Summary
본 프로토콜은 알츠하이머병의 APP/PS1 트랜스제닉 마우스 모델에서 아밀로이드-베타 부하를 정량화하기 위해 시상 마우스 뇌 절편의 전체 영역 또는 관심 영역 분석을 수행하는 절차를 설명하고 비교한다.
Abstract
아밀로이드 베타 (Aβ) 플라크의 세포외 축적은 알츠하이머 병 (AD)의 주요 병리학 적 특징 중 하나이며, AD에 대한 FDA 승인 질병 변형 치료의 유일한 표적입니다. 따라서, 아밀로이드 전구체 단백질을 과발현시키고 이로 인해 대뇌 Aβ 플라크를 축적시키는 트랜스제닉 마우스 모델의 사용은 마우스에서 인간 AD를 모델링하는 데 널리 사용됩니다. 따라서, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA) 및 면역염색을 포함하는 면역검정은 일반적으로 AD 형질전환 마우스로부터 유래된 뇌 조직에서 Aβ 부하를 측정한다. Aβ 검출 및 정량화를 위한 방법이 잘 확립되고 문서화되었지만, 면역염색 후 Aβ 부하 측정에 대한 뇌 조직에서 선택된 관심 영역의 크기가 미치는 영향은 보고되지 않았다. 따라서, 현재의 프로토콜은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 있는 전체 및 하위 영역에 걸친 Aβ 부하 측정치를 비교하는 것을 목표로 한다. 뇌 조직 준비, 자유 부유 뇌 섹션 면역염색, 이미징 및 관심있는 전체 대 하위 영역에서 Aβ 부하의 정량화에 관련된 단계는 13 개월 된 APP / PS1 이중 트랜스제닉 수컷 마우스에서 파생 된 뇌 섹션을 사용하여 설명됩니다. 현재의 프로토콜과 결과는 관심있는 영역의 크기가 Aβ 양성 영역 정량화에 미치는 영향에 대한 귀중한 정보를 제공하고, 광범위한 Aβ 침착을 보여주는 13 개월 된 수컷 APP / PS1 마우스에서 파생 된 뇌 절편에 대한 관심 영역의 전체 및 하위 영역 분석을 사용하여 얻은 Aβ 양성 영역 사이의 강한 상관 관계를 보여줍니다.
Introduction
미국에서 여섯 번째로 큰 사망 원인 인 알츠하이머 병 (AD)은 공중 보건의 위협으로 계속 남아 있으며 약 6.2 만 명의 미국인이 AD와 함께 살고 있습니다. 이것은 2060 년까지 13.8 백만에 도달 할 것으로 예상됩니다1. 현재까지 콜린에스테라제 억제제 및 메만틴과 같은 약물을 통한 증상 관리는 치료2의 주요 과정입니다. AD는 아밀로이드-베타 (Aβ) 플라크의 세포외 침착 및 신경세동 엉킴 3,4의 형태로 세포내 과인산화된 타우 축적과 같은 신경병리학적 징후를 특징으로 한다. 베타- 및 감마 세크레타제를 통한 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 내프로테롤리드 절단에 의해 형성되고, Aβ 응집체는 올리고머 및 피브릴을 형성하여, 신경독성 효과5를 유도한다. Aβ는 1980년대부터 일차적인 병리학적 역할을 하는 것으로 가설되어 왔으며, AD6에 대한 유일한 FDA 승인 질환 변형 요법의 치료 표적이다. 그 결과, 강력한 뇌 Aβ 축적을 초래하는 유전자에 돌연변이를 보유하는 형질전환 AD 마우스 모델은 1990년대 초반부터 전임상 AD 연구에 널리 사용되어왔다 7.
이러한 AD 트랜스제닉 마우스 뇌에서 Aβ 종의 검출은 일반적으로 두 가지 면역검정, 즉 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)과 면역염색을 사용하여 수행된다. 이전 분석은 상이한 Aβ 종의 정량적 결정을 가능하게 하고, 면역염색에 비해 시간이 덜 소요되며, 이는 조직 절편화, 면역염색, 이미징 및 정량화를 포함하는 여러 순차적 조직 처리 및 이미징 단계를 필요로 한다8. 또한, 면역염색 후 얻어진 결과는 반정량적8이다. 그러나, Aβ를 공간적으로 국소화하는 능력은 면역염색을 뇌 조직에서의 Aβ 검출을 위한 매력적인 접근법으로 만든다8.
Aβ 면역염색을 사용하는 동안, 몇몇 상이한 정량화 패러다임이 상이한 연구 그룹에 의해 이용되었다. 예를 들어, 일부 연구 그룹은 관심 영역 (피질 또는 해마)의 전체 Aβ 부하를 정량화하는 반면, 다른 연구 그룹은 지정된 관심 하위 영역 (피질 또는 해마의 일부)에서 Aβ 부하를 정량화합니다 9,10,11. Aβ 검출 및 정량화를 위한 방법들이 잘 확립되고 문서화되었지만, 면역염색 후 Aβ 부하 측정에 대한 관심 영역의 크기의 영향은 보고되지 않았다. 따라서, 현재의 프로토콜은 이미지 분석 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 관심 있는 전체 및 하위 영역에 걸친 Aβ 부하 측정치를 비교하는 것을 목표로 한다.
