Summary
O presente protocolo descreve e compara o procedimento para realizar uma análise de interesse de região completa ou sub-região de seções cerebrais de camundongos sagitos para quantificar a carga amilóide-beta no modelo de camundongo transgênico APP/PS1 da doença de Alzheimer.
Abstract
O acúmulo extracelular de placas amilóide-beta (Aβ) é uma das principais marcas patológicas da doença de Alzheimer (DA), e é o alvo do único tratamento modificador de doença aprovado pela FDA para AD. Consequentemente, o uso de modelos de camundongos transgênicos que superexpressam a proteína precursora amiloide e, assim, acumulam placas aβ cerebrais são amplamente utilizadas para modelar aD. Portanto, os imunoensatórios, incluindo o ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA) e a imunostaining, geralmente medem a carga de Aβ em tecidos cerebrais derivados de camundongos transgênicos da DA. Embora os métodos de detecção e quantificação de Aβ tenham sido bem estabelecidos e documentados, o impacto do tamanho da região de interesse selecionado no tecido cerebral em medidas de carga Aβ após a imunostaining não foi relatado. Portanto, o protocolo atual visava comparar as medições de carga Aβ em todas as sub-regiões de interesse usando um software de análise de imagem. As etapas envolvidas na preparação do tecido cerebral, a imunostenção da seção cerebral flutuante livre, a imagem e a quantificação da carga de Aβ em total versus sub-regiões de interesse são descritas usando seções cerebrais derivadas de camundongos machos transgênicos duplos APP/PS1 de 13 meses de idade. O protocolo atual e os resultados fornecem informações valiosas sobre o impacto do tamanho da região de interesse na quantificação da área aβ positiva, e mostram uma forte correlação entre a área Aβ-positiva obtida utilizando-se as análises completas e sub-regiões de interesse para seções cerebrais derivadas de camundongos app/PS1 masculinos de 13 meses de idade que mostram uma deposição Aβ generalizada.
Introduction
A doença de Alzheimer (AD), a sexta principal causa de morte nos Estados Unidos, continua a ser uma ameaça à saúde pública, com cerca de 6,2 milhões de americanos vivendo com AD. Espera-se que chegue a 13,8 milhões até 20601. Até o momento, o manejo sintomático através de medicamentos como inibidores de colinestease e memantina é o curso primário do tratamento2. AD é caracterizada por manifestações neuropatologias como deposição extracelular de placas amilóide-beta (Aβ) e acúmulo de tau hiperfosforilato intracelular na forma de emaranhados neurofibrilares 3,4. Formado por um decote endoproteolítico da proteína precursora amiloide (APP) via beta e gama-secretase, a Aβ agrega para formar oligômeros e fibrilas, levando aos efeitos neurotóxicos5. Aβ tem sido hipótese para servir a um papel patológico primário desde a década de 1980, e é o alvo terapêutico da única terapia modificadora de doença aprovada pela FDA para AD6. Como resultado, modelos transgênicos de camundongos AD que abrigam mutações em genes que resultam em um acúmulo robusto de Aβ cerebral têm sido amplamente utilizados para pesquisas de AD pré-clínicos desde o início da década de 19907.
A detecção de espécies Aβ nestes cérebros de camundongos transgênicos da AD é geralmente feita usando dois imunoensatórios: ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA) e imunostaining. O ensaio anterior permite a determinação quantitativa de diferentes espécies Aβ e é menos demorado em comparação com a imunostaining, que requer várias etapas sequenciais de processamento e imagem de tecido, incluindo seção de tecidos, imunostaining, imagem e quantificação8. Além disso, os resultados obtidos após a imunossuagem são semi-quantitativos8. No entanto, a capacidade de localizar espacialmente Aβ torna a imunostenção uma abordagem atraente para a detecção de Aβ em tecidos cerebrais8.
Ao usar a imunostaining Aβ, vários paradigmas de quantificação diferentes têm sido empregados por diferentes grupos de pesquisa. Por exemplo, alguns grupos de pesquisa quantificam a carga de Aβ em toda a região de interesse (córtex ou hipocampo), enquanto outros quantificam a carga Aβ em uma sub-região de interesse especificada (uma parte do córtex ou do hipocampo)9,10,11. Embora os métodos de detecção e quantificação de Aβ tenham sido bem estabelecidos e documentados, o impacto do tamanho da região de interesse nas medições de carga Aβ após a imunosstaining não foi relatado. Portanto, o protocolo atual visava comparar as medições de carga Aβ em todas as sub-regiões de interesse usando um software de análise de imagem, ImageJ.
