Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Характеристика сальмонеллы Typhimurium-индуцированного септического перитонита у мышей

Published: July 29, 2022 doi: 10.3791/63695

Summary

Этот протокол описывает индукцию грамотрицательного монобактериального сепсиса в мышиной модельной системе. Модель полезна для исследования воспалительных и смертельных реакций хозяина во время сепсиса.

Abstract

Сепсис представляет собой нерегулируемый иммунный ответ хозяина на микробную инвазию или повреждение тканей, приводящий к повреждению органов в месте, удаленном от инфекции или повреждения. В настоящее время широко используемые модели сепсиса на мышах включают липополисахаридную (LPS) эндотоксемию, лигирование и пункцию слепой кишки (CLP) и модельные системы монобактериальных инфекций. Этот протокол описывает метод изучения реакций хозяина во время сальмонеллы Typhimurium, вызванного инфекцией септического перитонита у мышей. С. Typhimurium, грамотрицательный внутриклеточный патоген, вызывает брюшной тифоз у мышей.

Этот протокол разрабатывает культуральную подготовку, индукцию септического перитонита у мышей посредством внутрибрюшинной инъекции и методы изучения системных реакций хозяина. Кроме того, представлена оценка бактериальной нагрузки в различных органах и проточный цитометрический анализ повышенного количества нейтрофилов в перитонеальном лаваже. Сальмонелла Typhimurium-индуцированный сепсис у мышей приводит к увеличению провоспалительных цитокинов и быстрой инфильтрации нейтрофилов в брюшинной полости, что приводит к снижению выживаемости.

Каждый шаг в этом протоколе был оптимизирован, что привело к высокой воспроизводимости патогенеза септического перитонита. Эта модель полезна для изучения иммунологических реакций во время бактериального сепсиса, роли различных генов в прогрессировании заболевания и эффектов лекарств для ослабления сепсиса.

Introduction

Сепсис определяется как дисрегулируемый системный воспалительный и иммунный ответ на микробную инвазию или повреждение тканей, приводящий к повреждению органа, удаленному от места инфекции или повреждения. Септический шок представляет собой подмножество сепсиса, характеризующегося гипотонией, сохраняющейся во время объемной реанимации, со значительно повышенным риском смертности1. Широкая общественность стала более осведомлена об этом расстройстве во время пандемии COVID-19. Несмотря на высокую смертность, всеобъемлющие эпидемиологические данные о глобальном бремени сепсиса отсутствуют из-за сложности его диагностики. В 2017 году во всем мире было зарегистрировано 48,9 миллиона случаев сепсиса и 11 миллионов смертей, что составляет 19,7% всех глобальных смертей2. Кроме того, исследование расширенной распространенности инфекции и связанного с ней сепсиса у пациентов отделения интенсивной терапии показало, что 62% положительных изолятов от пациентов были грамотрицательными организмами3.

Первоначально исследования сепсиса были сосредоточены на разграничении микробного патогенеза. Однако понимание «гипотезы опасности», которая диктует, как хозяин различает себя и не-себя, привело к смещению баланса исследований сепсиса в сторону понимания реакции хозяина на вторгшийся патоген. Широко используемые модели сепсиса на мышах включают модель эндотоксемии, индуцированную липополисахаридом (ЛПС), модели полимикробного сепсиса, перевязку и пункцию слепой кишки (CLP) и перитонит стента толстой кишки (CASP) и модели монобактериальной инфекции4.

