توصيف التهاب الصفاق الإنتاني الناجم عن السالمونيلا التيفيموريوم في الفئران
Summary
يصف هذا البروتوكول تحريض الإنتان أحادي البكتيريا سالب الجرام في نظام نموذج الماوس. النموذج مفيد في التحقيق في استجابات المضيف الالتهابية والمميتة أثناء الإنتان.
Abstract
الإنتان هو استجابة مناعية للمضيف غير منظم للغزو الميكروبي أو تلف الأنسجة ، مما يؤدي إلى إصابة الأعضاء في موقع بعيد عن موقع العدوى أو الضرر. حاليا، تشمل نماذج الفئران المستخدمة على نطاق واسع من الإنتان تسمم الدم الداخلي الناجم عن عديد السكاريد الشحمي (LPS)، والربط والثقب الدماغي (CLP)، وأنظمة نماذج العدوى أحادية البكتيريا. يصف هذا البروتوكول طريقة لدراسة استجابات المضيف أثناء التهاب الصفاق الإنتاني الناجم عن عدوى السالمونيلا التيفيموريوم في الفئران. س. التيفيموريوم، وهو عامل ممرض داخل الخلايا سالب الجرام، يسبب مرضا شبيها بالتيفوئيد في الفئران.
يوضح هذا البروتوكول إعداد الثقافة ، وتحريض التهاب الصفاق الإنتاني في الفئران من خلال الحقن داخل الصفاق ، وطرق دراسة استجابات المضيف الجهازية. علاوة على ذلك ، يتم تقديم تقييم العبء البكتيري في الأعضاء المختلفة وتحليل التدفق الخلوي لزيادة أعداد العدلات في الغسيل البريتوني. السالمونيلا يؤدي الإنتان الناجم عن التيفيموريوم في الفئران إلى زيادة في السيتوكينات الالتهابية والتسلل السريع للعدلات في التجويف البريتوني ، مما يؤدي إلى انخفاض البقاء على قيد الحياة.
تم تحسين كل خطوة في هذا البروتوكول ، مما أدى إلى قابلية عالية للتكرار من التسبب في التهاب الصفاق الإنتاني . هذا النموذج مفيد لدراسة الاستجابات المناعية أثناء الإنتان البكتيري ، وأدوار الجينات المختلفة في تطور المرض ، وآثار الأدوية لتخفيف الإنتان.
Introduction
يعرف الإنتان بأنه استجابة التهابية ومناعية جهازية غير منظمة للغزو الميكروبي أو تلف الأنسجة ، مما يؤدي إلى إصابة الأعضاء بعيدا عن موقع العدوى أو الضرر. الصدمة الإنتانية هي مجموعة فرعية من الإنتان تتميز بانخفاض ضغط الدم المستمر أثناء إنعاش الحجم ، مع زيادة كبيرة في خطر الوفاة1. أصبح عامة الناس أكثر وعيا بهذا الاضطراب خلال جائحة COVID-19. وعلى الرغم من ارتفاع معدل الوفيات المرتبطة به، فإن البيانات الوبائية الشاملة عن العبء العالمي للإنتان غير متوفرة بسبب تعقيد تشخيصه. في عام 2017 ، كان هناك 48.9 مليون حالة إنتان و 11 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم ، وهو ما يمثل 19.7 ٪ من جميع الوفيات العالمية2. علاوة على ذلك ، وجدت دراسة حول الانتشار المطول للعدوى والإنتان المرتبط بها في مرضى وحدة العناية المركزة أن 62٪ من العزلات الإيجابية من المرضى كانت كائنات سالبة الجرام3.
في البداية ، ركزت التحقيقات حول الإنتان على تحديد الإمراض الميكروبية. ومع ذلك ، فإن فهم “فرضية الخطر” ، التي تملي كيفية تمييز المضيف بين الذات وغير الذات ، أدى إلى إمالة توازن أبحاث الإنتان نحو فهم استجابة المضيف لمسببات الأمراض الغازية. تشمل نماذج الفئران المستخدمة على نطاق واسع من الإنتان نموذج تسمم الدم الداخلي الناجم عن عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، ونماذج الإنتان متعدد الميكروبات ، والربط والثقب الرأسي (CLP) والتهاب الصفاق العمودي الصاعد للقولون (CASP) ، ونماذج العدوى الأحادية البكتيرية4.
لقد قمنا بتوحيد نظام نموذج الماوس عن طريق تحفيز الإنتان البريتوني باستخدام السالمونيلا التيفيموريوم. هذا النموذج مفيد على غيره لأن السالمونيلا التيفيموريوم هي مسببات الأمراض داخل الخلايا التي تحاكي الحالة ذات الصلة سريريا من الإنتان سالب الجرام. نتيجة تعفن الدم في التهاب الصفاق في هذا النموذج نظامية ، مع وفيات 100 ٪ في غضون 96 ساعة بعد الإصابة. لذلك ، هذا النموذج مفيد في دراسة استجابات المضيف الالتهابية والمميتة. في هذا النموذج، يحدث الإنتان عن طريق حقن 0.5 مليون وحدة تشكيل مستعمرة (CFU) من السالمونيلا التيفيموريوم داخل الصفاق في فأر C57BL/6 عمره 8-10 أسابيع. يمكن تأكيد العدوى الجهازية عن طريق تقييم العبء البكتيري للعضو ~ 16 ساعة بعد الإصابة. توضح هذه المقالة تعفن الدم الناجم عن التهاب الصفاق الناجم عن السالمونيلا التيفيموريوم في الفئران ، وتميز التغيرات الناتجة في تكوين الخلايا البريتونية ، وتحدد العبء البكتيري في الأعضاء المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة طريقة لتحفيز شكل حاد من الإنتان البكتيري عن طريق الحقن داخل الصفاق من السالمونيلا التيفيموريوم. هذا النموذج مفيد على غيره لأن السالمونيلا التيفيموريوم هي مسببات الأمراض داخل الخلايا ، وبالتالي ، شديدة الإمراض ، تحاكي الحالة ذات الصلة سريريا من الإنتان سالب الج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مرفق الحيوانات المركزي ، IISc على تزويدنا بالفئران للبحث. تم تمويل هذه الدراسة من خلال منح مقدمة إلى DpN من قسم التكنولوجيا الحيوية ومجلس أبحاث العلوم والهندسة ، حكومة الهند. يتم الاعتراف بشكل كبير بدعم البنية التحتية من برنامج DBT-IISc ومنح DST-FIST. نشكر جميع الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر DpN على دعمهم.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
