Summary
Den nåværende protokollen beskriver og sammenligner prosedyren for å utføre en full-region eller sub-region av interesse analyse av sagittal mus hjerne seksjoner for å kvantifisere amyloid-beta belastning i APP / PS1 transgene musemodell av Alzheimers sykdom.
Abstract
Ekstracellulær akkumulering av amyloid-beta (Aβ) plakk er et av de viktigste patologiske kjennetegnene ved Alzheimers sykdom (AD), og er målet for den eneste FDA-godkjente sykdomsmodifiserende behandlingen for AD. Følgelig brukes bruken av transgene musemodeller som overekspresserer amyloidforløperproteinet og dermed akkumulerer cerebral Aβ-plakk, mye brukt til å modellere menneskelig AD hos mus. Derfor måler immunoassays, inkludert enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og immunostaining, vanligvis Aβ-belastningen i hjernevev avledet fra AD-transgene mus. Selv om metodene for Aβ-deteksjon og kvantifisering er godt etablert og dokumentert, er det ikke rapportert effekten av størrelsen på interesseområdet som er valgt i hjernevevet på Aβ-belastningsmålinger etter immunstaining. Derfor hadde den nåværende protokollen som mål å sammenligne Aβ-belastningsmålingene på tvers av full- og underregioner av interesse ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare. Trinnene som er involvert i hjernevevsforberedelse, frittflytende hjerneseksjonsimmunisering, avbildning og kvantifisering av Aβ-belastning i full- versus underregioner av interesse, beskrives ved hjelp av hjerneseksjoner avledet fra 13 måneder gamle APP / PS1 doble transgene mannlige mus. Den nåværende protokollen og resultatene gir verdifull informasjon om virkningen av størrelsen på interesseområdet på Aβ-positiv område kvantifisering, og viser en sterk sammenheng mellom det Aβ-positive området oppnådd ved hjelp av full- og underregioner av interesseanalyser for hjerneseksjoner avledet fra 13 måneder gamle mannlige APP / PS1 mus som viser utbredt Aβ-avsetning.
Introduction
Alzheimers sykdom (AD), den sjette ledende dødsårsaken i USA, fortsetter å være en folkehelsetrussel, med anslagsvis 6,2 millioner amerikanere som bor med AD. Dette forventes å nå 13,8 millioner innen 20601. Til dags dato er symptomatisk styring gjennom medisiner som kolinsterasehemmere og memantin det primære behandlingsforløpet2. AD er preget av nevropaologiske manifestasjoner som ekstracellulær avsetning av amyloid-beta (Aβ) plakk og intracellulær hyperfosforylert tau akkumulering i form av nevrofibrillære tangles 3,4. Formet av en endoproteolytisk spalting av amyloid forløperproteinet (APP) via beta- og gamma-secretase, aggregerer Aβ for å danne oligomerer og fibrils, noe som fører til nevrotoksiske effekter5. Aβ har blitt hypoteset til å tjene en primær patologisk rolle siden 1980-tallet, og er det terapeutiske målet for den eneste FDA-godkjente sykdomsmodifiserende behandlingen for6. Som et resultat har transgene AD-musemodeller med mutasjoner i gener som resulterer i robust cerebral Aβ-akkumulering blitt mye brukt til preklinisk AD-forskning siden tidlig på 1990-tallet7.
Påvisning av Aβ-arter i disse AD-transgene musehjernene gjøres vanligvis ved hjelp av to immunoassays: enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og immunstaining. Den tidligere analysen muliggjør kvantitativ bestemmelse av forskjellige Aβ-arter og er mindre tidkrevende sammenlignet med immunoppnåelse, noe som krever flere sekvensielle vevsbehandlings- og bildetrinn, inkludert vevsseksjon, immunostaining, avbildning og kvantifisering8. Videre er resultatene oppnådd etter immunstainingsemi-kvantitative 8. Evnen til å lokalisere Aβ gjør imidlertid immunstaining til en attraktiv tilnærming for Aβ-deteksjon i hjernevev8.
Ved bruk av Aβ-immunostaining har flere ulike kvantifiseringsparadigmer blitt brukt av ulike forskningsgrupper. For eksempel kvantifiserer noen forskningsgrupper Aβ-belastningen i hele interesseområdet (cortex eller hippocampus), mens andre kvantifiserer Aβ-belastningen i en spesifisert underregion av interesse (en del av cortex eller hippocampus)9,10,11. Selv om metodene for Aβ-deteksjon og kvantifisering er godt etablert og dokumentert, er det ikke rapportert effekten av størrelsen på interesseområdet på Aβ-belastningsmålinger etter immunstaining. Derfor hadde den nåværende protokollen som mål å sammenligne Aβ-belastningsmålingene på tvers av full- og underregioner av interesse ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare, ImageJ.