Мы стандартизировали систему мышиной модели, индуцируя перитонеальный сепсис с использованием Salmonella Typhimurium. Эта модель выгодна перед другими, потому что Salmonella Typhimurium является внутриклеточным патогеном, который имитирует клинически значимое состояние грамотрицательного сепсиса. Исход сепсиса перитонита в этой модели является системным, со 100% смертностью в течение 96 ч после заражения. Таким образом, эта модель играет важную роль в изучении воспалительных и смертельных реакций хозяина. В этой модели сепсис индуцируется внутрибрюшинной инъекцией 0,5 миллиона колониеобразующих единиц (КОЕ) Salmonella Typhimurium в 8-10-недельную мышь C57BL/6. Системная инфекция может быть подтверждена путем оценки бактериальной нагрузки органов ~ 16 ч после заражения. Эта статья демонстрирует сепсис перитонита, вызванный сальмонеллой Typhimurium, у мышей, характеризует результирующие изменения в составе перитонеальных клеток и количественно оценивает бактериальную нагрузку в различных органах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты с использованием Salmonella Typhimurium проводились на объектах уровня биобезопасности 2 (BSL-2). Необходимо соблюдать осторожность при использовании надлежащих средств индивидуальной защиты (СИЗ), обеспечивать безопасность и следовать стандартным методам утилизации биологической опасности BSL-2. Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Институциональным комитетом по этике животных, IISc. Мыши были выведены и содержались в Центральном животноводческом учреждении IISc (регистрационный номер: 48/1999/CPCSEA, от 03.01.1999), утвержденном Министерством окружающей среды и лесного хозяйства правительства Индии. Протоколы экспериментов были утверждены Комитетом по целям, контролю и надзору за экспериментами на животных с утвержденным номером разрешения CAF/Ethics/797/2020.

Определение BSL2: Рейтинг BSL2 представляет собой то, что биологически опасные агенты представляют умеренную угрозу для окружающей среды и лабораторного персонала5.

1. Приготовление культуры сальмонеллы Typhimurium         

  1. Добавьте 100 мкл бульона сальмонеллы Typhimurium NCTC 12023 глицерина в 3 мл бульона Luria Bertani (LB). Инкубируйте культуру со скоростью 160 об/мин при 37 °C в течение ночи.
  2. Проведите 50 мкл выращенной на ночь культуры в бульоне LB на агаровую пластину Salmonella Shigella (SS) и инкубируйте при 37 °C в течение ~ 12 ч. Храните агаровую пластину SS с бактериальными колониями при 4 °C в течение нескольких дней до эксперимента с инфекцией in vivo .
  3. Выберите одну колонию из полосатой агаровой пластины SS с помощью микроконверса. Выталкивайте микрокол в 3 мл бульона LB и культивируйте при 160 об/мин при 37 °C в течение ночи.
  4. Добавьте 0,1 мл бактериальной культуры к 50 мл бульона LB и инкубируйте при 37 °C в шейкерном инкубаторе при 160 об/мин в течение 3-4 ч, чтобы достичь логарифмической фазы роста. Разбавить культуру в 2 раза, используя бульон LB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время логарифмической фазы бактериальные клетки находятся в лучшем состоянии здоровья и активно делятся.
  5. Измерьте оптическую плотность (OD) культуры при длине волны света 600 нм в спектрофотометре или считывателе микропластин. Как только ОД достигнет 1,0, сделайте две аликвоты по 1 мл культуры в микрофьюжных пробирках объемом 1,5 мл.
  6. Центрифугируйте пробирки по 7 750 × г в течение 15 мин. Выбросьте супернатант и промыть гранулу 1 мл 1x PBS 2x. Центрифугируйте пробирки по 7 750 × г в течение 15 мин.
  7. Повторно суспендировать гранулу в 0,5 мл 1x PBS в двух разных микрофьюжных пробирках по 1,5 мл. Объедините суспензии из обеих трубок в одну трубку объемом 1,5 мл, содержащую ~ 2 × 108 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл.
  8. Приготовьте бактериальную клеточную суспензию 1 × 106 КОЕ/мл, разбавляя этот раствор.
    ВНИМАНИЕ: Оптимизируйте КОЕ, соответствующую OD, в определенных лабораторных условиях для определения КОЕ для OD 1.0 перед началом экспериментов.

