Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר ומשווה את ההליך לביצוע ניתוח של אזור מלא או תת-אזור עניין של מקטעי מוח של עכברי sagittal כדי לכמת את עומס העמילואיד-בטא במודל העכבר המהונדס APP/PS1 של מחלת אלצהיימר.
Abstract
הצטברות חוץ-תאית של פלאקים עמילואיד-בטא (Aβ) היא אחד מסימני ההיכר הפתולוגיים העיקריים של מחלת האלצהיימר (AD), והיא היעד של הטיפול היחיד המשנה את המחלה שאושר על ידי ה-FDA עבור AD. בהתאם לכך, השימוש במודלים של עכברים מהונדסים המבטאים יתר על המידה את החלבון המבשר עמילואיד ובכך צוברים פלאקים Aβ מוחיים נמצאים בשימוש נרחב כדי לדגום AD אנושי בעכברים. לכן, בדיקות אימונואסאסאיות, כולל בדיקה חיסונית הקשורה לאנזים (ELISA) ו-immunostaining, מודדות בדרך כלל את עומס ה-Aβ ברקמות המוח שמקורן בעכברים מהונדסים של AD. אף על פי שהשיטות לזיהוי וכימות של Aβ מבוססות היטב ותועדו היטב, ההשפעה של גודל אזור העניין שנבחר ברקמת המוח על מדידות עומס Aβ לאחר שמירה חיסונית לא דווחה. לכן, הפרוטוקול הנוכחי נועד להשוות את מדידות העומס של Aβ על פני האזורים המלאים ותת-האזורים המעניינים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. השלבים המעורבים בהכנת רקמות מוח, חיטוי חיסוני של מקטעי מוח צפים בחופשיות, הדמיה וכימות של עומס Aβ באזורי משנה מלאים לעומת אזורי עניין מתוארים באמצעות מקטעי מוח הנגזרים מעכברים זכרים מהונדסים כפולה של APP/PS1 בני 13 חודשים. הפרוטוקול הנוכחי והתוצאות מספקים מידע רב ערך על ההשפעה של גודל אזור העניין על כימות אזור חיובי Aβ, ומראים מתאם חזק בין האזור החיובי Aβ המתקבל באמצעות ניתוחים מלאים ותת-אזורי עניין עבור מקטעי מוח הנגזרים מעכברי APP/PS1 זכרים בני 13 חודשים המראים תצהיר Aβ נרחב.
Introduction
מחלת האלצהיימר (AD), סיבת המוות השישית המובילה בארצות הברית, ממשיכה להוות איום על בריאות הציבור, עם כ-6.2 מיליון אמריקאים החיים עם אלצהיימר. זה צפוי להגיע ל-13.8 מיליון עד 20601. נכון להיום, ניהול סימפטומטי באמצעות תרופות כגון מעכבי כולינסטראז וממנטין הוא הקורס העיקרי של הטיפול2. AD מאופיין בביטויים נוירופתולוגיים כגון תצהיר חוץ-תאי של פלאקים עמילואיד-בטא (Aβ) והצטברות טאו היפר-פוספורית תוך-תאית בצורה של סבכים נוירו-פיברילריים 3,4. Aβ נוצר על ידי ביקוע אנדופרוטאוליטי של החלבון המבשר עמילואידי (APP) באמצעות בטא וגמא-סודאז, ומצטבר ליצירת אוליגומרים ופיברילים, מה שמוביל להשפעות נוירוטוקסיות5. ההשערה היא ש-Aβ ממלא תפקיד פתולוגי ראשוני מאז שנות ה-80 של המאה ה-20, והוא היעד הטיפולי של הטיפול היחיד בשינוי המחלה שאושר על ידי ה-FDA עבור AD6. כתוצאה מכך, מודלים מהונדסים של עכברי AD המכילים מוטציות בגנים וכתוצאה מכך הצטברות מוחית חזקה של Aβ היו בשימוש נרחב למחקר AD פרה-קליני מאז תחילת שנות ה-907.
זיהוי של מיני Aβ במוחות עכברים מהונדסים אלה של AD נעשה בדרך כלל באמצעות שני מבחנים חיסוניים: בדיקה חיסונית הקשורה לאנזים (ELISA) ושמירה חיסונית. הבדיקה הראשונה מאפשרת קביעה כמותית של מיני Aβ שונים והיא גוזלת פחות זמן בהשוואה לתפיסת חיסון, הדורשת מספר שלבי עיבוד והדמיה רציפים של רקמות, כולל חתך רקמות, חיסון, הדמיה וכימות8. יתר על כן, התוצאות המתקבלות לאחר חיסון הם כמותיים למחצה8. עם זאת, היכולת למקם את Aβ באופן מרחבי הופכת את החיסון לגישה אטרקטיבית לזיהוי Aβ ברקמות המוח8.
בעת השימוש ב-Aβ immunostaining, מספר פרדיגמות כימות שונות שימשו קבוצות מחקר שונות. לדוגמה, קבוצות מחקר מסוימות מכמתות את עומס ה-Aβ בכל אזור העניין (קליפת המוח או ההיפוקמפוס), בעוד שאחרות מכמתות את עומס ה-Aβ בתת-אזור מסוים של עניין (חלק מקליפת המוח או ההיפוקמפוס)9,10,11. אף על פי שהשיטות לזיהוי וכימות Aβ היו מבוססות ומתועדות היטב, ההשפעה של גודל אזור העניין על מדידות עומס Aβ בעקבות חיסון לא דווחה. לכן, הפרוטוקול הנוכחי נועד להשוות את מדידות העומס של Aβ על פני אזורי העניין המלאים ותת-האזורים המעניינים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, ImageJ.
