Summary
Detta protokoll beskriver och jämför proceduren för att utföra en fullständig region- eller subregion av intresseanalys av sagittala mushjärnsektioner för att kvantifiera amyloid-beta-belastning i APP / PS1 transgen musmodell av Alzheimers sjukdom.
Abstract
Extracellulär ackumulering av amyloid-beta (Aβ) plack är ett av de viktigaste patologiska kännetecknen för Alzheimers sjukdom (AD), och är målet för den enda FDA-godkända sjukdomsmodifierande behandlingen för AD. Följaktligen används användningen av transgena musmodeller som överuttrycker amyloidprekursorproteinet och därmed ackumulerar cerebrala Aβ-plack i stor utsträckning för att modellera human AD hos möss. Därför mäter immunanalyser, inklusive enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) och immunfärgning, vanligtvis Aβ-belastningen i hjärnvävnader härledda från AD-transgena möss. Även om metoderna för Aβ-detektion och kvantifiering har varit väl etablerade och dokumenterade, har effekten av storleken på det intresseområde som valts i hjärnvävnaden på Aβ-belastningsmätningar efter immunfärgning inte rapporterats. Därför syftade det nuvarande protokollet till att jämföra Aβ-belastningsmätningarna över de fullständiga och delregionerna av intresse med hjälp av en bildanalysprogramvara. Stegen som är involverade i hjärnvävnadsberedning, fritt flytande hjärnsektionsimmunfärgning, avbildning och kvantifiering av Aβ-belastning i full- kontra subregioner av intresse beskrivs med hjälp av hjärnsektioner härledda från 13 månader gamla APP / PS1 dubbeltransgena hanmöss. Det aktuella protokollet och resultaten ger värdefull information om effekten av storleken på regionen av intresse på Aβ-positiv areakvantifiering och visar en stark korrelation mellan det Aβ-positiva området som erhållits med hjälp av full- och delregionerna av intresseanalyser för hjärnsektioner härledda från 13 månader gamla manliga APP / PS1-möss som visar utbredd Aβ-deposition.
Introduction
Alzheimers sjukdom (AD), den sjätte ledande dödsorsaken i USA, fortsätter att vara ett hot mot folkhälsan, med uppskattningsvis 6.2 miljoner amerikaner som lever med AD. Detta förväntas uppgå till 13,8 miljoner år 20601. Hittills är symptomatisk hantering genom läkemedel som kolinesterashämmare och memantin den primära behandlingsförloppet2. AD kännetecknas av neuropatologiska manifestationer såsom extracellulär avsättning av amyloid-beta (Aβ) plack och intracellulär hyperfosforylerad tau-ackumulering i form av neurofibrillära trassel 3,4. Bildad av endoproteolytisk klyvning av amyloidprekursorproteinet (APP) via beta- och gammasekretas, Aβ-aggregat för att bilda oligomerer och fibriller, vilket leder till neurotoxiska effekter5. Aβ har antagits tjäna en primär patologisk roll sedan 1980-talet och är det terapeutiska målet för den enda FDA-godkända sjukdomsmodifierande terapin för AD6. Som ett resultat har transgena AD-musmodeller som innehåller mutationer i gener som resulterar i robust cerebral Aβ-ackumulering använts i stor utsträckning för preklinisk AD-forskning sedan början av 1990-talet7.
Detektion av Aβ-arter i dessa AD-transgena mushjärnor görs vanligtvis med hjälp av två immunanalyser: enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) och immunfärgning. Den tidigare analysen möjliggör kvantitativ bestämning av olika Aβ-arter och är mindre tidskrävande jämfört med immunfärgning, vilket kräver flera sekventiella vävnadsbehandlings- och avbildningssteg, inklusive vävnadssnitt, immunfärgning, avbildning och kvantifiering8. Vidare är resultaten erhållna efter immunfärgning semikvantitativa8. Förmågan att rumsligt lokalisera Aβ gör emellertid immunfärgning till ett attraktivt tillvägagångssätt för Aβ-detektion i hjärnvävnader8.
Vid användning av Aβ-immunfärgning har flera olika kvantifieringsparadigmer använts av olika forskargrupper. Till exempel kvantifierar vissa forskargrupper Aβ-belastningen i hela regionen av intresse (cortex eller hippocampus), medan andra kvantifierar Aβ-belastningen i en specificerad delregion av intresse (en del av cortex eller hippocampus)9,10,11. Även om metoderna för Aβ-detektion och kvantifiering har varit väl etablerade och dokumenterade, har effekten av storleken på det intressanta området på Aβ-belastningsmätningar efter immunfärgning inte rapporterats. Därför syftade det nuvarande protokollet till att jämföra Aβ-belastningsmätningarna över de fullständiga och delregionerna av intresse med hjälp av en bildanalysprogramvara, ImageJ.