2. Мыши и инфекции

  1. Домашний 8-10-недельный самец мышей C57BL/6 весом ~20 г в помещении для животных в течение нескольких дней для акклиматизации.
  2. В день заражения подержите мышь одной рукой, протрите кожу живота 70% этанолом, а задние лапы раздвиньте для лучшей доступности брюшной стенки.
  3. Вводят 0,5 мл 1 × 106 КОЕ/мл бактериальной суспензии внутрибрюшинно с помощью шприца 1 мл. Поэтому каждая мышь получает 5 × 105 КОЕ. Контрольные, неинфицированные мыши получают 0,5 мл PBS в одиночку. После заражения вдавайте культуру, чтобы проверить фактически введенный КОЕ, который может варьироваться от 0,2-0,8 млн КОЕ / 0,5 млн.
  4. Поместите мышей обратно в клетки по назначению.
  5. Принесите в жертву мышей, использующих асфиксиюCO2 ~ 12-18 ч после заражения, для лучшего ответа. Обычно все инфицированные мыши умирают в течение 96 ч. При некоторых экспериментальных вмешательствах некоторые мыши могут выжить. Усыпляют этих мышей через 96 ч. Кроме того, усыпляют любую мышь с температурой тела ниже 33,2 ° C и острым дистрессом через 96 ч в качестве гуманной конечной точки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой модели некоторые мыши могут начать умирать после 12 ч инъекции сальмонеллы . Поэтому планируйте эксперименты правильно, используя несколько временных точек.

3. Оценка КОЕ органов

  1. Принесите в жертву инфицированную мышь удушьемCO2 и протрите живот кусочком хлопка, смоченным в 70% этаноле. Разрезать кожу живота. Обратитесь к статье Рэя и Диттеля для видеопротокола о том, как собирать жидкость для промывания брюшины6. Вскрываем брюшинную полость и собираем органы, представляющие интерес, в микрофьюжные трубки. Кроме того, поскольку кровь у мышей с сепсисом быстро свертывается, а количество низкое, соберите ее быстро после жертвоприношения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это видео демонстрирует перечисление КОЕ органов из печени, поскольку печень подвергается обширному гистопатологическому повреждению в этой модели сепсиса.
  2. Отрежьте небольшой кусочек печени и поместите его в микрофьюжную трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Его можно хранить на льду в течение максимум 2-3 ч, прежде чем перейти к следующему шагу.
  3. Взвесьте и переложите кусочки в микроцентрифужные трубки. Предпочтительно нарезать куски массой ~10-15 мг для правильной гомогенизации. Используйте целые органы в случае более мелких, таких как брыжеечные лимфатические узлы (MLN) или тимус.
  4. Добавьте в трубку 0,5 мл 1x PBS и гомогенизируйте органы с помощью гомогенизатора рук. Убедитесь, что органы полностью гомогенизированы. Увеличьте объем до 1 мл, добавив 0,5 мл 1x PBS.
  5. Центрифугируйте пробирки по 200 × г в течение 5 мин при 4 °C.
  6. Соберите супернатант в свежие микрофрагменные трубки и приготовьте разведения 1 × 10−1 и 10−2 в 96-луночной пластине.
  7. Выложить 50 мкл разбавителя на свежие агаровые пластины SS и инкубировать пластины при 37 °C в течение 12 ч.
  8. Подсчитайте количество колоний, которые появляются в каждом состоянии, и нормализуйте данные с массой органа с помощью уравнения (1):
    КОЕ/мг = Equation 1 (1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Число 20 используется в формуле для преобразования колоний на пластину в КОЕ/мл. Это число получают путем деления 1 мл на количество данного объема покрываемой культуры - в данном случае 50 мкл.
    Например, если в агаровой пластине SS обнаружено 100 колоний, где распространяется 50 мкл 1 × 10-1 разведения гомогенизированного органа весом 10 мг, то
    КОЕ/мг = Equation 2

4. Проточный цитометрический анализ различных популяций иммунных клеток в перитонеальном экссудате

