Summary
Denne protokol beskriver og sammenligner proceduren for at udføre en fuldregion eller underregion af interesseanalyse af sagittal musehjerneafsnit for at kvantificere amyloid-beta-belastning i APP / PS1 transgene musemodel af Alzheimers sygdom.
Abstract
Ekstracellulær akkumulering af amyloid-beta (Aβ) plaques er et af de vigtigste patologiske kendetegn ved Alzheimers sygdom (AD) og er målet for den eneste FDA-godkendte sygdomsmodificerende behandling for AD. Følgelig anvendes brugen af transgene musemodeller, der overudtrykker amyloidprecursorproteinet og derved akkumulerer cerebrale Aβ-plaques, i vid udstrækning til at modellere human AD hos mus. Derfor måler immunoassays, herunder enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) og immunostaining, almindeligvis Aβ-belastningen i hjernevæv afledt af AD-transgene mus. Selv om metoderne til Aβ-påvisning og kvantificering er veletablerede og dokumenterede, er virkningen af størrelsen af det interesseområde, der er valgt i hjernevævet, på Aβ-belastningsmålinger efter immunstaining ikke blevet rapporteret. Derfor havde den nuværende protokol til formål at sammenligne Aβ-belastningsmålingerne på tværs af fuld- og underregioner af interesse ved hjælp af en billedanalysesoftware. De trin, der er involveret i hjernevævsforberedelse, fritflydende hjernesektion immunstaining, billeddannelse og kvantificering af Aβ-belastning i fuld- versus underregioner af interesse, beskrives ved hjælp af hjerneafsnit afledt af 13 måneder gamle APP / PS1 dobbelt transgene hanmus. Den nuværende protokol og resultaterne giver værdifuld information om virkningen af størrelsen af interesseområdet på Aβ-positiv arealkvantificering og viser en stærk sammenhæng mellem det Aβ-positive område opnået ved hjælp af fuld- og underregioner af interesseanalyser for hjerneafsnit afledt af 13 måneder gamle mandlige APP / PS1-mus, der viser udbredt Aβ-aflejring.
Introduction
Alzheimers sygdom (AD), den sjette førende dødsårsag i USA, er fortsat en trussel mod folkesundheden, med anslået 6,2 millioner amerikanere, der lever med AD. Dette forventes at nå 13,8 millioner i 20601. Til dato er symptomatisk behandling gennem medicin såsom cholinesterasehæmmere og memantin det primære behandlingsforløb2. AD er karakteriseret ved neuropatologiske manifestationer såsom ekstracellulær aflejring af amyloid-beta (Aβ) plaques og intracellulær hyperphosphorylated tau akkumulering i form af neurofibrillære tangles 3,4. Dannet af en endoproteolytisk spaltning af amyloidprecursorproteinet (APP) via beta- og gamma-sekretase, aggregerer Aβ til dannelse af oligomerer og fibriller, hvilket fører til neurotoksiske virkninger5. Aβ er blevet antaget at tjene en primær patologisk rolle siden 1980'erne og er det terapeutiske mål for den eneste FDA-godkendte sygdomsmodificerende terapi til AD6. Som et resultat har transgene AD-musemodeller, der indeholder mutationer i gener, hvilket resulterer i robust cerebral Aβ-akkumulering, været meget anvendt til præklinisk AD-forskning siden begyndelsen af 1990'erne7.
Påvisning af Aβ-arter i disse AD-transgene musehjerner udføres generelt ved hjælp af to immunoassays: enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) og immunostaining. Det tidligere assay muliggør kvantitativ bestemmelse af forskellige Aβ-arter og er mindre tidskrævende sammenlignet med immunostaining, hvilket kræver flere sekventielle vævsbehandlings- og billeddannelsestrin, herunder vævssektionering, immunostaining, billeddannelse og kvantificering8. Endvidere er resultaterne opnået efter immunostaining semikvantitative8. Evnen til rumligt at lokalisere Aβ gør imidlertid immunostaining til en attraktiv tilgang til Aβ-detektion i hjernevæv8.
Under anvendelse af Aβ immunostaining er flere forskellige kvantificeringsparadigmer blevet anvendt af forskellige forskningsgrupper. For eksempel kvantificerer nogle forskergrupper Aβ-belastningen i hele interesseområdet (cortex eller hippocampus), mens andre kvantificerer Aβ-belastningen i et bestemt underområde af interesse (en del af cortex eller hippocampus)9,10,11. Selv om metoderne til påvisning og kvantificering af Aβ er veletablerede og dokumenterede, er virkningen af størrelsen af interesseområdet på Aβ-belastningsmålinger efter immunstaining ikke blevet rapporteret. Derfor havde den nuværende protokol til formål at sammenligne Aβ-belastningsmålingerne på tværs af fuld- og underregioner af interesse ved hjælp af en billedanalysesoftware, ImageJ.