Den aktuella studien använde 13 månader gamla APP / PS1 dubbeltransgena hanmöss, som uttrycker en chimär mus / mänsklig APP och en mutant presenilin 1, för att modellera tidig debut av AD12. Aβ-avlagringar börjar utvecklas vid 6-7 månaders ålder, och riklig Aβ-ackumulering observeras både i cortex och hippocampus hos dessa möss vid 9-10 månaders ålder12. De transgena amyloidpeptiderna och holoproteinet kan detekteras med 6E10-immunfärgning13, vilket gör det till en önskvärd djurmodell för detta protokoll. Förfarandet som behandlas häri inkluderar beredning av hjärnvävnad, immunfärgning av fritt flytande sektioner, avbildning och kvantifiering av Aβ-belastning i full- kontra delregioner av intresse. Analysen visar en stark korrelation mellan den fullständiga och subregionala kvantifieringen, vilket indikerar robust överensstämmelse mellan dessa två metoder i hjärnvävnadssektionerna härledda från 13 månader gamla APP / PS1-hanmöss som visar rikliga Aβ-avlagringar.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med University Laboratory Animal Resources enligt protokoll som godkänts av University of California, Irvine, Institutional Animal Care and Use Committee. Experimenten utfördes med manliga B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (APP/PS1) möss (13 månader gamla, n = 35). Mössen erhölls från kommersiella källor (se materialtabell).
1. Förberedelse av hjärnvävnad
- Bedöva mössen med en dödlig dos av ett fenytoin/pentobarbitalbaserat bedövningsmedel (150 mg/kg) injicerat intraperitonealt (se materialtabell) enligt godkända djurprotokoll. Utför hjärtperfusion med iskall fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) i 5 min med en hastighet av 5 ml / min för att rensa hjärnkärlen14.
- Skörda hjärnvävnad enligt den tidigare publicerade rapporten15, separera i vänster och höger hjärnhalva och placera den högra hemi-hjärnan hos varje mus i ett 15 ml koniskt rör innehållande 5 ml nyberedd 4% paraformaldehydlösning (PFA) i 1x PBS i 72 timmar vid 4 °C.
OBS: Hjärnorna kan vara nedsänkningsfixerade från 24-72 timmar beroende på antigenet som studeras. Den vänstra hemi-hjärnan, utan lillhjärnan, kan snäppfrysas i flytande kväve och sedan lagras vid -80 °C, följt av bearbetning för biokemiska analyser såsom ELISA och biokemisk Aβ-detektion16.
VARNING: PFA är sannolikt cancerframkallande, och hudkontakt med PFA kan leda till allergiska hudsymtom. Använd nitril- eller butylhandskar, masker och ögonskydd för att hantera det och förbered dig under en kemisk dragskåp. - Efter inkubation i 4% PFA, inkubera hemi-hjärnorna sekventiellt i 5 ml av 10%, 20% och 30% sackaroslösningar beredda i 1x PBS i 24 timmar, var och en vid 4 °C tills hjärnvävnaden sjunker till botten av det koniska röret.
- Efter inkubation i 30% sackaroslösningen, ta bort hemi-hjärnan, badda försiktigt hjärnan på ett filterpapper för att ta bort överskottet av sackaroslösning och frys den fasta hemi-hjärnan i pulveriserad torris i 30 minuter. Förvara den frusna hemi-hjärnan i väl märkta aluminiumfolier vid -80 °C tills kryosektion.
OBS: I det nuvarande protokollet lagrades hemi-hjärnorna vid -80 °C i 6-8 månader. - Dela den frusna hemi-hjärnan i 20 μm tjocka sektioner med hjälp av en kryostat (se materialtabell).
OBS: För det nuvarande protokollet delades hemi-hjärnorna i sagittala sektioner, och vid behov kan koronala sektioner också förberedas17. Steg 2 är för Aβ-immunofluorescerande färgning på fasta och kryoskyddade hjärnvävnadsprover.
2. Immunofluorescens
- Placera de sagittala hjärnvävnadssektionerna (steg 1.5) i en 24-brunnsplatta (upp till sex mushjärnsektioner per 300 μL per brunn). Tvätta i 5 min med 1x PBS tre gånger vid rumstemperatur (23 °C) genom att placera plattan på en shaker med försiktig virvling.
- Inkubera hjärnvävnadssektionerna med 70% myrsyra i dH20 vid rumstemperatur i 10 min.
VARNING: Myrsyra är frätande, så undvik hud- och ögonkontakt. - Tvätta hjärnvävnadssektionerna i 5 min med dH20 tre gånger vid rumstemperatur.