O presente estudo utilizou camundongos machos transgênicos duplos APP/PS1 de 13 meses de idade, que expressam um mouse quimérico/APP humano e um mutante pré-sentimental 1, para modelar o início precoce do AD12. Os depósitos de Aβ começam a se desenvolver aos 6-7 meses de idade, e o acúmulo abundante de Aβ é observado tanto no córtex quanto no hipocampo desses camundongos por 9-10 meses de idade12. Os peptídeos amiloides transgênicos e a holoproteína podem ser detectados pelo 6E10-imunostaining13, tornando-se um modelo animal desejável para o presente protocolo. O procedimento aqui abordado inclui preparação de tecidos cerebrais, imunossaturação de seções flutuantes livres, imagem e quantificação da carga de Aβ em total versus sub-regiões de interesse. A análise mostra uma forte correlação entre a quantificação total e sub-regional, indicando concordância robusta entre esses dois métodos nas seções de tecido cerebral derivadas de camundongos machos APP/PS1 de 13 meses de idade que apresentam depósitos abundantes de Aβ.
Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com o Laboratório Universitário de Recursos Animais sob protocolos aprovados pela Universidade da Califórnia, Irvine, Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Os experimentos foram realizados com camundongos B6C3-Tg masculinos (APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (APP/PS1) (13 meses de idade, n = 35). Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação do tecido cerebral
- Anestesiar os camundongos usando uma dose letal de um anestésico à base de fenitoin/pentobarbital (150 mg/kg) injetado intraperitoneally (ver Tabela de Materiais) seguindo protocolos animais aprovados. Realize a perfusão cardíaca com soro fisiológico tamponado de fosfato gelado (1x PBS) por 5 min a uma velocidade de 5 mL/min para limpar a vasculatura cerebral14.
- Colher tecido cerebral após o relatório publicado anteriormente15, separar-se no hemisfério cerebral esquerdo e direito e colocar o hemi-cérebro direito de cada camundongo em um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de solução de paraformaldeído (PFA) recém-preparada em 1x PBS por 72 h a 4 °C.
NOTA: Os cérebros podem ser corrigidos de imersão de 24-72 h, dependendo do antígeno que está sendo estudado. O hemi-cérebro esquerdo, sem o cerebelo, pode ser congelado em nitrogênio líquido e depois armazenado a -80 °C, seguido de processamento para ensaios bioquímicos como ELISA e detecção bioquímica Aβ16.
ATENÇÃO: A PFA é um provável cancerígeno, e o contato com a pele com PFA pode levar a sintomas alérgicos à pele. Use luvas de nitríl ou butil, máscaras e proteção ocular para manuseá-lo, e prepare-se sob um capô de fumaça química. - Após a incubação em 4% de PFA, incubar os hemi-cérebros sequencialmente em 5 mL de 10%, 20% e 30% de soluções de sacarose preparadas em 1x PBS por 24 h, cada uma a 4 °C até que o tecido cerebral afunde na parte inferior do tubo cônico.
- Após a incubação na solução de 30% de sacarose, remova o cérebro hemi, dob suavemente o cérebro em um papel filtro para remover o excesso de solução de sacarose, e congele o hemi-cérebro fixo em gelo seco em pó por 30 minutos. Armazene o hemi-cérebro congelado em folhas de alumínio bem rotuladas a -80 °C até a criosecção.
NOTA: No protocolo atual, os hemi-cérebros foram armazenados a -80 °C durante 6-8 meses. - Se sectionia o hemi-cérebro congelado em seções de 20 μm de espessura usando um criostat (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Para o protocolo atual, os hemi-cérebros foram seccionados em seções sagidas, e se necessário, seções coronais também podem ser preparadas17. O passo 2 é para coloração imunofluorescente de Aβ em amostras de tecido cerebral fixas e crioprotegidas.