  1. Соберите перитонеальные клетки, как описано ранее Ray и Dittel6.
  2. Повторное суспендирование клеточной гранулы из жидкости перитонеального лаважа в 1 мл RPMI с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Перечислите общее количество клеток в промывании брюшины с помощью гемоцитометра. Отрегулируйте количество клеток так, чтобы каждая трубка получала 0,2-0,5 миллиона клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перитонеальное лаваж у мышей с сепсисом может содержать эритроциты, которые, вероятно, появляются из-за кровоизлияния. Будьте осторожны, чтобы исключить эритроциты при подсчете перитонеальных клеток. В микроскопе С ярким полем эритроциты кажутся намного меньше, чем иммунные клетки. Они выглядят как плоские диски или пончики, круглые, с углублением в центре, но не полые. Шаг для лизирования эритроцитов может быть добавлен7.
  3. Раскрутите ячейки вниз при 200 × g при 4 °C в течение 10 мин, выбросьте супернатант и промыте ячейки 1x с 1x холодным PBS. Центрифугирование клеток при 200 × г при 4 °C в течение 10 мин.
  4. Блокируют Fc-рецепторы на PECs с помощью блокатора FcR (разбавление 1:400), приготовленного в блокирующем буфере, состоящем из 5% FBS и 0,02% азида натрия в PBS. Инкубировать на льду в течение 15 мин.
  5. Центрифугируют ячейки при 200 × г при 4 °C в течение 10 мин. Выбросьте супернатант. Разбавляют фторхром-конъюгированные антитела, представляющие интерес в блокирующем буфере. Используйте разведение 1:500 против мышиного LY6G для окрашивания нейтрофилов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие популяции иммунных клеток также могут быть обнаружены с помощью, например, антимышечного B220 для В-клеток, антимышечного CD3 для Т-клеток и антимышечного F4/80 для макрофагов.
  6. Инкубируют ~0,2 млн клеток в 200 мкл разбавленных растворов антител в отдельных пробирках. В качестве отрицательного контроля выделяют по одной трубке в каждом типе фторхрома для неокрашенного контроля для инкубации клеток с 200 мкл блокирующего буфера без антител.
  7. Инкубируйте образцы на льду в течение 45 минут с прерывистым постукиванием каждые 15 минут.
  8. Центрифугируют ячейки при 200 × г в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант. Зафиксируйте клетки с 4% параформальдегидом в течение ~ 15 мин при комнатной температуре, если их необходимо хранить в течение нескольких дней. Однако лучше всего получать данные из свежеокрашенных образцов в проточном цитометре.
  9. Повторное суспендирование клеток в 200 мкл буфера окрашивания FACS (2% FBS в PBS). Получение данных в проточном цитометре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Подробная характеристика иммунного ответа хозяина с использованием этой конкретной модели показана в предыдущих публикациях 8,9. В этом разделе представлены некоторые репрезентативные результаты описанного протокола. Эта модель направлена на индуцирование системной инфекции S. Типимурий путем внутрибрюшинной инъекции бактериальной культуры для индуцирования сепсиса. Для подтверждения инфекции лизаты печени и селезенки от септических мышей распределяли на агаровые пластины SS, и подсчитывали количество колоний. На рисунке 1 изображения агаровых пластин SS указывают на нагрузку на орган КОЕ в печени и селезенке септических мышей. Гомогенизированные лизаты органов распространяли в разведении 1 × 10−1 и инкубировали при 37 °C.  Черный пигментированный S. Колонии Typhimurium появились после ~12 ч инкубации при 37 °C. Кроме того, при инфицировании мышей культуры из крови и промывания брюшины, как сообщается, являются положительными для бактериальных клеток8. Эти результаты показали, что внутрибрюшинно введенные бактериальные клетки диссеминировались системно и колонизировали внутренние органы. Часть пластины показана в виде увеличенной вставки, чтобы выделить колонии. Возбудитель успешно распространялся системно и колонизировал внутренние органы.

На рисунке 2 показаны сыворотки, изолированные от здоровых и септических мышей. Объем коллекционной крови через сердечную пункцию у септических мышей обычно составляет 100-200 мкл, что ниже, чем количество у здоровых мышей, где можно получить ~500 мкл крови. В результате объем сыворотки, выделенной из септической мышиной крови, невысокий. Такое явление происходит из-за повышенной свертывания крови у септических мышей. Более того, сыворотки от септических мышей демонстрируют отчетливую красную окраску, свидетельствующую о возникновении обширного гемолиза 8,9.