Den nåværende studien brukte 13 måneder gamle APP/ PS1 doble transgene hannmus, som uttrykker en chimerisk mus / menneskelig APP og en mutant presenilin 1, for å modellere tidlig start på12 e.Kr. Aβ-forekomster begynner å utvikle seg med 6-7 måneder, og rikelig Aβ-akkumulering observeres både i cortex og hippocampus av disse musene med 9-10 måneder i alderen12. De transgene amyloidpeptider og holoprotein kan påvises ved 6E10-immunostaining13, noe som gjør det til en ønskelig dyremodell for den nåværende protokollen. Prosedyren som dekkes her inkluderer hjernevevsforberedelse, immunisering av frittflytende seksjoner, avbildning og kvantifisering av Aβ-belastning i full- versus underregioner av interesse. Analysen viser en sterk sammenheng mellom full- og subregionsk kvantifisering, noe som indikerer robust enighet mellom disse to metodene i hjernevevsseksjonene avledet fra 13 måneder gamle APP / PS1 mannlige mus som viser rikelig Aβ-forekomster.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med University Laboratory Animal Resources under protokoller godkjent av University of California, Irvine, Institutional Animal Care and Use Committee. Eksperimentene ble utført med mannlige B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (APP/PS1) mus (13 måneder gamle, n = 35). Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se Materialliste).
1. Forberedelse av hjernevev
- Bedøv musene ved hjelp av en dødelig dose av et fenytoin/pentobarbitalbasert bedøvelsesmiddel (150 mg/kg) injisert intraperitonealt (se materialfortegnelser) etter godkjente dyreprotokoller. Utfør hjerteperfusjon med iskald fosfatbufret saltvann (1x PBS) i 5 minutter med en hastighet på 5 ml/min for å fjerne hjernens vaskulatur14.
- Høst hjernevev etter den tidligere publiserte rapporten15, separer i venstre og høyre hjernehalvdel og legg høyre hemihjerne av hver mus i et 15 ml konisk rør som inneholder 5 ml nytilberedt 4% paraformaldehyd (PFA) løsning i 1x PBS i 72 timer ved 4 °C.
MERK: Hjernene kan være nedsenket fra 24-72 timer avhengig av antigenet som studeres. Venstre hemi-hjerne, uten cerebellum, kan fryses i flytende nitrogen og deretter lagres ved -80 °C, etterfulgt av behandling for biokjemiske analyser som ELISA og biokjemisk Aβ-deteksjon16.
FORSIKTIG: PFA er et sannsynlig kreftfremkallende middel, og hudkontakt med PFA kan føre til allergiske hudsymptomer. Bruk nitril- eller butylhansker, masker og øyebeskyttelse for å håndtere det, og forbered deg under en kjemisk avtrekkshette. - Etter inkubasjon i 4% PFA, inkuber hemihjernene sekvensielt i 5 ml 10%, 20% og 30% sukroseløsninger fremstilt i 1x PBS i 24 timer, hver ved 4 °C til hjernevevet synker til bunnen av konisk rør.
- Etter inkubasjon i 30% sukroseoppløsningen, fjern hemi-hjernen, forsiktig dab hjernen på et filterpapir for å fjerne overflødig sukroseoppløsning, og frys den faste hemihjernen i pulverisert tørris i 30 minutter. Oppbevar den frosne hemihjernen i godt merkede aluminiumsfolier ved -80 °C til kryooseksjon.
MERK: I den nåværende protokollen ble hemihjernene lagret ved -80 °C i 6-8 måneder. - Del den frosne hemihjernen i 20 μm tykke seksjoner ved hjelp av en kryostat (se Materialfortegnelser).
MERK: For den nåværende protokollen ble hemihjernene delt inn i sagittale seksjoner, og om nødvendig kan koronaseksjoner også fremstilles17. Trinn 2 er for Aβ immunfluorescent farging på faste og kryooproterte hjernevevsprøver.
2. Immunfluorescens
- Plasser sagittal hjernevevsseksjonene (trinn 1,5) i en 24-brønns plate (opptil seks musehjerneseseksjoner per 300 μL per brønn). Vask i 5 min med 1x PBS tre ganger ved romtemperatur (23 °C) ved å plassere platen på en shaker med skånsom virveling.
- Inkuber hjernevevsseksjonene med 70% maursyre i dH20 ved romtemperatur i 10 min.
FORSIKTIG: Maursyre er etsende, så unngå hud- og øyekontakt. - Vask hjernevevsseksjonene i 5 min med dH20 tre ganger ved romtemperatur.