המחקר הנוכחי השתמש בעכברים זכרים מהונדסים כפולים של APP/PS1 בני 13 חודשים, המבטאים אפליקציה של עכבר/אדם כימרי ופרזנילין 1 מוטנטי, כדי לדגום הופעה מוקדמת של12 לספירה. מרבצי Aβ מתחילים להתפתח בגיל 6-7 חודשים, והצטברות Aβ שופעת נצפית הן בקליפת המוח והן בהיפוקמפוס של עכברים אלה עד גיל 9-10 חודשים בגיל12. ניתן לזהות את פפטידי העמילואיד המהונדסים וההולופרוטאין על ידי 6E10-immunostaining13, מה שהופך אותו למודל חייתי רצוי לפרוטוקול הנוכחי. ההליך הנדון כאן כולל הכנת רקמות מוח, חיסון של מקטעים צפים חופשיים, הדמיה וכימות של עומס Aβ באזורי עניין מלאים לעומת תתי-תחומי עניין. הניתוח מראה מתאם חזק בין הכימות המלא והתת-אזורי, מה שמצביע על הסכמה איתנה בין שתי השיטות הללו בקטעי רקמת המוח הנגזרים מעכברי זכרי APP/PS1 בני 13 חודשים שמראים שפע של משקעי Aβ.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם למשאבי בעלי החיים במעבדה האוניברסיטאית תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, אירווין, הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. הניסויים בוצעו עם זכרים B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (APP/PS1) זכרים עכברים (בני 13 חודשים, n = 35). העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).
1. הכנת רקמת המוח
- הרדמה את העכברים באמצעות מינון קטלני של חומר הרדמה מבוסס פניטואין/פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג) המוזרקת באופן תוך-צפקי (ראו טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקולים מאושרים של בעלי חיים. יש לבצע זלוף לבבי עם מי מלח בעלי מאגר פוספט קר כקרח (1x PBS) למשך 5 דקות במהירות של 5 מ"ל לדקה כדי לנקות את כלי הדם במוח14.
- קציר רקמת מוח בעקבות דו"ח15 שפורסם בעבר, נפרד לתוך ההמיספרה השמאלית והימנית של המוח ומניח את ההמי-מוח הימני של כל עכבר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של תמיסת 4% paraformaldehyde (PFA) שהוכנה לאחרונה ב- 4% תמיסת paraformaldehyde (PFA) שהוכנה זה עתה ב- 1x PBS במשך 72 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: המוחות עשויים להיות קבועים בטבילה בין 24-72 שעות בהתאם לאנטיגן הנחקר. המוח ההמי השמאלי, ללא המוח הקטן, יכול להיות קפוא בחנקן נוזלי ולאחר מכן מאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן עיבוד לבדיקות ביוכימיות כגון ELISA וזיהוי ביוכימי Aβ16.
אזהרה: PFA הוא מסרטן סביר, ומגע עור עם PFA עלול להוביל לתסמיני עור אלרגיים בעור. השתמשו בכפפות ניטריל או בוטיל, מסכות והגנה על העיניים לטיפול בו, והתכוננו מתחת למכסה מנוע אדים כימי. - לאחר הדגירה ב-4% PFA, דגירה של המוחות ההמיים ברצף ב-5 מ"ל של 10%, 20% ו-30% תמיסות סוכרוז שהוכנו ב-1x PBS למשך 24 שעות, כל אחת ב-4 מעלות צלזיוס עד שרקמת המוח שוקעת לתחתית הצינור החרוטי.
- לאחר הדגירה בתמיסת 30% סוכרוז, הסירו את המוח ההמי,טפחו בעדינות את המוח על נייר מסנן כדי להסיר את תמיסת הסוכרוז העודפת, והקפיאו את המוח ההמי הקבוע באבקת קרח יבש למשך 30 דקות. אחסנו את מוח ההמי הקפוא ביריעות אלומיניום מסומנות היטב בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד להקפאה.
הערה: בפרוטוקול הנוכחי, המוחות של ההמי אוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 6-8 חודשים. - חתך את המוח ההמי הקפוא למקטעים בעובי 20 מיקרומטר באמצעות קריוסטאט (ראו טבלת חומרים).
הערה: עבור הפרוטוקול הנוכחי, המוחות ההמיים חולקו למקטעים סגיטליים, ובמידת הצורך, ניתן להכין גם מקטעים קורונליים17. שלב 2 הוא עבור צביעה אימונופלואורסצנטית של Aβ על דגימות של רקמת מוח קבועה ומוגנת בהקפאה.
2. אימונופלואורסצנציה
- ממקמים את מקטעי רקמת המוח הסגיטלית (שלב 1.5) בלוחית של 24 בארות (עד שישה מקטעי מוח של עכבר לכל 300 μL לבאר). יש לשטוף במשך 5 דקות עם 1x PBS שלוש פעמים בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס) על ידי הנחת הצלחת על שייקר עם מערבולת עדינה.
