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Neuroscience

माउस मस्तिष्क अनुभागों पर एमिलॉयड-बीटा लोड का पूर्ण-बनाम उप-क्षेत्रीय परिमाणीकरण

Published: May 19, 2022 doi: 10.3791/63669
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4,5
1Henry E. Riggs School of Applied Life Sciences, Keck Graduate Institute, 2Crean College of Health and Behavioral Sciences, Chapman University, 3Keck Science Department, Claremont McKenna College, 4Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Chapman University, 5Department of Neurology, University of California, Irvine

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल अल्जाइमर रोग के एपीपी / पीएस 1 ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में अमाइलॉइड-बीटा लोड को मापने के लिए धनु माउस मस्तिष्क वर्गों के ब्याज विश्लेषण के पूर्ण-क्षेत्र या उप-क्षेत्र को करने की प्रक्रिया का वर्णन और तुलना करता है।

Abstract

अमाइलॉइड-बीटा (Aβ) सजीले टुकड़े का बाह्य संचय अल्जाइमर रोग (एडी) के प्रमुख रोग हॉलमार्क में से एक है, और एडी के लिए एकमात्र एफडीए-अनुमोदित रोग-संशोधित उपचार का लक्ष्य है तदनुसार, ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग जो अमाइलॉइड अग्रदूत प्रोटीन को ओवरएक्सप्रेस करता है और इस तरह सेरेब्रल एβ सजीले टुकड़े जमा करता है, चूहों में मानव एडी को मॉडल करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इसलिए, एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) और इम्यूनोस्टेनिंग सहित इम्यूनोएसेस, आमतौर पर एडी ट्रांसजेनिक चूहों से प्राप्त मस्तिष्क के ऊतकों में एβ लोड को मापते हैं। यद्यपि Aβ का पता लगाने और परिमाणीकरण के तरीकों को अच्छी तरह से स्थापित और प्रलेखित किया गया है, इम्यूनोस्टेनिंग के बाद Aβ लोड माप पर मस्तिष्क के ऊतकों में चयनित ब्याज के क्षेत्र के आकार के प्रभाव की सूचना नहीं दी गई है। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ब्याज के पूर्ण और उप-क्षेत्रों में Aβ लोड माप की तुलना करना है। मस्तिष्क ऊतक की तैयारी, फ्री-फ्लोटिंग ब्रेन सेक्शन इम्यूनोस्टेनिंग, इमेजिंग और ब्याज के पूर्ण बनाम उप-क्षेत्रों में एβ लोड की मात्रा का ठहराव में शामिल चरणों को 13 महीने पुराने एपीपी / पीएस 1 डबल ट्रांसजेनिक नर चूहों से प्राप्त मस्तिष्क वर्गों का उपयोग करके वर्णित किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल और परिणाम Aβ-पॉजिटिव क्षेत्र परिमाणीकरण पर ब्याज के क्षेत्र के आकार के प्रभाव के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं, और 13 महीने के पुरुष एपीपी / पीएस 1 चूहों से प्राप्त मस्तिष्क वर्गों के लिए ब्याज विश्लेषण के पूर्ण और उप-क्षेत्रों का उपयोग करके प्राप्त एβ-पॉजिटिव क्षेत्र के बीच एक मजबूत सहसंबंध दिखाते हैं जो व्यापक एβ बयान दिखाते हैं।

Introduction

अल्जाइमर रोग (एडी), संयुक्त राज्य अमेरिका में मृत्यु का छठा प्रमुख कारण, एक सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरा बना हुआ है, अनुमानित 6.2 मिलियन अमेरिकियों के साथ एडी के साथ रहना है। 2060 तक इसके 13.8 मिलियन तक पहुंचने की उम्मीदहै। आज तक, कोलिनेस्टेरेज़ इनहिबिटर और मेमेंटाइन जैसी दवाओं के माध्यम से रोगसूचक प्रबंधन उपचार का प्राथमिक पाठ्यक्रम है2. एडी को न्यूरोपैथोलॉजिकल अभिव्यक्तियों की विशेषता है जैसे कि एमिलॉयड-बीटा (एβ) सजीले टुकड़े के बाह्य कोशिकीय जमाव और न्यूरोफाइब्रिलरी टंगल्स 3,4 के रूप में इंट्रासेल्युलर हाइपरफॉस्फोराइलेटेड ताऊ संचय। बीटा- और गामा-स्राव के माध्यम से एमिलॉयड अग्रदूत प्रोटीन (एपीपी) के एंडोप्रोटियोलाइटिक दरार द्वारा गठित, एβ ऑलिगोमर्स और फाइब्रिल बनाने के लिए समुच्चय करता है, जिससे न्यूरोटॉक्सिक प्रभावहोता है 5. 1980 के दशक से एक प्राथमिक रोग भूमिका निभाने के लिए Aβ की परिकल्पना की गई है, और ईस्वी6 के लिए एकमात्र एफडीए-अनुमोदित रोग-संशोधित चिकित्सा का चिकित्सीय लक्ष्य है। नतीजतन, ट्रांसजेनिक एडी माउस मॉडल जीन में उत्परिवर्तन को आश्रय देते हैं जिसके परिणामस्वरूप मजबूत सेरेब्रल एβ संचय होता है, 1990 के दशककी शुरुआत से प्रीक्लिनिकल एडी अनुसंधान के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

इन एडी ट्रांसजेनिक माउस दिमाग में एβ प्रजातियों का पता लगाना आम तौर पर दो इम्यूनोसेस का उपयोग करके किया जाता है: एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) और इम्यूनोस्टेनिंग। पूर्व परख विभिन्न Aβ प्रजातियों के मात्रात्मक निर्धारण को सक्षम बनाता है और इम्यूनोस्टेनिंग की तुलना में कम समय लेने वाला है, जिसके लिए ऊतक सेक्शनिंग, इम्यूनोस्टेनिंग, इमेजिंग और परिमाणीकरण सहित कई अनुक्रमिक ऊतक प्रसंस्करण और इमेजिंग चरणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इम्यूनोस्टेनिंग के बाद प्राप्त परिणाम अर्ध-मात्रात्मक8 हैं। हालांकि, स्थानिक रूप से स्थानीयकरण करने की क्षमता एβ मस्तिष्क के ऊतकों में एβ का पता लगाने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग को एक आकर्षक दृष्टिकोण बनातीहै 8.