Как показано на Фиг.3, иммунофенотипирование перитонеальных экссудатных клеток на основе проточной цитометрии проводили для оценки инфильтрации нейтрофилов в брюшную полость здоровых и септических мышей. Поскольку нейтрофилы экспрессируют белок LY6G на поверхности клетки, антитело против LY6G, помеченное FITC, использовалось для окрашивания популяции нейтрофильных клеток. Эти изображения представляют данные одной здоровой и двух инфицированных мышей. После сбора данных ячейки были закрыты для включения только синглетов в график FSC-A против SSC-A. Затем были нарисованы графики гистограммы и точечный график. Здесь у септических мышей наблюдалась повышенная инфильтрация нейтрофилов в брюшинной полости.

Figure 1
Рисунок 1: Визуализация КОЕ органа после заражения. Органы были гомогенизированы, как описано в протоколе. Лизат намазывали на агаровую пластину СС с помощью разбрасывателя. Изображения пластинок, распространяемых при 1 × 10-1 разведении гомогенизированных лизатов печени (А) и (В) селезенки. Часть пластины показана в виде увеличенной вставки, чтобы выделить колонии. Увеличение вставки = 13x (площадь). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Усиленный гемолиз у септических мышей. Кровь собирали в микроцентрифужные трубки и оставляли ненарушенной при комнатной температуре в течение 30 мин. Сгусток удаляли центрифугированием трубок при 2000 × г в течение 10 мин в охлажденной центрифуге. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Проточное цитометрическое профилирование популяции нейтрофилов в жидкости перитонеального лаважа. Жидкость для промывания брюшины собирали через 16 ч после заражения. Перитонеальные клетки были окрашены антителом анти-LY6G, помеченным FITC. Септические мыши показали повышенную инфильтрацию нейтрофилов в брюшинной полости. Сокращения: FITC = флуоресцеин изотиоцианат; LY6G = лимфоцитарный антиген 6 комплексный локус G6D; SSC-A = площадь бокового рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В данной статье описан метод индуцирования тяжелой формы бактериального сепсиса путем внутрибрюшинной инъекции сальмонеллы Typhimurium. Эта модель выгодна перед другими, так как Salmonella Typhimurium является внутриклеточным патогеном и, следовательно, высокопатогенным, имитируя клинически значимое состояние грамотрицательного сепсиса. Исход сепсиса перитонита в этой модели является системным, со 100% смертностью в течение 96 ч после заражения. Таким образом, эта модель играет важную роль в изучении воспалительных и летальных реакций хозяина8 и эффектов терапевтического вмешательства при ослаблении сепсиса.

В этой модельной системе клеточный состав брюшинной полости резко изменяется для борьбы с инокулированным патогеном. Большое количество нейтрофилов LY6G+ проникает в брюшинную полость, с одновременным уменьшением F4/80+ макрофагов, в результате чего возникает реакция исчезновения макрофагов (MDR)8,10. Таким образом, эта модель полезна для изучения кинетических изменений в составе и функциях иммунных клеток во время сепсиса, который все еще является чрезвычайно неисследованной областью. Сальмонелла Typhimurium системно заражает, находится и размножается в органах мышей. Провоспалительные цитокины сыворотки, такие как TNF-α, IL-6 и IFN-γ также увеличиваютсяна 8. Каскад провоспалительных реакций также приводит к гемолизу и свертыванию крови, что становится заметным при рассечении инфицированных мышей10,11. Взаимодействие между реакцией хозяина на это бактериальное бремя и повреждающим воздействием бактерий приводит к обезображенной тканевой архитектуре, потере функций и некрозу тканей, особенно в печени.

Более того, предыдущие отчеты лаборатории показали, что такие эффекты модулируются повышенной экспрессией синтазы оксида азота 2 (NOS2), что приводит к увеличению активных форм кислорода (АФК) и более высоким уровням провоспалительных цитокинов, что приводит к усилению воспалительной реакции8. Эта модель мышиного сепсиса выгодна перед другими, потому что индукция сепсиса происходит быстрее с более летальными эффектами. Это не требует технических знаний для выполнения операции на обезболенных мышах, как в случае с текущей моделью мыши CLP-сепсиса золотого стандарта. В модели CLP-сепсиса только у подмножества мышей развивается сепсис, тогда как у всех мышей развивается сепсис в модели, описанной здесь.