- דגירה של מקטעי רקמת המוח עם 70% חומצה פורמית ב-dH20 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
אזהרה: חומצה פורמית היא קורוזיבית, לכן יש להימנע מקשר עור ועיניים. - לשטוף את חלקי רקמת המוח במשך 5 דקות עם dH20 שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
- חסום קשירה לא ספציפית עם 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-0.3% TritonX 100 (ראו טבלת חומרים) ב-1x PBS בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
- דגירה של מקטעי רקמת המוח עם נוגדן ראשוני המסומן בפלואורופור (6E10, ראו טבלת חומרים) מדולל (1:1000) ב-1x PBS המכיל 0.3% TritonX 100 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
הערה: מכיוון שהנוגדן העיקרי הוא מצומד פלואורופור, הצלחת צריכה להיות מכוסה משלב זה ואילך, או שיש לבצע את כל העבודה בחדר חשוך כדי לשמור על יעילות הפלואורופור. - שטפו את חלקי רקמת המוח במשך 10 דקות עם 1x PBS שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
- הרכיבו את חלקי רקמת המוח על שקופיות זכוכית טעונות חיובית (ראו טבלת חומרים) המסומנות היטב (פרטי התווית בשקופית מבוססים על העדפה), לאחר שטיפה קצרה עם dH20 כדי להסיר את המלחים שנותרו. תנו לאוויר המגלשות להתייבש בחושך.
הערה: יש להרכיב את מקטעי המוח בזהירות כדי למנוע קיפולים וקרעים, מה שמשפיע על כימות הנתונים. במקרה של קרעים ו/או קיפולים הנמצאים באזור העניין ועלולים להפריע לכימות הנתונים, מומלץ להכתים מחדש ולהרכיב מחדש. - הרכיבו את חלקי רקמת המוח בעזרת אמצעי הרכבה מימיים (ראו טבלת חומרים) והניחו את כיסוי הזכוכית מעל הרקמה. אטמו את קצות הכיסויים בלק שקוף ואחסנו את השקופיות בקופסת שקופיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להדמיה.
הערה: בפרוטוקול הנוכחי, השקופיות צולמו תוך חודש לאחר ההכתמה.
3. הדמיה
- דמיינו את מקטעי המוח המוכתמים ב-6E10 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אפיפלואורסצנציה או קונפוקלי) (ראו טבלת חומרים), שמטרתו היא פי 2 ללכוד את כל מקטע רקמת המוח בתמונה אחת והוא מצויד במסנן המתאים (GFP בעבודה זו).
הערה: הגדרות ההדמיה חייבות להיות עקביות בשקופיות שונות. - שמור את התמונות שצולמו כקובץ TIFF או כנדרש ופתח אותן בתוכנת ניתוח התמונות (ראה טבלת חומרים) כמתואר בשלב 4.2 להלן לכימות 6E10.
הערה: כלול סרגל קנה מידה לפני לכידת התמונה לכימות בתוכנת ניתוח התמונות, ImageJ.
4. ניתוח אזור מלא של עניין
הערה: שני אזורי העניין של העבודה הנוכחית הם ההיפוקמפוס והאיזו-קליפת המוח. ניתוח אזור מלא של עניין מייצג את הניתוח של כל האיזו-קליפת המוח (המכונה קליפת המוח בהמשך) או של ההיפוקמפוס בקטע רקמת המוח המצולם.
- הורד את תוכנת ניתוח התמונות (ראה טבלת חומרים) והפעל את התוכנה לאחר ההתקנה.
- לאחר הפעלת התוכנה, לחץ על קובץ | | פתוח בחר את התמונה לניתוח.
- לחץ על ניתוח | קבע קנה מידה| לחץ כדי להסיר את קנה המידה. בחר בכלי ישר משורת הכלים של התוכנה וצייר קו ישר לאורך סרגל קנה המידה. לחץ על ניתוח | למדוד. שים לב לאורך או למרחק של סרגל קנה המידה בפיקסלים. לחץ על ניתוח | קבע קנה מידה.
- בחלון הקופץ, הזן את המרחק בפיקסלים, את המרחק הידוע של סרגל קנה המידה (ב- μm במקרה זה), ואת יחידת האורך כ- μm. בדוק גלובלי כדי להחיל את הגדרת קנה המידה החדשה על כל התמונות הבאות אם תמונות מרובות מעובדות. לחץ על אישור כדי להחיל את ההגדרות.
הערה: תמיד מומלץ לבדוק אם קנה המידה המדויק מוחל על התמונה לפני ניתוח נוסף.
- בחלון הקופץ, הזן את המרחק בפיקסלים, את המרחק הידוע של סרגל קנה המידה (ב- μm במקרה זה), ואת יחידת האורך כ- μm. בדוק גלובלי כדי להחיל את הגדרת קנה המידה החדשה על כל התמונות הבאות אם תמונות מרובות מעובדות. לחץ על אישור כדי להחיל את ההגדרות.
- כדי להגדיר את המדידה הרצויה לאזור המקטע, עבור אל נתח | הגדרת מדידות | בחר את התיבות 'תווית אזור' ו'תצוגה'. ודא שהתמונה המנותחת נבחרה תחת ניתוב מחדש אל.
- כדי להקל על ההדמיה של ההיפוקמפוס או קליפת המוח, עבור אל תמונה | התאמת | בהירות/ניגודיות. גרור את סרגל ההחלקה המרבי בהדרגה שמאלה כדי להגביר את בהירות הרקמות עד שניתן יהיה לזהות את אזורי העניין במוח.