현재의 연구는 AD12의 조기 발병을 모델링하기 위해 키메라 마우스 / 인간 APP와 돌연변이 프레세닐린 1을 발현하는 13 개월 된 APP / PS1 이중 트랜스제닉 남성 마우스를 사용했습니다. Aβ 침착물은 생후 6-7개월에 의해 발달하기 시작하고, 풍부한 Aβ 축적은12세의 9-10개월에 의해 이들 마우스의 피질과 해마 모두에서 관찰된다. 트랜스제닉 아밀로이드 펩티드 및 홀로단백질은 6E10-면역염색13에 의해 검출될 수 있어, 본 프로토콜에 대한 바람직한 동물 모델이 된다. 본원에 다룬 절차는 뇌 조직 준비, 자유 부유 절편의 면역염색, 영상화, 및 관심의 전체 대 하위-영역에서의 Aβ 부하의 정량화를 포함한다. 이 분석은 전체 및 하위 지역 정량화 사이의 강한 상관 관계를 보여 주며, 풍부한 Aβ 침착을 보여주는 13 개월 된 APP / PS1 수컷 마우스에서 파생 된 뇌 조직 절편에서이 두 가지 방법 간의 강력한 일치를 나타냅니다.
Protocol
모든 동물 실험은 캘리포니아 대학, 어바인, 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 승인 한 프로토콜에 따라 대학 실험실 동물 자원에 따라 수행되었습니다. 실험은 수컷 B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (APP/PS1) 마우스(13개월령, n=35)와 함께 수행하였다. 마우스를 상업적 공급원으로부터 수득하였다( 물질의 표 참조).
1. 뇌조직 준비
- 승인 된 동물 프로토콜에 따라 페니토인 / 펜토바르비탈 기반 마취제 (150 mg / kg)를 복강 내 주사 ( 물질 표 참조)의 치사량을 사용하여 마우스를 마취하십시오. 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(1x PBS)로 5분 동안 5분 동안 심장 관류를 수행하여 뇌 혈관구조를 맑게 합니다(14).
- 앞서 발표된 보고서 15에 이어 뇌 조직을 수확하고, 좌뇌 및 우측 뇌 반구로 분리하고, 각 마우스의 우반뇌를 4°C에서 72시간 동안 1x PBS 중의 갓 제조된 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액 5 mL를 함유하는15 mL 원뿔형 튜브에 넣는다.
참고 : 뇌는 연구되는 항원에 따라 24-72 시간에서 침수 고정 될 수 있습니다. 소뇌가 없는 좌측 반뇌는 -80°C에서 저장한 후 액체 질소에서 스냅-냉동시킬 수 있고, 이어서 ELISA 및 생화학적 Aβ 검출16과 같은 생화학적 분석을 위해 처리될 수 있다.
주의: PFA는 발암 가능성이 높으며 PFA와의 피부 접촉은 알레르기 성 피부 증상을 유발할 수 있습니다. 니트릴 또는 부틸 장갑, 마스크 및 눈 보호 장치를 사용하여 취급하고 화학 흄 후드 아래에서 준비하십시오. - 4% PFA에서 인큐베이션한 후, 뇌 조직이 원뿔형 튜브의 바닥에 가라앉을 때까지 각각 4°C에서 24시간 동안 1x PBS로 제조된 10%, 20%, 및 30% 수크로오스 용액 5 mL에서 순차적으로 헤미뇌를 인큐베이션한다.
- 30% 수크로오스 용액에서 인큐베이션한 후, 헤미-뇌를 제거하고, 과량의 슈크로스 용액을 제거하기 위해 여과지에 뇌를 부드럽게 담그고, 고정된 반쪽-뇌를 분말화된 드라이아이스에서 30분 동안 동결시킨다. 냉동된 반뇌를 동결절제될 때까지 -80°C에서 잘 표지된 알루미늄 호일에 보관한다.
참고: 현재의 프로토콜에서, 반뇌는 -80°C에서 6-8개월 동안 저장되었다. - 동결된 반미 뇌를 냉동 스토스타트를 사용하여 20 μm 두께의 절편으로 절편한다( 재료 표 참조).
참고 : 현재 프로토콜의 경우, 반쪽 뇌는 시상 섹션으로 섹션화되었으며, 필요한 경우 코로나 절편도 준비 할 수 있습니다17. 단계 2는 고정되고 동결보호된 뇌 조직 샘플 상의 Aβ 면역형광 염색을 위한 것이다.