Более того, по сравнению с моделью эндотоксемии, вызванной ЛПС, эта модель более клинически актуальна для грамотрицательного монобактериального сепсиса. Модель также полезна для понимания увеличения внутриклеточного АФК, провоспалительных уровней цитокинов, гемолиза и свертывания крови, все из которых происходят во время сепсиса. Сообщается, что использование донорского препарата оксида азота DETA-NONOate обеспечивает преимущество выживаемости у нокаутирующих мышей Nos2 с сепсисом с использованием этой модели8. Это говорит о том, что эта модель может быть использована для идентификации новых лекарств для лечения сепсиса. Также данная модель может быть быстро принята на вооружение любой лабораторией, оснащенной оборудованием BSL-2.

При использовании этой модели необходимо принимать меры предосторожности на уровне здоровья бактериальных клеток и количества КОЕ для получения оптимальных результатов. Всегда следует использовать свежеиспеченные колонии сальмонелл из тарелок агара SS. Также рекомендуется оптимизировать процесс подготовки культуры путем нахождения значения OD в спектрофотометре, соответствующего упомянутому КОЕ.

Недостатком использования этой модели является то, что эффект сепсиса у мышей интенсивно смертелен в течение 96 часов после заражения. Это ограничивает изучение иммунных реакций хозяина в поздние моменты времени. Его можно преодолеть, используя более ослабленный бактериальный штамм Salmonella Typhimurium.

Существуют различия между пациентами, страдающими сепсисом, и моделями мышей, пытающимися имитировать сепсис человека. Например, пациентам требуется больше времени для развития сепсиса, и им назначают поддерживающие вмешательства и терапию. Однако сепсис у мышиных моделей развивается гораздо быстрее, и поддерживающие вмешательства не проводятся4. Тем не менее, есть некоторые сходства между сепсисом у людей и мышей, причем пациенты с сепсисом демонстрируют более высокие уровни провоспалительных цитокинов, свертывания крови и гемолиза в клинических условиях. Все это имитируется в этой мышиной модели сепсиса. Таким образом, некоторые показания этой модели имеют отношение к клиническим сценариям, хотя прямая корреляция может быть нецелесообразной.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Мы благодарим Центральный центр животноводства, IISc за поставку нам мышей для исследований. Это исследование финансировалось за счет грантов DpN от Департамента биотехнологии и Совета по научным и инженерным исследованиям правительства Индии. Инфраструктурная поддержка со стороны программы DBT-IISc и грантов DST-FIST высоко ценится. Мы благодарим всех предыдущих и нынешних членов лаборатории DpN за их поддержку.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
1 mL Sterile Syringe with 26 G needle Beckton Dickinson, Singapore 303060
1.5 mL Microcentrifuge Tube Tarsons, USA 500010
10 mL Sterile Syringe with 21 G needle Beckton Dickinson, Spain 307758
50 mL Conical Flask Tarsons, USA 441150
50 mL Graduated Centrifuge Tube Tarsons, USA 546041
50 mL Graduated Centrifuge Tube Tarsons, USA 546021
Cell spreader VWR, USA VWRU60828-680
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline HiMedia, Mumbai, India TS1006
Ethanol Merck 100983
FcR blocker BD Biosciences 553142
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106
FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 551460
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Hand based Homogenizer - -
Hemocytometer (Neubauer counting chamber) Rohem, India I.S. 10269
Luria Bertani Broth HiMedia, Mumbai, India M1245
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Petriplates Tarsons, USA 460091
RPMI Himedia, Mumbai, India AT060-10X1L
Salmonella-Shigella Agar HiMedia, Mumbai, India M108
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Equipments
Centrifuge Kubota
Flow cytometer BD FACSverse
Incubator N-biotek
Spectrophotometer Shimadzu
Weighing machine Sartorius

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
  2. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  3. Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
  4. Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
  5. Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
  6. Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
  7. Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
  8. Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
  9. Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
  10. Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
  11. Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 185
Характеристика <em>сальмонеллы</em> Typhimurium-индуцированного септического перитонита у мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chattopadhyay, A., Joseph, J. P.,More

Chattopadhyay, A., Joseph, J. P., Shyam, S., Nandi, D. Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice. J. Vis. Exp. (185), e63695, doi:10.3791/63695 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter