Summary
פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של אלח דם מונובקטריאלי גראם שלילי במערכת מודל עכבר. המודל שימושי בחקירת תגובות הפונדקאי הדלקתיות והקטלניות במהלך אלח דם.
Abstract
אלח דם הוא תגובה חיסונית של פונדקאי לא מווסת לפלישה מיקרוביאלית או נזק לרקמות, מה שמוביל לפגיעה באיברים באתר מרוחק מזה של הזיהום או הנזק. נכון לעכשיו, המודלים הנפוצים של עכברים של אלח דם כוללים אנדוטוקסמיה המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS), קשירת צקל וניקוב (CLP) ומערכות מודל לזיהום חד-בקטריאלי. פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקור את תגובות המארח במהלך דלקת הצפק הספיגה הנגרמת על ידי זיהום סלמונלה טיפימוריום בעכברים. ב. טיפימוריום, פתוגן תוך-תאי גראם-שלילי, גורם למחלה דמוית טיפוס בעכברים.
פרוטוקול זה מפרט את הכנת התרבית, אינדוקציה של דלקת צפק ספטית בעכברים באמצעות הזרקה תוך-צפקית, ושיטות לחקר תגובות פונדקאיות סיסטמיות. יתר על כן, מוצגת הערכת נטל החיידקים באיברים שונים והניתוח הציטומטרי של הזרימה של מספרי נויטרופילים מוגברים בשטף הצפק. סלמונלה אלח דם הנגרם על ידי טיפימוריום בעכברים מוביל לעלייה בציטוקינים פרו-דלקתיים ולחדירה מהירה של נויטרופילים בחלל הצפק, מה שמוביל להישרדות נמוכה יותר.
כל שלב בפרוטוקול זה עבר אופטימיזציה, וכתוצאה מכך שכפול גבוה של הפתוגנזה של דלקת הצפק הספיגה. מודל זה שימושי לחקר תגובות אימונולוגיות במהלך אלח דם חיידקי, את התפקידים של גנים שונים בהתקדמות המחלה, ואת ההשפעות של תרופות כדי להחליש אלח דם.
Introduction
אלח דם מוגדר כתגובה דלקתית מערכתית ומערכתית לא מווסתת לפלישה מיקרוביאלית או נזק לרקמות, מה שמוביל לפגיעה באיברים המרוחקים ממקום ההדבקה או הנזק. הלם ספטי הוא תת-קבוצה של אלח דם המאופיינת בלחץ דם הנמשך במהלך החייאה נפחית, עם סיכון מוגבר באופן משמעותי לתמותה1. הציבור הרחב נעשה מודע יותר להפרעה זו במהלך מגיפת COVID-19. למרות התמותה הגבוהה הקשורה אליו, נתונים אפידמיולוגיים מקיפים על הנטל העולמי של אלח דם חסרים בגלל המורכבות של האבחנה שלו. בשנת 2017 היו 48.9 מיליון מקרי מקרים של אלח דם ו-11 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם, המהווים 19.7% מכלל מקרי המוות בעולם2. יתר על כן, מחקר על השכיחות המורחבת של זיהום ואלח דם קשור בחולי יחידות טיפול נמרץ מצא כי 62% מהבודדים החיוביים מהחולים היו אורגניזמים גראם שליליים3.
בתחילה, החקירות על אלח דם התמקדו בתיחום פתוגנזה מיקרוביאלית. עם זאת, הבנת "השערת הסכנה", המכתיבה כיצד המארח מבחין בין העצמי ללא-עצמי, הובילה להטיית מאזן חקר אלח הדם לעבר הבנת תגובת המארח לפתוגן פולש. המודלים הנפוצים של אלח דם בעכברים כוללים את מודל האנדוטוקסמיה המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS), מודלים של אלח דם פולימיקרוביאלי, קשירת cecal ונקב (CLP) ומודלים של דלקת צפק מסוג stent scendens (CASP) של המעי הגס ומודלים של זיהום חד-בקטריאלי4.