2. 면역형광
- 시상 뇌 조직 절편(단계 1.5)을 24-웰 플레이트에 넣는다(웰 당 300 μL 당 최대 6개의 마우스 뇌 절편). 플레이트를 온화한 소용돌이로 진탕기 상에 위치시켜 실온 (23°C)에서 3회 1x PBS로 5분 동안 세척한다.
- 뇌 조직 절편을 실온에서 10분 동안dH2 0의70% 포름산으로 인큐베이션한다.
주의: 포름산은 부식성이 있으므로 피부와 눈을 마주치지 마십시오. - 뇌 조직 절편을 실온에서dH20으로 5 분 동안 세 번 세척하십시오.
- 실온에서 1시간 동안 1x PBS에서 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.3% TritonX 100 ( 표 표의 물질 참조)과의 비특이적 결합을 차단한다.
- 뇌 조직 절편을 0.3% TritonX 100을 함유하는 1x PBS 중에서 희석(1:1000)한 형광단 표지된 1차 항체(6E10, 표 표 참조)로 4°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 일차 항체는 형광단-접합되기 때문에, 플레이트는 이 단계부터 커버되어야 하거나, 형광단 효과를 유지하기 위해 암실에서 모든 작업을 수행해야 한다. - 뇌 조직 절편을 실온에서 1x PBS로 10분 동안 세 번 세척한다.
- 뇌 조직 절편을 양전하를 띤 유리 슬라이드(표 참조)에 잘 표지되어 있는 슬라이드(슬라이드의 라벨 정보는 선호도에 기초함) 상에 장착하고, dH2 0으로 간단히 세척한 후 남은 염을 제거한다. 어둠 속에서 슬라이드가 공기 건조하게하십시오.
참고: 뇌 섹션은 주름과 찢어짐을 피하기 위해 조심스럽게 장착해야 하며, 이는 데이터 정량화에 영향을 미칩니다. 관심 영역에 놓여 있고 데이터 정량화를 방해할 수 있는 립 및/또는 폴드의 경우, 다시 염색하고 다시 장착하는 것이 좋습니다. - 수성 장착 매체 ( 재료 표 참조)로 뇌 조직 절편을 장착하고 유리 커버 슬립을 조직 위에 놓습니다. 커버슬립의 끝을 투명한 매니큐어로 밀봉하고 이미징될 때까지 슬라이드를 4°C의 슬라이드 박스에 보관합니다.
참고: 현재 프로토콜에서, 슬라이드는 염색 후 1개월 이내에 이미지화되었다.
3. 이미징
- 형광 (epifluorescence 또는 공초점) 현미경 ( 물질의 표 참조)을 사용하여 6E10 염색 된 뇌 절편을 이미지화하고, 전체 뇌 조직 섹션을 하나의 이미지로 캡처하는 2x 목표를 가지며 적절한 필터 (GFP)가 장착되어 있습니다.
참고: 이미징 설정은 여러 슬라이드에서 일관되어야 합니다. - 캡처된 이미지를 TIFF 파일로 저장하거나 필요에 따라 6E10 정량화를 위해 아래 단계 4.2에 설명된 대로 이미지 분석 소프트웨어( 자료 표 참조)에서 엽니다.
참고: 이미지 분석 소프트웨어인 ImageJ에서 정량화할 이미지를 캡처하기 전에 스케일 바를 포함하십시오.
4. 관심 영역 전체 영역 분석
참고 : 현재 연구의 두 가지 관심 영역은 해마와 이소 피질입니다. 전체-관심 영역 분석은 영상화된 뇌 조직 절편에서 전체 이소피질(앞으로 나아가는 피질로 지칭됨) 또는 해마의 분석을 나타낸다.
- 이미지 분석 소프트웨어( 자료표 참조)를 다운로드하고 일단 설치되면 소프트웨어를 시작하십시오.
- 소프트웨어가 실행되면 파일 |를 클릭하십시오. 오픈 | 분석할 이미지를 선택합니다 .
- | 분석을 클릭하십시오. 배율을 설정합| 를 클릭하여 배율을 제거합니다. 소프트웨어 도구 모음에서 직선 도구를 선택하고 눈금 막대의 길이를 따라 직선을 그립니다. | 분석을 클릭하십시오. 측정. 배율 막대의 길이 또는 거리를 픽셀 단위로 기록해 둡니다. | 분석을 클릭하십시오. 배율을 설정합니다.
- 팝업 창에서 거리(픽셀 단위), 스케일 막대의 알려진 거리(이 경우 μm), 길이 단위를 μm로 입력합니다. 여러 이미지가 처리되는 경우 다음 모든 이미지에 새 배율 설정을 적용하려면 글로벌을 선택합니다. 확인을 클릭하여 설정을 적용합니다.
참고: 추가 분석 전에 항상 정확한 배율이 이미지에 적용되었는지 확인하는 것이 좋습니다.