Aβ इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करते समय, विभिन्न अनुसंधान समूहों द्वारा कई अलग-अलग परिमाणीकरण प्रतिमानों को नियोजित किया गया है। उदाहरण के लिए, कुछ शोध समूह ब्याज के पूरे क्षेत्र (कॉर्टेक्स या हिप्पोकैम्पस) में एβ लोड की मात्रा निर्धारित करते हैं, जबकि अन्य ब्याज के निर्दिष्ट उप-क्षेत्र (कॉर्टेक्स या हिप्पोकैम्पस का एक हिस्सा) 9,10,11 में एβ लोड की मात्रा निर्धारित करते हैं। यद्यपि Aβ का पता लगाने और परिमाणीकरण के तरीकों को अच्छी तरह से स्थापित और प्रलेखित किया गया है, इम्यूनोस्टेनिंग के बाद Aβ लोड माप पर ब्याज के क्षेत्र के आकार के प्रभाव की सूचना नहीं दी गई है। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर, इमेजजे का उपयोग करके ब्याज के पूर्ण और उप-क्षेत्रों में एβ लोड माप की तुलना करना है।

वर्तमान अध्ययन में 13 महीने के एपीपी / पीएस 1 डबल ट्रांसजेनिक नर चूहों का उपयोग किया गया था, जो एडी12 की शुरुआती शुरुआत को मॉडल करने के लिए एक चिमेरिक माउस / मानव एपीपी और एक उत्परिवर्ती प्रेसेनिलिन 1 व्यक्त करते हैं। Aβ जमा 6-7 महीने की उम्र तक विकसित होने लगते हैं, और12 साल की उम्र के 9-10 महीने तक इन चूहों के प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस दोनों में प्रचुर मात्रा में Aβ संचय देखा जाता है। ट्रांसजेनिक अमाइलॉइड पेप्टाइड्स और होलोप्रोटीन को 6 ई 10-इम्यूनोस्टेनिंग13 द्वारा पता लगाया जा सकता है, जिससे यह वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए एक वांछनीय पशु मॉडल बन जाता है। यहां कवर की गई प्रक्रिया में मस्तिष्क के ऊतकों की तैयारी, फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन की इम्यूनोस्टेनिंग, इमेजिंग और ब्याज के पूर्ण बनाम उप-क्षेत्रों में एβ लोड का परिमाणीकरण शामिल है। विश्लेषण पूर्ण और उप-क्षेत्रीय परिमाणीकरण के बीच एक मजबूत सहसंबंध दिखाता है, जो 13 महीने पुराने एपीपी / पीएस 1 नर चूहों से प्राप्त मस्तिष्क ऊतक वर्गों में इन दो विधियों के बीच मजबूत समझौते का संकेत देता है जो प्रचुर मात्रा में एβ जमा दिखाते हैं।

Protocol

कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन, संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत विश्वविद्यालय प्रयोगशाला पशु संसाधनों के अनुपालन में सभी पशु प्रयोग किए गए थे। प्रयोगों को नर बी 6 सी 3-टीजी (एपीपीएसडब्ल्यूई, पीएसईएन 1 डीई 9) 85 डीबीओ / एमएमजैक्स (एपीपी / पीएस 1) चूहों (13 महीने पुराना, एन = 35) के साथ किया गया था। चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. मस्तिष्क ऊतक तैयारी

  1. पेंटोबार्बिटल-आधारित संवेदनाहारी (150 मिलीग्राम / किग्रा) की घातक खुराक का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें जो अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के बाद इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया है ( सामग्री की तालिका देखें)। मस्तिष्क वास्कुलचर14 को साफ करने के लिए 5 एमएल / मिनट की गति से 5 मिनट के लिए बर्फ-ठंडा फॉस्फेट-बफर खारा (1 एक्स पीबीएस) के साथ कार्डियक छिड़काव करें।
  2. पहले प्रकाशित रिपोर्ट15 के बाद हार्वेस्ट मस्तिष्क के ऊतक, बाएं और दाएं मस्तिष्क गोलार्ध में अलग हो जाते हैं और प्रत्येक माउस के दाहिने हेमी-मस्तिष्क को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखते हैं जिसमें 4 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए 1 एक्स पीबीएस में ताजा तैयार 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान के 5 एमएल होते हैं।
    नोट: अध्ययन किए जा रहे एंटीजन के आधार पर दिमाग को 24-72 घंटे से विसर्जन-तय किया जा सकता है। सेरिबैलम के बिना बाएं हेमी-मस्तिष्क को तरल नाइट्रोजन में स्नैप-जमे हुए किया जा सकता है और फिर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, इसके बाद एलिसा और जैव रासायनिक एβ डिटेक्शन 16 जैसे जैव रासायनिकपरखों के लिए प्रसंस्करण किया जा सकता है।
    सावधानी: पीएफए एक संभावित कार्सिनोजेन है, और पीएफए के साथ त्वचा के संपर्क से एलर्जी त्वचा के लक्षण हो सकते हैं। इसे संभालने के लिए नाइट्राइल या ब्यूटाइल दस्ताने, मास्क और आंखों की सुरक्षा का उपयोग करें, और एक रासायनिक धूआं हुड के तहत तैयार करें।
  3. 4% पीएफए में इनक्यूबेशन के बाद, 24 घंटे के लिए 1 एक्स पीबीएस में तैयार 10%, 20%, और 30% सुक्रोज समाधानों के 5 एमएल में क्रमिक रूप से हेमी-दिमाग सेते हैं, प्रत्येक 4 डिग्री सेल्सियस पर जब तक मस्तिष्क ऊतक शंक्वाकार ट्यूब के नीचे डूब नहीं जाता।
  4. 30% सुक्रोज समाधान में इनक्यूबेशन के बाद, हेमी-मस्तिष्क को हटा दें, अतिरिक्त सुक्रोज समाधान को हटाने के लिए धीरे-धीरे मस्तिष्क को फिल्टर पेपर पर थपकाएं, और 30 मिनट के लिए पाउडर सूखी बर्फ में निश्चित हेमी-मस्तिष्क को फ्रीज करें। क्रायोसेक्शनिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से लेबल एल्यूमीनियम पन्नी में जमे हुए हेमी-मस्तिष्क को स्टोर करें।
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में, हेमी-दिमाग 6-8 महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे।
  5. क्रायोस्टैट का उपयोग करके जमे हुए हेमी-मस्तिष्क को 20 μm मोटी वर्गों में विभाजित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए, हेमी-दिमाग को धनु वर्गों में विभाजित किया गया था, और यदि आवश्यक हो, तो कोरोनल अनुभाग भी तैयार किए जा सकते हैं17. चरण 2 निश्चित और क्रायोप्रोटेक्टेड मस्तिष्क ऊतक के नमूनों पर इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने के लिए है।