Den nuværende undersøgelse brugte 13 måneder gamle APP / PS1 dobbelt transgene hanmus, der udtrykker en kimær mus / human APP og en mutant presenilin 1, til at modellere tidlig begyndelse af AD12. Aβ-aflejringer begynder at udvikle sig ved 6-7 måneders alder, og rigelig Aβ-ophobning observeres både i cortex og hippocampus hos disse mus ved 9-10 måneders alder12. De transgene amyloidpeptider og holoprotein kan detekteres ved 6E10-immunostaining13, hvilket gør det til en ønskelig dyremodel for den nuværende protokol. Den procedure, der er omfattet heri, omfatter forberedelse af hjernevæv, immunostaining af fritflydende sektioner, billeddannelse og kvantificering af Aβ-belastning i fuld- versus underregioner af interesse. Analysen viser en stærk sammenhæng mellem den fulde og subregionale kvantificering, hvilket indikerer robust overensstemmelse mellem disse to metoder i hjernevævsafsnittene afledt af 13 måneder gamle APP / PS1-hanmus, der viser rigelige Aβ-aflejringer.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med University Laboratory Animal Resources i henhold til protokoller godkendt af University of California, Irvine, Institutional Animal Care and Use Committee. Forsøgene blev udført med B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (APP/PS1) mus (13 måneder gamle, n=35). Musene blev fremstillet fra kommercielle kilder (se Materialetabel).
1. Forberedelse af hjernevæv
- Bedøv musene ved hjælp af en dødelig dosis af et phenytoin/pentobarbitalbaseret bedøvelsesmiddel (150 mg/kg) injiceret intraperitonealt (se materialetabel) efter godkendte dyreprotokoller. Udfør hjerteperfusion med iskold fosfatbufferet saltvand (1x PBS) i 5 minutter med en hastighed på 5 ml / min for at rydde hjernevaskulaturen14.
- Høst hjernevæv efter den tidligere offentliggjorte rapport15, adskil i venstre og højre hjernehalvdel og placer højre hemi-hjerne hos hver mus i et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml frisklavet 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning i 1x PBS i 72 timer ved 4 ° C.
BEMÆRK: Hjernen kan være nedsænkningsfikseret fra 24-72 timer afhængigt af det antigen, der undersøges. Den venstre hemi-hjerne uden lillehjernen kan snap-fryses i flydende nitrogen og derefter opbevares ved -80 °C efterfulgt af behandling til biokemiske assays såsom ELISA og biokemisk Aβ-detektion16.
FORSIGTIG: PFA er et sandsynligt kræftfremkaldende stof, og hudkontakt med PFA kan føre til allergiske hudsymptomer. Brug nitril- eller butylhandsker, masker og øjenbeskyttelse til håndtering af det, og forbered dig under en kemisk røghætte. - Efter inkubation i 4% PFA inkuberes hemi-hjernerne sekventielt i 5 ml 10%, 20% og 30% saccharoseopløsninger fremstillet i 1x PBS i 24 timer, hver ved 4 ° C, indtil hjernevævet synker til bunden af det koniske rør.
- Efter inkubation i 30% saccharoseopløsningen skal du fjerne hemi-hjernen, forsigtigt duppe hjernen på et filterpapir for at fjerne den overskydende saccharoseopløsning og fryse den faste hemi-hjerne i pulveriseret tøris i 30 minutter. Opbevar den frosne hemi-hjerne i velmærkede aluminiumsfolier ved -80 °C indtil kryosesektion.
BEMÆRK: I den nuværende protokol blev hemi-hjernerne opbevaret ved -80 °C i 6-8 måneder. - Sektion den frosne hemi-hjerne i 20 μm tykke sektioner ved hjælp af en kryostat (se Materialetabel).
BEMÆRK: For den nuværende protokol blev hemi-hjernerne opdelt i sagittale sektioner, og om nødvendigt kan koronale sektioner også fremstilles17. Trin 2 er til Aβ immunofluorescerende farvning på faste og kryobeskyttede hjernevævsprøver.
2. Immunfluorescens
- Sagittale hjernevævssektioner (trin 1.5) anbringes i en plade med 24 brønde (op til seks musehjerneafsnit pr. 300 μL pr. Brønd). Vask i 5 minutter med 1x PBS tre gange ved stuetemperatur (23 °C) ved at placere pladen på en ryster med let hvirvlen.
- Inkuber hjernevævssektionerne med 70% myresyre i dH20 ved stuetemperatur i 10 min.
FORSIGTIG: Myresyre er ætsende, så undgå hud- og øjenkontakt. - Hjernevævssektionerne vaskes i 5 minutter med dH20 tre gange ved stuetemperatur.