- 팝업 창에서 거리(픽셀 단위), 스케일 막대의 알려진 거리(이 경우 μm), 길이 단위를 μm로 입력합니다. 여러 이미지가 처리되는 경우 다음 모든 이미지에 새 배율 설정을 적용하려면 글로벌을 선택합니다. 확인을 클릭하여 설정을 적용합니다.
- 원하는 측정값을 단면의 영역으로 설정하려면 분석으로 이동 | 측정 | 설정 영역 및 표시 레이블 상자를 선택합니다. 분석 중인 이미지가 리디렉션에서 선택되어 있는지 확인합니다.
- 해마 또는 피질 시각화의 용이성을 위해, 이미지 |로 이동 | 조정 밝기/대비. 최대 슬라이드 막대를 왼쪽으로 점진적으로 드래그하여 관심 있는 뇌 영역을 식별할 수 있을 때까지 조직의 선명도를 높입니다.
참고: 분석 중에 잘못된 측정을 방지하기 위해 이 설정을 적용하지 말고 다음 단계로 진행하십시오. - 다각형 선택 또는 자유형 선택 도구를 사용하여 해마 영역의 윤곽을 그립니다. 해마가 윤곽선이 잡히면 밝기 / 대비 설정의 재설정 옵션을 클릭하여 원래 밝기로 되돌립니다.
참고 : 피질 영역에 대해 단계를 별도로 반복해야합니다. - 선택한 영역의 전체 조직 영역을 측정하려면 편집| 바깥 쪽이 맑아집니다. 선택한 영역이 화면의 유일한 이미지가되면 | 분석을 클릭하십시오. 팝업 창에서 분석된 전체 조직 면적 을 얻기 위해 측정한다. 나중에 사용할 수 있도록 Excel 파일에 데이터를 저장합니다.
- 6E10 긍정 영역을 측정하려면 이미지 |로 이동하십시오 . | 조정 색상 임계값. 임계값 지정 메서드 에서 미리 만들어진 필터는 일반적으로 가장 강한 신호를 빨간색으로 강조 표시하는 원하는 결과를 제공합니다.
참고: 최적의 임계값 선택은 이미지의 배경과 염색 강도에 따라 달라집니다. 배경이 아닌 얼룩을 집어 올리는 임계 값 설정을 선택하십시오. - 적절한 임계값을 선택한 후 어두운 배경을 확인합니다. 이것은 검은 배경에 Aβ 반점 (관심있는 얼룩)을 강조 표시합니다. | 선택을 클릭하십시오. 오리지널 | 흰색 배경에 어두운 신호 (Aβ 퇴적물)를 제공하여 선택하십시오. | 분석을 클릭하십시오. 파티클을 분석 하고 팝업 창이 생성되면 확인을 클릭합니다.
- 편집|을 클릭하여 소프트웨어에서 생성 된 요약 출력을 복사하십시오 . 복사. 각 레이블을 사용하여 이전에 시작한 Excel 파일에 붙여 넣습니다. 이것은 선택된 관심 영역 (해마 또는 피질)의 6E10 양성 영역입니다.
참고: Excel에는 총 6E10 양성 영역(단계 4.10) 및 전체 조직 영역(단계 4.7)에 대한 열이 있을 것입니다. - 다음과 같이 6E10 양성 면적 (%)을 계산하십시오 : (총 6E10 양성 영역 / 총 조직 면적 분석) x 100.
5. 관심 하위 영역 분석
참고: 관심 하위 영역 분석은 영상화된 뇌 조직 섹션에서 피질 또는 해마의 일부에 대한 분석을 나타냅니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 다운로드하고 일단 설치되면 소프트웨어를 시작하십시오.
- 소프트웨어가 실행되면 파일 |를 클릭하십시오. 오픈 | 분석할 이미지를 선택합니다 .
- | 분석을 클릭하십시오. 배율을 설정합| 를 클릭하여 배율을 제거합니다. 소프트웨어 도구 모음에서 직선 도구를 선택하고 눈금 막대의 길이를 따라 직선을 그립니다. | 분석을 클릭하십시오. 측정. 배율 막대의 길이 또는 거리를 픽셀 단위로 기록해 둡니다. | 분석을 클릭하십시오. 배율을 설정합니다.
- 팝업 창에서 거리(픽셀 단위), 배율 막대의 알려진 거리(이 경우 μm)를 입력하고 길이 단위를 μm로 입력합니다. 여러 이미지가 처리되는 경우 다음 모든 이미지에 새 배율 설정을 적용하려면 글로벌을 선택합니다. 확인을 클릭하여 설정을 적용합니다.
참고: 추가 분석 전에 항상 정확한 배율이 이미지에 적용되었는지 확인하는 것이 좋습니다.