- Blockera icke-specifik bindning med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 0,3% TritonX 100 (se materialtabell) i 1x PBS vid rumstemperatur i 1 timme.
- Inkubera hjärnvävnadssektionerna med en fluoroformärkt primär antikropp (6E10, se materialtabell) utspädd (1:1000) i 1x PBS innehållande 0,3 % TritonX 100 vid 4 °C i 24 timmar.
OBS: Eftersom den primära antikroppen är fluoroforkonjugerad måste plattan täckas från detta steg och framåt, eller allt arbete måste göras i ett mörkt rum för att bibehålla fluoroforens effektivitet. - Tvätta hjärnvävnadssektionerna i 10 min med 1x PBS tre gånger vid rumstemperatur.
- Montera hjärnvävnadssektionerna på positivt laddade glasskivor (se materialtabell) som är väl märkta (etikettinformation på bilden baseras på önskemål), efter en kort tvätt med dH20 för att ta bort återstående salter. Låt bilderna lufttorka i mörkret.
OBS: Hjärnsektionerna måste monteras försiktigt för att undvika veck och revor, vilket påverkar datakvantifieringen. Vid revor och/eller veck som ligger i det område som är av intresse och kan störa datakvantifieringen rekommenderas omfärgning och ommontering. - Montera hjärnvävnadssektionerna med ett vattenhaltigt monteringsmedium (se materialtabell) och placera glasöverdragen över vävnaden. Försegla ändarna på täckglaset med klart nagellack och förvara objektglasen i en glidlåda vid 4 °C tills de avbildas.
OBS: I det aktuella protokollet avbildades bilderna inom 1 månad efter färgning.
3. Bildbehandling
- Avbilda de 6E10-färgade hjärnsektionerna med hjälp av ett fluorescensmikroskop (epifluorescens eller konfokal) (se materialtabell), som har ett 2x mål att fånga hela hjärnvävnadssektionen i en bild och är utrustad med lämpligt filter (GFP i detta arbete).
Bildinställningarna måste vara konsekventa över olika bilder. - Spara de tagna bilderna som en TIFF-fil eller efter behov och öppna dem i bildanalysprogramvaran (se materialtabell) enligt beskrivningen i steg 4.2 nedan för 6E10-kvantifiering.
OBS: Inkludera en skalstreck innan du tar bilden för att kvantifiera i bildanalysprogramvaran ImageJ.
4. Analys av hela regionen av intresse
OBS: Det nuvarande arbetets två regioner av intresse är hippocampus och iso-cortex. Analys av full region av intresse representerar analysen av hela iso-cortex (kallad cortex framöver) eller hippocampus i den avbildade hjärnvävnadssektionen.
- Ladda ner bildanalysprogramvaran (se materialtabell) och starta programvaran när den är installerad.
- När programvaran körs klickar du på File | Öppna | Välj den bild som ska analyseras.
- Klicka på Analysera | Ställ in skala| Klicka för att ta bort skalan. Välj verktyget Straight från programvaruverktygsfältet och rita en rak linje längs skalstreckets längd. Klicka på Analysera | Mät. Notera skalstreckets längd eller avstånd i pixlar. Klicka på Analysera | Ställ in skala.
- I popup-fönstret anger du avståndet i pixlar, det kända avståndet för skalstrecket (i μm i det här fallet) och längdenheten som μm. Markera Global för att tillämpa den nya skalningsinställningen på alla följande bilder om flera bilder bearbetas. Klicka på OK för att tillämpa inställningarna.
OBS: Det rekommenderas alltid att kontrollera om den exakta skalan tillämpas på bilden innan ytterligare analys.
- I popup-fönstret anger du avståndet i pixlar, det kända avståndet för skalstrecket (i μm i det här fallet) och längdenheten som μm. Markera Global för att tillämpa den nya skalningsinställningen på alla följande bilder om flera bilder bearbetas. Klicka på OK för att tillämpa inställningarna.
- För att ställa in önskad mätning till området i avsnittet, gå till Analysera | Ställ in mått | Markera rutorna Område och Visa etikett. Kontrollera att bilden som analyseras är markerad under Omdirigera till.
- För att underlätta hippocampus eller cortex visualisering, gå till Bild | Justera | Ljusstyrka/kontrast. Dra skjutreglaget Maximalt gradvis åt vänster för att öka vävnadens klarhet tills hjärnregionerna av intresse kan identifieras.
Använd inte den här inställningen för att undvika falska mätningar under analysen, fortsätt istället till nästa steg. - Använd polygonmarkeringen eller markeringsverktyget på frihand för att beskriva hippocampusregionen. Klicka på alternativet Återställ för inställningarna för ljusstyrka / kontrast när hippocampus har beskrivits för att återgå till den ursprungliga ljusstyrkan.
