Характеристика сальмонеллы Typhimurium-индуцированного септического перитонита у мышей
Summary
Этот протокол описывает индукцию грамотрицательного монобактериального сепсиса в мышиной модельной системе. Модель полезна для исследования воспалительных и смертельных реакций хозяина во время сепсиса.
Abstract
Сепсис представляет собой нерегулируемый иммунный ответ хозяина на микробную инвазию или повреждение тканей, приводящий к повреждению органов в месте, удаленном от инфекции или повреждения. В настоящее время широко используемые модели сепсиса на мышах включают липополисахаридную (LPS) эндотоксемию, лигирование и пункцию слепой кишки (CLP) и модельные системы монобактериальных инфекций. Этот протокол описывает метод изучения реакций хозяина во время сальмонеллы Typhimurium, вызванного инфекцией септического перитонита у мышей. С. Typhimurium, грамотрицательный внутриклеточный патоген, вызывает брюшной тифоз у мышей.
Этот протокол разрабатывает культуральную подготовку, индукцию септического перитонита у мышей посредством внутрибрюшинной инъекции и методы изучения системных реакций хозяина. Кроме того, представлена оценка бактериальной нагрузки в различных органах и проточный цитометрический анализ повышенного количества нейтрофилов в перитонеальном лаваже. Сальмонелла Typhimurium-индуцированный сепсис у мышей приводит к увеличению провоспалительных цитокинов и быстрой инфильтрации нейтрофилов в брюшинной полости, что приводит к снижению выживаемости.
Каждый шаг в этом протоколе был оптимизирован, что привело к высокой воспроизводимости патогенеза септического перитонита. Эта модель полезна для изучения иммунологических реакций во время бактериального сепсиса, роли различных генов в прогрессировании заболевания и эффектов лекарств для ослабления сепсиса.
Introduction
Сепсис определяется как дисрегулируемый системный воспалительный и иммунный ответ на микробную инвазию или повреждение тканей, приводящий к повреждению органа, удаленному от места инфекции или повреждения. Септический шок представляет собой подмножество сепсиса, характеризующегося гипотонией, сохраняющейся во время объемной реанимации, со значительно повышенным риском смертности1. Широкая общественность стала более осведомлена об этом расстройстве во время пандемии COVID-19. Несмотря на высокую смертность, всеобъемлющие эпидемиологические данные о глобальном бремени сепсиса отсутствуют из-за сложности его диагностики. В 2017 году во всем мире было зарегистрировано 48,9 миллиона случаев сепсиса и 11 миллионов смертей, что составляет 19,7% всех глобальных смертей2. Кроме того, исследование расширенной распространенности инфекции и связанного с ней сепсиса у пациентов отделения интенсивной терапии показало, что 62% положительных изолятов от пациентов были грамотрицательными организмами3.
Первоначально исследования сепсиса были сосредоточены на разграничении микробного патогенеза. Однако понимание «гипотезы опасности», которая диктует, как хозяин различает себя и не-себя, привело к смещению баланса исследований сепсиса в сторону понимания реакции хозяина на вторгшийся патоген. Широко используемые модели сепсиса на мышах включают модель эндотоксемии, индуцированную липополисахаридом (ЛПС), модели полимикробного сепсиса, перевязку и пункцию слепой кишки (CLP) и перитонит стента толстой кишки (CASP) и модели монобактериальной инфекции4.
Мы стандартизировали систему мышиной модели, индуцируя перитонеальный сепсис с использованием Salmonella Typhimurium. Эта модель выгодна перед другими, потому что Salmonella Typhimurium является внутриклеточным патогеном, который имитирует клинически значимое состояние грамотрицательного сепсиса. Исход сепсиса перитонита в этой модели является системным, со 100% смертностью в течение 96 ч после заражения. Таким образом, эта модель играет важную роль в изучении воспалительных и смертельных реакций хозяина. В этой модели сепсис индуцируется внутрибрюшинной инъекцией 0,5 миллиона колониеобразующих единиц (КОЕ) Salmonella Typhimurium в 8-10-недельную мышь C57BL/6. Системная инфекция может быть подтверждена путем оценки бактериальной нагрузки органов ~ 16 ч после заражения. Эта статья демонстрирует сепсис перитонита, вызванный сальмонеллой Typhimurium, у мышей, характеризует результирующие изменения в составе перитонеальных клеток и количественно оценивает бактериальную нагрузку в различных органах.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной статье описан метод индуцирования тяжелой формы бактериального сепсиса путем внутрибрюшинной инъекции сальмонеллы Typhimurium. Эта модель выгодна перед другими, так как Salmonella Typhimurium является внутриклеточным патогеном и, следовательно, высокопатогенным, имитируя клиниче…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Центральный центр животноводства, IISc за поставку нам мышей для исследований. Это исследование финансировалось за счет грантов DpN от Департамента биотехнологии и Совета по научным и инженерным исследованиям правительства Индии. Инфраструктурная поддержка со стороны программы DBT-IISc и грантов DST-FIST высоко ценится. Мы благодарим всех предыдущих и нынешних членов лаборатории DpN за их поддержку.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