- 팝업 창에서 거리(픽셀 단위), 배율 막대의 알려진 거리(이 경우 μm)를 입력하고 길이 단위를 μm로 입력합니다. 여러 이미지가 처리되는 경우 다음 모든 이미지에 새 배율 설정을 적용하려면 글로벌을 선택합니다. 확인을 클릭하여 설정을 적용합니다.
- 원하는 측정값을 단면의 영역으로 설정하려면 분석으로 이동 | 측정 | 설정 영역 및 표시 레이블 상자를 선택합니다. 분석 중인 이미지가 리디렉션에서 선택되어 있는지 확인합니다.
- 이미지가 너무 어둡고 뇌 영역 (예 :이 경우 해마 또는 피질)을 쉽게 식별 할 수없는 경우 밝기 및 대비를 조정하십시오. 소프트웨어 도구 모음을 사용하고 이미지 |를 클릭하십시오. | 조정 밝기/대비를 선택하고 필요에 따라 최대 슬라이더를 왼쪽으로 드래그하여 조직 가시성을 높입니다.
참고: 분석 중에 잘못된 측정을 방지하기 위해 이 설정을 적용하지 말고 다음 단계로 진행하십시오. - 사각형 도구를 사용하여 피질 또는 해마에서 관심있는 영역을 선택하십시오. 도구 모음을 사용하고 | 편집을 클릭하십시오. 선택 | 높이와 너비를 미리 정의된 값으로 변경하여 지정합니다. 상자를 조정하여 조직으로 완전히 덮으십시오. 밝기/대비를 재설정하여 원래 밝기로 되돌립니다.
참고: 관심 영역을 선택하는 데 사용되는 상자의 크기는 모든 이미지에 대해 일관되어야 합니다. 본 분석의 경우, 박스 크기는 300 픽셀 x 300 픽셀 (1177 μm x 1177 μm에 해당) 또는 400 픽셀 x 200 픽셀 (1569 μm x 784 μm에 해당)이었다. - 상자를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 복제를 클릭하여 선택한 관심 영역을 복제합니다. 선택한 지역이 있는 새 창이 열립니다. 복제된 이미지의 이름을 바꿔 그것이 위치한 영역(예를 들어, 피질 또는 해마)을 표시한다.
- 도구 모음을 사용하고 이미지 |를 클릭하여 중복 된 이미지 유형을 조정하십시오 . 유형 | 8비트 로 복제된 RGB 이미지를 8비트로 변환하여 플라크를 가장 잘 분석합니다. | 편집을 클릭하여 이미지를 반전 반전.
- 6E10 긍정 영역을 측정하려면 이미지 |로 이동합니다 . | 조정 임계값. Thresholding 메서드 에서 미리 정의된 필터는 일반적으로 가장 강한 신호를 빨간색으로 강조 표시하여 원하는 결과를 제공합니다.
참고: 최적의 임계값 선택은 이미지의 배경과 염색 강도에 따라 달라집니다. 배경이 아닌 얼룩을 집어 올리는 임계 값 설정을 선택하십시오. - 적절한 임계값을 선택한 후 적용을 선택합니다.
- 6E10 긍정 영역을 분석하려면 도구 모음을 사용하고 | 분석을 클릭하십시오. 입자를 분석하여 "결과 요약"이 확인되었는지 확인합니다.
- 편집 |을 클릭하여 소프트웨어에서 생성 된 %Area로 요약 출력을 복사하십시오. 복사. 각 레이블을 사용하여 이전에 시작한 Excel 파일에 붙여 넣습니다.
- 조직의 다른 영역에 대해 5.3-5.12단계를 반복합니다. 관심 영역을 윤곽선으로 표시하기 위해 각 상자의 배치가 각 이미지 간에 일관성이 있는지 확인합니다.
참고: 사각형 도구 상자 치수가 조직 곡률로 인해 지정된 영역에 맞지 않는 경우 회전 도구를 사용할 수 있습니다. - 사각형을 회전하려면 도구 모음을 사용하고 편집(Edit) | 선택 | 필요에 따라 회전 정도를 회전하고 조정합니다. 5.7 단계에서 언급 한대로 이미지를 복제하고 도구 모음을 사용하고 | 편집을 클릭하여 외부를 지우 십시오. 지정된 사각형 외부의 6E10 얼룩을 지우는 바깥쪽을 맑게 합니다. 위에서 설명한 5.8단계로 진행하십시오.
Representative Results
여기서, 두 가지 다른 방법을 비교하여 마우스 뇌 조직의 해마와 피질에서 6E10 양성 영역을 정량화한다. 두 가지 방법은 관심 분석의 전체 영역 및 하위 영역입니다(그림 1). 이름에서 알 수 있듯이 전체 관심 영역 분석은 6E10 양성 영역을 결정하기 위해 전체 관심 영역 (이 경우 이소 피질 또는 해마)을 윤곽을 그리는 것을 포함합니다 (그림 1A, B). 관심 하위 영역 분석은 6E10 양성 영역을 결정하기 위해 관심 영역 내에서 미리 정의된 영역을 선택하는 것을 포함한다(도 1C,D). 두 가지 방법에 대한 단계적 ImageJ 프로토콜은 그림 2, 그림 3 및 그림 4에 나와 있습니다.
