Summary
本プロトコールは、アルツハイマー病のAPP/PS1トランスジェニックマウスモデルにおけるアミロイドβ負荷を定量するために、矢状マウス脳切片の全領域またはサブ領域の関心分析を実行する手順を記載および比較する。
Abstract
アミロイドβ(Aβ)プラークの細胞外蓄積は、アルツハイマー病(AD)の主要な病理学的特徴の1つであり、ADに対する唯一のFDA承認疾患修飾治療の標的である。 したがって、アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現し、それによって脳Aβプラークを蓄積するトランスジェニックマウスモデルの使用は、マウスにおけるヒトADをモデル化するために広く使用されている。したがって、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)および免疫染色を含む免疫アッセイは、一般に、ADトランスジェニックマウスに由来する脳組織におけるAβ負荷を測定する。Aβの検出および定量のための方法は十分に確立され、文書化されているが、脳組織において選択された関心領域のサイズが免疫染色後のAβ負荷測定に及ぼす影響は報告されていない。したがって、現在のプロトコルは、画像解析ソフトウェアを使用して、関心の全領域およびサブ領域にわたるAβ負荷測定値を比較することを目的としていました。脳組織調製、自由浮遊脳切片免疫染色、イメージング、および関心の完全領域対サブ領域におけるAβ負荷の定量化に関与するステップは、生後13ヶ月のAPP/PS1二重トランスジェニック雄マウスに由来する脳切片を用いて記載されている。現在のプロトコルと結果は、Aβ陽性領域の定量に対する関心領域の大きさの影響に関する貴重な情報を提供し、広範なAβ沈着を示す生後13ヶ月の雄APP/PS1マウス由来の脳切片の完全およびサブ関心領域分析を用いて得られたAβ陽性領域間に強い相関関係を示す。
Introduction
アルツハイマー病(AD)は、米国における死因の第6位であり、公衆衛生上の脅威であり続けており、推定620万人のアメリカ人がADとともに暮らしています。これは2060年までに1380万人に達すると予想されています1。今日まで、コリンエステラーゼ阻害剤やメマンチンなどの薬物療法による対症療法は、治療の主な経過です2。ADは、アミロイドβ(Aβ)プラークの細胞外沈着および神経原線維もつれの形態での細胞内過リン酸化タウ蓄積などの神経病理学的症状によって特徴付けられる3、4。β-およびγ-セクレターゼ を介した アミロイド前駆体タンパク質(APP)のタンパク質分解内切断によって形成されるAβ凝集体は、オリゴマーおよび線維を形成し、神経毒性作用5をもたらす。Aβは1980年代から主要な病理学的役割を果たすと仮説されており、AD6に対する唯一のFDA承認の疾患修飾療法の治療標的である。その結果、堅牢な脳Aβ蓄積をもたらす遺伝子に変異を有するトランスジェニックADマウスモデルは、1990年代初頭から前臨床AD研究に広く使用されてきた7。
これらのADトランスジェニックマウス脳におけるAβ種の検出は、一般に、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)および免疫染色の2つの免疫アッセイを用いて行われる。前者のアッセイは、異なるAβ種の定量的決定を可能にし、組織切片化、免疫染色、イメージング、および定量を含むいくつかの逐次組織処理およびイメージングステップを必要とする免疫染色と比較して、より少ない時間である8。また、免疫染色後に得られた結果は半定量的8である。しかし、Aβを空間的に局在化する能力により、免疫染色は脳組織におけるAβ検出のための魅力的なアプローチとなる8。