OBS: Stegen måste upprepas separat för det kortikala området. - För att mäta den totala vävnadsarean i den valda regionen, klicka på Redigera | Rensa utanför. När den valda regionen är den enda bilden på skärmen klickar du på Analysera | Mät för att få det totala vävnadsområdet analyserat i ett popup-fönster. Spara data i en Excel-fil för senare användning.
- För att mäta det 6E10-positiva området, gå till Bild | Justera | Färgtröskel. Ett färdigt filter under tröskelmetoden ger vanligtvis önskat resultat som markerar de starkaste signalerna i rött.
OBS: Det optimala tröskelvalet beror på bildens bakgrund och färgningsintensiteten. Välj en tröskelinställning som tar upp fläcken och inte bakgrunden. - När du har valt lämplig tröskel markerar du Mörk bakgrund. Detta kommer att markera Aβ-fläckarna (fläcken av intresse) på en svart bakgrund. Klicka på Välj | Ursprunglig | Välj, ge de mörka signalerna (Aβ-avlagringarna) på en vit bakgrund. Klicka på Analysera | Analysera partiklar och klicka på OK när popup-fönstret genererar.
- Kopiera sammanfattningen som genereras av programvaran genom att klicka på Redigera | Kopiera. Klistra in i den tidigare startade Excel-filen med respektive etiketter. Detta är det 6E10-positiva området i de valda regionerna av intresse (antingen hippocampus eller cortex).
OBS: I Excel kommer det att finnas en kolumn för det totala 6E10-positiva området (steg 4.10) och det totala vävnadsområdet (steg 4.7). - Beräkna det 6E10-positiva området (%) enligt följande16: (Totalt 6E10-positivt område / Totalt analyserat vävnadsarea) x 100.
5. Analys av delområden av intresse
OBS: Subregion av intresseanalys representerar analysen av en del av cortex eller hippocampus i den avbildade hjärnvävnadssektionen.
- Ladda ner bildanalysprogramvaran och starta programvaran när den är installerad.
- När programvaran körs klickar du på File | Öppna | Välj den bild som ska analyseras.
- Klicka på Analysera | Ställ in skala| Klicka för att ta bort skalan. Välj verktyget Straight i verktygsfältet och rita en rak linje längs skalstreckets längd. Klicka på Analysera | Mät. Notera skalstreckets längd eller avstånd i pixlar. Klicka på Analysera | Ställ in skala.
- I popup-fönstret anger du avståndet i pixlar, det kända avståndet för skalstrecket (i μm i det här fallet) och anger längdenheten som μm. Markera Global för att tillämpa den nya skalningsinställningen på alla följande bilder om flera bilder bearbetas. Klicka på OK för att tillämpa inställningarna.
OBS: Det rekommenderas alltid att kontrollera om den exakta skalan tillämpas på bilden innan ytterligare analys.
- I popup-fönstret anger du avståndet i pixlar, det kända avståndet för skalstrecket (i μm i det här fallet) och anger längdenheten som μm. Markera Global för att tillämpa den nya skalningsinställningen på alla följande bilder om flera bilder bearbetas. Klicka på OK för att tillämpa inställningarna.
- För att ställa in önskad mätning till området i avsnittet, gå till Analysera | Ställ in mått | markera rutorna Område och Visa etikett. Kontrollera att bilden som analyseras är markerad under Omdirigera till.
- Justera ljusstyrkan och kontrasten om bilden är för svag och hjärnregionerna (t.ex. hippocampus eller cortex i detta fall) inte lätt kan identifieras. Använd programvarans verktygsfält och klicka på Image | Justera | Ljusstyrka/kontrast och dra skjutreglagen Maximalt åt vänster efter behov för att öka vävnadens synlighet.
Använd inte den här inställningen för att undvika falska mätningar under analysen, fortsätt istället till nästa steg. - Använd rektangelverktyget och välj det område som är av intresse i cortex eller hippocampus. Använd verktygsfältet och klicka på Redigera | Urval | Ange, ändra höjd och bredd till ett fördefinierat värde. Justera lådan så att den är helt täckt av vävnad. Återställ ljusstyrkan / kontrasten för att återgå till den ursprungliga ljusstyrkan.
Storleken på rutan som används för att välja de intressanta regionerna måste vara konsekvent för alla bilder. För den aktuella analysen var rutans storlek antingen 300 pixlar x 300 pixlar (motsvarande 1177 μm x 1177 μm) eller 400 pixlar x 200 pixlar (motsvarande 1569 μm x 784 μm). - Duplicera den valda regionen av intresse genom att högerklicka på rutan och klicka på Duplicera. Ett nytt fönster med den valda regionen öppnas. Byt namn på den duplicerade bilden för att visa regionen den ligger i (t.ex. cortex eller hippocampus).