- Blokker ikke-spesifikk binding med 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) og 0,3 % TritonX 100 (se Materialfortegnelser) i 1x PBS ved romtemperatur i 1 time.
- Inkuber hjernevevsseksjonene med et fluoroformerket primærantistoff (6E10, se Materialtabellen) fortynnet (1:1000) i 1x PBS som inneholder 0,3% TritonX 100 ved 4 °C i 24 timer.
MERK: Siden det primære antistoffet er fluoroforkonjugert, må platen dekkes fra dette trinnet og fremover, eller alt arbeid må gjøres i et mørkt rom for å opprettholde fluorofor effektivitet. - Vask hjernevevsseksjonene i 10 min med 1x PBS tre ganger ved romtemperatur.
- Monter hjernevevsdelene på positivt ladede glasssklier (se Materialfortegnelse) som er godt merket (etikettinformasjon på lysbildet er basert på preferanse), etter en kort vask med dH20 for å fjerne gjenværende salter. La skredene lufttørke i mørket.
MERK: Hjerneseksjonene må monteres forsiktig for å unngå folder og riper, noe som påvirker data kvantifisering. Ved riper og/eller folder som ligger i interesseområdet og kan forstyrre data kvantifisering, anbefales re-farging og re-montering. - Monter hjernevevsseksjonene med et vandig monteringsmedie (se Materialtabell) og plasser glassdekslene over vevet. Forsegle endene av dekslene med klar neglelakk og oppbevar lysbildene i en glideboks ved 4 °C til bildebehandling.
MERK: I gjeldende protokoll ble lysbildene avbildet innen 1 måned etter farging.
3. Bildebehandling
- Bilde 6E10-farget hjerne seksjoner ved hjelp av en fluorescens (epifluorescence eller confocal) mikroskop (se Tabell over materialer), som har en 2x mål å fange hele hjernevev delen i ett bilde og er utstyrt med riktig filter (GFP i dette arbeidet).
MERK: Bildeinnstillingene må være konsekvente på tvers av forskjellige lysbilder. - Lagre de innspilte bildene som en TIFF-fil eller etter behov, og åpne dem i bildeanalyseprogramvaren (se Tabell over materialer) som beskrevet i trinn 4.2 nedenfor for 6E10-kvantifisering.
MERK: Inkluder en skalalinje før du tar bildet for å kvantifisere i bildeanalyseprogramvaren ImageJ.
4. Full region av interesseanalyse
MERK: Det nåværende verkets to interesseregioner er hippocampus og iso-cortex. Full-region av interesse analyse representerer analysen av hele iso-cortex (referert til som cortex fremover) eller hippocampus i den avbildede hjernevev delen.
- Last ned bildeanalyseprogramvaren (se Tabell over materialer) og start programvaren når den er installert.
- Når programvaren kjører, klikker du på Fil | Åpne | Velg bildet som skal analyseres.
- Klikk på Analyser | Angi skala| Klikk for å fjerne skalaen. Velg det rette verktøyet fra programvareverktøylinjen, og tegn en rett linje langs lengden på skalalinjen. Klikk på Analyser | Mål. Legg merke til lengden eller avstanden til skalalinjen i piksler. Klikk på Analyser | Angi skala.
- I popup-vinduet angir du avstanden i piksler, den kjente avstanden til skalalinjen (i μm i dette tilfellet) og lengdeenheten som μm. Merk av for Global for å bruke den nye skaleringsinnstillingen på alle følgende bilder hvis flere bilder behandles. Klikk OK for å bruke innstillingene.
MERK: Det anbefales alltid å sjekke om den nøyaktige vekten brukes på bildet før videre analyse.
- I popup-vinduet angir du avstanden i piksler, den kjente avstanden til skalalinjen (i μm i dette tilfellet) og lengdeenheten som μm. Merk av for Global for å bruke den nye skaleringsinnstillingen på alle følgende bilder hvis flere bilder behandles. Klikk OK for å bruke innstillingene.
- Hvis du vil angi ønsket mål for området for inndelingen, går du til Analyser | Angi mål | Merk av for Område og Vis etikett . Kontroller at bildet som analyseres, er valgt under Omadresser til.
- For enkel hippocampus- eller cortex-visualisering, gå til Image | Juster | Lysstyrke/kontrast. Dra den maksimale glidebryteren gradvis til venstre for å øke vevsklarheten til hjerneområdene av interesse er identifiserbare.
MERK: Ikke bruk denne innstillingen for å unngå falske målinger under analysen, og fortsett i stedet til neste trinn. - Bruk markeringsverktøyet Polygon eller Frihånd til å skissere hippocampus-regionen. Klikk på Tilbakestilling alternativet for lysstyrke / kontrast innstillinger når hippocampus er skissert for å gå tilbake til den opprinnelige lysstyrken.