Aβ免疫染色を使用している間、いくつかの異なる定量パラダイムが異なる研究グループによって採用されてきた。例えば、関心のある領域全体(皮質または海馬)のAβ負荷を定量化する研究グループもあれば、関心のある特定のサブ領域(皮質または海馬の一部)のAβ負荷を定量化する研究グループもあります9,10,11。Aβの検出および定量のための方法は十分に確立され、文書化されているが、免疫染色後のAβ負荷測定に対する関心領域のサイズの影響は報告されていない。したがって、現在のプロトコルは、画像解析ソフトウェアImageJを使用して、関心の全領域とサブ領域にわたるAβ負荷測定値を比較することを目的としていました。
現在の研究では、キメラマウス/ヒトAPPと変異型プレセニリン1を発現する生後13ヶ月のAPP/PS1ダブルトランスジェニック雄マウスを使用して、AD12の早期発症をモデル化した。Aβ沈着物は6〜7ヶ月齢までに発達し始め、12〜9〜10ヶ月齢までにこれらのマウスの皮質および海馬の両方に豊富なAβ蓄積が観察される。トランスジェニックアミロイドペプチドおよびホロタンパク質は、6E10−免疫染色13によって検出することができ、本プロトコールにとって望ましい動物モデルとなる。本明細書でカバーされる手順は、脳組織調製、自由浮遊切片の免疫染色、画像化、および関心のある完全対サブ領域におけるAβ負荷の定量化を含む。この解析は、完全領域定量と亜局所定量の間に強い相関関係を示しており、豊富なAβ沈着を示す生後13ヶ月のAPP/PS1雄マウス由来の脳組織切片において、これら2つの方法の確固たる一致を示している。
Protocol
すべての動物実験は、カリフォルニア大学アーバイン校施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルの下で、大学実験動物資源に準拠して実施されました。実験は、雄のB6C3-Tg(APPswe、PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax(APP/PS1)マウス(生後13ヶ月、n = 35)で行った。マウスを市販の供給源から入手した( 材料表を参照のこと)。
1. 脳組織作製
- 承認された動物のプロトコルに従って腹腔内に注射された致死量のフェニトイン/ペントバルビタールベースの麻酔薬(150mg / kg)( 材料表を参照)を使用してマウスを麻酔する。氷冷リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)で心臓灌流を5mL/minの速度で5分間行い、脳血管系をクリアする14。
- 以前に公表された報告15に従って脳組織を採取し、左脳半球と右脳半球に分離し、各マウスの右半脳を、1x PBS中の5mLの新しく調製した4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を含む15mL円錐管に入れ、4°Cで72時間。
注:脳は、研究されている抗原に応じて、24〜72時間浸漬固定されることがあります。左半脳は、小脳を伴わずに、液体窒素中でスナップ凍結し、次いで−80°Cで保存し、続いてELISAおよび生化学的Aβ検出16などの生化学的アッセイのための処理によって行うことができる。
警告: PFA は発がん性物質の可能性があり、PFA との皮膚接触はアレルギー性皮膚症状を引き起こす可能性があります。ニトリルまたはブチル手袋、マスク、および目の保護具を使用して取り扱い、化学ヒュームフードの下で準備してください。 - 4%PFA中でインキュベートした後、脳組織が円錐管の底に沈むまで、1x PBS中に調製した10%、20%、および30%スクロース溶液を5mL中で24時間、それぞれ4°Cでインキュベートする。