- Bloker ikke-specifik binding med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 0,3% TritonX 100 (se materialetabel) i 1x PBS ved stuetemperatur i 1 time.
- Hjernevævssektionerne inkuberes med et fluoroformærket primært antistof (6E10, se materialetabel) fortyndet (1:1000) i 1x PBS indeholdende 0,3% TritonX 100 ved 4 °C i 24 timer.
BEMÆRK: Da det primære antistof er fluoroforkonjugeret, skal pladen dækkes fra dette trin og fremefter, eller alt arbejde skal udføres i et mørkt rum for at opretholde fluorophoreeffektivitet. - Hjernevævssektionerne vaskes i 10 minutter med 1x PBS tre gange ved stuetemperatur.
- Monter hjernevævssektionerne på positivt ladede glasglas (se Materialetabel), der er godt mærket (etiketoplysninger på diaset er baseret på præference), efter en kort vask med dH20 for at fjerne resterende salte. Lad gliderne lufttørre i mørket.
BEMÆRK: Hjernesektionerne skal monteres omhyggeligt for at undgå folder og revner, der påvirker datakvantificering. I tilfælde af revner og/ eller folder, der ligger i det område, der er af interesse og kan forstyrre datakvantificering, anbefales genfarvning og genmontering. - Monter hjernevævssektionerne med et vandigt monteringsmedie (se Materialetabel), og placer glasovertrækket over vævet. Forsegl enderne af dækslippen med klar neglelak, og opbevar diasene i en glideboks ved 4 °C indtil billeddannelse.
BEMÆRK: I den nuværende protokol blev diasene afbildet inden for 1 måned efter farvning.
3. Billedbehandling
- Forestil dig de 6E10-farvede hjerneafsnit ved hjælp af et fluorescensmikroskop (epifluorescens eller konfokalt) (se Materialetabel), der har et 2x mål om at fange hele hjernevævssektionen i et billede og er udstyret med det passende filter (GFP i dette arbejde).
BEMÆRK: Billedindstillinger skal være ensartede på tværs af forskellige dias. - Gem de optagne billeder som en TIFF-fil eller efter behov, og åbn dem i billedanalysesoftwaren (se Materialetabel) som beskrevet i trin 4.2 nedenfor for 6E10-kvantificering.
BEMÆRK: Inkluder en skalabjælke, før du tager billedet for at kvantificere i billedanalysesoftwaren, ImageJ.
4. Analyse af hele interesseområdet
BEMÆRK: Det foreliggende værks to interesseområder er hippocampus og iso-cortex. Fuldregionsanalyse repræsenterer analysen af hele iso-cortex (kaldet cortex fremadrettet) eller hippocampus i den afbildede hjernevævssektion.
- Download billedanalysesoftwaren (se Materialetabel), og start softwaren, når den er installeret.
- Når softwaren kører, skal du klikke på File | Åbn | Vælg det billede, der skal analyseres.
- Klik på Analyser | Indstil skala| Klik for at fjerne skala. Vælg værktøjet Lige fra softwareværktøjslinjen, og tegn en lige linje langs skalalinjens længde. Klik på Analyser | Foranstaltning. Bemærk længden eller afstanden af skalalinjen i pixel. Klik på Analyser | Indstil skala.
- I pop op-vinduet skal du indtaste afstanden i pixels, den kendte afstand af skalabjælken (i μm i dette tilfælde) og længdeenheden som μm. Markér Global for at anvende den nye skaleringsindstilling på alle følgende billeder, hvis der behandles flere billeder. Klik på OK for at anvende indstillingerne.
BEMÆRK: Det anbefales altid at kontrollere, om den nøjagtige skala anvendes på billedet, før yderligere analyse.
- I pop op-vinduet skal du indtaste afstanden i pixels, den kendte afstand af skalabjælken (i μm i dette tilfælde) og længdeenheden som μm. Markér Global for at anvende den nye skaleringsindstilling på alle følgende billeder, hvis der behandles flere billeder. Klik på OK for at anvende indstillingerne.
- For at indstille den ønskede måling til sektionens område skal du gå til Analyser | Indstil målinger | Markér felterne Område og Vis etiket. Kontrollér, at det billede, der analyseres, er valgt under Omdiriger til.
- For at lette hippocampus eller cortex visualisering, gå til Billede | Juster | Lysstyrke/kontrast. Træk den maksimale glidebjælke gradvist til venstre for at øge vævets klarhed, indtil hjerneområderne af interesse kan identificeres.