2. Imunofluorescência
- Coloque as seções de tecido cerebral sagital (passo 1.5) em uma placa de 24 poços (até seis seções cerebrais do rato por 300 μL por poço). Lave por 5 min com 1x PBS três vezes à temperatura ambiente (23 °C) colocando a placa em um shaker com redemoinho suave.
- Incubar as seções de tecido cerebral com 70% de ácido fórmico em dH20à temperatura ambiente por 10 minutos.
ATENÇÃO: O ácido fórmico é corrosivo, por isso evite o contato com a pele e o contato visual. - Lave as seções de tecido cerebral por 5 minutos com dH20 três vezes à temperatura ambiente.
- Bloqueie a ligação não específica com albumina de soro bovino de 0,5% (BSA) e TritonX 100 0,3% (ver Tabela de Materiais) em 1x PBS à temperatura ambiente por 1 h.
- Incubar as seções de tecido cerebral com um anticorpo primário rotulado por fluoróforo (6E10, ver Tabela de Materiais) diluído (1:1000) em 1x PBS contendo 0,3% TritonX 100 a 4 °C por 24 h.
NOTA: Uma vez que o anticorpo primário é conjugado fluoróforo, a placa precisa ser coberta a partir deste passo em diante, ou todo o trabalho deve ser feito em uma sala escura para manter a eficácia do fluoróforo. - Lave as seções de tecido cerebral por 10 minutos com 1x PBS três vezes à temperatura ambiente.
- Monte as seções de tecido cerebral em lâminas de vidro carregadas positivamente (ver Tabela de Materiais) que são bem rotuladas (as informações de etiqueta no slide são baseadas na preferência), após uma breve lavagem com dH20para remover os sais restantes. Deixe o ar dos slides secar no escuro.
NOTA: As seções cerebrais devem ser montadas cuidadosamente para evitar dobras e rasgos, impactando a quantificação dos dados. Em caso de rasgos e/ou dobras que residem na região de interesse e podem interferir na quantificação de dados, são recomendados re-coloração e remontagem. - Monte as seções de tecido cerebral com uma mídia de montagem aquosa (ver Tabela de Materiais) e coloque a tampa de vidro sobre o tecido. Sele as extremidades da tampa com esmalte transparente e armazene os slides em uma caixa de slides a 4 °C até a imagem.
NOTA: No protocolo atual, os slides foram imagens dentro de 1 mês após a coloração.
3. Imagem
- Imagem das seções cerebrais manchadas de 6E10 usando um microscópio de fluorescência (epifluorescência ou confocal) (ver Tabela de Materiais), que tem um objetivo de 2x para capturar toda a seção do tecido cerebral em uma imagem e está equipado com o filtro apropriado (GFP neste trabalho).
NOTA: As configurações de imagem devem ser consistentes em diferentes slides. - Salve as imagens capturadas como um arquivo TIFF ou conforme necessário e abra-as no software de análise de imagens (ver Tabela de Materiais) conforme descrito na etapa 4.2 abaixo para quantificação 6E10.
NOTA: Inclua uma barra de escala antes de capturar a imagem para quantificar no software de análise de imagens, ImageJ.
4. Região completa da análise de juros
NOTA: As duas regiões de interesse do presente trabalho são o hipocampo e o iso-córtex. A análise de interesse da região completa representa a análise de todo o iso-córtex (referido como córtex daqui para frente) ou o hipocampo na seção de tecido cerebral imageado.
- Baixe o software de análise de imagens (ver Tabela de Materiais) e inicie o software uma vez instalado.
- Uma vez que o software é executado, clique em | de arquivos | Escolha a imagem a ser analisada.
- Clique em Analisar | Definir escala| Clique para remover a escala. Selecione a ferramenta Reta na barra de ferramentas de software e desenhe uma linha reta ao longo do comprimento da barra de escala. Clique em Analisar | Meça. Observe o comprimento ou distância da barra de escala em pixels. Clique em Analisar | Definir escala.
- Na janela pop-up, entre a distância em pixels, a distância conhecida da barra de escala (em μm neste caso), e a unidade de comprimento como μm. Verifique a Global para aplicar a nova configuração de escala a todas as imagens a seguir se várias imagens forem processadas. Clique em OK para aplicar as configurações.