- 30%スクロース溶液中でインキュベートした後、ヘミ脳を除去し、脳を濾紙に軽く叩いて余分なスクロース溶液を除去し、固定ヘミ脳を粉末ドライアイスで30分間凍結した。凍結した半脳を、凍結切除するまで-80°Cでよく標識されたアルミニウム箔に保管する。
注:現在のプロトコルでは、半脳は-80°Cで6〜8ヶ月間保存されました。 - 凍結した半脳をクライオスタットを用いて厚さ20μmの切片に切開する( 材料表参照)。
注:現在のプロトコルでは、半脳を矢状セクションに切片化し、必要に応じて冠状切片を調製することもできる17。ステップ2は、固定および凍結保護された脳組織サンプル上のAβ免疫蛍光染色のためのものである。
2. 免疫蛍光
- 矢状脳組織切片(ステップ1.5)を24ウェルプレート(ウェルあたり300 μLあたり最大6つのマウス脳切片)に入れます。穏やかに旋回するシェーカーの上にプレートを置くことによって室温(23°C)で3回1x PBSで5分間洗浄する。
- 脳組織切片をdH20中の70%ギ酸と共に室温で10分間インキュベートする。
警告: ギ酸は腐食性なので、皮膚やアイコンタクトは避けてください。 - 脳組織切片をdH20で5分間室温で3回洗浄する。
- 0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.3%TritonX 100( 材料表を参照)を1x PBS中で室温で1時間ブロックし、非特異的結合をブロックします。
- 脳組織切片を、0.3% TritonX 100を含む1x PBSで希釈(1:1000)した蛍光色素標識一次抗体(6E10、 材料表を参照)で4°Cで24時間インキュベートする。
注:一次抗体は蛍光色素結合体であるため、このステップ以降はプレートを覆うか、蛍光色素分子の有効性を維持するためにすべての作業を暗室で行う必要があります。 - 脳組織切片を1x PBSで10分間室温で3回洗浄する。
- 脳組織切片を、十分にラベル付けされた正に帯電したスライドガラス(材料表を参照)に取り付け(スライド上のラベル情報は好みに基づいています)、dH2 0で短時間洗浄した後、残りの塩を除去します。スライドを暗闇の中で空気乾燥させます。
注:脳のセクションは、データの定量化に影響を与える折り目や裂け目を避けるために慎重に取り付ける必要があります。関心のある領域にあり、データの定量化を妨げる可能性のある裂け目や折り目がある場合は、再染色と再取り付けをお勧めします。 - 脳組織切片を水性マウント媒体( 材料表を参照)でマウントし、ガラスカバースリップを組織の上に置きます。カバースリップの端を透明なマニキュアでシールし、スライドを4°Cのスライドボックスにイメージングするまで保管します。
注:現在のプロトコルでは、スライドは染色後1ヶ月以内に画像化されました。
3. イメージング
- 6E10染色された脳切片を蛍光(落射蛍光またはコンフォカル)顕微鏡( 材料表参照)を用いて画像化し、脳組織切片全体を1つの画像に捕捉する2倍の対物レンズを有し、適切なフィルター(この作業ではGFP)が装備されている。
メモ: イメージング設定は、スライドごとに一貫している必要があります。 - キャプチャした画像をTIFFファイルとして、または必要に応じて保存し、6E10定量化については、以下のステップ4.2で説明するように、画像解析ソフトウェア( 材料表を参照)で開きます。
メモ:画像解析ソフトウェアImageJで定量化する画像をキャプチャする前にスケールバーを含めてください。
4. 全関心領域分析
注:本研究の関心のある2つの領域は、海馬と等皮質である。関心の全領域分析は、画像化された脳組織切片における等皮質全体(今後皮質と呼ばれる)または海馬の分析を表す。
- 画像解析ソフトウェア( 資料表を参照)をダウンロードし、インストール後にソフトウェアを起動します。
