マウスにおける サルモネラ ・チフス菌誘発性敗血症性腹膜炎の特性評価
Summary
このプロトコールは、マウスモデル系におけるグラム陰性単細菌敗血症の誘導を記載する。このモデルは、敗血症中の炎症性および致死性の宿主応答を調査するのに有用である。
Abstract
敗血症は、微生物の侵入または組織損傷に対する調節不全の宿主免疫応答であり、感染または損傷のそれから離れた部位で器官損傷をもたらす。現在、敗血症の広く使用されているマウスモデルには、リポ多糖(LPS)誘発性内毒素血症、盲腸結紮および穿刺(CLP)、および単細菌感染モデル系が含まれる。このプロトコールは、マウスにおける サルモネラ・ チフス菌感染誘発敗血症性腹膜炎の間の宿主応答を研究する方法を記載する。 S. グラム陰性細胞内病原体である腸チフスは、マウスに腸チフス様疾患を引き起こす。
このプロトコールは、培養調製、腹腔内注射によるマウスにおける敗血症性腹膜炎の誘導、および全身宿主応答を研究する方法を詳述する。さらに、異なる器官における細菌負荷の評価および腹膜洗浄における好中球数の増加のフローサイトメトリー分析が提示される。 サルモネラ マウスにおけるチフス誘発敗血症は、炎症誘発性サイトカインの増加および腹腔内の好中球の急速な浸潤をもたらし、生存率を低下させる。
このプロトコルのすべてのステップが最適化されており、敗血症性腹膜炎の病因の再現性が高い。このモデルは、細菌敗血症中の免疫学的応答、疾患進行における異なる遺伝子の役割、および敗血症を減弱させる薬物の効果を研究するのに有用である。
Introduction
敗血症は、微生物の侵入または組織損傷に対する調節不全の全身性炎症および免疫応答として定義され、感染または損傷の部位から離れた器官損傷をもたらす。敗血症性ショックは、体積蘇生中に持続する低血圧を特徴とする敗血症のサブセットであり、死亡リスクが実質的に増加する1。一般の人々は、COVID-19パンデミックの間にこの障害をより認識するようになりました。その高い関連死亡率にもかかわらず、敗血症の世界的な負担に関する包括的な疫学的データは、その診断の複雑さのために欠けている。2017年には、世界中で4,890万人の敗血症発生率と1,100万人が死亡し、全世界の死亡の19.7%を占めています2。さらに、集中治療室の患者における感染および関連する敗血症の長期有病率に関する研究は、患者からの陽性分離株の62%がグラム陰性生物であることを発見しました3。
当初、敗血症の調査は微生物の病因を描写することに焦点を当てていました。しかし、宿主が自己と非自己をどのように区別するかを決定する「危険仮説」を理解することは、敗血症研究のバランスを、侵入する病原体に対する宿主の反応を理解する方向に傾けることにつながった。敗血症の広く用いられているマウスモデルには、リポ多糖(LPS)誘発内毒素血症モデル、多微生物敗血症モデル、盲腸結紮および穿刺(CLP)および結腸上突起ステント腹膜炎(CASP)、および単細菌感染モデル4が含まれる。
我々は、 サルモネラ・ チフス菌を用いて腹膜敗血症を誘導することにより、マウスモデル系を標準化した。 サルモネラ・ チフス菌はグラム陰性敗血症の臨床的に関連する状態を模倣する細胞内病原体であるため、このモデルは他のモデルよりも有利である。このモデルにおける腹膜炎敗血症の結果は全身性であり、感染後96時間以内に100%の死亡率を有する。したがって、このモデルは、炎症性および致死性の宿主応答を研究する上で有用である。このモデルでは、敗血症は、8〜10週齢のC57BL/6マウスに50万個のコロニー形成単位(CFU)の サルモネラ ・チフス菌を腹腔内注射することによって誘発される。全身感染は、感染後〜16時間の臓器細菌負荷を評価することによって確認することができる。この記事では、マウスにおける サルモネラ ・チフス菌誘発性腹膜炎敗血症を実証し、腹膜細胞組成の結果生じる変化を特徴付け、異なる器官における細菌負荷を定量化する。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、 サルモネラ・ チフス菌の腹腔内注射によって重篤な形態の細菌敗血症を誘発する方法について説明する。このモデルは、 サルモネラ・ チフムリウム菌が細胞内病原体であり、したがって、高病原性であり、グラム陰性敗血症の臨床的に関連する状態を模倣するので、他のモデルよりも有利である。このモデルにおける腹膜炎敗血症の結果は全身性であり、感染…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究のためにマウスを提供してくれた中央動物施設IIScに感謝します。この研究は、インド政府バイオテクノロジー・サイエンス・アンド・エンジニアリング研究委員会(Department of Biotechnology and Science and Engineering Research Board)からのDpNへの助成金によって資金提供されました。DBT-IIScプログラムとDST-FIST助成金からのインフラ支援は大いに認められています。DpNラボの過去および現在のすべてのメンバーのサポートに感謝します。
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
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