NOTA: É sempre recomendável verificar se a escala precisa é aplicada à imagem antes de uma análise mais aprofundada.
- Na janela pop-up, entre a distância em pixels, a distância conhecida da barra de escala (em μm neste caso), e a unidade de comprimento como μm. Verifique a Global para aplicar a nova configuração de escala a todas as imagens a seguir se várias imagens forem processadas. Clique em OK para aplicar as configurações.
- Para definir a medição desejada na área do trecho, vá para Analisar | Definir medidas | Selecione as caixas Desarmes e Etiquetas de Exibição. Verifique se a imagem que está sendo analisada está selecionada sob redirecionar para.
- Para facilitar a visualização do hipocampo ou córtex, vá para Image | Ajuste | Brilho/Contraste. Arraste a barra de slides máxima gradualmente para a esquerda para aumentar a clareza tecidual até que as regiões de interesse do cérebro sejam identificáveis.
NOTA: Não aplique esta configuração para evitar medições falsas durante a análise, em vez disso, prossiga para a próxima etapa. - Use a seleção de polígono ou a seleção à mão livre para delinear a região do hipocampo. Clique na opção Redefinir as configurações De brilho/contraste uma vez que o hipocampo é delineado para reverter para o brilho original.
NOTA: As etapas devem ser repetidas separadamente para a região cortical. - Para medir a área total do tecido da região selecionada, clique em Editar | Claro lá fora. Uma vez que a região selecionada seja a única imagem na tela, clique em Analisar | Meça para obter a área total do tecido analisada em uma janela pop-up. Salve os dados em um arquivo Excel para uso posterior.
- Para medir a área 6E10 positiva, acesse Imagem | Ajuste | Limiar de cor. Um filtro pré-fabricado sob o método Thresholding geralmente fornece resultados desejados destacando os sinais mais fortes em vermelho.
NOTA: A seleção ideal do limiar dependerá do fundo da imagem e da intensidade de coloração. Selecione uma configuração de limiar que capta a mancha e não o fundo. - Depois de selecionar o limiar apropriado, verifique o plano de fundo escuro. Isso destacará as manchas de Aβ (a mancha de interesse) em um fundo preto. Clique em Selecionar | | original Selecione, dando os sinais escuros (os depósitos Aβ) em um fundo branco. Clique em Analisar | Analise as partículas e clique em OK quando a janela pop-up for gerada.
- Copie a saída de resumo gerada pelo software clicando em Editar | Copiou. Cole o arquivo Excel iniciado anteriormente com respectivas etiquetas. Esta é a área 6E10-positiva nas regiões de interesse selecionadas (hipocampo ou córtex).
NOTA: No Excel, haverá uma coluna para a área total 6E10-positive (etapa 4.10) e a área total do tecido (etapa 4.7). - Calcular a área 6E10 positiva (%) da seguinte forma16: (Área total 6E10-positiva/Área total de tecido analisada) x 100.
5. Sub-região de análise de juros
NOTA: A sub-região de análise de interesse representa a análise de uma parte do córtex ou do hipocampo na seção de tecido cerebral imagem.
- Baixe o software de análise de imagens e inicie o software uma vez instalado.
- Uma vez que o software é executado, clique em | de Arquivo | Escolha a imagem a ser analisada.
- Clique em Analisar | Definir escala| Clique para remover a escala. Selecione a ferramenta Reta na barra de ferramentas do software e desenhe uma linha reta ao longo do comprimento da barra de escala. Clique em Analisar | Meça. Observe o comprimento ou distância da barra de escala em pixels. Clique em Analisar | Definir escala.
- Na janela pop-up, entre na distância em pixels, a distância conhecida da barra de escala (em μm neste caso), e digite a unidade de comprimento como μm. Verifique a Global para aplicar a nova configuração de escala a todas as imagens a seguir se várias imagens forem processadas. Clique em OK para aplicar as configurações.
NOTA: É sempre recomendável verificar se a escala precisa é aplicada à imagem antes de uma análise mais aprofundada.
- Na janela pop-up, entre na distância em pixels, a distância conhecida da barra de escala (em μm neste caso), e digite a unidade de comprimento como μm. Verifique a Global para aplicar a nova configuração de escala a todas as imagens a seguir se várias imagens forem processadas. Clique em OK para aplicar as configurações.