- ソフトウェアが実行されたら、[ファイル|]をクリックします。 オープン|分析する画像を選択します 。
- [|の分析]をクリックします。スケールを設定|クリックしてスケールを削除します。ソフトウェアツールバーから直線ツールを選択し、スケールバーの長さに沿って直線を描画します。[|の分析]をクリックします。測定します。スケールバーの長さまたは距離をピクセル単位でメモします。[|の分析]をクリックします。スケールを設定します。
- ポップアップウィンドウで、距離をピクセル単位、スケールバーの既知の距離(この場合はμm単位)、長さの単位をμmとして入力します。複数の画像が処理される場合に、次のすべての画像に新しい縮尺設定を適用するには、[グローバル] をオンにします。「OK」をクリックして設定を適用します。
注: さらに分析する前に、正確なスケールが画像に適用されているかどうかを常に確認することをお勧めします。
- ポップアップウィンドウで、距離をピクセル単位、スケールバーの既知の距離(この場合はμm単位)、長さの単位をμmとして入力します。複数の画像が処理される場合に、次のすべての画像に新しい縮尺設定を適用するには、[グローバル] をオンにします。「OK」をクリックして設定を適用します。
- 目的の測定値を断面の領域に設定するには、[ |の分析]に進みます。測定値を|に設定する[領域] ボックスと [表示ラベル] ボックスを選択します。分析対象の画像が [ リダイレクト先] で選択されていることを確認します。
- 海馬または皮質の視覚化を容易にするには、 画像||を調整する明るさ/コントラスト。 最大 スライドバーを徐々に左にドラッグして、関心のある脳領域が識別可能になるまで組織の明瞭さを高めます。
メモ: 解析中に誤った測定が行われないようにこの設定を適用せず、次の手順に進みます。 - ポリゴン選択ツールまたはフリーハンド選択ツールを使用して、海馬領域の輪郭を描きます。海馬が元の明るさに戻るように輪郭を描いたら、明るさ/コントラスト設定のリセットオプションをクリックします。
注:皮質領域については、この手順を別々に繰り返す必要があります。 - 選択した領域の総組織面積を測定するには、[ 編集]をクリック|外は澄んでいる。選択した領域が画面上の唯一の画像になったら、[ |を分析]をクリックします。測定 して、ポップアップウィンドウで分析された 総組織面積 を取得します。後で使用するために、データを Excel ファイルに保存します。
- 6E10 陽性領域を測定するには、 画像||を調整する色のしきい値。 しきい値法 の下で事前に作られたフィルタは、通常、最も強い信号を赤で強調表示する望ましい結果を提供します。
注:最適なしきい値の選択は、画像の背景と染色強度によって異なります。背景ではなく、汚れを拾うしきい値設定を選択します。 - 適切なしきい値を選択したら、[背景が 暗い] をオンにします。これにより、黒い背景にAβスポット(目的の汚れ)が強調表示されます。[|の選択]をクリックします。 オリジナル|選択し、白い背景に暗い信号(Aβ堆積物)を与えます。[ |の分析]をクリックします。パーティクルを解析 し、ポップアップ ウィンドウが生成されたら「 OK」 をクリックします。
- ソフトウェアによって生成された要約出力をコピーするには、[ 編集]をクリックして|コピー。以前に開始したExcelファイルにそれぞれのラベルを付けて貼り付けます。これは、選択された関心領域(海馬または皮質のいずれか)における6E10陽性領域である。
注:Excelでは、合計6E10陽性面積(ステップ4.10)と合計組織面積(ステップ4.7)の列があります。 - 6E10陽性面積(%)を以下のように算出する16: (6E10陽性面積合計/解析総組織面積) x 100.