הערה: אל תחיל הגדרה זו כדי למנוע מדידות שגויות במהלך הניתוח, במקום זאת המשך לשלב הבא. - השתמש בכלי בחירת מצולע או בחירה ביד חופשית כדי לתאר את אזור ההיפוקמפוס. לחץ על האפשרות איפוס של הגדרות הבהירות/ניגודיות לאחר שההיפוקמפוס מתואר כדי לחזור לבהירות המקורית.
הערה: יש לחזור על הצעדים בנפרד עבור אזור קליפת המוח. - כדי למדוד את שטח הרקמה הכולל של האזור שנבחר, לחץ על ערוך | ברור בחוץ. לאחר שהאזור שנבחר הוא התמונה היחידה על המסך, לחץ על נתח | מדוד כדי לקבל את שטח הרקמה הכולל שנותח בחלון קופץ. שמור את הנתונים בקובץ Excel לשימוש מאוחר יותר.
- כדי למדוד את האזור החיובי של 6E10, עבור אל תמונה | התאמת | סף צבע. מסנן מוכן מראש תחת שיטת Thresholding מספק בדרך כלל את התוצאות הרצויות המדגישות את האותות החזקים ביותר באדום.
הערה: בחירת הסף האופטימלית תהיה תלויה ברקע התמונה ובעוצמת הכתם. בחר הגדרת סף שמרימה את הכתם ולא את הרקע. - לאחר בחירת הסף המתאים, בדוק רקע כהה. זה ידגיש את כתמי Aβ (כתם העניין) על רקע שחור. לחץ על בחר | | מקורי בחר, תוך מתן האותות הכהים (הפקדות Aβ) על רקע לבן. לחץ על ניתוח | נתחו חלקיקים ולחצו על 'אישור ' כאשר החלון הקופץ ייווצר.
- העתק את פלט הסיכום שנוצר על-ידי התוכנה על-ידי לחיצה על ערוך | העתק. הדבק לתוך קובץ Excel שהתחיל בעבר עם תוויות מתאימות. זהו האזור החיובי 6E10 באזורי העניין הנבחרים (או בהיפוקמפוס או בקליפת המוח).
הערה: ב- Excel, תהיה עמודה עבור השטח החיובי הכולל של 6E10 (שלב 4.10) ואזור הרקמה הכולל (שלב 4.7). - חשב את האזור החיובי 6E10 (%) כדלהלן16: (סה"כ 6E10-שטח חיובי / שטח רקמה כולל מנותח) x 100.
5. תת-אזור של ניתוח עניין
הערה: ניתוח תת-אזור עניין מייצג ניתוח של חלק מקליפת המוח או ההיפוקמפוס בחלק של רקמת המוח המצולמת.
- הורד את תוכנת ניתוח התמונות והפעל את התוכנה לאחר ההתקנה.
- לאחר הפעלת התוכנה, לחץ על קובץ | | פתוח בחר את התמונה לניתוח.
- לחץ על ניתוח | קבע קנה מידה| לחץ כדי להסיר את קנה המידה. בחר את הכלי ישר מסרגל הכלים של התוכנה וצייר קו ישר לאורך סרגל קנה המידה. לחץ על ניתוח | למדוד. שים לב לאורך או למרחק של סרגל קנה המידה בפיקסלים. לחץ על ניתוח | קבע קנה מידה.
- בחלון הקופץ, הזן את המרחק בפיקסלים, את המרחק הידוע של סרגל קנה המידה (ב- μm במקרה זה), והזן את יחידת האורך כ- μm. בדוק גלובלי כדי להחיל את הגדרת קנה המידה החדשה על כל התמונות הבאות אם תמונות מרובות מעובדות. לחץ על אישור כדי להחיל את ההגדרות.
הערה: תמיד מומלץ לבדוק אם קנה המידה המדויק מוחל על התמונה לפני ניתוח נוסף.
- בחלון הקופץ, הזן את המרחק בפיקסלים, את המרחק הידוע של סרגל קנה המידה (ב- μm במקרה זה), והזן את יחידת האורך כ- μm. בדוק גלובלי כדי להחיל את הגדרת קנה המידה החדשה על כל התמונות הבאות אם תמונות מרובות מעובדות. לחץ על אישור כדי להחיל את ההגדרות.
- כדי להגדיר את המדידה הרצויה לאזור המקטע, עבור אל נתח | הגדרת מדידות | בחר את התיבות 'אזור' ו'תווית תצוגה'. ודא שהתמונה המנותחת נבחרה תחת ניתוב מחדש אל.
- התאם את הבהירות והניגודיות אם התמונה עמומה מדי ולא ניתן לזהות בקלות את אזורי המוח (למשל, ההיפוקמפוס או קליפת המוח במקרה זה). השתמש בסרגל הכלים של התוכנה ולחץ על תמונה | התאמת | בהירות/ניגודיות וגרור את המחוונים המרביים שמאלה לפי הצורך כדי להגביר את נראות הרקמה.
הערה: אל תחיל הגדרה זו כדי למנוע מדידות שגויות במהלך הניתוח, במקום זאת המשך לשלב הבא. - באמצעות הכלי מלבן, בחר את אזור העניין בקליפת המוח או בהיפוקמפוס. השתמש בסרגל הכלים ולחץ על ערוך | | בחירה ציין, שנה את הגובה והרוחב לערך מוגדר מראש. התאם את התיבה, כך שהיא מכוסה לחלוטין על ידי רקמה. אפס את הבהירות/הניגודיות כדי לחזור לבהירות המקורית.