- Para definir a medição desejada na área do trecho, acesse Analisar | Definir medidas | selecione as caixas De etiqueta de área e exibição. Verifique se a imagem que está sendo analisada está selecionada sob redirecionar para.
- Ajuste o brilho e o contraste se a imagem for muito fraca e as regiões cerebrais (por exemplo, o hipocampo ou o córtex neste caso) não puderem ser facilmente identificadas. Use a barra de ferramentas do software e clique em Image | Ajuste | Brilho/Contraste e arraste os controles deslizantes máximos para a esquerda, conforme necessário para aumentar a visibilidade do tecido.
NOTA: Não aplique esta configuração para evitar medições falsas durante a análise, em vez disso, prossiga para a próxima etapa. - Usando a ferramenta Retângulo, selecione a região de interesse no córtex ou no hipocampo. Use a barra de ferramentas e clique em Editar | | de seleção Especifique, alterando a altura e a largura para um valor pré-definido. Ajuste a caixa, por isso está completamente coberta por tecido. Reinicie o brilho/contraste para reverter ao brilho original.
NOTA: O tamanho da caixa usada para selecionar as regiões de interesse deve ser consistente para todas as imagens. Para a presente análise, o tamanho da caixa foi de 300 pixels x 300 pixels (equivalente a 1177 μm x 1177 μm) ou 400 pixels x 200 pixels (equivalente a 1569 μm x 784 μm). - Duplique a região de interesse selecionada clicando com o botão direito do mouse na caixa e clicando em Duplicar. Uma nova janela com a região selecionada será aberta. Renomeie a imagem duplicada para exibir a região em que está localizada (por exemplo, córtex ou hipocampo).
- Ajuste o tipo de imagem duplicada usando a barra de ferramentas e clicando em | Tipo | 8-Bit para converter a imagem RGB duplicada em 8 bits para analisar melhor as placas. Inverta a imagem clicando em Editar | Inverter.
- Para medir a área 6E10-positiva, acesse Imagem | Ajuste | O limiar. Um filtro pré-definido sob o método Thresholding geralmente fornece os resultados desejados, destacando os sinais mais fortes em vermelho.
NOTA: A seleção ideal do limiar dependerá do fundo da imagem e da intensidade de coloração. Selecione uma configuração de limiar que capta a mancha e não o fundo. - Depois de selecionar o limiar apropriado, selecione Aplicar.
- Para analisar a área 6E10 positiva, use a barra de ferramentas e clique em Analisar | Analisar as partículas, garantindo que o "Summarize Results" seja verificado.
- Copie a saída de resumo com a %Área gerada pelo software clicando em Editar | Copiou. Cole o arquivo Excel iniciado anteriormente com respectivas etiquetas.
- Repita as etapas 5.3-5.12 para as diferentes regiões do tecido. Certifique-se de que a colocação de cada caixa para delinear a região de interesse é consistente entre cada imagem.
NOTA: A ferramenta de rotação pode ser utilizada se as dimensões da caixa de ferramentas Retângulo não se encaixarem na região especificada devido à curvatura tecidual. - Para girar o retângulo, use a barra de ferramentas e clique em Editar | | de seleção Gire e ajuste o grau de rotação conforme necessário. Duplique a imagem conforme mencionado na etapa 5.7 e limpe o lado de fora usando a barra de ferramentas e clicando em Editar | Limpe lá fora, o que limpa as manchas do 6E10 fora do retângulo especificado. Prossiga com a etapa 5.8 descrita acima.
Representative Results
Aqui, dois métodos diferentes são comparados para quantificar a área 6E10 positiva no hipocampo e o córtex dos tecidos cerebrais do camundongo. Os dois métodos são a região completa e sub-região de análises de interesse (Figura 1). A análise completa da região de interesse, como o nome sugere, envolve delinear toda a região de interesse (neste caso, seja o iso-córtex ou o hipocampo) para determinar a área 6E10-positiva (Figura 1A,B). A sub-região de análise de interesse envolve a seleção de uma região pré-definida dentro da região de interesse para determinar a área 6E10-positiva (Figura 1C,D). O protocolo ImageJ stepwise para os dois métodos é mostrado na Figura 2, Figura 3 e Figura 4.