이 연구는 세 명의 독자를 사용했습니다. 두 명의 독립적 인 독자가 관심 하위 영역 분석을 수행했으며 세 번째 독자는 관심 영역의 전체 영역을 분석했습니다. 도 5A,B에서 보는 바와 같이, 관심 하위 영역 분석을 수행한 두 독자에 의해 보고된 6E10 양성 영역 사이에 강한 유의한 양의 상관관계(p<0.0001)가 있었다(피어슨 상관 계수는 피질에 대해 r = 0.97, 해마의 경우 r = 0.96). 관심 하위영역 분석을 위해 두 독자에 의해 보고된 6E10 양성 영역을 평균화하고, 관심 하위영역인 6E10 양성 영역의 평균화된 하위영역은 피질 모두에 대한 전체 관심 영역 분석을 사용하여 얻은 6E10 양성 영역과 강한 유의한 양의 상관관계(p<0.0001)를 공유하였다(Pearson 상관 계수 r = 0.96; 그림 5C) 및 해마 (피어슨 상관 계수 r = 0.95; 도 5D). 전체 관심 영역 및 하위 관심 영역 분석에 의해 얻어진 평균 피질- 및 해마-6E10 양성 영역은 유의한 차이 없이 필적하였고, 두 방법 사이의 일치를 확인하였다(도 5E). 또한, 불용성 Aβ1-42는 마우스의 서브세트에서 전뇌 균질물을 측정하였고 피질(도 5F) 및 해마(도 5G) 관심 영역 전체 분석에 의해 결정된 6E10 양성 영역은 ELISA를 이용한 불용성 Aβ1-42 부하와 유의하게(p <0.01) 상관관계가 있었다(물질의 표 참조).
그림 1: 관심 영역 선택의 전체 영역 대 하위 영역 전체 이소피질(cortex) 및 해마를 나타내는 대표적인 이미지는 각각 (A) 및 (B)에서 관심 있는 전체 영역 분석에 대해 윤곽을 그렸다. 대표적인 이미지는 각각 (C) 및 (D)에서 관심있는 하위영역 분석에 대한 피질 및 해마의 서브-영역/s의 선택을 보여준다. 배율 막대 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 관심 영역 전체 6E10 양성 영역 정량화를 위한 프로토콜. 원본 영상(A), 밝기/대비 조정 후의 영상(B), 관심 영역의 선택(C), 클리어링(D), 임계치 조정(E) 및 분석 준비(F)를 보여주는 영상 분석 단계. 그림의 숫자는 프로토콜의 단계 번호를 지정합니다. 배율 막대 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 관심 하위 영역 6E10 양성 영역 정량화를 위한 프로토콜. 원본 영상(A), 밝기/대비 조정 후 영상(B), 관심 영역의 선택(C), 관심 영역의 이미지 복제(D), 영상을 8비트로 변경 및 반전 영상(E), 임계치 조정(F), 분석 준비 최종 영상(G)을 나타내는 영상 분석 단계. 그림의 숫자는 프로토콜의 단계 번호를 지정합니다. 배율 막대 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 관심 영역 회전에 대한 프로토콜. 조직 곡률에 맞게 선택 박스의 관심 영역의 선택 및 회전(A), 복제 후의 관심 영역의 이미지(B), 및 외부(관심 영역)를 클리어한 후의 영상(C)을 나타내는 영상 분석 단계. 그림의 숫자는 프로토콜의 단계 번호를 지정합니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 관심 분석의 전체 영역과 하위 영역 간의 상관 관계. 산점도는 피질(A)과 해마(B)에 대한 관심 하위 영역 분석을 수행하는 두 개의 독립적인 독자에 의해 6E10 양성 영역 사이의 상관관계를 보여준다. 관심 하위영역 분석으로부터 생성된 6E10 양성 영역과 피질(C)과 해마(D) 둘 다에 대한 관심 영역의 전체 관심 영역 분석 사이에 강한 양의 상관관계가 관찰된다. 피질 및 해마(E)에서의 관심 전체 영역과 관심 하위영역 분석에 의한 평균 6E10 양성 영역에는 통계적으로 유의한 차이가 없다. ELISA를 이용한 전뇌 균질불용성 Aβ1-42 측정과 피질(F)과 해마(G) 둘 다에 대한 관심 영역 전체 영역 분석 사이에 유의한 상관관계가 관찰된다. 데이터는 Pearson 상관 계수, r, in (A-D) 및 (F-G)를 사용하고, 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 (E)의 양방향 반복 측정 ANOVA를 사용하여 분석하였다. 데이터는 (E)에서 n=35 마우스의 평균(SEM)의 평균 ± 표준 오차로서 제시되고, 0.05< 두 꼬리 p 는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
