Summary
该协议描述了小鼠模型系统中革兰氏阴性单细菌性脓毒症的诱导。该模型有助于研究脓毒症期间的炎症和致死宿主反应。
Abstract
脓毒症是对微生物侵袭或组织损伤的宿主免疫反应失调,导致器官损伤在远离感染或损伤的部位。目前,广泛使用的脓毒症小鼠模型包括脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症,盲肠结扎和穿刺(CLP)以及单细菌感染模型系统。该协议描述了一种研究鼠伤寒 沙门氏菌 感染诱导的小鼠脓毒性腹膜炎期间宿主反应的方法。 S. 鼠伤寒是一种革兰氏阴性细胞内病原体,在小鼠中引起伤寒样疾病。
该方案详细说明了培养制备,通过腹腔注射诱导小鼠脓毒性腹膜炎,以及研究全身宿主反应的方法。此外,还介绍了不同器官中细菌负荷的评估以及腹膜灌洗中中性粒细胞数量增加的流式细胞术分析。 沙门氏菌 鼠伤寒诱导的小鼠败血症导致促炎细胞因子增加和腹膜腔中嗜中性粒细胞的快速浸润,导致存活率降低。
该方案中的每个步骤都经过优化,导致脓毒性腹膜炎发病机制的高再现性。该模型可用于研究细菌脓毒症期间的免疫反应,不同基因在疾病进展中的作用以及药物对减轻脓毒症的作用。
Introduction
脓毒症被定义为对微生物侵袭或组织损伤的全身炎症和免疫反应失调,导致远离感染或损伤部位的器官损伤。脓毒性休克是脓毒症的一个亚群,其特征为容量复苏期间持续低血压,死亡风险显著增加1。在COVID-19大流行期间,公众对这种疾病的认识越来越高。尽管相关死亡率很高,但由于脓毒症诊断的复杂性,缺乏关于脓毒症全球负担的全面流行病学数据。2017年,全世界有4890万例脓毒症发病率和1100万例死亡,占全球所有死亡人数的19.7%2。此外,一项关于重症监护病房患者感染和相关脓毒症患病率延长的研究发现,62% 的患者阳性分离株是革兰氏阴性菌3。
最初,脓毒症的研究集中在描述微生物发病机制上。然而,理解“危险假说”,即宿主如何区分自我和非自我,导致脓毒症研究的平衡向理解宿主对入侵病原体的反应倾斜。广泛使用的脓毒症小鼠模型包括脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症模型,多种微生物脓毒症模型,盲肠结扎和穿刺(CLP)和结肠上行支架腹膜炎(CASP),以及单细菌感染模型4。
我们已经通过使用鼠伤寒 沙门氏菌 诱导腹膜败血症来标准化小鼠模型系统。该模型优于其他模型,因为鼠伤寒 沙门氏菌 是一种细胞内病原体,模仿革兰氏阴性脓毒症的临床相关病症。在该模型中,腹膜炎脓毒症的结果是全身性的,感染后96小时内死亡率为100%。因此,该模型有助于研究炎症和致命的宿主反应。在该模型中,脓毒症是通过腹腔注射50万个菌落形成单位(CFU)的鼠伤寒 沙门氏菌 到8-10周龄的C57BL / 6小鼠中诱导的。全身感染可以通过在感染后约16小时评估器官细菌负荷来确认。本文展示了鼠伤寒 沙门氏菌 诱导的小鼠腹膜炎败血症,表征了腹膜细胞组成的改变,并量化了不同器官中的细菌负担。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有使用鼠伤寒 沙门氏菌 的实验都在生物安全2级(BSL-2)设施中进行。必须注意使用适当的个人防护装备(PPE),确保安全,并遵循标准的BSL-2生物危害处置方法。所有小鼠实验均按照机构动物伦理委员会IISc的指南进行。小鼠在IISc中央动物设施(注册号:48/1999/CPCSEA,日期为1/3/1999)进行繁殖和维护,该设施由印度政府环境和森林部批准。实验方案由动物实验目的与控制和监督委员会批准,批准的许可证号为CAF/Ethics/797/2020。
BSL2 定义:BSL2 等级表示生物危害剂对环境和实验室工作人员构成中等威胁5.