BEMÆRK: Anvend ikke denne indstilling for at undgå falske målinger under analysen, men fortsæt i stedet til næste trin. - Brug polygonvalget eller frihåndsmarkeringsværktøjet til at skitsere hippocampusområdet. Klik på indstillingen Nulstil i indstillingerne for lysstyrke / kontrast, når hippocampus er skitseret for at vende tilbage til den oprindelige lysstyrke.
BEMÆRK: Trinene skal gentages separat for det kortikale område. - For at måle det samlede vævsareal i det valgte område skal du klikke på Rediger | Ryd udenfor. Når den valgte region er det eneste billede på skærmen, skal du klikke på Analyser | Mål for at opnå det samlede vævsareal, der analyseres i et pop op-vindue. Gem dataene i en Excel-fil til senere brug.
- Hvis du vil måle det 6E10-positive område, skal du gå til Billede | Juster | Farve tærskel. Et foruddefineret filter under Thresholding-metoden giver normalt ønskede resultater, der fremhæver de stærkeste signaler i rødt.
BEMÆRK: Det optimale tærskelvalg afhænger af billedets baggrund og farvningsintensiteten. Vælg en tærskelindstilling, der opfanger pletten og ikke baggrunden. - Når du har valgt den relevante tærskel, skal du kontrollere Mørk baggrund. Dette vil fremhæve Aβ-pletterne (pletten af interesse) på en sort baggrund. Klik på Vælg | Oprindelig | Vælg, og giv de mørke signaler (Aβ-aflejringerne) på en hvid baggrund. Klik på Analyser | Analysér partikler , og klik på OK , når pop op-vinduet genereres.
- Kopier det resuméoutput, der genereres af softwaren, ved at klikke på Rediger | Kopier. Indsæt i den tidligere startede Excel-fil med respektive etiketter. Dette er det 6E10-positive område i de udvalgte regioner af interesse (enten hippocampus eller cortex).
BEMÆRK: I Excel vil der være en kolonne for det samlede 6E10-positive område (trin 4.10) og det samlede vævsareal (trin 4.7). - Beregn det 6E10-positive område (%) som følger16: (Samlet 6E10-positivt område / Samlet vævsareal analyseret) x 100.
5. Analyse af interesseområde
BEMÆRK: Subregion af interesseanalyse repræsenterer analysen af en del af cortex eller hippocampus i den afbildede hjernevævssektion.
- Download billedanalysesoftwaren, og start softwaren, når den er installeret.
- Når softwaren kører, skal du klikke på File | Åbn | Vælg det billede, der skal analyseres.
- Klik på Analyser | Indstil skala| Klik for at fjerne skala. Vælg værktøjet Lige fra softwareværktøjslinjen, og tegn en lige linje langs skalalinjens længde. Klik på Analyser | Foranstaltning. Bemærk længden eller afstanden af skalalinjen i pixel. Klik på Analyser | Indstil skala.
- I pop op-vinduet skal du indtaste afstanden i pixels, den kendte afstand af skalalinjen (i μm i dette tilfælde) og indtaste længdeenheden som μm. Markér Global for at anvende den nye skaleringsindstilling på alle følgende billeder, hvis der behandles flere billeder. Klik på OK for at anvende indstillingerne.
BEMÆRK: Det anbefales altid at kontrollere, om den nøjagtige skala anvendes på billedet, før yderligere analyse.
- I pop op-vinduet skal du indtaste afstanden i pixels, den kendte afstand af skalalinjen (i μm i dette tilfælde) og indtaste længdeenheden som μm. Markér Global for at anvende den nye skaleringsindstilling på alle følgende billeder, hvis der behandles flere billeder. Klik på OK for at anvende indstillingerne.
- For at indstille den ønskede måling til sektionens område skal du gå til Analyser | Indstil målinger | vælg felterne Område og Vis etiket. Kontrollér, at det billede, der analyseres, er valgt under Omdiriger til.
- Juster lysstyrken og kontrasten, hvis billedet er for svagt, og hjerneområderne (f.eks. Hippocampus eller cortex i dette tilfælde) ikke let kan identificeres. Brug softwareværktøjslinjen, og klik på | Juster | Lysstyrke/kontrast , og træk skyderne Maksimum til venstre efter behov for at øge vævets synlighed.
BEMÆRK: Anvend ikke denne indstilling for at undgå falske målinger under analysen, men fortsæt i stedet til næste trin. - Brug rektangelværktøjet til at vælge det område, der er af interesse i cortex eller hippocampus. Brug værktøjslinjen, og klik på Rediger | Udvælgelse | Angiv, og skift højde og bredde til en foruddefineret værdi. Juster kassen, så den er helt dækket af væv. Nulstil lysstyrken/kontrasten for at vende tilbage til den oprindelige lysstyrke.