MERK: Trinnene må gjentas separat for kortikale regionen. - For å måle det totale vevsområdet i det valgte området, klikk på Rediger | Rydd utenfor. Når det valgte området er det eneste bildet på skjermen, klikker du på Analyser | Mål for å få det totale vevsområdet analysert i et popup-vindu. Lagre dataene i en Excel-fil for senere bruk.
- Hvis du vil måle området 6E10-positiv, går du til Bilde | Juster | Fargeterskel. Et forhåndsprodusert filter under Terskelverdi-metoden gir vanligvis ønskede resultater som fremhever de sterkeste signalene i rødt.
MERK: Den optimale terskelmarkeringen avhenger av bakgrunnen til bildet og fargeintensiteten. Velg en terskelinnstilling som fanger opp flekken og ikke bakgrunnen. - Når du har valgt riktig terskel, kontrollerer du Mørk bakgrunn. Dette vil markere Aβ flekker (flekken av interesse) på en svart bakgrunn. Klikk på Velg | Opprinnelig | Velg, og gi de mørke signalene (Aβ-avsetningene) på hvit bakgrunn. Klikk på Analyser | Analyser partikler , og klikk OK når popup-vinduet genererer.
- Kopier sammendragsutdataene som genereres av programvaren ved å klikke på Rediger | Kopier. Lim inn i den tidligere startede Excel-filen med respektive etiketter. Dette er det 6E10-positive området i de valgte interesseområdene (enten hippocampus eller cortex).
MERK: I Excel vil det være en kolonne for det totale 6E10-positive området (trinn 4.10) og det totale vevsområdet (trinn 4.7). - Beregn det 6E10-positive området (%) som følger16: (Totalt 6E10-positivt område / Totalt vevsområde analysert) x 100.
5. Underregion av interesseanalyse
MERK: Underregionen av interesseanalyse representerer analysen av en del av cortex eller hippocampus i den avbildede hjernevevsseksjonen.
- Last ned bildeanalyseprogramvaren og start programvaren når den er installert.
- Når programvaren kjører, klikker du på Fil | Åpne | Velg bildet som skal analyseres.
- Klikk på Analyser | Angi skala| Klikk for å fjerne skalaen. Velg rett verktøy fra programvareverktøylinjen, og tegn en rett linje langs lengden på skalalinjen. Klikk på Analyser | Mål. Legg merke til lengden eller avstanden til skalalinjen i piksler. Klikk på Analyser | Angi skala.
- I popup-vinduet angir du avstanden i piksler, den kjente avstanden til skalalinjen (i μm i dette tilfellet), og angir lengdeenheten som μm. Merk av for Global for å bruke den nye skaleringsinnstillingen på alle følgende bilder hvis flere bilder behandles. Klikk OK for å bruke innstillingene.
MERK: Det anbefales alltid å sjekke om den nøyaktige vekten brukes på bildet før videre analyse.
- I popup-vinduet angir du avstanden i piksler, den kjente avstanden til skalalinjen (i μm i dette tilfellet), og angir lengdeenheten som μm. Merk av for Global for å bruke den nye skaleringsinnstillingen på alle følgende bilder hvis flere bilder behandles. Klikk OK for å bruke innstillingene.
- Hvis du vil angi ønsket mål til området i inndelingen, går du til Analyser | Angi mål | merker du av for Område og Vis etikett . Kontroller at bildet som analyseres, er valgt under Omadresser til.
- Juster lysstyrken og kontrasten hvis bildet er for svakt og hjerneområdene (f.eks. hippocampus eller cortex i dette tilfellet) ikke lett kan identifiseres. Bruk programvareverktøylinjen og klikk på Image | Juster | Lysstyrke/kontrast , og dra maksimumsglidebryterne mot venstre etter behov for å øke vevssynligheten.
MERK: Ikke bruk denne innstillingen for å unngå falske målinger under analysen, og fortsett i stedet til neste trinn. - Bruk rektangelverktøyet til å velge regionen av interesse for cortex eller hippocampus. Bruk verktøylinjen, og klikk Rediger | Merket område | Angi, og endre høyden og bredden til en forhåndsdefinert verdi. Juster boksen, slik at den er helt dekket av vev. Tilbakestill lysstyrken/kontrasten for å gå tilbake til den opprinnelige lysstyrken.
MERK: Størrelsen på boksen som brukes til å velge interesseområdene, må være konsekvent for alle bildene. For den nåværende analysen var boksstørrelsen enten 300 piksler x 300 piksler (tilsvarende 1177 μm x 1177 μm) eller 400 piksler x 200 piksler (tilsvarende 1569 μm x 784 μm). - Dupliser det valgte området av interesse ved å høyreklikke boksen og klikke på Dupliser. Et nytt vindu med det valgte området åpnes. Gi nytt navn til det dupliserte bildet for å vise regionen det ligger i (f.eks. cortex eller hippocampus).