2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. धनु मस्तिष्क ऊतक वर्गों (चरण 1.5) को 24-अच्छी तरह से प्लेट में रखें (प्रति 300 μL प्रति छह माउस मस्तिष्क वर्गों तक)। कोमल घूमने के साथ एक प्रकार के बरतन पर थाली रखकर कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर तीन बार 1x पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए धो लें।
  2. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएच20 में 70% फॉर्मिक एसिड के साथ मस्तिष्क के ऊतकों वर्गों सेते हैं।
    सावधानी: फॉर्मिक एसिड संक्षारक है, इसलिए त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें।
  3. कमरे के तापमान पर तीन बार डीएच20 के साथ 5 मिनट के लिए मस्तिष्क के ऊतकों वर्गों को धो लें।
  4. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 1x पीबीएस में 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 0.3% ट्राइटोनएक्स 100 ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी ब्लॉक करें।
  5. 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.3% ट्राइटनएक्स 100 युक्त 1 एक्स पीबीएस में फ्लोरोफोर-लेबल वाले प्राथमिक एंटीबॉडी (6 ई 10, सामग्री की तालिका देखें) पतला (1: 1000) के साथ मस्तिष्क के ऊतक वर्गों सेते हैं।
    नोट: चूंकि प्राथमिक एंटीबॉडी फ्लोरोफोर-संयुग्मित है, इसलिए प्लेट को इस चरण से आगे कवर करने की आवश्यकता है, या फ्लोरोफोर प्रभावशीलता को बनाए रखने के लिए सभी काम एक अंधेरे कमरे में किए जाने चाहिए।
  6. कमरे के तापमान पर तीन बार 1x पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए मस्तिष्क के ऊतक वर्गों धो लें।
  7. शेष लवणों को हटाने के लिए डीएच20 के साथ एक संक्षिप्त धोने के बाद, सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए ग्लास स्लाइड्स (सामग्री की तालिका देखें) पर मस्तिष्क के ऊतक वर्गों को माउंट करें जो अच्छी तरह से लेबल किए गए हैं (स्लाइड पर लेबल जानकारी वरीयता पर आधारित है)। स्लाइड्स को अंधेरे में सूखने दें।
    नोट: मस्तिष्क वर्गों को डेटा परिमाणीकरण को प्रभावित करते हुए सिलवटों और चीरों से बचने के लिए सावधानीपूर्वक घुड़सवार किया जाना चाहिए। या सिलवटों के मामले में जो ब्याज के क्षेत्र में झूठ बोलते हैं और डेटा परिमाणीकरण में हस्तक्षेप कर सकते हैं, फिर से धुंधला और फिर से बढ़ते की सिफारिश की जाती है।
  8. एक जलीय बढ़ते मीडिया के साथ मस्तिष्क के ऊतकों वर्गों को माउंट करें ( सामग्री की तालिका देखें) और ऊतक पर ग्लास कवरस्लिप रखें। स्पष्ट नाखून पॉलिश के साथ कवरस्लिप के सिरों को सील करें और इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड बॉक्स में स्लाइड स्टोर करें।
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में, स्लाइड धुंधला होने के बाद 1 महीने के भीतर इमेज किए गए थे।

3. इमेजिंग

  1. प्रतिदीप्ति (एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल) माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके 6 ई 10-दाग वाले मस्तिष्क वर्गों की छवि, जिसमें एक छवि में पूरे मस्तिष्क ऊतक अनुभाग को कैप्चर करने के लिए 2x उद्देश्य है और उपयुक्त फिल्टर (इस काम में जीएफपी) से लैस है।
    नोट:: इमेजिंग सेटिंग्स विभिन्न स्लाइड्स भर में संगत होना चाहिए।
  2. कैप्चर की गई छवियों को एक टीआईएफएफ फ़ाइल के रूप में या आवश्यकतानुसार सहेजें और उन्हें छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में खोलें ( सामग्री की तालिका देखें) जैसा कि 6E10 मात्रा का ठहराव के लिए नीचे चरण 4.2 में वर्णित है।
    नोट: छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, इमेजजे में मात्रा निर्धारित करने के लिए छवि को कैप्चर करने से पहले एक स्केल बार शामिल करें।

4. ब्याज विश्लेषण का पूर्ण क्षेत्र

नोट: वर्तमान कार्य के ब्याज के दो क्षेत्र हिप्पोकैम्पस और आईएसओ-कॉर्टेक्स हैं। ब्याज विश्लेषण का पूर्ण क्षेत्र पूरे आईएसओ-कॉर्टेक्स (जिसे आगे बढ़ने वाले कॉर्टेक्स के रूप में संदर्भित किया जाता है) या इमेज किए गए मस्तिष्क ऊतक अनुभाग में हिप्पोकैम्पस के विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करता है।

  1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर डाउनलोड करें ( सामग्री की तालिका देखें) और एक बार स्थापित होने के बाद सॉफ़्टवेयर शुरू करें।
  2. सॉफ्टवेयर चलने के बाद फाइल | पर क्लिक करें | खोलें विश्लेषण करने के लिए छवि चुनें ।
  3. एनालिसिस | पर क्लिक करें स्केल सेट करें| स्केल निकालने के लिए क्लिक करें. सॉफ़्टवेयर टूल बार से सीधे टूल का चयन करें और स्केल बार की लंबाई के साथ एक सीधी रेखा खींचें। एनालिसिस | पर क्लिक करें मापें। पिक्सेल में स्केल बार की लंबाई या दूरी पर ध्यान दें। एनालिसिस | पर क्लिक करें स्केल सेट करें।
    1. पॉप-अप विंडो में, पिक्सेल में दूरी दर्ज करें, स्केल बार की ज्ञात दूरी (इस मामले में μm में), और लंबाई की इकाई μm के रूप में। एकाधिक छवियों को संसाधित कर रहे हैं, तो सभी निम्न छवियों के लिए नई स्केल सेटिंग लागू करने के लिए ग्लोबल की जाँच करें। सेटिंग्स को लागू करने के लिए ठीक क्लिक करें।
      नोट: यह हमेशा जांचने की सिफारिश की जाती है कि आगे के विश्लेषण से पहले छवि पर सटीक पैमाने लागू होता है या नहीं।
  4. अनुभाग के क्षेत्र में वांछित माप सेट करने के लिए, विश्लेषण करें पर जाएँ | माप | सेट करें क्षेत्र और प्रदर्शन लेबल बॉक्स का चयन करें. जाँचें कि विश्लेषण की जा रही छवि रीडायरेक्ट के तहत चयनित है।
  5. हिप्पोकैम्पस या कॉर्टेक्स विज़ुअलाइज़ेशन में आसानी के लिए, छवि | पर जाएं | समायोजित करें चमक/कंट्रास्ट। अधिकतम स्लाइड बार को धीरे-धीरे बाईं ओर खींचें ऊतक स्पष्टता बढ़ाने के लिए जब तक कि ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्रों की पहचान न हो।
    नोट:: विश्लेषण के दौरान झूठी माप से बचने के लिए इस सेटिंग को लागू न करें, इसके बजाय अगले चरण पर आगे बढ़ें।
  6. हिप्पोकैम्पस क्षेत्र को रेखांकित करने के लिए बहुभुज चयन या फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करें। मूल चमक पर वापस जाने के लिए हिप्पोकैम्पस को रेखांकित करने के बाद चमक / कंट्रास्ट सेटिंग्स के रीसेट विकल्प पर क्लिक करें।
    नोट: चरणों को कॉर्टिकल क्षेत्र के लिए अलग से दोहराया जाना चाहिए।
  7. चयनित क्षेत्र के कुल ऊतक क्षेत्र को मापने के लिए, संपादित करें पर क्लिक करें | बाहर साफ़ करें। एक बार चयनित क्षेत्र स्क्रीन पर एकमात्र छवि है, विश्लेषण पर क्लिक करें | एक पॉप-अप विंडो में विश्लेषण किए गए कुल ऊतक क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए उपाय करें। बाद में उपयोग के लिए डेटा को एक्सेल फ़ाइल में सहेजें।
  8. 6E10-पॉजिटिव क्षेत्र को मापने के लिए, छवि | पर जाएँ | समायोजित करें रंग दहलीज। थ्रेसहोल्डिंग विधि के तहत एक पूर्व-निर्मित फ़िल्टर आमतौर पर लाल रंग में सबसे मजबूत संकेतों को उजागर करने वाले वांछित परिणाम प्रदान करता है।
    नोट: इष्टतम थ्रेसहोल्ड चयन छवि की पृष्ठभूमि और धुंधला तीव्रता पर निर्भर करेगा। एक थ्रेशोल्ड सेटिंग का चयन करें जो दाग उठाता है और पृष्ठभूमि नहीं।
  9. उपयुक्त थ्रेसहोल्ड का चयन करने के बाद, डार्क पृष्ठभूमि की जांच करें। यह एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर Aβ धब्बे (ब्याज का दाग) को उजागर करेगा। सेलेक्ट | पर क्लिक करें। मूल | एक सफेद पृष्ठभूमि पर अंधेरे संकेत (Aβ जमा) दे, का चयन करें। एनालिसिस | पर क्लिक करें कणों का विश्लेषण करें और पॉप-अप विंडो उत्पन्न होने पर ठीक क्लिक करें।
  10. संपादन पर क्लिक करके सॉफ़्टवेयर द्वारा उत्पन्न सारांश आउटपुट की प्रतिलिपि बनाएँ | कॉपी करें। संबंधित लेबल के साथ पहले से शुरू की गई एक्सेल फ़ाइल में पेस्ट करें। यह ब्याज के चयनित क्षेत्रों (या तो हिप्पोकैम्पस या कॉर्टेक्स) में 6 ई 10-सकारात्मक क्षेत्र है।
    नोट: एक्सेल में, कुल 6E10-सकारात्मक क्षेत्र (चरण 4.10) और कुल ऊतक क्षेत्र (चरण 4.7) के लिए एक कॉलम होगा।
  11. निम्नानुसार 6E10-धनात्मक क्षेत्र (%) की गणना करें16: (कुल 6E10-धनात्मक क्षेत्र/कुल ऊतक क्षेत्र का विश्लेषण) x 100।

5. ब्याज विश्लेषण का उप-क्षेत्र

नोट: ब्याज विश्लेषण का उप-क्षेत्र इमेज किए गए मस्तिष्क ऊतक अनुभाग में कॉर्टेक्स या हिप्पोकैम्पस के एक हिस्से के विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करता है।

  1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर डाउनलोड करें और एक बार इंस्टॉल होने के बाद सॉफ़्टवेयर शुरू करें।
  2. सॉफ्टवेयर चलने के बाद फाइल | पर क्लिक करें | खोलें विश्लेषण करने के लिए छवि चुनें ।
  3. एनालिसिस | पर क्लिक करें स्केल सेट करें| स्केल निकालने के लिए क्लिक करें. सॉफ़्टवेयर टूलबार से सीधे टूल का चयन करें और स्केल बार की लंबाई के साथ एक सीधी रेखा खींचें। एनालिसिस | पर क्लिक करें मापें। पिक्सेल में स्केल बार की लंबाई या दूरी पर ध्यान दें। एनालिसिस | पर क्लिक करें स्केल सेट करें।
    1. पॉप-अप विंडो में, पिक्सेल में दूरी दर्ज करें, स्केल बार की ज्ञात दूरी (इस मामले में μm में), और लंबाई की इकाई को μm के रूप में दर्ज करें। एकाधिक छवियों को संसाधित कर रहे हैं, तो सभी निम्न छवियों के लिए नई स्केल सेटिंग लागू करने के लिए ग्लोबल की जाँच करें। सेटिंग्स को लागू करने के लिए ठीक क्लिक करें।
      नोट: यह हमेशा जांचने की सिफारिश की जाती है कि आगे के विश्लेषण से पहले छवि पर सटीक पैमाने लागू होता है या नहीं।
  4. अनुभाग के क्षेत्र में वांछित माप सेट करने के लिए, विश्लेषण करें पर जाएँ | माप | सेट करें क्षेत्र और प्रदर्शन लेबल बक्सों का चयन करें. जाँचें कि विश्लेषण की जा रही छवि रीडायरेक्ट के तहत चयनित है।
  5. चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें यदि छवि बहुत मंद है और मस्तिष्क क्षेत्रों (जैसे, हिप्पोकैम्पस या इस मामले में प्रांतस्था) को आसानी से पहचाना नहीं जा सकता है। सॉफ्टवेयर टूलबार का उपयोग करें और छवि | पर क्लिक करें | समायोजित करें कंट्रास्ट और ऊतक दृश्यता बढ़ाने के लिए आवश्यकतानुसार बाईं ओर अधिकतम स्लाइडर्स खींचें।
    नोट:: विश्लेषण के दौरान झूठी माप से बचने के लिए इस सेटिंग को लागू न करें, इसके बजाय अगले चरण पर आगे बढ़ें।
  6. आयत उपकरण का उपयोग करके, प्रांतस्था या हिप्पोकैम्पस में रुचि के क्षेत्र का चयन करें। टूलबार का उपयोग करें और संपादित करें पर क्लिक करें | चयन | निर्दिष्ट करें, ऊँचाई और चौड़ाई को पूर्व-निर्धारित मान में परिवर्तित करें. बॉक्स को समायोजित करें, इसलिए यह पूरी तरह से ऊतक द्वारा कवर किया गया है। मूल चमक पर वापस जाने के लिए चमक/कंट्रास्ट रीसेट करें।
    नोट: ब्याज के क्षेत्रों का चयन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बॉक्स का आकार सभी छवियों के लिए सुसंगत होना चाहिए। वर्तमान विश्लेषण के लिए, बॉक्स का आकार या तो 300 पिक्सेल x 300 पिक्सेल (1177 μm x 1177 μm के बराबर) या 400 पिक्सेल x 200 पिक्सेल (1569 μm x 784 μm के बराबर) था।
  7. बॉक्स पर राइट-क्लिक करके और डुप्लिकेट पर क्लिक करके ब्याज के चयनित क्षेत्र को डुप्लिकेट करें। चयनित क्षेत्र के साथ एक नई विंडो खुलेगी। उस क्षेत्र को प्रदर्शित करने के लिए डुप्लिकेट की गई छवि का नाम बदलें जिसमें यह स्थित है (उदाहरण के लिए, कॉर्टेक्स या हिप्पोकैम्पस)।
  8. टूलबार का उपयोग करके और छवि | पर क्लिक करके डुप्लिकेट छवि प्रकार समायोजित करें | टाइप करें सजीले टुकड़े का सर्वोत्तम विश्लेषण करने के लिए डुप्लिकेट की गई आरजीबी छवि को 8-बिट में परिवर्तित करने के लिए 8-बिट। संपादित करें पर क्लिक करके छवि को पलटें | उल्टा करें।
  9. 6E10-पॉजिटिव क्षेत्र को मापने के लिए, छवि | पर जाएँ | समायोजित करें थ्रेसहोल्ड। थ्रेसहोल्डिंग विधि के तहत एक पूर्व-परिभाषित फ़िल्टर आमतौर पर लाल रंग में सबसे मजबूत संकेतों को उजागर करके वांछित परिणाम प्रदान करता है।
    नोट: इष्टतम थ्रेसहोल्ड चयन छवि की पृष्ठभूमि और धुंधला तीव्रता पर निर्भर करेगा। एक थ्रेशोल्ड सेटिंग का चयन करें जो दाग उठाता है और पृष्ठभूमि नहीं।
  10. उपयुक्त थ्रेशोल्ड का चयन करने के बाद, लागू करें का चयन करें।
  11. 6E10-सकारात्मक क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए, टूलबार का उपयोग करें और विश्लेषण | पर क्लिक करें कणों का विश्लेषण करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि "सारांश परिणाम" की जाँच की जाती है।
  12. संपादन पर क्लिक करके सॉफ़्टवेयर द्वारा जनरेट किए गए % क्षेत्र के साथ सारांश आउटपुट की प्रतिलिपि बनाएँ | कॉपी करें। संबंधित लेबल के साथ पहले से शुरू की गई एक्सेल फ़ाइल में पेस्ट करें।
  13. ऊतक में विभिन्न क्षेत्रों के लिए चरण 5.3-5.12 दोहराएं। सुनिश्चित करें कि ब्याज के क्षेत्र को रेखांकित करने के लिए प्रत्येक बॉक्स की नियुक्ति प्रत्येक छवि के बीच सुसंगत है।
    नोट: रोटेशन उपकरण का उपयोग किया जा सकता है यदि आयत टूलबॉक्स आयाम ऊतक वक्रता के कारण निर्दिष्ट क्षेत्र में फिट नहीं हो सकते हैं।
  14. आयत को घुमाने के लिए, टूलबार का उपयोग करें और संपादित करें पर क्लिक करें | चयन | रोटेशन डिग्री को आवश्यकतानुसार घुमाएं और समायोजित करें। चरण 5.7 में उल्लिखित छवि को डुप्लिकेट करें और टूलबार का उपयोग करके और संपादित करें पर क्लिक करके बाहर साफ़ करें | बाहर साफ़ करें, जो निर्दिष्ट आयत के बाहर 6 ई 10 दाग को साफ करता है। ऊपर वर्णित चरण 5.8 के साथ आगे बढ़ें।

Representative Results

यहां, हिप्पोकैम्पस में 6 ई 10-पॉजिटिव क्षेत्र और माउस मस्तिष्क के ऊतकों के प्रांतस्था को मापने के लिए दो अलग-अलग तरीकों की तुलना की जाती है। दो विधियां ब्याज विश्लेषण (चित्रा 1) के पूर्ण-क्षेत्र और उप-क्षेत्र हैं। ब्याज विश्लेषण का पूर्ण क्षेत्र, जैसा कि नाम से पता चलता है, 6 ई 10-पॉजिटिव क्षेत्र (चित्रा 1 ए, बी) निर्धारित करने के लिए ब्याज के पूरे क्षेत्र (इस मामले में, आईएसओ-कॉर्टेक्स या हिप्पोकैम्पस) को रेखांकित करना शामिल है। ब्याज विश्लेषण के उप-क्षेत्र में 6 ई 10-पॉजिटिव क्षेत्र (चित्रा 1 सी, डी) निर्धारित करने के लिए ब्याज के क्षेत्र के भीतर एक पूर्व-परिभाषित क्षेत्र का चयन करना शामिल है। दो विधियों के लिए चरणबद्ध इमेजजे प्रोटोकॉल चित्रा 2, चित्रा 3 और चित्रा 4 में दिखाया गया है।