1. 鼠伤寒 沙门氏菌的培养制备
- 将100μL鼠伤寒 沙门氏菌 NCTC 12023甘油储备液加入3mLLuria Bertani(LB)肉汤中。将培养物在37°C下以160rpm孵育过夜。
- 将50μL过夜培养物在LB肉汤中连通到志贺氏菌(SS)琼脂平板上,并在37°C下孵育〜12小时。在 体内 感染实验之前,将带有细菌菌落的SS琼脂板在4°C下储存数天。
- 使用微尖从条纹SS琼脂平板中挑选单个菌落。将微尖放入3mL LB肉汤中,并在37°C下以160rpm培养过夜。
- 将0.1mL细菌培养物加入50mL LB肉汤中,并在37°C下以160rpm的振荡器培养箱中孵育3-4小时以达到对数生化阶段。使用LB肉汤将培养物稀释2倍。
注意:在对数阶段,细菌细胞处于最佳健康状态,并且正在积极分裂。 - 在分光光度计或酶标仪中以600nm波长的光测量培养物的光密度(OD)。一旦OD达到1.0,在1.5 mL微量离心管中制作两个等分试样的1mL培养物。
- 将管以7,750× g 离心15分钟。弃去上清液,用1mL 1x PBS 2x洗涤沉淀。将管以7,750× g 离心15分钟。
- 将沉淀重悬于两个不同的1.5 mL微量离心管中0.5 mL的1x PBS中。将两个管中的悬浮液组合成一个1.5 mL管,现在含有约2个×10个8 菌落形成单元(CFU)/ mL。
- 通过稀释该储备溶液制备1×106 CFU / mL的细菌细胞悬浮液。
注意:在特定的实验室条件下优化与OD相对应的CFU,以便在开始实验之前确定OD 1.0的CFU。
2. 小鼠和感染
- 将8-10周龄的雄性C57BL / 6小鼠放在动物设施的洁净空气室中,体重约20克,以进行几天的适应。
- 在感染当天,用一只手握住小鼠,用70%乙醇擦拭腹部皮肤,并展开后腿,以便更好地接近腹壁。
- 在1 mL注射器的帮助下,腹膜内注射0.5mL 1 ×106 CFU / mL细菌悬浮液。因此,每只鼠标接收5个×10个5 CFU。对照组,未感染的小鼠单独接受0.5毫升PBS。感染后,平板培养物以检查实际注射的CFU,其可能从0.2-0.8百万CFU / 0.5mL不等。
- 按照分配将小鼠放回笼子里。
- 感染后约12-18 小时使用CO 2窒息法处死小鼠以获得最佳反应。通常,所有受感染的小鼠在96小时内死亡。在一些实验干预下,一些小鼠可能会存活下来。在96小时后对这些小鼠实施安乐死。此外,安乐死任何体温低于33.2°C并在96小时时急性痛苦的小鼠作为人道终点。
注意:在此模型中,一些小鼠可能在注射 沙门氏菌 12小时后开始死亡。因此,正确规划涉及多个时间点的实验。
3. CFU对器官的评估
- 通过CO2 窒息牺牲感染的小鼠,并用一块浸有70%乙醇的棉花擦拭腹部。切开腹部皮肤。请参阅Ray和Dittel的文章,以获取有关如何收集腹膜灌洗液的视频协议6。切开腹膜腔,并将感兴趣的器官收集在微量离心管中。此外,由于患有脓毒症的小鼠的血液凝固速度快且数量低,因此在牺牲后迅速收集血液。
注意:本视频演示了肝脏器官CFU的枚举,因为肝脏在这种脓毒症模型中经历了广泛的组织病理学损伤。 - 切一小块肝脏并将其放入微量离心管中。
注意:在进行下一步之前,这可以在冰上储存最多2-3小时。 - 称重并将碎片转移到微量离心管中。优选,切割重量为〜10-15mg的碎片以进行适当的均质化。在较小的器官(如肠系膜淋巴结(MLN)或胸腺)的情况下使用整个器官。
- 向试管中加入0.5 mL 1x PBS,并使用手动均质机使器官均质化。确保器官完全同质化。通过加入 0.5 mL 的 1x PBS,将体积增至 1 mL。
- 将管在4°C下以200× g 离心5分钟。
- 将上清液收集到新鲜的微量离心管中,并在96孔板中制备1×10-1 和10-2 的稀释液。
- 将50μL稀释剂铺展到新鲜的SS琼脂平板上,并将板在37°C下孵育12小时。
- 计算每种病症中出现的菌落数量,并使用等式(1)使用器官重量对数据进行归一化:
CFU/毫克 = (1)
注意:公式中使用数字20将每板的菌落转换为CFU / mL。通过将1 mL除以接种的给定体积的培养物的量(在这种情况下为50μL)得出该数字。
例如,如果在SS琼脂平板中发现100个菌落,其中50μL的1×10-1 稀释的重10mg的均质器官扩散,则
CFU/毫克 =
4. 腹膜渗出物中各种免疫细胞群的流式细胞术分析
- 收集Ray和Dittel6之前描述的腹膜细胞。