- Juster den dupliserte bildetypen ved hjelp av verktøylinjen og klikk på Bilde | Skriv inn | 8-biters for å konvertere det dupliserte RGB-bildet til 8-biters for best å analysere plakkene. Inverter bildet ved å klikke på Rediger | Inverter.
- Hvis du vil måle området 6E10-positiv, går du til Bilde | Juster | Terskelverdi. Et forhåndsdefinert filter under Terskelverdi-metoden gir vanligvis de ønskede resultatene ved å fremheve de sterkeste signalene i rødt.
MERK: Den optimale terskelmarkeringen avhenger av bakgrunnen til bildet og fargeintensiteten. Velg en terskelinnstilling som fanger opp flekken og ikke bakgrunnen. - Når du har valgt riktig terskel, velger du Bruk.
- Hvis du vil analysere området 6E10-positive, bruker du verktøylinjen og klikker Analyser | Analyser partikler, og sørg for at "Oppsummer resultater" kontrolleres.
- Kopier sammendragsutdataene med %Area generert av programvaren ved å klikke på Rediger | Kopier. Lim inn i den tidligere startede Excel-filen med respektive etiketter.
- Gjenta trinn 5.3-5.12 for de forskjellige områdene i vevet. Kontroller at plasseringen av hver boks for å skissere interesseområdet er konsekvent mellom hvert bilde.
MERK: Rotasjonsverktøyet kan brukes hvis rektangelverktøykassens dimensjoner ikke får plass i det angitte området på grunn av vevskurvatur. - Hvis du vil rotere rektanglet, bruker du verktøylinjen og klikker Rediger | Merket område | Roter og juster rotasjonsgraden etter behov. Dupliser bildet som nevnt i trinn 5.7, og rydd utsiden ved å bruke verktøylinjen og klikke Rediger | Fjern utsiden, som fjerner 6E10-flekkene utenfor det angitte rektangelet. Fortsett med trinn 5.8 som er beskrevet ovenfor.
Representative Results
Her sammenlignes to forskjellige metoder for å kvantifisere det 6E10-positive området i hippocampus og cortex av musehjernevev. De to metodene er hele regionen og underregionen av interesseanalyser (figur 1). Hele interesseanalysen, som navnet antyder, innebærer å skissere hele interesseområdet (i dette tilfellet enten iso-cortex eller hippocampus) for å bestemme det 6E10-positive området (figur 1A, B). Underregionen av interesseanalyse innebærer å velge et forhåndsdefinert område innenfor interesseområdet for å bestemme det 6E10-positive området (figur 1C,D). Den trinnvise ImageJ-protokollen for de to metodene vises i figur 2, figur 3 og figur 4.
Denne studien brukte tre lesere; to uavhengige lesere utførte underregionen av interesseanalyse, og den tredje leseren utførte hele interesseanalysen. Sett i figur 5A,B var det en sterk signifikant positiv korrelasjon (p < 0,0001) mellom det 6E10-positive området rapportert av de to leserne som utførte underregionen av interesseanalyse (Pearson-korrelasjonskoeffisient r = 0,97 for cortex og r = 0,96 for hippocampus). De 6E10-positive områdene rapportert av de to leserne for underregionen av interesseanalyse ble gjennomsnittet, og det gjennomsnittlige underregionen av interesse 6E10-positivt område delte en sterk signifikant positiv korrelasjon (p < 0,0001) med det 6E10-positive området oppnådd ved hjelp av hele interesseanalysen for både cortex (Pearson correlation coefficient r = 0,96; Figur 5C) og hippocampus (Pearson korrelasjonskoeffisient r = 0,95; Figur 5D). Det gjennomsnittlige kortikale og hippocampal-6E10-positive området oppnådd av hele regionen og underregionen av interesseanalyser var sammenlignbare uten signifikant forskjell, noe som bekreftet avtalen mellom de to metodene (figur 5E). Videre ble den uoppløselige Aβ1-42 målt i helhjerne homogenater i en undergruppe av mus og kortikale (figur 5F) og hippocampal (figur 5G) 6E10-positivt område bestemt av hele interesseområdet analysen var betydelig (p < 0,01) korrelert med uoppløselig Aβ1-42 belastning ved hjelp av ELISA (se Tabell over materialer).