BEMÆRK: Størrelsen på den boks, der bruges til at vælge de områder, der er af interesse, skal være ensartet for alle billederne. Til denne analyse var boksstørrelsen enten 300 pixels x 300 pixels (svarende til 1177 μm x 1177 μm) eller 400 pixels x 200 pixels (svarende til 1569 μm x 784 μm). - Dupliker det valgte område af interesse ved at højreklikke på feltet og klikke på Dupliker. Et nyt vindue med den valgte region åbnes. Omdøb det duplikerede billede for at vise det område, det er placeret i (f.eks. Cortex eller hippocampus).
- Juster den duplikerede billedtype ved hjælp af værktøjslinjen og klikke på Billed- | Skriv | 8-bit for at konvertere det duplikerede RGB-billede til 8-bit for bedst at analysere plaques. Vend billedet om ved at klikke på Rediger | Inverter.
- Hvis du vil måle det 6E10-positive område, skal du gå til Billede | Juster | Tærskel. Et foruddefineret filter under Thresholding-metoden giver normalt de ønskede resultater ved at fremhæve de stærkeste signaler med rødt.
BEMÆRK: Det optimale tærskelvalg afhænger af billedets baggrund og farvningsintensiteten. Vælg en tærskelindstilling, der opfanger pletten og ikke baggrunden. - Når du har valgt den relevante tærskel, skal du vælge Anvend.
- For at analysere det 6E10-positive område skal du bruge værktøjslinjen og klikke på Analyser | Analyser partikler, og sørg for, at "Opsummer resultater" kontrolleres.
- Kopier resuméoutputtet med % Område genereret af softwaren ved at klikke på Rediger | Kopier. Indsæt i den tidligere startede Excel-fil med respektive etiketter.
- Trin 5.3-5.12 gentages for de forskellige regioner i vævet. Sørg for, at placeringen af hver boks for at skitsere interesseområdet er konsistent mellem hvert billede.
BEMÆRK: Rotationsværktøjet kan bruges, hvis rektanglets værktøjskasse dimensioner ikke kan passe ind i det angivne område på grund af vævskrumning. - For at rotere rektanglet skal du bruge værktøjslinjen og klikke på Rediger | Udvælgelse | Drej og juster rotationsgraden efter behov. Dupliker billedet som nævnt i trin 5.7, og ryd ydersiden ved hjælp af værktøjslinjen og klik på Rediger | Ryd udenfor, hvilket rydder 6E10-pletterne uden for det specificerede rektangel. Fortsæt med trin 5.8 beskrevet ovenfor.
Representative Results
Her sammenlignes to forskellige metoder til at kvantificere det 6E10-positive område i hippocampus og cortex i musehjernevæv. De to metoder er analyser af hele regionen og underregionen (figur 1). Den fulde interesseanalyse, som navnet antyder, indebærer at skitsere hele interesseområdet (i dette tilfælde enten iso-cortex eller hippocampus) for at bestemme det 6E10-positive område (figur 1A, B). Analysen af interesseområdet indebærer udvælgelse af en foruddefineret region inden for interesseregionen for at bestemme det 6E10-positive område (figur 1C, D). Den trinvise ImageJ-protokol for de to metoder er vist i figur 2, figur 3 og figur 4.
Denne undersøgelse brugte tre læsere; to uafhængige læsere udførte underregionsanalysen af interesse, og den tredje læser udførte den fulde interesseregionsanalyse. Som det ses i figur 5A,B, var der en stærk signifikant positiv korrelation (p < 0,0001) mellem det 6E10-positive område rapporteret af de to læsere, der udførte underregionen af interesseanalyse (Pearson korrelationskoefficient r = 0,97 for cortex og r = 0,96 for hippocampus). De 6E10-positive områder, der blev rapporteret af de to læsere for underregionsanalysen, blev gennemsnitligt, og det gennemsnitlige underregion af interesse 6E10-positivt område delte en stærk signifikant positiv korrelation (p < 0,0001) med det 6E10-positive område opnået ved hjælp af den fulde interesseregionsanalyse for begge cortex (Pearson korrelationskoefficient r = 0,96; Figur 5C) og hippocampus (Pearson korrelationskoefficient r = 0,95; Figur 5D). Det gennemsnitlige kortikale og hippocampale-6E10-positive område opnået ved helregions- og subregionsanalyserne var sammenligneligt uden nogen signifikant forskel, hvilket bekræfter overensstemmelsen mellem de to metoder (figur 5E). Endvidere blev den uopløselige Aβ1-42 målt i helhjernehomogenater i en delmængde af mus, og det kortikale (figur 5F) og hippocampale (figur 5G) 6E10-positive område bestemt af den fulde interesseregion var signifikant (p < 0,01) korreleret med uopløselig Aβ1-42-belastning ved hjælp af ELISA (se Materialetabel).