- Justera den duplicerade bildtypen genom att använda verktygsfältet och klicka på Bild | Typ | 8-bitars för att konvertera den duplicerade RGB-bilden till 8-bitars för att bäst analysera placken. Invertera bilden genom att klicka på Redigera | Invertera.
- För att mäta det 6E10-positiva området, gå till Bild | Justera | Tröskel. Ett fördefinierat filter under tröskelmetoden ger vanligtvis önskat resultat genom att markera de starkaste signalerna i rött.
OBS: Det optimala tröskelvalet beror på bildens bakgrund och färgningsintensiteten. Välj en tröskelinställning som tar upp fläcken och inte bakgrunden. - När du har valt lämpligt tröskelvärde väljer du Tillämpa.
- För att analysera det 6E10-positiva området, använd verktygsfältet och klicka på Analysera | Analysera partiklar och se till att "Sammanfatta resultat" kontrolleras.
- Kopiera sammanfattningsutdata med % Area som genereras av programvaran genom att klicka på Redigera | Kopiera. Klistra in i den tidigare startade Excel-filen med respektive etiketter.
- Upprepa steg 5.3-5.12 för de olika regionerna i vävnaden. Se till att placeringen av varje ruta för att beskriva det intressanta området är konsekvent mellan varje bild.
OBS: Rotationsverktyget kan användas om rektangelns verktygslådans dimensioner inte kan passa in i det angivna området på grund av vävnadskrökning. - För att rotera rektangeln, använd verktygsfältet och klicka på Redigera | Urval | Rotera och justera rotationsgraden efter behov. Duplicera bilden som nämns i steg 5.7 och rensa utsidan genom att använda verktygsfältet och klicka på Redigera | Rensa utsidan, vilket rensar 6E10-fläckarna utanför den angivna rektangeln. Fortsätt med steg 5.8 som beskrivs ovan.
Representative Results
Här jämförs två olika metoder för att kvantifiera det 6E10-positiva området i hippocampus och cortex i musens hjärnvävnader. De två metoderna är analyserna av hela regionen och delregionen av intresse (figur 1). Analysen av hela regionen av intresse, som namnet antyder, innebär att man beskriver hela regionen av intresse (i detta fall antingen iso-cortex eller hippocampus) för att bestämma det 6E10-positiva området (figur 1A, B). Analysen av delregionen av intresse innebär att man väljer en fördefinierad region inom det intressanta området för att bestämma det 6E10-positiva området (figur 1C,D). Det stegvisa ImageJ-protokollet för de två metoderna visas i figur 2, bild 3 och bild 4.
Denna studie använde tre läsare; två oberoende läsare utförde delregionen av intresseanalys, och den tredje läsaren utförde analysen av hela regionen av intresse. Som framgår av figur 5A,B fanns det en stark signifikant positiv korrelation (p < 0,0001) mellan det 6E10-positiva området som rapporterades av de två läsarna som utförde analysen av delregionen av intresse (Pearson korrelationskoefficient r = 0,97 för cortex och r = 0,96 för hippocampus). De 6E10-positiva områden som rapporterades av de två läsarna för analysen av delregionen av intresse var i genomsnitt, och den genomsnittliga delregionen av intresse 6E10-positivt område delade en stark signifikant positiv korrelation (p < 0,0001) med det 6E10-positiva området som erhölls med hjälp av analysen av hela regionen av intresse för båda cortex (Pearson-korrelationskoefficienten r = 0,96; Figur 5C) och hippocampus (Pearson korrelationskoefficient r = 0, 95; Figur 5D). Det genomsnittliga kortikala och hippocampus-6E10-positiva området som erhölls genom analyserna av hela regionen och delregionen av intresse var jämförbara utan någon signifikant skillnad, vilket bekräftade överensstämmelsen mellan de två metoderna (figur 5E). Vidare mättes det olösliga Aβ1-42 i homogenater i hela hjärnan i en delmängd av möss och det kortikala (figur 5F) och hippocampala (figur 5G) 6E10-positiva området bestämt av analysen av hela regionen av intresse var signifikant (p < 0,01) korrelerat med olöslig Aβ1-42-belastning med elisa (se materialtabell).