본원에 기재된 프로토콜은 시상 절편화를 위한 반-뇌 제제, 자유 부유 절편 상의 6E10 항체를 이용한 Aβ 침착물의 면역형광 염색, Aβ 염색된 뇌 절편의 영상화, 이어서 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 마우스 뇌 조직의 피질 및 해마에서의 Aβ 침착물의 정량화를 위한 절차를 개략적으로 설명한다. 뇌 조직 절편 8,10에서 Aβ 부하를 정량화하기 위한 공개된 프로토콜이 있지만, 이 프로토콜은 이것이 요망될 수 있을 때, 피질 및 해마에서 관심있는 서브 영역에서의 Aβ 부하와 비교하여 전체 이소피질(피질로 지칭됨) 및 해마에서 Aβ 부하의 정량화에 관여하는 단계들을 기술한다. 관심 분석의 전체 영역과 하위 영역 간의 상관 관계도 제공됩니다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, 기술된 프로토콜은 20 μm 두께의 뇌 조직 절편에 대해 자유 부유 면역염색을 실시하고, 이는 조직 섹션(18) 내에서 최적의 항체 침투를 초래한다. 자유-부유 기술은 조직 절편이 면역형광 염색 동안 상이한 용액들 사이에서 수동으로 전달될 것을 요구하고, 절차 전반에 걸쳐 조직 절편의 신중한 취급을 요구할 수 있다. 이것은 조직 절편이 현재의 프로토콜에서 항원 검색을 위해 70% 포름산 용액에 침지될 때 특히 중요하며, 얇은 절편에 대한 조직 취약성을 증가시킨다. 기술된 프로토콜에 대한 대안적인 접근법은 더 두꺼운 조직 절편(예를 들어, 30-40 μm)을 사용하거나 면역형광 염색 전에 양전하를 띤 슬라이드 상에 직접 장착되는 조직 절편을 사용하는 것을 포함한다. 둘째, 본원에 기재된 프로토콜은 형광 표지된 6E10 항체를 사용한다. 형광 표지된 6E10 항체를 사용하는 것 외에, 비형광성 6E10 항체 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 6E10 항체)는 또한 뇌 조직 절편에서 Aβ 부하를 검출하는데 사용될 수 있고, 현재의 프로토콜은 앞서 기술된 바와 같이 뇌 조직 절편에서 Aβ 양성 면역화학적 염색을 정량화하도록 적응될 수 있다8 . 셋째, Aβ 부하 정량화에 대한 결과의 정확도는 분석 소프트웨어에서 적절한 역치 선택에 의존하며, 이는 조직 배경 및 신호 강도에 의존한다. 역치 선택은 정량화를 위해 Aβ 양성 염색만 선택되도록 최종 사용자에 의해 수행되어야 한다. 임계값 설정의 정확성을 보장하기 위해 모든 이미지에 적용할 수 있는 특정 임계값을 최적화하려면 최종 사용자의 개입이 필요합니다. 넷째, 관심 하위영역 분석에서는 조직 절편에서 작은 관심 영역을 선택해야 하기 때문에, 이 분석에 두 개의 독립적인 리더가 사용되었다. 데이터 수집 중에 독립성과 블라인드를 유지하기 위해 모든 이미지는 번호가 코드화되었습니다. 이미지 분석 시퀀스는 독자간에 무작위화되어 서로 다른 독자가 주어진 시간에 다른 이미지를 분석하고 매주 말에 데이터를 제출했습니다. 관심 하위 영역 분석에서 관심 영역 선택에서 리더 간 변동성의 가능성이 증가했기 때문에 독자는 데이터 수집을 시작하기 전에 피질과 해마에서 영역 선택을 최적화하기 위해 여러 샘플 이미지를 사용하여 훈련되었습니다. 이 훈련은 독자 간 변동성을 줄이는 데 중요하며, 볼 수 있듯이 (그림 5A, B), 두 독자가 보고한 6E10 양성 영역은 현재 연구에서 강한 상대적 일치를 보여줍니다.
현재의 프로토콜 및 결과는 Aβ 양성 영역 정량화에 대한 관심 영역 크기의 영향에 대한 귀중한 정보를 제공한다. 더 큰 관심 영역은 더 작은 관심 영역보다 더 많은 조직을 나타낼 것으로 예상된다. 따라서, 더 큰 조직을 샘플링하는 것은 조직 내의 Aβ 부하를 정확하게 정량화하는 것이 바람직하다. 그러나, 조직 내의 균질한 Aβ 부하 분포의 경우에, 더 작은 샘플링 영역은 일반적으로 분석하에 더 큰 조직의 양호한 표현으로 간주된다. 현재의 연구 결과는 이것을 확인하고, 전체 피질과 해마에서의 Aβ 하중은 피질과 해마의 선택된 하위영역에서 Aβ 부하의 강한 상관관계를 가졌다(도 5C, D). 관심 분석의 전체 영역과 하위 영역 간의 일치를 더 확인하기 위해 피질과 해마의 평균 6E10 양성 영역을 비교했으며 두 방법 간의 차이는 발견되지 않았습니다 (그림 5E). 이는 이들 방법 중 하나(전체 또는 하위 영역 분석)가 필적할만한 Aβ 부하 측정을 산출한다는 것을 확인시켜 준다.