Figur 1: Hel- versus underregioner med interessevalg. Repræsentative billeder, der viser den fulde iso-cortex (cortex) og hippocampus skitseret for den fulde region af interesseanalyse i henholdsvis (A) og (B). Repræsentative billeder viser udvælgelsen af underregion/er af cortex og hippocampus til underregion af interesseanalyse i henholdsvis (C) og (D). Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Protokol for kvantificering af hele interesseområdet 6E10-positiv. Billedanalysetrin, der viser det originale billede (A), billedet efter lysstyrke/kontrastjustering (B), valg af interesseområde (C), rydning (D), tærskeljustering (E) og det endelige billede klar til analyse (F). Tallene i figuren angiver trinnumrene i protokollen. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Protokol for kvantificering af interesseområde 6E10-positiv areal. Billedanalysetrin, der viser det originale billede (A), billedet efter justering af lysstyrke/kontrast (B), valg af interesseområde (C), duplikering af billedet af interesseområdet (D), ændring af billedet til 8-bit og invertering af billedet (E), tærskeljustering (F) og endeligt billede klar til analyse (G). Tallene i figuren angiver trinnumrene i protokollen. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Protokol for interesseområdets rotation. Billedanalysetrin, der viser valg af interesseområde og rotation af markeringsboksen, så den passer til vævskrumningen (A), billedet af interesseområdet efter duplikering (B) og billedet efter rydning af det udvendige (ikke-interesseområde) område (C). Tallene i figuren angiver trinnummeret i protokollen. Skala bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Korrelation mellem hel- og underregioner af interesseanalyser. Scatter plots viser sammenhængen mellem det 6E10-positive område af de to uafhængige læsere, der udfører subregion af interesseanalyse for cortex (A) og hippocampus (B). En stærk positiv korrelation observeres mellem det 6E10-positive område som følge af subregion af interesseanalyse og den fulde region af interesseanalyse for både cortex (C) og hippocampus (D). Der er ingen statistisk signifikant forskel i det gennemsnitlige 6E10-positive område ved den fulde interesseregion og underregionen af interesseanalyser i cortex og hippocampus (E). En signifikant korrelation observeres mellem helhjernehomogenatuopløselige Aβ1-42-målinger ved hjælp af ELISA og den fulde interesseregionsanalyse for både cortex (F) og hippocampus (G). Data blev analyseret ved hjælp af Pearson-korrelationskoefficienten, r, in (A-D) og (F-G), og ved hjælp af tovejs gentagne målinger ANOVA i (E) ved hjælp af en graf- og statistiksoftware. Data præsenteres som middelværdien ± standardfejl af middelværdien (SEM) på n = 35 mus i (E), og en tosidet p -< 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Protokollen beskrevet heri skitserer proceduren for hemi-hjerneforberedelse til sagittal sektionering, immunofluorescerende farvning af Aβ-aflejringer ved anvendelse af 6E10-antistoffet på fritflydende sektioner, billeddannelse af de Aβ-farvede hjerneafsnit efterfulgt af kvantificering af Aβ-aflejringerne i cortex og hippocampus af musehjernevæv ved hjælp af en billedanalysesoftware. Mens der er offentliggjort protokoller til kvantificering af Aβ-belastning i hjernevævsafsnit 8,10, beskriver denne protokol de trin, der er involveret i kvantificeringen af Aβ-belastningen i hele iso-cortex (kaldet cortex) og hippocampus i sammenligning med Aβ-belastningen i en underregion af interesse i cortex og hippocampus, når dette kan ønskes. Sammenhængen mellem de fulde versus subregioner af interesseanalyser er også angivet.