הערה: גודל התיבה המשמשת לבחירת אזורי העניין חייב להיות עקבי עבור כל התמונות. עבור הניתוח הנוכחי, גודל התיבה היה 300 פיקסלים x 300 פיקסלים (שווה ערך ל- 1177 μm x 1177 μm) או 400 פיקסלים x 200 פיקסלים (שווה ערך ל- 1569 μm x 784 μm). - שכפל את אזור העניין שנבחר על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על התיבה ולחיצה על שכפול. ייפתח חלון חדש עם האזור שנבחר. שנה את שם התמונה המשוכפלת כדי להציג את האזור שבו היא ממוקמת (למשל, קליפת המוח או ההיפוקמפוס).
- התאמת סוג התמונה המשוכפלת באמצעות סרגל הכלים ולחיצה על תמונה | סוג | 8 סיביות כדי להמיר את תמונת ה- RGB המשוכפלת ל- 8 סיביות כדי לנתח בצורה הטובה ביותר את הפלאקים. הפוך את התמונה על-ידי לחיצה על ערוך | הפוך.
- כדי למדוד את האזור החיובי של 6E10, עבור אל תמונה | התאמת | סף. מסנן מוגדר מראש תחת שיטת Thresholding מספק בדרך כלל את התוצאות הרצויות על ידי הדגשת האותות החזקים ביותר באדום.
הערה: בחירת הסף האופטימלית תהיה תלויה ברקע התמונה ובעוצמת הכתם. בחר הגדרת סף שמרימה את הכתם ולא את הרקע. - לאחר בחירת הסף המתאים, בחר החל.
- כדי לנתח את האזור החיובי 6E10, השתמש בסרגל הכלים ולחץ על נתח | נתח חלקיקים, ויבטיח כי "סיכום התוצאות" נבדק.
- העתק את פלט הסיכום עם %Area שנוצר על-ידי התוכנה על-ידי לחיצה על ערוך | העתק. הדבק לתוך קובץ Excel שהתחיל בעבר עם תוויות מתאימות.
- חזור על שלבים 5.3-5.12 עבור האזורים השונים ברקמה. ודא שהמיקום של כל תיבה כדי לתאר את אזור העניין עקבי בין כל תמונה.
הערה: ניתן להשתמש בכלי הסיבוב אם מידות ארגז הכלים של המלבן אינן יכולות להתאים לאזור שצוין עקב עקמומיות הרקמה. - כדי לסובב את המלבן, השתמש בסרגל הכלים ולחץ על ערוך | | בחירה סובב והתאם את דרגת הסיבוב לפי הצורך. שכפל את התמונה כאמור בשלב 5.7 ונקה את החלק החיצוני באמצעות סרגל הכלים ולחץ על ערוך | נקה בחוץ, מה שמנקה את כתמי 6E10 מחוץ למלבן שצוין. המשך עם שלב 5.8 שתואר לעיל.
Representative Results
כאן, שתי שיטות שונות מושוות לכימות האזור החיובי 6E10 בהיפוקמפוס ובקליפת המוח של רקמות המוח של עכברים. שתי השיטות הן ניתוחי האזור המלא ותת-האזור של תחומי העניין (איור 1). האזור המלא של ניתוח העניין, כפי שהשם מרמז, כרוך בהתוויית כל אזור העניין (במקרה זה, איזו-קליפת המוח או ההיפוקמפוס) כדי לקבוע את האזור החיובי 6E10 (איור 1A,B). תת-אזור ניתוח העניין כולל בחירת אזור מוגדר מראש בתוך אזור העניין כדי לקבוע את האזור החיובי 6E10 (איור 1C,D). פרוטוקול ImageJ של שתי השיטות מוצג באיור 2, באיור 3 ובאיור 4.
במחקר זה נעשה שימוש בשלושה קוראים; שני קוראים עצמאיים ביצעו את תת-האזור של ניתוח העניין, והקורא השלישי ביצע את כל אזור ניתוח העניין. כפי שניתן לראות באיור 5A,B, היה מתאם חיובי משמעותי חזק (p < 0.0001) בין האזור החיובי 6E10 שדווח על ידי שני הקוראים שביצעו את תת-האזור של ניתוח העניין (מקדם המתאם של פירסון r = 0.97 עבור קליפת המוח ו-r = 0.96 עבור ההיפוקמפוס). האזורים החיוביים של 6E10 שדווחו על ידי שני הקוראים עבור תת-האזור של ניתוח הריבית היו ממוצעים, ותת-האזור הממוצע של אזור העניין החיובי 6E10 חולק מתאם חיובי משמעותי חזק (p < 0.0001) עם האזור החיובי של 6E10 שהתקבל באמצעות אזור העניין המלא של ניתוח הן עבור קליפת המוח (מקדם המתאם של פירסון r = 0.96; איור 5ג) וההיפוקמפוס (מקדם המתאם של פירסון r = 0.95; איור 5D). האזור החיובי הממוצע של קליפת המוח וההיפוקמפוס-6E10 שהתקבל על-ידי ניתוחי האזור המלא ותת-אזור העניין היו דומים ללא הבדל משמעותי, ואישרו את ההסכמה בין שתי השיטות (איור 5E). יתר על כן, ה-Aβ1-42 הבלתי מסיס נמדד בהומוגנטים של מוח שלם בתת-קבוצה של עכברים, והאזור החיובי של קליפת המוח (איור 5F) וההיפוקמפוס (איור 5G) 6E10-positive שנקבע על-ידי ניתוח אזור העניין המלא היה מתואם באופן משמעותי (p < 0.01) עם עומס Aβ1-42 בלתי מסיס באמצעות ELISA (ראו טבלת חומרים).