현재 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 두 가지 방법(전체 영역 대 하위 영역 분석)이 항상 상호 교환적으로 사용되는 것은 아닙니다. 전체 또는 하위영역 분석을 사용하는 선택은 조직 내 Aβ의 지역적 분포에 의존할 것이며, 이는 AD 마우스 모델의 연령, 성별 및 균주에 의해 영향을 받는다. 13개월에 Aβ 하중은 APP/PS1 마우스의 피질과 해마 전체에 분포한다. 그러나, 6개월에, Aβ 침착물은 피질로 제한되고, 해마(12)에서 최소 퇴적물이 관찰된다. 이러한 조건 하에서, 전체 관심 영역 분석은 조직 샘플링 영역을 증가시키고 이에 따라 Aβ 신호를 증가시키는 바람직한 접근법일 수 있다. 한편, 서브-영역 분석은 특정 뇌 영역(예를 들어, 체감각 피질)에 Aβ 부하가 관심 있는 경우에 선택되는 방법일 수 있다. 또한 13 개월에 APP / PS1 수컷 마우스는 강렬한 6E10 양성 염색을 보여 주며 면역 형광 염색은 매우 낮은 배경으로 우수한 신호를 생성하므로 현재 프로토콜은 주어진 조건 하에서 정량화에 매우 적합합니다. 이 정량화 방법이 덜 강렬한 염색에 성공적으로 적용될 수 있는지는 불분명하며,이 질문에 답하기 위해서는 앞으로의 연구가 필요할 것입니다. 본원에 제시된 면역형광 및 이미지 정량 방법은 전구체 형태13을 포함하는 모든 형태의 Aβ를 검출한다. 결과적으로, 특정 Aβ 스펙 (예를 들어, Aβ1-40 또는 Aβ1-42)의 검출에 관심이 있다면, 이들 Aβ 이소형에 특이적인 항체가 사용될 수 있다. 따라서 6E10 면역형광 염색 및 검출 방법이 ELISA를 이용한 전뇌 균질액에서의 Aβ1-42 측정치의 측정치와 상관관계가 있음에도 불구하고(도 5F, G), 상관관계는 미미할 뿐이었다. 이는 ELISA를 이용한 Aβ1-42만을 측정하고 6E10 면역염색을 이용한 모든 Aβ 종의 검출에 기인할 수 있다. 현재 연구는 세 명의 독자를 사용하여 전체 및 하위 지역 분석 간의 합의와 상관 관계를 평가합니다. 추가 독자를 확보하면 연구의 견고성이 향상 될 수 있으며 여기에 제시된 두 가지 방법 간의 합의를 더욱 검증 할 수 있습니다. 또한, 우리는 Pearson 상관 관계를 합의의 척도로 사용하며, 이는 연속 변수19 간의 합의를 설명하기 위해 다른 방법들 사이에서 널리 사용됩니다. 그러나, Pearson 상관관계를 사용하여 합의를 결정하는 한 가지 한계는 여기에 사용된 두 가지 방법이 관련 결과를 제공할 수 있지만, 한 방법은 체계적인 편향으로 인해 다른 방법보다 전반적으로 더 높은 값을 초래할 수 있다는 것이다. 따라서 피어슨 상관관계는 상대적 합의(19)의 좋은 척도이다. 프로토콜의 견고성을 높이기 위해, 두 가지 방법으로 평균 6E10 양성 영역을 비교하는 것과 같은 절대 일치를 확인하기 위한 추가적인 방법(그림 5E)이 사용될 수 있다(도 5E). 종합하면, 현재의 프로토콜은 면역형광 염색에 의해 검출된 Aβ 부하를 비교하고, 뇌 조직 절편에서 관심있는 전체 및 하위영역을 분석한다. 결과는 풍부한 Aβ 침착을 보여주는 13 개월 된 APP / PS1 수컷 마우스에서 파생 된 뇌 조직 절편에 대한이 두 가지 방법 사이의 강한 상관 관계를 보여줍니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 간행물에보고 된 연구는 수상 번호 R01AG062840 (RKS에) 및 R01AG072896 (RKS로)으로 국립 보건원 국립 노화 연구소의 지원을 받았다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 연방 기금의 약 $ 200k (100 %)가이 프로젝트를 지원했습니다. 우리는 또한 원고 편집에 도움을 주신 Joshua Yang 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML |
References
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