Der er flere kritiske trin i protokollen. For det første er den beskrevne protokol for 20 μm tykke hjernevævssektioner udsat for fritsvævende immunstaining, hvilket resulterer i optimal antistofindtrængning i vævsafsnit18. Den fritsvævende teknik kan kræve, at vævssektionerne manuelt overføres mellem de forskellige opløsninger under immunfluorescerende farvning og omhyggelig håndtering af vævssektionerne under hele proceduren. Dette er især afgørende, når vævssektionerne nedsænkes i 70% myresyreopløsningen til antigenudtagning i den nuværende protokol, hvilket øger vævssvagheden for tynde sektioner. Alternative tilgange til den beskrevne protokol inkluderer anvendelse af tykkere vævssektioner (f.eks. 30-40 μm) eller anvendelse af vævssektioner, der er direkte monteret på positivt ladede dias før immunfluorescerende farvning. For det andet bruger protokollen beskrevet heri et fluorescerende mærket 6E10-antistof. Udover at bruge det fluorescerende mærkede 6E10-antistof kan ikke-fluorescerende 6E10-antistoffer (f.eks. Peberrodsperoxidasekonjugeret 6E10-antistof) også bruges til at detektere Aβ-belastning i hjernevævssektioner, og den nuværende protokol kan tilpasses til at kvantificere Aβ-positive immunokemiske pletter i hjernevævssektionerne som beskrevet tidligere8 . For det tredje vil nøjagtigheden af resultaterne for Aβ-belastningskvantificering afhænge af det passende tærskelvalg i analysesoftwaren, som afhænger af vævets baggrund og signalintensitet. Tærskelvalg skal udføres af slutbrugeren, således at kun Aβ-positive pletter vælges til kvantificering. Slutbrugerintervention er påkrævet for at optimere den specifikke tærskel, der kan anvendes på alle billederne for at sikre nøjagtigheden af tærskelindstillingen. For det fjerde, da underregionen af interesseanalyse kræver udvælgelse af en lille region af interesse i vævsafsnittet, blev der brugt to uafhængige læsere til denne analyse. For at opretholde uafhængighed og blinding under dataindsamling blev alle billederne nummerkodet; billedanalysesekvensen blev randomiseret mellem læserne, således at de forskellige læsere analyserede forskellige billeder til enhver tid, og dataene blev indsendt i slutningen af hver uge. På grund af den øgede sandsynlighed for inter-læservariation i interesseområdet i underregionen af interesseanalysen blev læserne trænet ved hjælp af flere prøvebilleder for at optimere regionvalg i cortex og hippocampus, inden dataindsamlingen begyndte. Denne træning er afgørende for at reducere variationen mellem læsere, og som det kan ses (figur 5A, B), viser det 6E10-positive område, der er rapporteret af begge læsere, en stærk relativ enighed i den aktuelle undersøgelse.
Den nuværende protokol og resultaterne giver værdifulde oplysninger om virkningen af regionen af interessestørrelse på Aβ-positiv områdekvantificering. En større region af interesse forventes at repræsentere vævet mere end en mindre region af interesse. Derfor er prøveudtagning af et større væv ønskeligt for nøjagtigt at kvantificere Aβ-belastningen i væv. I tilfælde af homogen Aβ-belastningsfordeling i vævet betragtes en mindre prøveudtagningsregion imidlertid generelt som en god repræsentation af det større væv, der analyseres. De nuværende undersøgelsesresultater bekræfter dette, og Aβ-belastningen i hele cortex og hippocampus var en stærk korrelation af Aβ-belastning i en udvalgt underregion af cortex og hippocampus (figur 5C, D). For yderligere at bekræfte overensstemmelsen mellem hel- og underregionerne af interesseanalyser blev det gennemsnitlige 6E10-positive område i cortex og hippocampus sammenlignet, og der blev ikke fundet nogen forskel mellem de to metoder (figur 5E). Dette bekræfter, at en af disse metoder (fuld- eller subregionsanalyse) giver sammenlignelige Aβ-belastningsmålinger.
Den nuværende protokol har nogle begrænsninger. De to metoder (analyse af hele regioner versus subregioner) anvendes ikke altid i flæng. Valget af at bruge hel- eller subregionsanalysen afhænger af den regionale fordeling af Aβ i vævet, som påvirkes af alder, køn og stamme af AD-musemodellen. Efter 13 måneder fordeles Aβ-belastningen gennem cortex og hippocampus hos APP/PS1-musene. Efter 6 måneder er Aβ-aflejringer imidlertid begrænset til cortex, og minimale aflejringer observeres i hippocampus12. Under sådanne forhold kan analysen af hele interesseområdet være den ønskede tilgang til at øge vævsprøvetagningsområdet og derved Aβ-signalet. På den anden side kan subregionsanalyse være den valgte metode, når Aβ-belastning i en bestemt hjerneregion er af interesse (f.eks. Den somatosensoriske cortex). Derudover viser APP/PS1-hanmusene efter 13 måneder intense 6E10-positive pletter, og den immunfluorescerende farvning resulterer i et fremragende signal med en meget lav baggrund, hvilket gør den nuværende protokol meget velegnet til kvantificering under de givne forhold. Det er uklart, om denne kvantificeringsmetode kan anvendes med succes til mindre intens farvning, og fremtidigt arbejde vil være nødvendigt for at besvare dette spørgsmål. Den immunfluorescerende og billedkvantificeringsmetode, der præsenteres heri, detekterer alle former for Aβ, herunderforløberformen 13. Som et