איור 1: תתי-אזורים מלאים לעומת תתי-אזורים של בחירת תחומי עניין. תמונות מייצגות המציגות את האיזו-קליפת המוח המלאה (קליפת המוח) וההיפוקמפוס המתוארות עבור האזור המלא של ניתוח העניין ב-(A) ו-(B), בהתאמה. תמונות מייצגות מציגות את הבחירה של תת-אזורים/ים של קליפת המוח וההיפוקמפוס עבור תת-אזור ניתוח העניין ב-(C) ו-(D), בהתאמה. סרגל קנה מידה = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: פרוטוקול לכימות האזור החיובי 6E10 של אזור העניין המלא. שלבי ניתוח תמונה המציגים את התמונה המקורית (A), התמונה לאחר התאמת בהירות/ניגודיות (B), בחירת אזור העניין (C), ניקוי (D), התאמת סף (E) והתמונה הסופית המוכנה לניתוח (F). המספרים באיור מציינים את מספרי השלבים בפרוטוקול. סרגל קנה מידה = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: פרוטוקול עבור תת-אזור העניין של כימות אזור חיובי 6E10. שלבי ניתוח תמונה המציגים את התמונה המקורית (A), התמונה לאחר התאמת בהירות/ניגודיות (B), בחירת אזור העניין (C), שכפול התמונה של אזור העניין (D), שינוי התמונה ל- 8 סיביות והיפוך התמונה (E), התאמת סף (F) והתמונה הסופית המוכנה לניתוח (G). המספרים באיור מציינים את מספרי השלבים בפרוטוקול. סרגל קנה מידה = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: פרוטוקול לאזור הסיבוב המעניין. שלבי ניתוח תמונה המציגים את בחירת אזור העניין והסיבוב של תיבת הבחירה כך שיתאימו לעקמומיות הרקמה (A), לתמונה של אזור העניין לאחר שכפול (B) ולתמונה לאחר ניקוי האזור החיצוני (שאינו אזור עניין) (C). המספרים באיור מציינים את מספר השלב בפרוטוקול. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: מתאם בין האזורים המלאים ותת-האזורים של ניתוחי העניין. חלקות פיזור מראות את המתאם בין האזור החיובי 6E10 על ידי שני הקוראים העצמאיים המבצעים את תת-האזור של ניתוח העניין עבור קליפת המוח (A) וההיפוקמפוס (B). מתאם חיובי חזק נצפה בין האזור החיובי 6E10 הנובע מתת-האזור של ניתוח העניין לבין האזור המלא של ניתוח העניין הן עבור קליפת המוח (C) והן עבור ההיפוקמפוס (D). אין הבדל מובהק סטטיסטית באזור החיובי הממוצע של 6E10 לפי אזור העניין המלא ותת-אזור הניתוחים המעניינים בקליפת המוח ובהיפוקמפוס (E). מתאם משמעותי נצפה בין מדידות Aβ1-42 הומוגניות של מוח שלם באמצעות ELISA לבין ניתוח אזור העניין המלא הן עבור קליפת המוח (F) והן עבור ההיפוקמפוס (G). הנתונים נותחו באמצעות מקדם המתאם של פירסון, r, in (A-D) ו-(F-G), ובאמצעות מדידות חוזרות דו-כיווניות ANOVA ב-(E) באמצעות תוכנת גרפים וסטטיסטיקה. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM) של n = 35 עכברים ב- (E), ו- p דו-זנב < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מתווה את ההליך להכנת המוח ההמי לחתך סגיטלי, צביעה אימונופלואורסצנטית של מרבצי Aβ באמצעות הנוגדן 6E10 על מקטעים צפים חופשיים, הדמיה של מקטעי המוח המוכתמים ב-Aβ ולאחר מכן כימות של משקעי Aβ בקליפת המוח וההיפוקמפוס של רקמת המוח של העכבר באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. אמנם ישנם פרוטוקולים שפורסמו לכימות עומס Aβ בקטעים של רקמת המוח 8,10, אך פרוטוקול זה מתאר את השלבים המעורבים בכימות עומס Aβ בכל האיזו-קליפת המוח (המכונה קליפת המוח) ובהיפוקמפוס בהשוואה לעומס Aβ בתת-אזור בעל עניין בקליפת המוח ובהיפוקמפוס, כאשר הדבר עשוי להיות רצוי. ניתן גם המתאם בין תתי-האזורים המלאים לעומת תתי-האזורים של ניתוחי העניין.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, הפרוטוקול המתואר הוא עבור מקטעי רקמת מוח בעובי 20 מיקרומטר הנתונים לתכשיר חיסוני צף חופשי, מה שמביא לחדירת נוגדנים אופטימלית בתוך מקטע הרקמה18. טכניקת הציפה החופשית עשויה לדרוש את העברתם של חלקי הרקמה באופן ידני בין התמיסות השונות במהלך הכתם החיסוני, וטיפול זהיר בחתכי הרקמה לאורך ההליך. זה חיוני במיוחד כאשר חלקי הרקמה שקועים בתמיסת החומצה הפורמית של 70% לאחזור אנטיגן בפרוטוקול הנוכחי, מה שמגדיל את שבירת הרקמות עבור חלקים דקים. גישות חלופיות לפרוטוקול המתואר כוללות שימוש בחתכי רקמה עבים יותר (למשל, 30-40 מיקרומטר) או שימוש בקטעי רקמה המותקנים ישירות על שקופיות טעונות חיובית לפני הכתם האימונופלואורסצנטי. שנית, הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בנוגדן 6E10 בעל תווית פלואורסצנטית. מלבד השימוש בנוגדן 6E10 בעל התווית הפלואורסצנטית, ניתן להשתמש גם