Bild 1: Val av fullständigt kontra underområde av intresse. Representativa bilder som visar hela iso-cortex (cortex) och hippocampus som beskrivs för analysen av hela regionen av intresse i (A) respektive (B). Representativa bilder visar valet av underregion/er i cortex och hippocampus för subregionen av intresseanalys i (C) respektive (D). Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Protokoll för hela regionen av intresse 6E10-positiv arealkvantifiering. Bildanalyssteg som visar originalbilden (A), bilden efter justering av ljusstyrka/kontrast (B), val av intresseområde (C), rensning (D), tröskeljustering (E) och den slutliga bilden redo för analys (F). Siffrorna i figuren anger stegnumren i protokollet. Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Protokoll för delregionen av intresse 6E10-positiv arealkvantifiering. Bildanalyssteg som visar originalbilden (A), bilden efter justering av ljusstyrka/kontrast (B), val av intresseområde (C), duplicering av bilden av intresseområdet (D), ändring av bilden till 8-bitars och invertering av bilden (E), tröskeljustering (F) och slutlig bild redo för analys (G). Siffrorna i figuren anger stegnumren i protokollet. Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Protokoll för rotationsområdet för intresseområdet. Bildanalyssteg som visar valet av intresseområde och rotation av markeringsrutan för att passa vävnadskrökningen (A), bilden av intresseområdet efter duplicering (B) och bilden efter att ha rensat det yttre (icke-regionen av intresse) (C). Siffrorna i figuren anger stegnumret i protokollet. Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Korrelation mellan analyserna av hela och delregionerna av intresse. Spridningsdiagram visar korrelationen mellan det 6E10-positiva området av de två oberoende läsarna som utför subregionen av intresseanalys för cortex (A) och hippocampus (B). En stark positiv korrelation observeras mellan det 6E10-positiva området som härrör från subregionen av intresseanalys och analysen av hela regionen av intresse för både cortex (C) och hippocampus (D). Det finns ingen statistiskt signifikant skillnad i det genomsnittliga 6E10-positiva området av hela intresseregionen och subregionen av intresseanalyser i cortex och hippocampus (E). En signifikant korrelation observeras mellan hela hjärnans homogenat olösliga Aβ1-42-mätningar med ELISA och analysen av hela regionen av intresse för både cortex (F) och hippocampus (G). Data analyserades med hjälp av Pearson-korrelationskoefficienten, r, i (A-D) och (F-G), och med hjälp av tvåvägs upprepade mått ANOVA i (E) med hjälp av en graf- och statistikprogramvara. Data presenteras som medelvärde ± standardfelet för medelvärdet (SEM) av n = 35 möss i (E), och ett tvåsidigt p -< 0,05 ansågs statistiskt signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Protokollet som beskrivs här beskriver proceduren för hemi-hjärnberedning för sagittal sektionering, immunofluorescerande färgning av Aβ-avlagringar med användning av 6E10-antikroppen på fritt flytande sektioner, avbildning av de Aβ-färgade hjärnsektionerna följt av kvantifiering av Aβ-avlagringarna i cortex och hippocampus av mushjärnvävnad med hjälp av en bildanalysprogramvara. Även om det finns publicerade protokoll för att kvantifiera Aβ-belastning i hjärnvävnadsavsnitt 8,10, beskriver detta protokoll stegen som är involverade i kvantifieringen av Aβ-belastning i hela iso-cortex (kallad cortex) och hippocampus i jämförelse med Aβ-belastningen i en delregion av intresse för cortex och hippocampus, när detta kan önskas. Korrelationen mellan analyserna av hela respektive delregioner av intresse tillhandahålls också.