5. サブ関心領域分析
注:サブ関心領域分析は、画像化された脳組織切片における皮質または海馬の一部の分析を表す。
- 画像解析ソフトウェアをダウンロードし、インストールしたらソフトウェアを起動します。
- ソフトウェアが実行されたら、[ファイル|]をクリックします。 オープン|分析する画像を選択します 。
- [|の分析]をクリックします。スケールを設定|クリックしてスケールを削除します。ソフトウェアツールバーから直線ツールを選択し、スケールバーの長さに沿って直線を描画します。[|の分析]をクリックします。測定します。スケールバーの長さまたは距離をピクセル単位でメモします。[|の分析]をクリックします。スケールを設定します。
- ポップアップウィンドウで、距離をピクセル単位で入力し、スケールバーの既知の距離(この場合はμm単位)を入力し、長さの単位をμmとして入力します。複数の画像が処理される場合に、次のすべての画像に新しい縮尺設定を適用するには、[グローバル] をオンにします。「OK」をクリックして設定を適用します。
注: さらに分析する前に、正確なスケールが画像に適用されているかどうかを常に確認することをお勧めします。
- ポップアップウィンドウで、距離をピクセル単位で入力し、スケールバーの既知の距離(この場合はμm単位)を入力し、長さの単位をμmとして入力します。複数の画像が処理される場合に、次のすべての画像に新しい縮尺設定を適用するには、[グローバル] をオンにします。「OK」をクリックして設定を適用します。
- 目的の測定値を断面の領域に設定するには、 分析|測定値を|に設定する「領域」ボックスと「表示ラベル」ボックスを選択します。分析対象の画像が [ リダイレクト先] で選択されていることを確認します。
- 画像が暗すぎて脳領域(この場合は海馬や皮質など)を簡単に識別できない場合は、明るさとコントラストを調整します。ソフトウェアツールバーを使用して、[画像|]をクリックします。 |を調整する明るさ/コントラストを選択し 、必要に応じて 最大 スライダを左にドラッグして、組織の可視性を高めます。
メモ: 解析中に誤った測定が行われないようにこの設定を適用せず、次の手順に進みます。 - 長方形ツールを使用して、皮質または海馬の関心領域を選択します。ツールバーを使用して、[編集]をクリック|選択|高さと幅を事前定義された値に変更して指定します。箱を調整して、ティッシュで完全に覆われるようにします。明るさ/コントラストをリセットして、元の明るさに戻します。
メモ: 関心領域の選択に使用するボックスのサイズは、すべての画像で一貫している必要があります。今回の解析では、ボックスサイズは300ピクセル×300ピクセル(1177μm x 1177μmに相当)または400画素×200画素(1569μm x 784μmに相当)のいずれかであった。 - 選択した関心領域を複製するには、ボックスを右クリックして [複製]をクリックします。選択した地域を含む新しいウィンドウが開きます。複製された画像の名前を変更して、それが位置する領域(例えば、皮質または海馬)を表示する。
- ツールバーを使用して複製された画像の種類を調整し、[画像|] をクリックします。 タイプ | 8ビットは、プラークを最適に分析するために、複製されたRGB画像を8ビットに変換します。[|の編集]をクリックして画像を反転させます 反転します。
- 6E10陽性領域を測定するには、 画像||を調整するしきい値。 しきい値設定メソッド で事前に定義されたフィルターは、通常、最も強い信号を赤で強調表示することによって、望ましい結果を提供します。
注:最適なしきい値の選択は、画像の背景と染色強度によって異なります。背景ではなく、汚れを拾うしきい値設定を選択します。 - 適切なしきい値を選択したら、[ 適用] を選択します。
- 6E10 陽性領域を分析するには、ツールバーを使用して [ |の分析] をクリックします。パーティクルを分析し、「結果を要約」がチェックされていることを確認します。
- ソフトウェアによって生成された%Areaを含むサマリー出力をコピーするには、[編集]|クリックします。コピー。以前に開始したExcelファイルにそれぞれのラベルを付けて貼り付けます。
- 組織内の異なる領域について、手順5.3~5.12を繰り返します。関心領域の輪郭を描く各ボックスの配置が、各画像間で一貫していることを確認します。