- 将细胞沉淀从腹膜灌洗液中重悬于1mLRPMI中,补充10%胎牛血清(FBS)。使用血细胞计数器枚举腹膜灌洗液中的总细胞数。调整细胞数量,使每个试管接收0.2-0.5百万个细胞。
注意:脓毒症小鼠的腹膜灌洗可能含有红细胞,这可能是由于出血而出现的。在计数腹膜细胞时,要小心排除红细胞。在明场显微镜下,红细胞看起来比免疫细胞小得多。这些看起来像扁平的圆盘或甜甜圈,圆形,中心有凹痕,但不是空心的。裂解红细胞的步骤可以加入7. - 将细胞在4°C下以200× g 旋转10分钟,弃去上清液,并用1x冷PBS洗涤细胞1x。将细胞在4°C下以200× g 离心10分钟。
- 使用FcR阻断剂(1:400稀释)阻断PEC上的Fc受体,在PBS中由5%FBS和0.02%叠氮化钠组成的封闭缓冲液中制备。在冰上孵育15分钟。
- 将细胞在4°C下以200× g 离心10分钟。弃去上清液。在封闭缓冲液中稀释感兴趣的荧光染料偶联抗体。使用1:500稀释的抗小鼠LY6G染色嗜中性粒细胞。
注意:也可以使用例如,针对B细胞的抗小鼠B220,针对T细胞的抗小鼠CD3和针对巨噬细胞的抗小鼠F4/80来检测其他免疫细胞群。 - 在单独的试管中的200μL稀释抗体溶液中孵育约0.2百万个细胞。作为阴性对照,在每种荧光染料类型中留出一根管子,用于未染色的对照,用200μL不含抗体的封闭缓冲液孵育细胞。
- 将样品在冰上孵育45分钟,每15分钟间歇敲击一次。
- 在4°C下以200× g 离心细胞10分钟。 弃去上清液。如果需要储存几天,则在室温下用4%多聚甲醛固定细胞约15分钟。但是,最好从流式细胞仪中新染色的样品中获取数据。
- 将细胞重悬于200μLFACS染色缓冲液(PBS中2%FBS)中。在流式细胞仪中获取数据。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用这种特定模型的宿主免疫反应的详细表征显示在以前的出版物8,9中。本节描述了所描述的协议的一些代表性结果。该模型旨在诱导 S的全身感染。鼠伤寒通过腹腔注射细菌培养诱导脓毒症。为了确认感染,将脓毒性小鼠的肝脏和脾脏裂解物扩散到SS琼脂平板上,并计数菌落的数量。在 图1中,SS琼脂平板的图像表明脓毒症小鼠肝脏和脾脏中的器官CFU负荷。将均质化的器官裂解物以1×10− 1的稀释度铺展,并在37°C下孵育。 黑色色素 S. 鼠伤寒菌落在37°C孵育约12小时后出现。 此外,在感染小鼠时,据报道,来自血液和腹膜灌洗的培养物对细菌细胞8呈阳性。这些结果表明,腹膜内注射的细菌细胞全身播散并定植于内脏器官。板的一部分显示为放大的插图,以突出显示菌落。病原体成功地全身传播并在内脏器官上定植。
图2 显示了从健康和脓毒性小鼠中分离出的血清。脓毒性小鼠通过心脏穿刺获得的可收集血液体积通常为100-200μL,低于健康小鼠的量,其中可以获得〜500μL血液。结果,从脓毒性小鼠血液中分离出的血清体积低。这种现象的发生是由于脓毒性小鼠血液凝固增加。此外,来自脓毒性小鼠的血清显示出明显的红色,表明发生广泛溶血8,9。
如图 3所示,对腹膜渗出物细胞进行基于流式细胞术的免疫表型分析,以评估中性粒细胞在健康和脓毒性小鼠腹膜腔中的浸润。由于中性粒细胞在细胞表面表达LY6G蛋白,因此使用FITC标记的抗LY6G抗体来染色中性粒细胞群。这些图像代表来自一只健康和两只受感染小鼠的数据。在数据采集后,细胞被门控以仅包括FSC-A与SSC-A图中的单线态蛋白。然后,绘制直方图和点图。在这里,脓毒性小鼠在腹膜腔中显示出嗜中性粒细胞浸润的增加。
图1:感染后器官CFU的可视化。 器官均质化,如协议中所述。使用撒布机将裂解物铺展在SS琼脂平板上。用1×10-1 稀释的(A)肝脏和(B)脾脏的均质裂解物铺展的平板图像。板的一部分显示为缩放插图以突出显示菌落。插图放大倍率 = 13 倍(面积)。 请点击此处查看此图的大图。
图2:脓毒性小鼠的增强溶血。 将血液收集在微量离心管中,并在室温下保持30分钟不受干扰。通过在冷藏离心机中将管以2,000× g 离心10分钟除去凝块。 请点击此处查看此图的大图。