इस अध्ययन में तीन पाठकों का उपयोग किया गया; दो स्वतंत्र पाठकों ने ब्याज विश्लेषण के उप-क्षेत्र का प्रदर्शन किया, और तीसरे पाठक ने ब्याज विश्लेषण के पूर्ण क्षेत्र का प्रदर्शन किया। जैसा कि चित्रा 5 ए, बी में देखा गया है, ब्याज विश्लेषण के उप-क्षेत्र (पियर्सन सहसंबंध गुणांक आर = 0.97 और हिप्पोकैम्पस के लिए आर = 0.96) प्रदर्शन करने वाले दो पाठकों द्वारा रिपोर्ट किए गए 6 ई 10-सकारात्मक क्षेत्र के बीच एक मजबूत महत्वपूर्ण सकारात्मक सहसंबंध (पी < 0.0001) था। ब्याज विश्लेषण के उप-क्षेत्र के लिए दो पाठकों द्वारा रिपोर्ट किए गए 6 ई 10-पॉजिटिव क्षेत्रों का औसत औसत था, और ब्याज के औसत उप-क्षेत्र 6 ई 10-पॉजिटिव क्षेत्र ने कॉर्टेक्स (पियर्सन सहसंबंध गुणांक आर = 0.96) दोनों के लिए ब्याज विश्लेषण के पूर्ण क्षेत्र का उपयोग करके प्राप्त 6 ई 10-सकारात्मक क्षेत्र के साथ एक मजबूत महत्वपूर्ण सकारात्मक सहसंबंध (पी < 0.0001) साझा किया; चित्रा 5 सी) और हिप्पोकैम्पस (पियर्सन सहसंबंध गुणांक आर = 0.95; चित्रा 5 डी)। ब्याज विश्लेषण के पूर्ण क्षेत्र और उप-क्षेत्र द्वारा प्राप्त औसत कॉर्टिकल- और हिप्पोकैम्पस -6 ई 10-सकारात्मक क्षेत्र बिना किसी महत्वपूर्ण अंतर के तुलनीय थे, दो तरीकों (चित्रा 5 ई) के बीच समझौते की पुष्टि करते हुए। इसके अलावा, अघुलनशील Aβ1-42 को चूहों के सबसेट में पूरे मस्तिष्क होमोजेनेट्स में मापा गया था और कॉर्टिकल (चित्रा 5 एफ) और हिप्पोकैम्पस (चित्रा 5 जी) ब्याज विश्लेषण के पूर्ण क्षेत्र द्वारा निर्धारित 6 ई 10-पॉजिटिव क्षेत्र काफी था (पी < 0.01) एलिसा का उपयोग करके अघुलनशील एβ1-42 लोड के साथ सहसंबद्ध था (सामग्री की तालिका देखें)।

Figure 1
चित्रा 1: ब्याज चयन के पूर्ण बनाम उप-क्षेत्र। प्रतिनिधि छवियां क्रमशः (ए) और (बी) में ब्याज विश्लेषण के पूर्ण क्षेत्र के लिए उल्लिखित पूर्ण आईएसओ-कॉर्टेक्स (कॉर्टेक्स) और हिप्पोकैम्पस दिखाती हैं। प्रतिनिधि छवियां क्रमशः (सी) और (डी) में ब्याज विश्लेषण के उप-क्षेत्र के लिए कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस के उप-क्षेत्र / स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ब्याज के पूर्ण क्षेत्र के लिए प्रोटोकॉल 6E10-सकारात्मक क्षेत्र मात्रा का ठहराव। विपरीत समायोजन (बी), ब्याज के क्षेत्र का चयन (सी), समाशोधन (डी), थ्रेशोल्ड समायोजन (ई), और विश्लेषण (एफ) के लिए तैयार अंतिम छवि दिखाते हुए छवि विश्लेषण चरण। आकृति में संख्याप्रोटोकॉल में चरण संख्याओं को नामित करती है। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ब्याज के उप-क्षेत्र के लिए प्रोटोकॉल 6E10-सकारात्मक क्षेत्र मात्रा का ठहराव। विपरीत समायोजन (बी) के बाद छवि, ब्याज के क्षेत्र (सी) का चयन, ब्याज के क्षेत्र (डी) की छवि का दोहराव, छवि को 8-बिट में बदलना और छवि (ई), थ्रेशोल्ड समायोजन (एफ), और विश्लेषण (जी) के लिए तैयार अंतिम छवि को उलटना। आकृति में संख्याप्रोटोकॉल में चरण संख्याओं को नामित करती है। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ब्याज रोटेशन के क्षेत्र के लिए प्रोटोकॉल। ऊतक वक्रता (ए), दोहराव (बी) के बाद ब्याज के क्षेत्र की छवि, और बाहर (ब्याज के गैर-क्षेत्र) क्षेत्र (सी) को साफ़ करने के बाद छवि को फिट करने के लिए चयन बॉक्स के ब्याज और रोटेशन के क्षेत्र के चयन को दिखाते हुए छवि विश्लेषण कदम। आकृति में संख्याप्रोटोकॉल में चरण संख्या निर्दिष्ट करती है। स्केल बार = 200 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ब्याज विश्लेषण के पूर्ण और उप-क्षेत्रों के बीच सहसंबंध। स्कैटर प्लॉट कॉर्टेक्स (ए) और हिप्पोकैम्पस (बी) के लिए ब्याज विश्लेषण के उप-क्षेत्र का प्रदर्शन करने वाले दो स्वतंत्र पाठकों द्वारा 6 ई 10-पॉजिटिव क्षेत्र के बीच सहसंबंध दिखाते हैं। ब्याज विश्लेषण के उप-क्षेत्र और प्रांतस्था (सी) और हिप्पोकैम्पस (डी) दोनों के लिए ब्याज विश्लेषण के पूर्ण क्षेत्र के परिणामस्वरूप 6 ई 10-सकारात्मक क्षेत्र के बीच एक मजबूत सकारात्मक सहसंबंध देखा जाता है। ब्याज के पूर्ण क्षेत्र और प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस (ई) में ब्याज विश्लेषण के उप-क्षेत्र द्वारा औसत 6 ई 10-सकारात्मक क्षेत्र में कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। एलिसा का उपयोग करके पूरे मस्तिष्क होमोजेनेट अघुलनशील Aβ1-42 माप और कॉर्टेक्स (एफ) और हिप्पोकैम्पस (जी) दोनों के लिए ब्याज विश्लेषण के पूर्ण क्षेत्र के बीच एक महत्वपूर्ण सहसंबंध मनाया जाता है। पियर्सन सहसंबंध गुणांक, आर, इन (ए-डी) और (एफ-जी) का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था, और ग्राफिंग और सांख्यिकी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके (ई) में दो-तरफा दोहराया-उपाय एनोवा का उपयोग करके। डेटा को माध्य ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया जाता है एन = 35 चूहों में (ई), और 0.05 < दो-पूंछ वाले पी को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल धनु सेक्शनिंग के लिए हेमी-मस्तिष्क की तैयारी की प्रक्रिया को रेखांकित करता है, फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन पर 6 ई 10 एंटीबॉडी का उपयोग करके एβ जमा के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला, एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कॉर्टेक्स में एβ जमा की मात्रा का ठहराव और माउस मस्तिष्क ऊतक के हिप्पोकैम्पस के बाद एβ दाग वाले मस्तिष्क वर्गों की इमेजिंग। जबकि मस्तिष्क ऊतकअनुभाग8,10 में Aβ लोड की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रकाशित प्रोटोकॉल हैं, यह प्रोटोकॉल पूरे आईएसओ-कॉर्टेक्स (कॉर्टेक्स के रूप में संदर्भित) और हिप्पोकैम्पस में Aβ लोड की मात्रा का ठहराव में शामिल चरणों का वर्णन करता है, जब यह वांछित हो सकता है। ब्याज विश्लेषण के पूर्ण बनाम उप-क्षेत्रों के बीच सहसंबंध भी प्रदान किया गया है।