Figur 1: Valg av alle kontra underområder av interesse. Representative bilder som viser hele iso-cortex (cortex) og hippocampus skissert for henholdsvis hele interesseanalysen i (A) og (B). Representative bilder viser valg av underregion/s av cortex og hippocampus for underregionen av interesseanalyse i henholdsvis (C) og (D). Skalastang = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Protokoll for hele interesseområdet 6E10-positiv areal kvantifisering. Bildeanalysetrinn som viser det opprinnelige bildet (A), bildet etter justering av lysstyrke/kontrast (B), valg av interesseområde (C), tømming (D), terskeljustering (E) og det endelige bildet som er klart for analyse (F). Tallene i figuren angir trinnnumrene i protokollen. Skalastang = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Protokoll for underregionen av interesse 6E10-positiv områdekvantifisering. Bildeanalysetrinn som viser det opprinnelige bildet (A), bildet etter justering av lysstyrke/kontrast (B), valg av interesseområde (C), duplisering av bildet av interesseområdet (D), endring av bildet til 8-biters og invertering av bildet (E), terskeljustering (F) og endelig bilde klar for analyse (G). Tallene i figuren angir trinnnumrene i protokollen. Skalastang = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Protokoll for området for renterotasjon. Bildeanalysetrinn som viser valget av interesseområdet og rotasjonsområdet for merkeboksen slik at det passer til vevskurvaturen (A), bildet av interesseområdet etter duplisering (B) og bildet etter at du har fjernet området utenfor (ikke-interesseområde) (C). Tallene i figuren angir trinnnummeret i protokollen. Skalastang = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenheng mellom full- og underregioner av interesseanalyser. Scatter-tomter viser sammenhengen mellom det 6E10-positive området av de to uavhengige leserne som utfører underregionen av interesseanalyse for cortex (A) og hippocampus (B). Det observeres en sterk positiv sammenheng mellom det 6E10-positive området som følge av underregionen av interesseanalyse og hele interesseanalysen for både cortex (C) og hippocampus (D). Det er ingen statistisk signifikant forskjell i det gjennomsnittlige 6E10-positive området av hele interesseområdet og underregionen av interesseanalyser i cortex og hippocampus (E). En signifikant korrelasjon observeres mellom homogenat i hele hjernen aβ1-42 målinger ved hjelp av ELISA og hele interesseområdet for både cortex (F) og hippocampus (G). Data ble analysert ved hjelp av Pearson-korrelasjonskoeffisienten r, i (A-D) og (F-G), og ved hjelp av toveis gjentatte mål ANOVA i (E) ved hjelp av en graf- og statistikkprogramvare. Data presenteres som gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM) på n = 35 mus i (E), og en tosidet p -< 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Protokollen som er beskrevet her, skisserer prosedyren for hemi-hjerneforberedelse for sagittal seksjonering, immunfluorescerende farging av Aβ-avsetninger ved hjelp av 6E10-antistoffet på frittflytende seksjoner, avbildning av Aβ-fargede hjerneseksjoner etterfulgt av kvantifisering av Aβ-forekomstene i cortex og hippocampus av musehjernevev ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare. Mens det er publiserte protokoller for å kvantifisere Aβ-belastning i hjernevevsseksjoner 8,10, beskriver denne protokollen trinnene som er involvert i kvantifiseringen av Aβ-belastning i hele iso-cortex (referert til som cortex) og hippocampus i forhold til Aβ-belastningen i en underregion av interesse for cortex og hippocampus, når dette kan være ønsket. Sammenhengen mellom full- og underregioner av interesseanalyser er også gitt.