Det finns flera kritiska steg i protokollet. För det första är det beskrivna protokollet för 20 μm tjocka hjärnvävnadssektioner som utsätts för fritt flytande immunfärgning, vilket resulterar i optimal antikroppspenetration inomvävnadsavsnittet 18. Den fritt flytande tekniken kan kräva att vävnadssektionerna överförs manuellt mellan de olika lösningarna under den immunofluorescerande färgningen och noggrann hantering av vävnadssektionerna under hela proceduren. Detta är särskilt viktigt när vävnadssektionerna är nedsänkta i 70% myrsyralösning för antigenhämtning i det aktuella protokollet, vilket ökar vävnadens bräcklighet för tunna sektioner. Alternativa tillvägagångssätt för det beskrivna protokollet inkluderar användning av tjockare vävnadssektioner (t.ex. 30-40 μm) eller användning av vävnadssektioner som är direkt monterade på positivt laddade objektglas före immunofluorescerande färgning. För det andra använder protokollet som beskrivs häri en fluorescerande märkt 6E10-antikropp. Förutom att använda den fluorescerande märkta 6E10-antikroppen kan icke-fluorescerande 6E10-antikroppar (t.ex. pepparrotsperoxidaskonjugerad 6E10-antikropp) också användas för att detektera Aβ-belastning i hjärnvävnadssektioner, och det nuvarande protokollet kan anpassas för att kvantifiera Aβ-positiva immunokemiska fläckar i hjärnvävnadssektionerna som beskrivits tidigare8 . För det tredje kommer noggrannheten i resultaten för Aβ-belastningskvantifiering att bero på lämpligt tröskelval i analysprogramvaran, vilket är beroende av vävnadsbakgrunden och signalintensiteten. Valet av tröskelvärde skall göras av slutanvändaren så att endast Aβ-positiva fläckar väljs ut för kvantifiering. Slutanvändarens ingripande krävs för att optimera det specifika tröskelvärdet som kan tillämpas på alla bilder för att säkerställa noggrannheten i tröskelinställningen. För det fjärde, eftersom analysen av delregionen av intresse kräver att man väljer en liten region av intresse i vävnadssektionen, användes två oberoende läsare för denna analys. För att upprätthålla oberoende och blindning under datainsamlingen var alla bilder nummerkodade; bildanalyssekvensen randomiserades mellan läsarna så att de olika läsarna analyserade olika bilder vid varje given tidpunkt, och data skickades in i slutet av varje vecka. På grund av den ökade sannolikheten för inter-reader-variabilitet i regionen av intresseval i underregionen av intresseanalys, utbildades läsarna med flera provbilder för att optimera regionval i cortex och hippocampus innan datainsamlingen påbörjades. Denna utbildning är avgörande för att minska variationen mellan läsare, och som framgår (figur 5A,B) visar det 6E10-positiva området som rapporterats av båda läsarna en stark relativ överenskommelse i den aktuella studien.
Det nuvarande protokollet och resultaten ger värdefull information om effekten av regionen av intressestorlek på Aβ-positiv arealkvantifiering. En större region av intresse förväntas representera vävnaden mer än en mindre region av intresse. Därför är provtagning av en större vävnad önskvärt för att exakt kvantifiera Aβ-belastningen i vävnader. Vid homogen Aβ-belastningsfördelning i vävnaden anses emellertid en mindre provtagningsregion i allmänhet vara en bra representation av den större vävnad som analyseras. De aktuella studieresultaten bekräftar detta, och Aβ-belastningen i hela cortex och hippocampus var ett starkt korrelat av Aβ-belastning i en utvald delregion av cortex och hippocampus (Figur 5C, D). För att ytterligare bekräfta överensstämmelsen mellan analyserna av full- och delregioner av intresse jämfördes det genomsnittliga 6E10-positiva området i cortex och hippocampus, och ingen skillnad mellan de två metoderna (figur 5E) hittades. Detta bekräftar att någon av dessa metoder (fullständig eller delregionanalys) ger jämförbara Aβ-belastningsmätningar.
Det nuvarande protokollet har vissa begränsningar. De två metoderna (analys av hela regionen kontra delregionen) kanske inte alltid används omväxlande. Valet att använda hela eller delregionanalysen beror på den regionala fördelningen av Aβ i vävnaden, vilket påverkas av ålder, kön och stam av AD-musmodellen. Vid 13 månader fördelas Aβ-belastningen över cortex och hippocampus hos APP/ PS1-mössen. Men vid 6 månader är Aβ-avlagringar begränsade till cortex, och minimala avlagringar observeras i hippocampus12. Under sådana förhållanden kan analysen av hela regionen av intresse vara det önskade tillvägagångssättet för att öka vävnadsprovtagningsområdet och därmed Aβ-signalen. Å andra sidan kan subregionanalys vara den metod som valts när Aβ-belastning i en specifik hjärnregion är av intresse (t.ex. den somatosensoriska cortexen). Dessutom, vid 13 månader, visar APP / PS1-hanmössen intensiva 6E10-positiva fläckar, och den immunofluorescerande färgningen resulterar i en utmärkt signal med en mycket låg bakgrund, vilket gör det nuvarande protokollet mycket lämpligt för kvantifiering under de givna förhållandena. Det är oklart om denna kvantifieringsmetod kan tillämpas framgångsrikt på mindre intensiv färgning, och framtida arbete kommer att krävas för att svara på denna fråga. Den immunofluorescerande och bildkvantifieringsmetod som presenteras häri detekterar alla former av Aβ, inklusive