Este estudo utilizou três leitores; dois leitores independentes realizaram a sub-região de análise de interesse, e o terceiro leitor realizou a análise completa da região de interesse. Como visto na Figura 5A,B, houve forte correlação positiva significativa (p < 0,0001) entre a área 6E10-positiva relatada pelos dois leitores que realizam a sub-região de análise de juros (coeficiente de correlação de Pearson r = 0,97 para o córtex e r = 0,96 para o hipocampo). As áreas 6E10-positivas relatadas pelos dois leitores para a sub-região de análise de juros foram médias, e a sub-região média de interesse 6E10-positivo compartilhou uma forte correlação positiva significativa (p < 0,0001) com a área 6E10-positiva obtida utilizando-se a região completa de análise de juros para ambos os córtex (coeficiente de correlação de Pearson r = 0,96; Figura 5C) e o hipocampo (coeficiente de correlação de Pearson r = 0,95; Figura 5D). A área média cortical e hipocampal-6E10-positiva obtida pela região completa e sub-região de análises de interesse foram comparáveis sem diferença significativa, confirmando o acordo entre os dois métodos (Figura 5E). Além disso, o insolúvel Aβ1-42 foi medido em homogeneizados cerebrais inteiros em um subconjunto de camundongos e a área cortical (Figura 5F) e hipocampal (Figura 5G) 6E10-positiva determinada pela região completa de análise de interesse foi significativamente (p < 0,01) correlacionada com carga insolúvel Aβ1-42 utilizando ELISA (ver Tabela de Materiais).
Figura 1: Completa versus sub-regiões de seleção de juros. Imagens representativas mostrando o iso-córtex completo (córtex) e hipocampo delineados para a região completa de análise de interesse em (A) e (B), respectivamente. Imagens representativas mostram a seleção de sub-regiões/s do córtex e hipocampo para a sub-região de análise de interesse em (C) e (D), respectivamente. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Protocolo para a região completa de interesse 6E10-positive área quantificação. Etapas de análise de imagem mostrando a imagem original (A), a imagem após ajuste de brilho/contraste (B), seleção da área de interesse (C), compensação (D), ajuste de limiar (E) e a imagem final pronta para análise (F). Os números na figura designam os números de passo no protocolo. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Protocolo para a sub-região de interesse 6E10-positive área quantificação. Etapas de análise de imagem mostrando a imagem original (A), a imagem após ajuste de brilho/contraste (B), seleção da área de interesse (C), duplicação da imagem da região de interesse (D), alteração da imagem para 8-Bit e invertendo a imagem (E), ajuste de limiar (F) e imagem final pronta para análise (G). Os números na figura designam os números de passo no protocolo. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Protocolo para a região de rotação de juros. Etapas de análise de imagem que mostram a seleção da área de interesse e rotação da caixa de seleção para adequação da curvatura tecidual (A), a imagem da região de interesse após duplicação (B) e a imagem após a limpeza da área externa (não região de interesse) (C). Os números na figura designam o número da etapa no protocolo. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Correlação entre as análises completas e sub-regiões de interesse. Os gráficos de dispersão mostram a correlação entre a área 6E10-positiva pelos dois leitores independentes que realizam a sub-região de análise de interesse para o córtex (A) e o hipocampo (B). Observa-se forte correlação positiva entre a área 6E10-positiva resultante da sub-região de análise de juros e a análise completa da região de interesse tanto para o córtex (C) quanto para o hipocampo (D). Não há diferença estatisticamente significativa na área média 6E10-positiva pela região de interesse pleno e na sub-região de análises de interesse no córtex e no hipocampo (E). Observa-se correlação significativa entre as medidas insolúveis de Aβ1-42 homogêneos do cérebro inteiro utilizando a ELISA e a região completa de análise de interesse tanto para o córtex (F) quanto para o hipocampo (G). Os dados foram analisados utilizando-se o coeficiente de correlação de Pearson, r, in (A-D) e (F-G), e utilizando-se de medidas repetidas bidirecional ANOVA in (E) utilizando um software de gráficos e estatísticas. Os dados são apresentados como erro padrão ± médio da média (SEM) de n = 35 camundongos em (E), e um p de duas caudas < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O protocolo descrito aqui descreve o procedimento de preparação hemi-cérebro para secção sagital, coloração imunofluorescente de depósitos Aβ usando o anticorpo 6E10 em seções flutuantes livres, imagem das seções cerebrais manchadas de Aβ seguidas pela quantificação dos depósitos Aβ no córtex e no hipopótamo do tecido cerebral do rato usando um software de análise de imagem. Embora existam protocolos publicados para quantificar a carga de Aβ nas seções de tecido cerebral 8,10, este protocolo descreve as etapas envolvidas na quantificação da carga de Aβ em todo o iso-córtex (referido como córtex) e hipocampo em comparação com a carga Aβ em uma sub-região de interesse no córtex e no hipocampo, quando isso pode ser desejado. Também é fornecida a correlação entre as sub-regiões completas das análises de interesse.