Det er flere kritiske trinn i protokollen. For det første er protokollen som er beskrevet for 20 μm tykke hjernevevsseksjoner utsatt for frittflytende immunostaining, noe som resulterer i optimal antistoffinntrengning i vevet avsnitt18. Den frittflytende teknikken kan kreve at vevsdelene overføres manuelt mellom de forskjellige løsningene under immunfluorescerende farging, og forsiktig håndtering av vevsdelene gjennom hele prosedyren. Dette er spesielt viktig når vevsseksjonene er nedsenket i 70% maursyreoppløsning for antigenuthenting i den nåværende protokollen, noe som øker vevsskjørheten for tynne seksjoner. Alternative tilnærminger til den beskrevne protokollen inkluderer bruk av tykkere vevsseksjoner (f.eks. 30-40 μm) eller bruk av vevsseksjoner som er direkte montert på positivt ladede lysbilder før immunfluorescerende farging. For det andre bruker protokollen som er beskrevet her, et fluorescerende merket 6E10 antistoff. Foruten å bruke fluorescerende merket 6E10 antistoff, kan ikke-fluorescerende 6E10 antistoffer (f.eks. pepperrotperoksidasekonjugert 6E10 antistoff) også brukes til å oppdage Aβ-belastning i hjernevevsseksjoner, og den nåværende protokollen kan tilpasses for å kvantifisere Aβ-positive immunkjemiske flekker i hjernevevseksjonene som beskrevet tidligere8 . For det tredje vil nøyaktigheten av resultatene for Aβ-belastnings kvantifisering avhenge av riktig terskelvalg i analyseprogramvaren, som er avhengig av vevsbakgrunnen og signalintensiteten. Terskelvalg må utføres av sluttbrukeren slik at bare Aβ-positive flekker velges for kvantifisering. Sluttbrukerintervensjon kreves for å optimalisere den spesifikke terskelen som kan brukes på alle bildene for å sikre nøyaktigheten av terskelinnstillingen. For det fjerde, siden underregionen av interesseanalyse krever valg av en liten interesseregion i vevsdelen, ble to uavhengige lesere brukt til denne analysen. For å opprettholde uavhengighet og blinding under datainnsamlingen, ble alle bildene nummerert kodet; Bildeanalysesekvensen ble randomisert mellom leserne slik at de forskjellige leserne analyserte forskjellige bilder til enhver tid, og dataene ble sendt inn på slutten av hver uke. På grunn av den økte sannsynligheten for variasjon mellom lesere i regionen av interessevalg i underregionen av interesseanalyse, ble leserne opplært ved hjelp av flere prøvebilder for å optimalisere regionvalget i cortex og hippocampus før de begynte datainnsamlingen. Denne opplæringen er avgjørende for å redusere variasjon mellom lesere, og som det fremgår (figur 5A,B), viser det 6E10-positive området rapportert av begge leserne en sterk relativ avtale i den nåværende studien.
Den nåværende protokollen og resultatene gir verdifull informasjon om virkningen av regionen av interessestørrelse på Aβ-positiv område kvantifisering. En større interesseregion forventes å representere vevet mer enn en mindre interesseregion. Derfor er prøvetaking av et større vev ønskelig å nøyaktig kvantifisere Aβ-belastningen i vev. Men når det gjelder homogen Aβ-belastningsfordeling i vevet, anses en mindre prøvetakingsregion generelt som en god representasjon av det større vevet som analyseres. De nåværende studieresultatene bekrefter dette, og Aβ-belastningen i hele cortex og hippocampus var en sterk korrelasjon av Aβ-belastning i en valgt underregion av cortex og hippocampus (figur 5C, D). For ytterligere å bekrefte avtalen mellom de fulle og underregionene av interesseanalyser, ble det gjennomsnittlige 6E10-positive området i cortex og hippocampus sammenlignet, og ingen forskjell mellom de to metodene (figur 5E) ble funnet. Dette bekrefter at en av disse metodene (full- eller underregionanalyse) gir sammenlignbare Aβ-belastningsmålinger.
Gjeldende protokoll har noen begrensninger. De to metodene (full-region versus sub-region analyse) kan ikke alltid brukes om hverandre. Valget av å bruke full- eller subregionanalysen vil avhenge av den regionale fordelingen av Aβ i vevet, som påvirkes av alder, kjønn og belastning av AD-musemodellen. På 13 måneder fordeles Aβ-belastningen gjennom cortex og hippocampus av APP / PS1-musene. Men på 6 måneder er Aβ-avsetninger begrenset til cortex, og minimale forekomster observeres i hippocampus12. Under slike forhold kan hele interesseanalysen være ønsket tilnærming for å øke vevsprøvetakingsområdet og dermed Aβ-signalet. På den annen side kan underregionanalyse være den valgte metoden når Aβ-belastning i en bestemt hjerneregion er av interesse(f.eks. den somatosensoriske cortexen). I tillegg, på 13 måneder, viser APP / PS1 mannlige mus intense 6E10-positive flekker, og immunfluorescerende farging resulterer i et utmerket signal med svært lav bakgrunn, noe som gjør den nåværende protokollen svært egnet for kvantifisering under de gitte forholdene. Det er uklart om denne kvantifiseringsmetoden kan brukes med hell på mindre intens farging, og fremtidig arbeid vil bli nødvendig for å svare på dette spørsmålet. Den immunfluoreserende og bilde kvantifiseringsmetoden presentert heri oppdager alle former for Aβ, inkludertforløperformen 13. Som et resultat, hvis det er