resultat, hvis der er interesse for påvisning af en specifik Aβ-art (f.eks. Aβ1-40 eller Aβ1-42), kan antistoffer, der er specifikke for disse Aβ-isoformer, anvendes. Selvom 6E10 immunofluorescerende farvnings- og detektionsmetode korrelerede med målingerne af Aβ1-42-målinger i helhjernehomogenater ved hjælp af ELISA (figur 5F, G), var korrelationen derfor kun beskeden. Dette kan tilskrives måling af kun Aβ1-42 ved anvendelse af ELISA og påvisning af alle Aβ-arter ved anvendelse af 6E10 immunostaining. Den aktuelle undersøgelse bruger tre læsere til at vurdere overensstemmelsen og sammenhængen mellem de fulde og subregionale analyser. At have yderligere læsere kan forbedre undersøgelsens robusthed og kan yderligere validere aftalerne mellem de to metoder, der præsenteres her. Desuden bruger vi Pearson-korrelationen som et mål for enighed, som i vid udstrækning anvendes blandt andre metoder til at beskrive aftalen mellem kontinuerlige variabler19. En begrænsning ved at bruge Pearson-korrelationen til at bestemme enighed er imidlertid, at de to metoder, der anvendes heri, kan give relaterede resultater, men den ene metode kan resultere i overordnede højere værdier end den anden på grund af systematisk bias. Derfor er Pearson-korrelation et godt mål for relativ enighed19. For at øge protokollens robusthed kan der anvendes yderligere metoder til at bekræfte den absolutte enighed, såsom sammenligning af det gennemsnitlige 6E10-positive område ved hjælp af de to metoder (figur 5E),19. Samlet set sammenligner den nuværende protokol Aβ-belastningen detekteret ved immunofluorescerende farvning og analyserer de fulde og underområder af interesse i hjernevævssektioner. Resultaterne viser en stærk sammenhæng mellem disse to metoder til hjernevævssektioner afledt af 13 måneder gamle APP / PS1-hanmus, der viser rigelige Aβ-aflejringer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of Aging of the National Institutes of Health under tildelingsnumre R01AG062840 (til RKS) og R01AG072896 (til RKS). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. Ca. $ 200k (100%) af føderale midler støttede dette projekt. Vi vil også gerne takke Dr. Joshua Yang for hans hjælp med manuskriptredigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML |
References
- Alzheimer's Association. 2021 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimer's & Dementia. 17 (3), 327-406 (2021).
- Langa, K. M., Foster, N. L., Larson, E. B. Mixed dementia: emerging concepts and therapeutic implications. Journal of the American Medical Association. 292 (23), 2901-2908 (2004).
- Gandy, S., DeKosky, S. T. Toward the treatment and prevention of Alzheimer's disease: rational strategies and recent progress. Annual Review of Medicine. 64, 367-383 (2013).
- Bloom, G. S. Amyloid-beta and tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis. JAMA Neurology. 71 (4), 505-508 (2014).
- Gremer, L., et al. Fibril structure of amyloid-beta(1-42) by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6359), 116-119 (2017).
- Ferrero, J., et al. First-in-human, double-blind, placebo-controlled, single-dose escalation study of aducanumab (BIIB037) in mild-to-moderate Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia Translational Research & Clinical Interventions. 2 (3), 169-176 (2016).
- Poon, C. H., Wang, Y., Fung, M. L., Zhang, C., Lim, L. W. Rodent models of amyloid-beta feature of Alzheimer's disease: development and potential treatment implications. Aging and Disease. 11 (5), 1235-1259 (2020).
- Christensen, A., Pike, C. J. Staining and quantification of beta-amyloid pathology in transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Methods in Molecular Biology. 2144, 221 (2020).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (11), 4501-4506 (2009).
- Song, Z., et al. Detecting amyloid-beta accumulation via immunofluorescent staining in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Visualized Experiments. (170), e62254 (2021).
- Sun, J., et al. Hematologic safety of chronic brain-penetrating erythropoietin dosing in APP/PS1 mice. Alzheimer's & DementiaTranslational Research & Clinical Interventions. 5, 627-636 (2019).
- Jankowsky, J. L., et al. Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Human Molecular Genetics. 13 (2), 159-170 (2004).
- Grant, M. K. O., et al. Human cerebrospinal fluid 6E10-immunoreactive protein species contain amyloid precursor protein fragments. PloS One. 14 (2), 0212815 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Eichenbaum, K. D., et al. Minimally invasive method for murine brain fixation. Biotechniques. 39 (4), 487-490 (2005).
- Chang, R., et al. Blood-brain barrier penetrating biologic tnf-alpha inhibitor for Alzheimer's disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (7), 2340-2349 (2017).
- Pinskiy, V., et al. High-throughput method of whole-brain sectioning, using the tape-transfer technique. PloS One. 10 (7), 0102363 (2015).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments. (162), e61622 (2020).
- van Stralen, K. J., Dekker, F. W., Zoccali, C., Jager, K. J. Measuring agreement, more complicated than it seems. Nephron Clinical Practice. 120 (3), 162-167 (2012).