图3:腹膜灌洗液中嗜中性粒细胞群的流式细胞术分析。 感染后16 h采集腹膜灌洗液。腹膜细胞用FITC标记的抗LY6G抗体染色。脓毒性小鼠在腹膜腔中显示出嗜中性粒细胞浸润增加。缩写:FITC =荧光素异硫氰酸酯;LY6G =淋巴细胞抗原6复合位点G6D;SSC-A = 侧散射面积。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本文介绍了一种通过腹腔注射鼠伤寒 沙门氏菌 诱导严重细菌性脓毒症的方法。该模型优于其他模型,因为鼠伤寒 沙门氏菌 是一种细胞内病原体,因此具有高致病性,模仿革兰氏阴性脓毒症的临床相关病症。在该模型中,腹膜炎脓毒症的结果是全身性的,感染后96小时内死亡率为100%。因此,该模型有助于研究炎症和致死宿主反应8 以及治疗干预在减轻脓毒症方面的效果。
在该模型系统中,腹膜腔的细胞组成发生巨大变化以对抗接种的病原体。大量LY6G+ 中性粒细胞浸润腹膜腔,同时F4/80+ 巨噬细胞减少,导致巨噬细胞消失反应(MDR)8,10。因此,该模型可用于研究脓毒症期间免疫细胞组成和功能的动力学变化,脓毒症仍然是一个尚未探索的领域。 沙门氏菌 鼠伤寒全身感染,驻留在小鼠器官中并增殖。血清促炎细胞因子如TNF-α,IL-6和IFN-γ也增加8。一连串的促炎反应也导致血液溶血和凝固,这在解剖受感染的小鼠10,11时变得可见。宿主对这种细菌负担的反应与细菌的破坏性影响之间的相互作用导致组织结构毁容,功能丧失和组织坏死,特别是在肝脏中。
此外,实验室先前的报告表明,这种效应受到一氧化氮合酶2(NOS2)上调表达的调节,这导致活性氧(ROS)增加和促炎细胞因子水平升高,导致炎症反应增强8。这种小鼠脓毒症模型比其他模型更有利,因为脓毒症的诱导速度更快,致死作用更强。它不需要技术专业知识来对麻醉小鼠进行手术,就像目前的金标准CLP-脓毒症小鼠模型一样。在CLP-脓毒症模型中,只有一部分小鼠发生脓毒症,而所有小鼠都发生此处描述的模型中的脓毒症。
此外,与 LPS 诱导的内毒素血症脓毒症模型相比,该模型与革兰氏阴性单细菌脓毒症的临床相关性更高。该模型还有助于了解细胞内ROS,促炎细胞因子水平,溶血和凝血的增加,所有这些都发生在脓毒症期间。据报道,使用一氧化氮供体药物DETA-NONOate在使用此模型8的Nos2敲除脓毒症小鼠中提供了生存益处。这表明该模型可用于鉴定治疗脓毒症的新型药物。此外,该模型可以被任何配备BSL-2设施的实验室快速采用。
使用此模型时,必须在细菌细胞健康和CFU编号水平上采取预防措施,以获得最佳结果。人们应该始终使用来自SS琼脂平板的新鲜条纹 沙门氏菌 菌落。还建议通过在分光光度计中查找与所述CFU相对应的OD值来优化培养物制备过程。
使用该模型的缺点是脓毒症对小鼠的影响在感染后96小时内具有强烈的致死性。这限制了在晚期时间点对宿主免疫反应的研究。它可以通过使用更衰减的鼠伤寒 沙门氏菌 菌株来克服。
患有脓毒症的人类患者与试图模仿人类脓毒症的小鼠模型之间存在差异。例如,患者需要更长的时间来发展脓毒症,并接受支持性干预和治疗。然而,小鼠模型中的脓毒症发展得更快,并且不支持性干预4。然而,人类和小鼠的脓毒症之间存在一些相似之处,脓毒症患者在临床环境中表现出更高水平的促炎细胞因子,凝血和溶血。所有这些都在这个脓毒症的小鼠模型中被模仿。因此,该模型的一些读数与临床场景相关,尽管直接相关可能不可取。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢中央动物设施IISc为我们提供用于研究的小鼠。这项研究由印度政府生物技术和科学与工程研究委员会向DpN提供的赠款资助。DBT-IISc计划和DST-FIST赠款的基础设施支持得到了极大的认可。我们感谢DpN实验室所有前任和现任成员的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Consumables | |||
1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
Hand based Homogenizer | - | - | |
Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Equipments | |||
Centrifuge | Kubota | ||
Flow cytometer | BD FACSverse | ||
Incubator | N-biotek | ||
Spectrophotometer | Shimadzu | ||
Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).