בנוגדנים 6E10 שאינם פלואורסצנטיים (למשל, נוגדן 6E10 מצומד ל-Aβ) שאינם פלואורסצנטיים (לדוגמה, נוגדן 6E10 מצומד ל-Aβ- peroxidase) כדי לזהות עומס Aβ בחתכי רקמת המוח כפי שתואר קודם לכן8 . שלישית, הדיוק של התוצאות עבור כימות עומס Aβ יהיה תלוי בבחירת הסף המתאימה בתוכנת הניתוח, התלויה ברקע הרקמה ובעוצמת האות. בחירת הסף חייבת להתבצע על ידי משתמש הקצה כך שרק כתמים חיוביים של Aβ ייבחרו לכימות. נדרשת התערבות של משתמש קצה כדי למטב את הסף הספציפי שניתן להחיל על כל התמונות כדי להבטיח את הדיוק של הגדרת הסף. רביעית, מכיוון שתת-אזור ניתוח העניין דורש בחירת אזור עניין קטן במדור הרקמות, נעשה שימוש בשני קוראים עצמאיים לניתוח זה. כדי לשמור על עצמאות וסנוור במהלך איסוף הנתונים, כל התמונות היו מקודדות במספרים; רצף ניתוח התמונות היה אקראי בין הקוראים כך שהקוראים השונים ניתחו תמונות שונות בכל זמן נתון, והנתונים הוגשו בסוף כל שבוע. בשל הסבירות המוגברת לשונות בין קוראים באזור בחירת העניין בתת-אזור ניתוח העניין, הקוראים אומנו באמצעות מספר תמונות מדגם כדי לייעל את בחירת האזור בקליפת המוח ובהיפוקמפוס לפני תחילת איסוף הנתונים. אימון זה חיוני כדי להפחית את השונות בין הקוראים, וכפי שניתן לראות (איור 5A,B), האזור החיובי 6E10 שדווח על ידי שני הקוראים מראה הסכמה יחסית חזקה במחקר הנוכחי.
הפרוטוקול הנוכחי והתוצאות מספקים מידע רב ערך על ההשפעה של אזור גודל העניין על כימות שטח חיובי Aβ. אזור עניין גדול יותר צפוי לייצג את הרקמה יותר מאשר אזור עניין קטן יותר. לכן, דגימת רקמה גדולה יותר רצויה כדי לכמת במדויק את עומס Aβ ברקמות. עם זאת, במקרה של התפלגות עומס Aβ הומוגנית בתוך הרקמה, אזור דגימה קטן יותר נחשב בדרך כלל לייצוג טוב של הרקמה הגדולה יותר תחת ניתוח. תוצאות המחקר הנוכחיות מאשרות זאת, ועומס ה-Aβ בכל קליפת המוח ובהיפוקמפוס היה מתאם חזק של עומס Aβ בתת-אזור נבחר של קליפת המוח ובהיפוקמפוס (איור 5C,D). כדי לאשש עוד יותר את ההסכמה בין ניתוחי העניין המלאים ותת-האזורים, הושוו האזור החיובי הממוצע של 6E10 בקליפת המוח ובהיפוקמפוס, ולא נמצא הבדל בין שתי השיטות (איור 5E). זה מאשר שאחת מהשיטות הללו (ניתוח מלא או תת-אזור) מניבה מדידות עומס Aβ דומות.
לפרוטוקול הנוכחי יש כמה מגבלות. שתי השיטות (ניתוח אזור מלא לעומת ניתוח תת-אזור) לא תמיד ישמשו לסירוגין. הבחירה בשימוש בניתוח מלא או תת-אזור תהיה תלויה בהתפלגות האזורית של Aβ בתוך הרקמה, המושפעת מהגיל, המין והמתח של מודל העכבר AD. בגיל 13 חודשים, עומס ה-Aβ מופץ בכל קליפת המוח וההיפוקמפוס של עכברי ה-APP/PS1. עם זאת, לאחר 6 חודשים, מרבצי Aβ מוגבלים לקליפת המוח, ומשקעים מינימליים נצפים בהיפוקמפוס12. בתנאים כאלה, האזור המלא של ניתוח העניין עשוי להיות הגישה הרצויה להגדלת אזור דגימת הרקמה ובכך האות Aβ. מצד שני, ניתוח תת-אזור עשוי להיות השיטה המועדפת כאשר עומס Aβ באזור מסוים במוח הוא בעל עניין, (למשל, קליפת המוח הסומטוסנסורית). בנוסף, בגיל 13 חודשים, העכברים הזכרים של APP/PS1 מדגימים כתמים חיוביים עזים של 6E10, והכתם האימונופלואורסצנטי גורם לאות מצוין עם רקע נמוך מאוד, מה שהופך את הפרוטוקול הנוכחי למתאים מאוד לכימות בתנאים הנתונים. לא ברור אם ניתן ליישם בהצלחה את שיטת הכימות הזו על כתמים פחות עזים, ויידרשו עבודות עתידיות כדי לענות על שאלה זו. שיטת הכימות האימונופלואורסצנטית והתמונה המוצגת כאן מזהה את כל הצורות של Aβ, כולל הצורה המקדימה13. כתוצאה מכך, אם יש עניין בזיהוי של Aβ specie ספציפי (למשל, Aβ1-40 או Aβ1-42), ניתן להשתמש בנוגדנים ספציפיים לאיזופורמים אלה של Aβ. לכן, אף על פי ששיטת הכתמים והזיהוי החיסוניים 6E10 תאמה את המדידות של מדידות Aβ1-42 בהומוגנאטים של מוח שלם באמצעות ELISA (איור 5F,G), המתאם היה צנוע בלבד. ניתן לייחס זאת למדידה של Aβ1-42 בלבד באמצעות ELISA ולזיהוי של כל מיני Aβ באמצעות 6E10 immunostaining. המחקר הנוכחי משתמש בשלושה קוראים כדי להעריך את ההסכמה והמתאם בין הניתוח המלא והתת-אזורי. קיום קוראים נוספים עשוי לשפר את חוסנו של המחקר ויכול לאמת עוד יותר את ההסכמים בין שתי השיטות שהוצגו כאן. יתר על כן, אנו משתמשים בקורלציה של פירסון כמדד להסכמה, אשר נמצא בשימוש נרחב בין שיטות אחרות כדי לתאר את ההסכם בין משתנים רציפים19. עם זאת, מגבלה אחת של שימוש בקורלציה של פירסון כדי לקבוע הסכמה היא ששתי השיטות המשמשות כאן עשויות לספק תוצאות קשורות, אך שיטה אחת עלולה לגרום לערכים גבוהים יותר מהשנייה בשל הטיה שיטתית. לכן, מתאם פירסון הוא מדד טוב להסכמה יחסית19. כדי להגביר את החוסן של הפרוטוקול, ניתן להשתמש בשיטות נוספות לאישור ההסכם המוחלט, כגון השוואת השטח החיובי הממוצע של 6E10 על ידי שתי השיטות (איור 5E),19. יחד, הפרוטוקול הנוכחי משווה את עומס ה-Aβ שזוהה על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית ומנתח את האזורים המלאים ותת-האזורים המעניינים בקטעי רקמת המוח. התוצאות מראות מתאם חזק בין שתי השיטות הללו עבור מקטעי רקמת מוח שמקורם בעכברים זכרים בני 13 חודשים של APP/PS1, שמראים שפע של משקעי Aβ.