Há vários passos críticos no protocolo. Primeiro, o protocolo descrito é para seções de tecido cerebral de 20 μm de espessura submetidas a imunostaining flutuante livre, o que resulta em penetração ideal de anticorpos dentro da seçãotecidual 18. A técnica de flutuação livre pode exigir que as seções teciduais sejam transferidas manualmente entre as diferentes soluções durante a coloração imunofluorescente e o manuseio cuidadoso das seções teciduais ao longo do procedimento. Isso é especialmente crucial quando as seções teciduais estão imersas na solução de ácido fórmico de 70% para recuperação de antígenos no protocolo atual, aumentando a fragilidade tecidual para seções finas. Abordagens alternativas ao protocolo descrito incluem o uso de seções de tecido mais grossas (por exemplo, 30-40 μm) ou o uso de seções teciduais que são diretamente montadas em lâminas carregadas positivamente antes da coloração imunofluorescente. Segundo, o protocolo descrito aqui usa um anticorpo 6E10 fluorescente. Além de usar o anticorpo 6E10 fluorescente, anticorpos não fluorescentes 6E10 (por exemplo, anticorpos 6E10 conjugados por rabanete) também podem ser usados para detectar carga de Aβ em seções de tecido cerebral, e o protocolo atual pode ser adaptado para quantificar manchas imunoquímicas aβ positivas nas seções do tecido cerebral como descrito anteriormente8 . Em terceiro lugar, a precisão dos resultados para quantificação da carga Aβ dependerá da seleção de limiares apropriada no software de análise, que depende do fundo do tecido e intensidade do sinal. A seleção de limiares deve ser realizada pelo usuário final, de tal forma que apenas as manchas Aβ-positivas sejam selecionadas para quantificação. A intervenção do usuário final é necessária para otimizar o limiar específico que pode ser aplicado a todas as imagens para garantir a precisão da configuração do limiar. Em quarto lugar, uma vez que a sub-região de análise de interesse requer a seleção de uma pequena região de interesse na seção de tecidos, dois leitores independentes foram utilizados para esta análise. Para manter a independência e a cegueira durante a coleta de dados, todas as imagens foram codificadas por números; a sequência de análise de imagens foi aleatória entre os leitores de modo que os diferentes leitores analisaram diferentes imagens a qualquer momento, e os dados foram enviados no final de cada semana. Devido à maior probabilidade de variabilidade entre leitores na região de seleção de interesse na sub-região de análise de interesse, os leitores foram treinados utilizando várias imagens de amostra para otimizar a seleção da região no córtex e no hipocampo antes de iniciar a coleta de dados. Esse treinamento é crucial para reduzir a variabilidade entre leitores e, como se pode ver (Figura 5A,B), a área 6E10-positiva relatada por ambos os leitores mostra uma forte concordância relativa no presente estudo.