メモ: 回転ツールは、組織の曲率のために 長方形ツールボックス の寸法が指定した領域に収まらない場合に使用できます。 - 長方形を回転させるには、ツールバーを使用して[編集] をクリックし|選択|必要に応じて回転 し、回転度を調整します。手順5.7で説明したように画像を複製し、ツールバーを使用して[編集]をクリックして外側をクリア |[外側をクリア] を選択すると、指定した四角形の外側の 6E10 の汚れがクリアされます。上記のステップ 5.8 に進みます。
Representative Results
ここでは、2つの異なる方法を比較して、海馬およびマウス脳組織の皮質における6E10陽性領域を定量化する。2つの方法は、全領域分析とサブ領域関心領域分析です(図1)。全関心領域分析は、その名前が示すように、関心領域全体(この場合は、等皮質または海馬のいずれか)を概説して、6E10陽性領域を決定することを含む(図1A、B)。サブ関心領域分析では、関心領域内で事前に定義された領域を選択して、6E10陽性領域を決定します(図1C、D)。2つの方法のステップワイズImageJプロトコルを図2、図3、および図4に示します。
この研究では、3人の読者を使用しました。2 人の独立したリーダが関心領域のサブ領域分析を実行し、3 番目のリーダが関心領域全体の分析を実行しました。図5A,Bに見られるように、サブ関心領域分析を実施した2人の読者によって報告された6E10陽性領域の間には、強い有意な正の相関(p<0.0001)があった(ピアソン相関係数r=0.97、海馬についてはr=0.96)。関心のあるサブ領域分析について2人の読者によって報告された6E10陽性領域を平均化し、平均化された関心サブ領域6E10陽性領域は、両方の皮質について関心領域全体分析を用いて得られた6E10陽性領域と強い有意な正の相関(p<0.0001)を共有した(ピアソン相関係数r = 0.96;図5C)海馬(ピアソン相関係数r = 0.図5D)。全領域およびサブ領域の関心分析によって得られた平均皮質および海馬-6E10陽性領域は、有意差なく同等であり、2つの方法の一致を確認した(図5E)。また、マウスのサブセットにおける全脳ホモジネートにおいて測定した不溶性Aβ1-42(図5F)および海馬(図5G)の完全関心領域分析により決定された6E10陽性領域は、ELISAを用いた不溶性Aβ1-42負荷と有意に相関していた(p<0.01)(材料表参照)。
図1:対象領域の完全領域とサブ領域の選択 (A)および(B)における全関心領域分析のために概説された完全等皮質(cortex)および海馬を示す代表的な画像は、それぞれである。代表的な画像は、それぞれ(C)および(D)の関心領域分析のための皮質および海馬のサブ領域/sの選択を示す。スケール バー = 200 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:関心領域6E10陽性領域の完全定量化のためのプロトコル。 元の画像(A)、明るさ/コントラスト調整後の画像(B)、関心領域の選択(C)、クリア(D)、しきい値調整(E)、および分析の準備ができている最終画像(F)を示す画像解析ステップ。図の数字は、プロトコルのステップ番号を示しています。スケール バー = 200 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:サブ関心領域6E10陽性領域定量化のためのプロトコル。 元の画像(A)、明るさ/コントラスト調整後の画像(B)、関心領域の選択(C)、関心領域の画像の複製(D)、画像を8ビットに変更して画像を反転(E)、しきい値調整(F)、および解析可能な最終画像(G)を示す画像解析ステップ。図の数字は、プロトコルのステップ番号を示しています。スケール バー = 200 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:関心領域回転のプロトコル 組織曲率に合わせて選択ボックスの関心領域および回転の選択(A)、複製後の関心領域の画像(B)、および外側(非関心領域)領域をクリアした後の画像(C)を示す画像解析ステップ。図の数字は、プロトコルのステップ番号を示しています。スケールバー = 200 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:対象領域全体分析とサブ領域分析の相関関係 散布図は、皮質(A)および海馬(B)について関心領域のサブ領域分析を実行する2つの独立した読影者による6E10陽性領域間の相関関係を示す。