가 오버레이됩니다 (왼쪽). 왼쪽 이미지(Inset)에서 박스를 확대하면 이미지가 아직 실제로 등록되지 않았음을 알 수 있습니다. 각 채널의 이미터는 가우시안 모델에 적합하며 지역화(등록)됩니다. 이미터의 지역화는 원-적색 채널의 원으로 표시되고 녹색 채널의 경우 교차로 표시됩니다. 마지막 단계는 원간 채널 로컬라이제이션 좌표를 녹색 채널 기준 프레임(Aligned)으로 이동시키기 위해 로컬 가중 평균 변환을 적용하는 것입니다. 계산된 로컬 가중 평균 변환은 후속 SiMPull 데이터를 등록하는 데 사용됩니다. (B) 녹색/EGFR-GFP 채널 및 원적색/AF647-안티-PY 채널의 대표적인 이미지. 배경 광자 수 위의 단일 이미터가 식별되고 상자로 표시됩니다. (c) 선택된 각 박스 내의 방출 프로파일은 가우시안 모델에 적합하고, 단일 형광단 PSF의 모델에 맞는 방출기가 유지된다. (d) EGFR-GFP(녹색)의 위치를 식별하기 위해 GFP 방출기로부터 마스크가 생성된다. EGFR-GFP와 AF647-항-PY의 공동국소화는 인산화된 수용체(백색)를 확인한다. (e) 인산화된 수용체의 분획은 공동국소화된 EGFR-GFP 및 AF647-항-PY 적합으로부터 계산된다. 막대 그래프는 PV + EGF 처리를 휴지 세포와 비교하며 다중 측정에 대해 평균화됩니다. 오류 막대는 이항 분포를 가정하여 계산된 표준 오류를 나타냅니다. 배율 막대 = 2 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 데이터 품질을 보장하기 위한 중요한 단계. (A) 왼쪽에서 오른쪽으로, 처음 세 개의 패널은 피라냐 에칭 후, PEG 및 PEG 플러스 NaBH4 처리(+로 표시됨)와 같은 각각의 조건 하에서 유리 상의 자가형광의 대표적인 이미지이다. 추가적으로, 표면 기능화는 용해물로부터의 EGFR-GFP의 강력한 결합을 보유하면서 최소한의 비특이적 PY99-AF647 결합에 의해 입증된 바와 같이 NaBH4처리 후에 유지된다. (B) 최적의 항체 표지를 보장하기 위해 사용되는 항체의 각 배치에 대해 포화 곡선을 획득해야 한다. 이 그림은 부위 특이적 포스포티로신 항체인 항-EGFR-pY1173으로 EGFR을 표지하기 위한 농도 곡선을 나타낸다. 최소 인산화는 처리되지 않은 세포 (휴식, 회색 다이아몬드)에서 검출됩니다. 비특이적 결합에 대한 대조군으로서, 세포는 또한 EGFR 인산화의 예상된 예방을 보여주는 100 nM의 EGF (마젠타 삼각형)를 첨가하기 전에 EGFR 키나제 억제제인 라파티닙으로 처리하였다. 오류 막대는 이항 분포를 가정하는 표준 오류를 나타냅니다. (c) PFA와 GA의 조합으로 샘플을 고정시키는 것은 시간에 따른 항체 해리를 방지한다. 오류 막대는 이항 분포를 가정하는 표준 오류를 나타냅니다. (D) 가우시안 피팅에 대한 적절한 임계값을 선택하여 위양성을 제외합니다. 배경(용해물 없음)과 실제 데이터(플러스 세포 용해물) 사이의 낮은 임계값(임계값 = 0; 상단)에서 적합 강도의 히스토그램을 비교하면 녹색 채널의 자동 형광 스팟에서 적합치를 제거하기 위해 적절한 값(임계값 = 475; 하단)을 선택할 수 있습니다. 수직 마젠타 선은 475 광자 임계 값을 나타냅니다. 히스토그램은 각 샘플 유형에 대해 동일한 ROI 수(n=3)로부터 계산됩니다. 배율 막대 = 2 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1 : SiMPull 분석을 실행하기위한 스크립트 및 유틸리티가 포함 된 zip 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 2 : 스마이트 단일 분자 분석 패키지를 포함하는 zip 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 3: 샘플 데이터를 포함하는 zip 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 4 : 대표 샘플 데이터 분석 출력을 포함하는 zip 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 5 : 3D 인쇄를 위한 커버슬립 홀더 청사진. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 기술된 프로토콜은 단일 단백질 수준에서 수용체 인산화의 정량적 측정을 가능하게 하도록 최적화되었다. SiMPull 프로토콜에 대한 몇 가지 간단하지만 중요한 변형이 개발되어 NaBH4 처리로 자가 형광을 감소시키고 항체 해리를 방지하기 위해 샘플의 후고정을 포함하여 포스포티 로신 검출을 위한 측정의 신뢰성을 향상시켰다. 녹색 채널 마스크를 사용하여 항-PY 항체와의 공국소화의 계산을 위한 수용체 위치를 확인함으로써 또한 세포 용해물에 대한 항체의 비특이적 결합으로부터 잠재적인 아티팩트를 제거함으로써 측정 정확도를 향상시킨다. 두 가지 컬러 이미징은 인산화된 수용체의 분획을 검출하기 위해 이용되었다. 이 시나리오에서, 수용체는 GFP로 유전적으로 태그되었고, 항체는 원거리 적색 염료로 직접 표지되었다. SiMPull 접근법은 세포 내 단백질을 포함하여 특정 항체를 사용할 수있는 다른 단백질 표적에 적용됩니다. 또한, 변성 조건이 필요하지 않기 때문에, 다중 서브유닛 수용체/복합체도 포획될 수 있다. 그러나, 변성은 관심있는 PTM이 단백질14의 구조화된 영역에 위치하는 경우 혼입될 수 있다. 궁극적으로, SiMPull은 다중 부위 인산화 패턴(15)을 정량화하기 위해 개별 수용체 상의 별개의 포스포티로신의 동시 표지를 포함하도록 쉽게 확장될 수 있다. 이러한 방식으로 전장, 손상되지 않은 수용체의 심문은 웨스턴 블롯팅 및 포스포 질량 분광법을 포함한 다른 표준 방법으로는 달성 될 수 없습니다.
SiMPull의 장점과 함께 몇 가지 제한 사항을 고려해야합니다. 임의의 항체 기반 기술과 마찬가지로, 사용된 항체의 친화도 및 특이성은 측정의 성공에 매우 중요하다. 따라서, 항체 표지 조건을 최적화하고 직접 표지된 일차 항체를 사용하여 이차 항체를 이상적으로 피하는 것이 중요하다. 더욱이, 표면 결합된 항체는 원형질막에 국한된 단백질과 세포질 구획 내에 침전될 것이다. 이것은 시토졸-국소화된 단백질이 외인성으로 첨가된 리간드에 접근할 수 없기 때문에 인산화를 과소평가할 수 있다. 수용체 표면 수준을 교정하기 위해 추가 단계를 수행해야 합니다(단계 6.2.10). 항-포스포티로신 항체는 일단 용해물이 존재하면 일부 비특이적 결합을 나타내었다. 이러한 아티팩트를 피하기 위해, EGFR은 수용체의 위치를 확인하기 위해 GFP로 유전적으로 태그되었고, 이는 우리가 수용체에서 항-PY 신호를 배제할 수 있게 하였다. 내인성 단백질이 심문될 경우, 전체 단백질 항체로 역염색하면 마스크 이미지를 제공할 수 있으며, 임의의 비특이적 결합에 대한 적절한 교정을 제공할 수 있다. 마지막으로, SiMPull은 단백질 수준에서 이질성에 대한 정보를 제공하지만,이 프로토콜에서 생성 된 용해물은 수천 개의 세포에서 생성되며 세포 간 가변성이 손실됩니다. 그러나, 단일 셀 SiMPull을 향한 진보는 10 μm 갭을 갖는 커버슬립 및 현미경 측면으로 구성된 유동 챔버를 사용하여 이루어졌다; 박테리아를 커버슬립 상에 드물게 플레이팅하는 동안 슬라이드는 항체로 기능화하여 목적 단백질을 포획하였다. 박테리아가 용해되면, 각 세포로부터의 단백질은 항체-코팅된 슬라이드(22) 상의 제한된 영역에서 포획되었다. 포유동물 세포 및 단백질 인산화의 유사한 단세포 SiMPull 분석은 미래에 가능할 수 있다.