O protocolo atual e os resultados fornecem informações valiosas sobre o impacto da região do tamanho dos juros na quantificação da área Aβ positiva. Espera-se que uma região maior de interesse represente o tecido mais do que uma região menor de interesse. Portanto, a amostragem de um tecido maior é desejável quantificar com precisão a carga Aβ nos tecidos. No entanto, no caso da distribuição homogênea da carga Aβ dentro do tecido, uma região amostral menor é geralmente considerada uma boa representação do tecido maior em análise. Os resultados atuais do estudo confirmam isso, e a carga de Aβ em todo o córtex e o hipocampo foi uma forte correlação da carga de Aβ em uma sub-região selecionada do córtex e do hipocampo (Figura 5C,D). Para confirmar ainda mais o acordo entre as análises de interesse completa e sub-regiões, foi comparada a área média 6E10 positiva no córtex e no hipocampo, não foi encontrada diferença entre os dois métodos (Figura 5E). Isso confirma que qualquer um desses métodos (análise completa ou sub-região) produz medições de carga Aβ comparáveis.
O protocolo atual tem algumas limitações. Os dois métodos (análise de região completa versus sub-região) nem sempre podem ser utilizados de forma intercambiável. A escolha do uso da análise completa ou sub-região dependerá da distribuição regional de Aβ dentro do tecido, que é impactado pela idade, sexo e tensão do modelo de camundongos AD. Aos 13 meses, a carga Aβ é distribuída por todo o córtex e hipocampo dos ratos APP/PS1. No entanto, aos 6 meses, os depósitos Aβ são limitados ao córtex, e depósitos mínimos são observados no hipocampo12. Sob tais condições, a região completa da análise de interesse pode ser a abordagem desejada para aumentar a área de amostragem de tecidos e, assim, o sinal Aβ. Por outro lado, a análise sub-região pode ser o método de escolha quando a carga de Aβ em uma região cerebral específica é de interesse, (por exemplo, o córtex somatosensorial). Além disso, aos 13 meses, os camundongos machos APP/PS1 demonstram intensas manchas 6E10 positivas, e a coloração imunofluorescente resulta em um excelente sinal com um fundo muito baixo, tornando o protocolo atual muito adequado para quantificação nas condições dadas. Não está claro se esse método de quantificação pode ser aplicado com sucesso a manchas menos intensas, e futuros trabalhos serão necessários para responder a essa pergunta. O método de quantificação imunofluorescente e de imagem aqui apresentado detecta todas as formas de Aβ, incluindo a forma precursora13. Como resultado, se houver interesse na detecção de uma espécie Aβ específica (por exemplo, Aβ1-40 ou Aβ1-42), anticorpos específicos desses isoformes Aβ podem ser usados. Portanto, embora o método de coloração e detecção imunofluorescente 6E10 tenha correlacionado com as medidas de Aβ1-42 em homogeneizadores cerebrais inteiros utilizando ELISA (Figura 5F,G), a correlação foi apenas modesta. Isso pode ser atribuído à medição de apenas Aβ1-42 usando o ELISA e detecção de todas as espécies Aβ usando a imunosstaining 6E10. O presente estudo utiliza três leitores para avaliar o acordo e a correlação entre as análises completa e sub-regional. Ter leitores adicionais pode melhorar a robustez do estudo e pode validar ainda mais os acordos entre os dois métodos aqui apresentados. Além disso, utilizamos a correlação de Pearson como medida de concordância, amplamente utilizada entre outros métodos para descrever a concordância entre as variáveis contínuas19. No entanto, uma limitação do uso da correlação de Pearson para determinar o acordo é que os dois métodos aqui utilizados podem fornecer resultados relacionados, mas um método pode resultar em valores gerais mais elevados do que o outro devido ao viés sistemático. Portanto, a correlação de Pearson é uma boa medida de acordo relativo19. Para aumentar a robustez do protocolo, podemser utilizados métodos adicionais para confirmar o acordo absoluto, como comparar a área média 6E10-positiva pelos dois métodos (Figura 5E). Em conjunto, o protocolo atual compara a carga Aβ detectada pela coloração imunofluorescente e analisa as sub-regiões de interesse em seções de tecido cerebral. Os resultados mostram uma forte correlação entre esses dois métodos para seções de tecido cerebral derivadas de camundongos machos APP/PS1 de 13 meses de idade que mostram depósitos abundantes de Aβ.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Envelhecimento dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de premiação R01AG062840 (para RKS) e R01AG072896 (para RKS). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Aproximadamente US$ 200 mil (100%) dos fundos federais apoiaram este projeto. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Joshua Yang por sua ajuda com a edição de manuscritos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML |
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