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, वर्णित प्रोटोकॉल मुक्त-फ्लोटिंग इम्यूनोस्टेनिंग के अधीन 20 μm मोटी मस्तिष्क ऊतक वर्गों के लिए है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक अनुभाग18 के भीतर इष्टतम एंटीबॉडी प्रवेश होता है। फ्री-फ्लोटिंग तकनीक को इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने के दौरान विभिन्न समाधानों के बीच ऊतक वर्गों को मैन्युअल रूप से स्थानांतरित करने की आवश्यकता हो सकती है, और प्रक्रिया के दौरान ऊतक वर्गों की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग हो सकती है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब ऊतक वर्गों को वर्तमान प्रोटोकॉल में एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए 70% फॉर्मिक एसिड समाधान में डुबोया जाता है, जिससे पतले वर्गों के लिए ऊतक नाजुकता बढ़ जाती है। वर्णित प्रोटोकॉल के वैकल्पिक दृष्टिकोण में मोटे ऊतक वर्गों (जैसे, 30-40 μm) का उपयोग करना या ऊतक वर्गों का उपयोग करना शामिल है जो इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने से पहले सीधे सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए स्लाइड पर घुड़सवार होते हैं। दूसरा, यहां वर्णित प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंटली-लेबल 6 ई 10 एंटीबॉडी का उपयोग करता है। फ्लोरोसेंटली-लेबल 6 ई 10 एंटीबॉडी का उपयोग करने के अलावा, गैर-फ्लोरोसेंट 6 ई 10 एंटीबॉडी (जैसे, हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित 6 ई 10 एंटीबॉडी) का उपयोग मस्तिष्क ऊतक वर्गों में एβ लोड का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है, और वर्तमान प्रोटोकॉल को मस्तिष्क ऊतक वर्गों में एβ-पॉजिटिव इम्यूनोकेमिकल दाग को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जैसा कि पहले वर्णित है8 . तीसरा, Aβ लोड परिमाणीकरण के लिए परिणामों की सटीकता विश्लेषण सॉफ्टवेयर में उपयुक्त थ्रेशोल्ड चयन पर निर्भर करेगी, जो ऊतक पृष्ठभूमि और सिग्नल तीव्रता पर निर्भर है। थ्रेशोल्ड चयन अंतिम उपयोगकर्ता द्वारा किया जाना चाहिए जैसे कि परिमाणीकरण के लिए केवल Aβ-सकारात्मक दाग का चयन किया जाता है। थ्रेशोल्ड सेटिंग की सटीकता को आश्वस्त करने के लिए सभी छवियों पर लागू की जा सकने वाली विशिष्ट थ्रेशोल्ड को अनुकूलित करने के लिए एंड-यूज़र हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है। चौथा, चूंकि ब्याज विश्लेषण के उप-क्षेत्र को ऊतक अनुभाग में रुचि के एक छोटे से क्षेत्र का चयन करने की आवश्यकता होती है, इसलिए इस विश्लेषण के लिए दो स्वतंत्र पाठकों का उपयोग किया गया था। डेटा संग्रह के दौरान स्वतंत्रता और अंधेरे को बनाए रखने के लिए, सभी छवियों को नंबर कोडित किया गया था; छवि विश्लेषण अनुक्रम पाठकों के बीच यादृच्छिक था जैसे कि विभिन्न पाठकों ने किसी भी समय अलग-अलग छवियों का विश्लेषण किया, और डेटा प्रत्येक सप्ताह के अंत में प्रस्तुत किया गया था। ब्याज विश्लेषण के उप-क्षेत्र में ब्याज चयन के क्षेत्र में अंतर-पाठक परिवर्तनशीलता की बढ़ती संभावना के कारण, पाठकों को डेटा संग्रह शुरू करने से पहले प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस में क्षेत्र चयन को अनुकूलित करने के लिए कई नमूना छवियों का उपयोग करके प्रशिक्षित किया गया था। यह प्रशिक्षण अंतर-पाठक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, और जैसा कि देखा जा सकता है (चित्रा 5 ए, बी), दोनों पाठकों द्वारा रिपोर्ट किया गया 6 ई 10-पॉजिटिव क्षेत्र वर्तमान अध्ययन में एक मजबूत सापेक्ष समझौता दिखाता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल और परिणाम Aβ-सकारात्मक क्षेत्र परिमाणीकरण पर ब्याज आकार के क्षेत्र के प्रभाव के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं। ब्याज का एक बड़ा क्षेत्र ब्याज के एक छोटे से क्षेत्र से अधिक ऊतक का प्रतिनिधित्व करने की उम्मीद है। इसलिए, ऊतकों में Aβ भार को सटीक रूप से मापने के लिए एक बड़े ऊतक का नमूना लेना वांछनीय है। हालांकि, ऊतक के भीतर समरूप एβ लोड वितरण के मामले में, एक छोटे नमूना क्षेत्र को आमतौर पर विश्लेषण के तहत बड़े ऊतक का एक अच्छा प्रतिनिधित्व माना जाता है। वर्तमान अध्ययन के परिणाम इसकी पुष्टि करते हैं, और पूरे प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस में एβ लोड प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस (चित्रा 5 सी, डी) के एक चयनित उप-क्षेत्र में एβ लोड का एक मजबूत सहसंबंध था। ब्याज विश्लेषण के पूर्ण और उप-क्षेत्रों के बीच समझौते की पुष्टि करने के लिए, कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस में औसत 6 ई 10-पॉजिटिव क्षेत्र की तुलना की गई थी, और दो तरीकों (चित्रा 5 ई) के बीच कोई अंतर नहीं पाया गया था। यह पुष्टि करता है कि इनमें से कोई भी विधि (पूर्ण- या उप-क्षेत्र विश्लेषण) तुलनीय Aβ लोड माप उत्पन्न करती है।