皮質(C)と海馬(D)の両方について、サブ関心領域分析と全関心領域分析の結果生じる6E10陽性領域との間に強い正の相関が観察される。皮質および海馬における全関心領域およびサブ関心領域分析による平均6E10陽性領域(E)に統計的に有意な差はない。ELISAを用いた全脳ホモジネート不溶性Aβ1-42測定と、皮質(F)と海馬(G)の両方について全関心領域分析との間に有意な相関が観察される。データは、ピアソン相関係数 r、in(A-D)および(F-G)を用いて分析し、(E)における二元反復測定ANOVAを用いてグラフ化および統計ソフトウェアを用いて分析した。データは、(E)におけるn=35匹のマウスの平均±標準誤差(SEM)の平均として提示され、両側 p <0.05で統計的に有意と考えられた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
本明細書に記載のプロトコールは、矢状切片化のための半脳調製、自由浮遊切片上の6E10抗体を用いたAβ沈着物の免疫蛍光染色、Aβ染色された脳切片の画像化、続いて画像解析ソフトウェアを用いたマウス脳組織の皮質および海馬におけるAβ沈着の定量化のための手順を概説する。脳組織切片8、10におけるAβ負荷を定量化するための公表されたプロトコルがあるが、このプロトコルは、皮質および海馬における関心のあるサブ領域におけるAβ負荷と比較して、アイソ皮質全体(皮質と呼ばれる)および海馬におけるAβ負荷の定量化に関与するステップを記載する。対象領域の完全領域とサブ領域の相関分析も提供されます。
プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。第1に、記載されるプロトコルは、厚さ20μmの脳組織切片に対して、自由浮遊免疫染色を施し、その結果、組織切片18内で最適な抗体浸透をもたらす。自由浮遊技術では、免疫蛍光染色中に組織切片を異なる溶液間で手動で移すこと、および手順全体を通して組織切片を慎重に取り扱うことが必要な場合があります。これは、現在のプロトコールで抗原検索のために組織切片を70%ギ酸溶液に浸漬し、薄切片の組織の脆弱性を高める場合に特に重要です。記載されたプロトコールに対する代替アプローチには、より厚い組織切片(例えば、30〜40μm)を使用すること、または免疫蛍光染色の前に正に荷電したスライドに直接取り付けられた組織切片を使用することが含まれる。第2に、本明細書に記載のプロトコールは、蛍光標識された6E10抗体を使用する。蛍光標識された6E10抗体を使用する以外に、非蛍光性の6E10抗体(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合6E10抗体)も、脳組織切片におけるAβ負荷を検出するために使用することができ、現在のプロトコールは、前述のように脳組織切片におけるAβ陽性免疫化学染色を定量するために適合させることができる8.第3に、Aβ負荷定量の結果の精度は、組織バックグラウンドおよびシグナル強度に依存する分析ソフトウェアにおける適切な閾値選択に依存するであろう。閾値選択は、Aβ陽性染色のみが定量のために選択されるように、エンドユーザーによって行われなければならない。しきい値設定の精度を保証するために、すべての画像に適用できる特定のしきい値を最適化するには、エンドユーザーの介入が必要です。第四に、サブ関心領域分析は、組織切片における小さな関心領域を選択する必要があるので、2つの独立したリーダがこの分析に使用された。データ収集中に独立性と盲目を維持するために、すべての画像は番号コード化されました。画像解析シーケンスは、異なる読者が任意の時点で異なる画像を分析するように、読者間でランダム化され、データは各週末に送信された。サブ関心領域分析における関心領域選択における読者間変動の可能性が高まるため、読者は、データ収集を開始する前に、皮質および海馬における領域選択を最適化するために、いくつかのサンプル画像を使用して訓練された。このトレーニングは、読者間のばらつきを減らすために不可欠であり、ご覧のとおり(図5A、B)、両方の読者によって報告された6E10陽性領域は、現在の研究において強い相対的一致を示しています。