prekursorformen13. Som ett resultat, om det finns ett intresse för detektion av en specifik Aβ-specie (t.ex. Aβ1-40 eller Aβ1-42), kan antikroppar specifika för dessa Aβ-isoformer användas. Därför, även om 6E10 immunofluorescerande färgnings- och detektionsmetod korrelerade med mätningarna av Aβ1-42-mätningar i homogenater i hela hjärnan med ELISA (figur 5F, G), var korrelationen endast blygsam. Detta kan hänföras till mätningen av endast Aβ1-42 med elisa och detektion av alla Aβ-arter med användning av 6E10-immunfärgningen. I den aktuella studien används tre läsare för att bedöma överensstämmelsen och korrelationen mellan de fullständiga och subregionala analyserna. Att ha ytterligare läsare kan förbättra studiens robusthet och kan ytterligare validera överenskommelserna mellan de två metoderna som presenteras här. Vidare använder vi Pearson-korrelationen som ett mått på överenskommelse, som ofta används bland andra metoder för att beskriva överensstämmelsen mellan kontinuerliga variabler19. En begränsning med att använda Pearson-korrelationen för att bestämma överenskommelse är dock att de två metoderna som används häri kan ge relaterade resultat, men en metod kan resultera i totalt sett högre värden än den andra på grund av systematisk bias. Därför är Pearson-korrelation ett bra mått på relativ överenskommelse19. För att öka protokollets robusthet kan ytterligare metoder för att bekräfta den absoluta överenskommelsen, såsom att jämföra det genomsnittliga 6E10-positiva området med de två metoderna (figur 5E), användas19. Sammantaget jämför det nuvarande protokollet Aβ-belastningen som detekteras genom immunofluorescerande färgning och analyserar de fullständiga och delregionerna av intresse i hjärnvävnadssektioner. Resultaten visar en stark korrelation mellan dessa två metoder för hjärnvävnadssektioner härledda från 13 månader gamla APP / PS1-hanmöss som visar rikliga Aβ-avlagringar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes av National Institute of Aging vid National Institutes of Health under tilldelningsnummer R01AG062840 (till RKS) och R01AG072896 (till RKS). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health. Cirka $ 200k (100%) av federala medel stödde detta projekt. Vi vill också tacka Dr. Joshua Yang för hans hjälp med manuskriptredigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML |
References
- Alzheimer's Association. 2021 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimer's & Dementia. 17 (3), 327-406 (2021).
- Langa, K. M., Foster, N. L., Larson, E. B. Mixed dementia: emerging concepts and therapeutic implications. Journal of the American Medical Association. 292 (23), 2901-2908 (2004).
- Gandy, S., DeKosky, S. T. Toward the treatment and prevention of Alzheimer's disease: rational strategies and recent progress. Annual Review of Medicine. 64, 367-383 (2013).
- Bloom, G. S. Amyloid-beta and tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis. JAMA Neurology. 71 (4), 505-508 (2014).
- Gremer, L., et al. Fibril structure of amyloid-beta(1-42) by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6359), 116-119 (2017).
- Ferrero, J., et al. First-in-human, double-blind, placebo-controlled, single-dose escalation study of aducanumab (BIIB037) in mild-to-moderate Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia Translational Research & Clinical Interventions. 2 (3), 169-176 (2016).
- Poon, C. H., Wang, Y., Fung, M. L., Zhang, C., Lim, L. W. Rodent models of amyloid-beta feature of Alzheimer's disease: development and potential treatment implications. Aging and Disease. 11 (5), 1235-1259 (2020).
- Christensen, A., Pike, C. J. Staining and quantification of beta-amyloid pathology in transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Methods in Molecular Biology. 2144, 221 (2020).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (11), 4501-4506 (2009).
- Song, Z., et al. Detecting amyloid-beta accumulation via immunofluorescent staining in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Visualized Experiments. (170), e62254 (2021).
- Sun, J., et al. Hematologic safety of chronic brain-penetrating erythropoietin dosing in APP/PS1 mice. Alzheimer's & DementiaTranslational Research & Clinical Interventions. 5, 627-636 (2019).
- Jankowsky, J. L., et al. Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Human Molecular Genetics. 13 (2), 159-170 (2004).
- Grant, M. K. O., et al. Human cerebrospinal fluid 6E10-immunoreactive protein species contain amyloid precursor protein fragments. PloS One. 14 (2), 0212815 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Eichenbaum, K. D., et al. Minimally invasive method for murine brain fixation. Biotechniques. 39 (4), 487-490 (2005).
- Chang, R., et al. Blood-brain barrier penetrating biologic tnf-alpha inhibitor for Alzheimer's disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (7), 2340-2349 (2017).
- Pinskiy, V., et al. High-throughput method of whole-brain sectioning, using the tape-transfer technique. PloS One. 10 (7), 0102363 (2015).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments. (162), e61622 (2020).
- van Stralen, K. J., Dekker, F. W., Zoccali, C., Jager, K. J. Measuring agreement, more complicated than it seems. Nephron Clinical Practice. 120 (3), 162-167 (2012).