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי להזדקנות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי הפרס R01AG062840 (ל- RKS) ו- R01AG072896 (ל- RKS). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. כ-200 אלף דולר (100%) מהקרנות הפדרליות תמכו בפרויקט זה. ברצוננו להודות גם לד"ר ג'ושוע יאנג על עזרתו בעריכת כתבי יד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML |
References
- Alzheimer's Association. 2021 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimer's & Dementia. 17 (3), 327-406 (2021).
- Langa, K. M., Foster, N. L., Larson, E. B. Mixed dementia: emerging concepts and therapeutic implications. Journal of the American Medical Association. 292 (23), 2901-2908 (2004).
- Gandy, S., DeKosky, S. T. Toward the treatment and prevention of Alzheimer's disease: rational strategies and recent progress. Annual Review of Medicine. 64, 367-383 (2013).
- Bloom, G. S. Amyloid-beta and tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis. JAMA Neurology. 71 (4), 505-508 (2014).
- Gremer, L., et al. Fibril structure of amyloid-beta(1-42) by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6359), 116-119 (2017).
- Ferrero, J., et al. First-in-human, double-blind, placebo-controlled, single-dose escalation study of aducanumab (BIIB037) in mild-to-moderate Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia Translational Research & Clinical Interventions. 2 (3), 169-176 (2016).
- Poon, C. H., Wang, Y., Fung, M. L., Zhang, C., Lim, L. W. Rodent models of amyloid-beta feature of Alzheimer's disease: development and potential treatment implications. Aging and Disease. 11 (5), 1235-1259 (2020).
- Christensen, A., Pike, C. J. Staining and quantification of beta-amyloid pathology in transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Methods in Molecular Biology. 2144, 221 (2020).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (11), 4501-4506 (2009).
- Song, Z., et al. Detecting amyloid-beta accumulation via immunofluorescent staining in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Visualized Experiments. (170), e62254 (2021).
- Sun, J., et al. Hematologic safety of chronic brain-penetrating erythropoietin dosing in APP/PS1 mice. Alzheimer's & DementiaTranslational Research & Clinical Interventions. 5, 627-636 (2019).
- Jankowsky, J. L., et al. Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Human Molecular Genetics. 13 (2), 159-170 (2004).
- Grant, M. K. O., et al. Human cerebrospinal fluid 6E10-immunoreactive protein species contain amyloid precursor protein fragments. PloS One. 14 (2), 0212815 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Eichenbaum, K. D., et al. Minimally invasive method for murine brain fixation. Biotechniques. 39 (4), 487-490 (2005).
- Chang, R., et al. Blood-brain barrier penetrating biologic tnf-alpha inhibitor for Alzheimer's disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (7), 2340-2349 (2017).
- Pinskiy, V., et al. High-throughput method of whole-brain sectioning, using the tape-transfer technique. PloS One. 10 (7), 0102363 (2015).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments. (162), e61622 (2020).
- van Stralen, K. J., Dekker, F. W., Zoccali, C., Jager, K. J. Measuring agreement, more complicated than it seems. Nephron Clinical Practice. 120 (3), 162-167 (2012).