現在のプロトコルと結果は、関心領域サイズがAβ陽性領域定量に与える影響に関する貴重な情報を提供します。より大きな関心領域は、より小さな関心領域よりも組織を表すことが期待される。したがって、組織中のAβ負荷を正確に定量するためには、より大きな組織をサンプリングすることが望ましい。しかしながら、組織内の均質なAβ負荷分布の場合、より小さいサンプリング領域は、一般に、分析中のより大きな組織の良好な表現であると考えられる。現在の研究結果はこれを確認し、皮質全体および海馬におけるAβ負荷は、皮質および海馬の選択されたサブ領域におけるAβ負荷の強い相関であった(図5C、D)。関心のある全領域とサブ領域の一致をさらに確認するために、皮質と海馬の平均6E10陽性領域を比較したところ、2つの方法の間に差は見られませんでした(図5E)。これは、これらの方法(全領域分析またはサブ領域分析)のいずれかが同等のAβ荷重測定値をもたらすことを裏付けています。
現在のプロトコルにはいくつかの制限があります。2 つの方法(全領域分析とサブ領域分析)は、必ずしも同じ意味で使用できるとは限りません。完全領域解析またはサブ領域解析を使用するかどうかは、ADマウスモデルの年齢、性別、および系統によって影響を受ける組織内のAβの局所分布に依存する。13ヶ月で、Aβ負荷はAPP/PS1マウスの皮質および海馬全体に分布する。しかし、6ヶ月で、Aβ沈着は皮質に限定され、海馬12では最小限の沈着が観察される。このような条件下で、完全関心領域分析は、組織サンプリング領域およびそれによってAβシグナルを増加させるための所望のアプローチであり得る。一方、サブ領域解析は、特定の脳領域(例えば、体性感覚皮質)におけるAβ負荷が対象である場合に選択される方法であり得る。さらに、13ヶ月で、APP/PS1雄マウスは強烈な6E10陽性染色を示し、免疫蛍光染色は非常に低いバックグラウンドで優れたシグナルをもたらし、現在のプロトコルは所定の条件下での定量に非常に適しています。この定量化法が強度の低い染色にうまく適用できるかどうかは不明であり、この質問に答えるためには将来の研究が必要になります。本明細書に提示される免疫蛍光および画像定量法は、前駆体形態13を含むすべての形態のAβを検出する。その結果、特定のAβ種(例えば、Aβ1-40またはAβ1-42)の検出に関心がある場合は、これらのAβアイソフォームに特異的な抗体を使用することができる。したがって、6E10免疫蛍光染色および検出方法は、ELISAを用いた全脳ホモジネート中のAβ1-42測定値の測定値と相関していたが(図5F,G)、相関はごくわずかであった。これは、ELISAを用いたAβ1-42のみの測定と、6E10免疫染色を用いた全Aβ種の検出に起因する可能性がある。現在の研究では、3人の読者を使用して、完全地域分析と準地域分析の間の一致と相関関係を評価しています。読者が増えることで、研究の堅牢性が向上し、ここで提示された2つの方法の間の合意をさらに検証することができます。さらに、我々は、連続変数19間の一致を記述するために他の方法の中でも広く使用されている一致の尺度としてピアソン相関を使用する。しかしながら、ピアソン相関を使用して一致を決定することの1つの制限は、本明細書で使用される2つの方法が関連する結果を提供し得るが、一方の方法は、系統的バイアスのために他方よりも全体的に高い値をもたらし得ることである。したがって、ピアソン相関は相対的一致19の良い尺度である。プロトコルのロバスト性を高めるために、絶対一致を確認するための追加の方法、例えば2つの方法による平均6E10陽性領域を比較するなど(図5E)、19を使用することができる。まとめると、現在のプロトコルは、免疫蛍光染色によって検出されたAβ負荷を比較し、脳組織切片の関心の完全領域およびサブ領域を分析する。この結果は、豊富なAβ沈着を示す生後13ヶ月のAPP/PS1雄マウス由来の脳組織切片について、これら2つの方法の間に強い相関関係を示した。
Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この出版物で報告された研究は、受賞番号R01AG062840(RKS宛)およびR01AG072896(RKS宛)の国立衛生研究所の国立加齢研究所の支援を受けています。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。連邦資金の約20万ドル(100%)がこのプロジェクトを支援した。また、原稿編集にご協力いただいたジョシュア・ヤン博士にも感謝申し上げます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML |
References
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