SiMPull 프로토콜에는 고품질 데이터를 보장하는 데 필요한 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 예를 들어, 프로토콜은 커버슬립 유리의 정교한 준비를 포함한다. 피라냐 에칭 커버슬립은 유리를 철저히 청소하고 커버슬립 표면을 최적화하는 데 필요한 히드록실기와 친수성을 증가시킵니다. 유기 용매로 여러 번 세척한 후, KOH 처리는 아미노실란화13,23을 위한 추가적인 히드록실기를 제공하며, 이는 PEG 및 비오틴-PEG 결합을 위한 아민기로 유리를 코팅한다. 이러한 단계 중 하나에서 부적절한 세척 또는 기능화는 단백질 풀다운을 방해합니다. PEG:비오틴-PEG의 몰비의 조절은 용해물 농도와 함께, SiMPull 기질 상에서 적절한 단백질 IP 밀도를 얻는 데 중요한 인자이다. 임의의 생물학적 분석과 마찬가지로, 세포 용해물 제제 사이에 가변성이 있고, 샘플 반복실험 간에 인산화 백분율 사이의 작은 차이가 보일 수 있다. 따라서, 동일한 샘플 내에서 상이한 티로신 부위의 인산화 수준을 측정하는 것이 중요하다. 이 프로토콜에 설명된 샘플 챔버는 하나의 이미징 세션에서 많은 데이터 포인트를 수집하는 시스템을 제공하며 여러 SiMPull 실험에 걸쳐 평균화를 허용합니다.
이미지 획득 측면에서, 정확한 채널 오버레이를 보장하기 위해 신탁 샘플을 얻는 것이 중요하다; 그렇지 않으면 공동 지역화가 정확하지 않습니다. 또한 레이저 전력 및 카메라 설정을 최적화하여 신호 대 잡음을 최대화하는 동시에 광 표백을 최소화하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 샘플 어레이는 소량의 샘플과 시약을 필요로 하지만, 낮은 부피는 이미징 세션 동안 증발에 취약하다. 주기적으로 샘플 어레이 (~ 30-45 분)를 확인하고 필요에 따라 버퍼를 추가하여 샘플이 건조되지 않도록하는 것이 중요합니다.
본 프로토콜은 막 수용체 인산화 상태를 정량화하기 위한 SiMPull의 사용을 입증하였다. EGFR에 초점을 맞추는 동안, 이 접근법은 적절한 항체가 이용가능한 한 다른 세포 표면 수용체 및 세포내 단백질 및 단백질 복합체에 적용될 수 있다. SiMPull의 또 다른 잠재적 용도는 상으로 분리된 응축액의 내용물과 인산화 상태를 조사하는 것이다. 또한, SiMPull은 유비퀴틴화와 같은 다른 PTM을 측정하는데 사용될 수 있다. 따라서 SiMPull은 세포 생물학자가 손상되지 않은 단백질에 대한 PTM을 조사하고 PTM 패턴을 세포 결과와 상호 연관시킬 수있는 독특한 도구를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 국립 보건원 R35GM126934, R01AI153617 및 R01CA248166에서 DSL로 지원했습니다. EMB는 ASERT-IRACDA 프로그램(NIH K12GM088021)과 UNM MARC 프로그램(NIH 2T34GM008751-20)에 의해 JAR을 통해 지원되었다. 우리는 NIH P30CA118100이 지원하는 뉴 멕시코 대학 종합 암 센터 형광 현미경 공유 자원을 사용하여 감사하게 인정합니다. 우리는 SiMPull의 원래 개발이이 작품에 영감을 준 Ankur Jain 박사와 Taekijip Ha 박사를 인정하고 싶습니다.
ES-C 현재 주소 : 면역 역학 그룹, 통합 암 면역학 실험실, 암 연구 센터, 국립 암 연구소, 베데스다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
References
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
- Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
- Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
- Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
- Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
- Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
- Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Smith, P. K., et al.
- Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
- Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
- fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013).
- Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
- Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T.
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