वर्तमान प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। दो विधियों (पूर्ण-क्षेत्र बनाम उप-क्षेत्र विश्लेषण) का उपयोग हमेशा परस्पर विनिमय के लिए नहीं किया जा सकता है। पूर्ण या उप-क्षेत्र विश्लेषण का उपयोग करने का विकल्प ऊतक के भीतर Aβ के क्षेत्रीय वितरण पर निर्भर करेगा, जो एडी माउस मॉडल की आयु, लिंग और तनाव से प्रभावित होता है। 13 महीनों में, एβ लोड एपीपी / पीएस 1 चूहों के प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस में वितरित किया जाता है। हालांकि, 6 महीनों में, Aβ जमा प्रांतस्था तक सीमित हैं, और हिप्पोकैम्पस12 में न्यूनतम जमा देखे जाते हैं। ऐसी स्थितियों के तहत, ब्याज विश्लेषण का पूर्ण क्षेत्र ऊतक नमूना क्षेत्र को बढ़ाने के लिए वांछित दृष्टिकोण हो सकता है और इस तरह एβ सिग्नल। दूसरी ओर, उप-क्षेत्र विश्लेषण पसंद की विधि हो सकती है जब एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र में एβ लोड ब्याज की होती है, (उदाहरण के लिए, सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स)। इसके अतिरिक्त, 13 महीनों में, एपीपी / पीएस 1 पुरुष चूहों तीव्र 6 ई 10-पॉजिटिव दाग प्रदर्शित करते हैं, और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने के परिणामस्वरूप बहुत कम पृष्ठभूमि के साथ एक उत्कृष्ट संकेत होता है, जिससे वर्तमान प्रोटोकॉल दी गई स्थितियों के तहत मात्रा का ठहराव के लिए बहुत उपयुक्त हो जाता है। यह स्पष्ट नहीं है कि क्या इस परिमाणीकरण विधि को कम तीव्र धुंधला करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है, और इस प्रश्न का उत्तर देने के लिए भविष्य के काम की आवश्यकता होगी। यहां प्रस्तुत इम्यूनोफ्लोरोसेंट और छवि परिमाणीकरण विधि अग्रदूत रूप13 सहित एβ के सभी रूपों का पता लगाती है। नतीजतन, यदि किसी विशिष्ट एβ स्पेकी (जैसे, Aβ1-40 या Aβ1-42) का पता लगाने में रुचि है, तो इन Aβ आइसोफॉर्म के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। इसलिए, हालांकि 6 ई 10 इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला और पता लगाने की विधि एलिसा (चित्रा 5 एफ, जी) का उपयोग करके पूरे मस्तिष्क होमोजेनेट्स में एβ1-42 माप के माप के साथ सहसंबद्ध है, सहसंबंध केवल मामूली था। इसे एलिसा का उपयोग करके केवल Aβ1-42 के माप और 6E10 इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करके सभी Aβ प्रजातियों का पता लगाने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन पूर्ण और उप-क्षेत्रीय विश्लेषणों के बीच समझौते और सहसंबंध का आकलन करने के लिए तीन पाठकों का उपयोग करता है। अतिरिक्त पाठक होने से अध्ययन की मजबूती में सुधार हो सकता है और यहां प्रस्तुत दो तरीकों के बीच समझौतों को और मान्य किया जा सकता है। इसके अलावा, हम समझौते के उपाय के रूप में पियर्सन सहसंबंध का उपयोग करते हैं, जिसका व्यापक रूप से निरंतर चर19 के बीच समझौते का वर्णन करने के लिए अन्य तरीकों के बीच उपयोग किया जाता है। हालांकि, समझौते को निर्धारित करने के लिए पियर्सन सहसंबंध का उपयोग करने की एक सीमा यह है कि यहां उपयोग की जाने वाली दो विधियां संबंधित परिणाम प्रदान कर सकती हैं, लेकिन एक विधि के परिणामस्वरूप व्यवस्थित पूर्वाग्रह के कारण दूसरे की तुलना में समग्र उच्च मूल्य हो सकते हैं। इसलिए, पियर्सन सहसंबंध सापेक्ष समझौते19 का एक अच्छा उपाय है। प्रोटोकॉल की मजबूती को बढ़ाने के लिए, पूर्ण समझौते की पुष्टि करने के लिए अतिरिक्त तरीके, जैसे कि दो तरीकों (चित्रा 5 ई) द्वारा औसत 6 ई 10-सकारात्मक क्षेत्र की तुलना करना,19 का उपयोग किया जा सकता है। एक साथ लिया गया, वर्तमान प्रोटोकॉल इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला द्वारा पता लगाए गए एβ लोड की तुलना करता है और मस्तिष्क के ऊतक वर्गों में रुचि के पूर्ण और उप-क्षेत्रों का विश्लेषण करता है। परिणाम 13 महीने पुराने एपीपी / पीएस 1 नर चूहों से प्राप्त मस्तिष्क के ऊतक वर्गों के लिए इन दो तरीकों के बीच एक मजबूत सहसंबंध दिखाते हैं जो प्रचुर मात्रा में एβ जमा दिखाते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को पुरस्कार संख्या आर 01 एजी 062840 (आरकेएस के लिए) और आर 01 एजी 072896 (आरकेएस के लिए) के तहत नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एजिंग द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है। संघीय धन के लगभग $ 200k (100%) ने इस परियोजना का समर्थन किया। हम पांडुलिपि संपादन के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ जोशुआ यांग को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tubes ThermoFisher Scientific, MA, USA 339650
24-well plates Fisher Scientific, NH, USA FB012929
Amyloid beta 42 human ELISA kit ThermoFisher Scientific, MA, USA KHB3441
Aqueous mounting media Vector laboratories, CA, USA H-5501-60
Bovine serum albumin Sigmaaldrich, MO, USA A2153-50G
BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope Keyence, IL, USA BZ-X710
Clear nail poilsh User preference NA
Cryostat Leica Biosystems, IL, USA Leica CM1860 Cryostat
Formic acid Sigmaaldrich, MO, USA F0507-500ML
Glass coverslips VWR, PA, USA 48393-081
GraphPad Prism GraphPad Software, CA, USA Version 8
ImageJ 1.51k National Institutes of Health, MD, USA Version 1.53e
Mice Jackson Laboratories, ME, USA 034829-JAX
Paraformaldehyde Sigmaaldrich, MO, USA P6148-500G
Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) Patterson Veterinary, MA, USA 07-805-9296
Phosphate-buffered saline Fisher Scientific,  NH, USA BP661-50
Plus (+) microscope slides Ted Pella, Inc., CA, USA 260100
Primary antibody (6E10) Biolegend, CA, USA 803013
Sucrose Sigmaaldrich, MO, USA 47289
Triton X 100 Sigmaaldrich, MO, USA T8787-100ML

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 183
माउस मस्तिष्क अनुभागों पर एमिलॉयड-बीटा लोड का पूर्ण-बनाम उप-क्षेत्रीय परिमाणीकरण
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Ohno, Y., Murphy, R., Choi, M., Ou,… More

Ohno, Y., Murphy, R., Choi, M., Ou, W., Sumbria, R. K. Full- versus Sub-Regional Quantification of Amyloid-Beta Load on Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (183), e63669, doi:10.3791/63669 (2022).

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