interesse for påvisning av en bestemt Aβ-spesifikasjon (f.eks. Aβ1-40 eller Aβ1-42), kan antistoffer som er spesifikke for disse Aβ-isoformene brukes. Derfor, selv om 6E10 immunfluorescent fargings- og deteksjonsmetoden korrelert med målingene av Aβ1-42-målinger i helhjerne homogenater ved hjelp av ELISA (figur 5F,G), var korrelasjonen bare beskjeden. Dette kan tilskrives målingen av bare Aβ1-42 ved hjelp av ELISA og påvisning av alle Aβ-arter ved hjelp av 6E10-immunostaining. Den nåværende studien bruker tre lesere til å vurdere avtalen og sammenhengen mellom full- og subregionale analyser. Å ha flere lesere kan forbedre robustheten i studien og kan ytterligere validere avtalene mellom de to metodene som presenteres her. Videre bruker vi Pearson-korrelasjonen som et mål på enighet, som er mye brukt blant andre metoder for å beskrive avtalen mellom kontinuerlige variabler19. En begrensning ved å bruke Pearson-korrelasjonen til å fastslå enighet er imidlertid at de to metodene som brukes her, kan gi relaterte resultater, men en metode kan resultere i generelle høyere verdier enn den andre på grunn av systematiske skjevheter. Derfor er Pearson-korrelasjon et godt mål på relativ avtale19. For å øke robustheten i protokollen kan ytterligere metoder for å bekrefte den absolutte avtalen, for eksempel å sammenligne det gjennomsnittlige 6E10-positive området ved hjelp av de to metodene (figur 5E), brukes19. Samlet sett sammenligner den nåværende protokollen Aβ-belastningen som oppdages av immunfluorescerende farging og analyserer full- og underregioner av interesse for hjernevevsseksjoner. Resultatene viser en sterk sammenheng mellom disse to metodene for hjernevevsseksjoner avledet fra 13 måneder gamle APP / PS1 mannlige mus som viser rikelig Aβ-forekomster.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of Aging of the National Institutes of Health under tildelingsnummer R01AG062840 (til RKS) og R01AG072896 (til RKS). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Omtrent $ 200 000 (100%) av føderale midler støttet dette prosjektet. Vi vil også takke Dr. Joshua Yang for hans hjelp med manuskriptredigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML |
References
- Alzheimer's Association. 2021 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimer's & Dementia. 17 (3), 327-406 (2021).
- Langa, K. M., Foster, N. L., Larson, E. B. Mixed dementia: emerging concepts and therapeutic implications. Journal of the American Medical Association. 292 (23), 2901-2908 (2004).
- Gandy, S., DeKosky, S. T. Toward the treatment and prevention of Alzheimer's disease: rational strategies and recent progress. Annual Review of Medicine. 64, 367-383 (2013).
- Bloom, G. S. Amyloid-beta and tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis. JAMA Neurology. 71 (4), 505-508 (2014).
- Gremer, L., et al. Fibril structure of amyloid-beta(1-42) by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6359), 116-119 (2017).
- Ferrero, J., et al. First-in-human, double-blind, placebo-controlled, single-dose escalation study of aducanumab (BIIB037) in mild-to-moderate Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia Translational Research & Clinical Interventions. 2 (3), 169-176 (2016).
- Poon, C. H., Wang, Y., Fung, M. L., Zhang, C., Lim, L. W. Rodent models of amyloid-beta feature of Alzheimer's disease: development and potential treatment implications. Aging and Disease. 11 (5), 1235-1259 (2020).
- Christensen, A., Pike, C. J. Staining and quantification of beta-amyloid pathology in transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Methods in Molecular Biology. 2144, 221 (2020).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (11), 4501-4506 (2009).
- Song, Z., et al. Detecting amyloid-beta accumulation via immunofluorescent staining in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Visualized Experiments. (170), e62254 (2021).
- Sun, J., et al. Hematologic safety of chronic brain-penetrating erythropoietin dosing in APP/PS1 mice. Alzheimer's & DementiaTranslational Research & Clinical Interventions. 5, 627-636 (2019).
- Jankowsky, J. L., et al. Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Human Molecular Genetics. 13 (2), 159-170 (2004).
- Grant, M. K. O., et al. Human cerebrospinal fluid 6E10-immunoreactive protein species contain amyloid precursor protein fragments. PloS One. 14 (2), 0212815 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Eichenbaum, K. D., et al. Minimally invasive method for murine brain fixation. Biotechniques. 39 (4), 487-490 (2005).
- Chang, R., et al. Blood-brain barrier penetrating biologic tnf-alpha inhibitor for Alzheimer's disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (7), 2340-2349 (2017).
- Pinskiy, V., et al. High-throughput method of whole-brain sectioning, using the tape-transfer technique. PloS One. 10 (7), 0102363 (2015).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments. (162), e61622 (2020).
- van Stralen, K. J., Dekker, F. W., Zoccali, C., Jager, K. J. Measuring agreement, more complicated than it seems. Nephron Clinical Practice. 120 (3), 162-167 (2012).