תיקנו מערכת מודל עכבר על ידי גרימת אלח דם פריטוניאלי באמצעות סלמונלה טיפימוריום. מודל זה הוא יתרון על פני אחרים כי סלמונלה Typhimurium הוא פתוגן תוך תאי המחקה את המצב הרלוונטי מבחינה קלינית של אלח דם גראם שלילי. התוצאה של אלח דם של דלקת הצפק במודל זה היא מערכתית, עם 100% תמותה בתוך 96 שעות לאחר ההדבקה. לכן, מודל זה מסייע בחקר תגובות הפונדקאי הדלקתיות והקטלניות. במודל זה, אלח דם מושרה על ידי הזרקה תוך-צפקית של 0.5 מיליון יחידות יוצרות מושבה (CFU) של סלמונלה טיפימוריום לתוך עכבר C57BL/6 בן 8-10 שבועות. זיהום סיסטמי יכול להיות מאושר על ידי הערכת נטל חיידקי איברים ~ 16 שעות לאחר ההדבקה. מאמר זה מדגים אלח דם של דלקת הצפק הנגרמת על ידי סלמונלה טיפימוריום בעכברים, מאפיין את השינויים הנובעים מכך בהרכב תאי הצפק, ומכמת את עומס החיידקים באיברים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים באמצעות סלמונלה טיפימוריום נערכו במתקני ביו בטיחות ברמה 2 (BSL-2). יש להקפיד על שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE), להבטיח בטיחות ולעקוב אחר שיטות סילוק ביו-האזרד סטנדרטיות של BSL-2. כל הניסויים בעכברים נערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים, IISc. עכברים גודלו והוחזקו במתקן המרכזי לבעלי חיים של IISc (מספר רישום: 48/1999/CPCSEA, מיום 1/3/1999), שאושר על ידי המשרד לאיכות הסביבה והיער, ממשלת הודו. פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה למטרה ובקרה ופיקוח על ניסויים בבעלי חיים עם מספר ההיתר המאושר CAF/Ethics/797/2020.
הגדרת BSL2: דירוג BSL2 מייצג כי הסוכנים הביו-האזרדיים מהווים איום מתון על הסביבה ועל צוות המעבדה5.
1. הכנת תרבות של סלמונלה טיפימוריום
- הוסף 100 μL של סלמונלה טיפימוריום NCTC 12023 מלאי גליצרול ל 3 מ"ל של מרק לוריא ברטאני (LB). הדגירו את התרבות ב-160 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- פזרו 50 μL מתרבית הלילה שגדלה בציר LB על צלחת אגר סלמונלה שיגלה (SS) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-12 שעות. אחסנו את צלחת האגר של SS עם מושבות החיידקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך מספר ימים לפני ניסוי הזיהום in vivo .
- בחרו מושבה בודדת מתוך צלחת האגר של האס-אס המפוספסת באמצעות מיקרוטיפ. פלטו את המיקרו-טייפ ל-3 מ"ל של מרק ותרבית LB ב-160 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס בלילה.
- הוסיפו 0.1 מ"ל מתרבית החיידקים ל-50 מ"ל של ציר LB ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר ב-160 סל"ד למשך 3-4 שעות כדי להגיע לשלב הלוגריתמי של הצמיחה. דיללו את התרבות בפקטור של 2 באמצעות ציר LB.
הערה: במהלך השלב הלוגריתמי, תאי החיידקים נמצאים במצב בריאותי הטוב ביותר שלהם והם מתחלקים באופן פעיל. - מדוד את הצפיפות האופטית (OD) של התרבית באורך גל של 600 ננומטר של אור בספקטרופוטומטר או בקורא מיקרו-לוחיות. ברגע שה-OD מגיע ל-1.0, הכינו שני אליקוטים של 1 מ"ל של תרבית בצינורות מיקרופוג' של 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה הצינורות ב 7,750 × גרם במשך 15 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הכדור עם 1 מ"ל של 1x PBS 2x. צנטריפוגה הצינורות ב 7,750 × גרם במשך 15 דקות.
- בצעו החייאה של הכדור ב-0.5 מ"ל של 1x PBS בשני צינורות מיקרו-פוג' שונים של 1.5 מ"ל. שלב את המתלים משני הצינורות לצינור אחד של 1.5 מ"ל המכיל כעת כ-2 × 108 יחידות יוצרות מושבה (CFU)/mL.
- הכינו תרחיף של תאי חיידקים של 1 × 106 CFU/mL על ידי דילול תמיסת מלאי זו.
אזהרה: מטב את ה- CFU המתאים ל- OD בתנאי מעבדה ספציפיים כדי לקבוע את ה- CFU עבור OD 1.0 לפני תחילת הניסויים.
2. עכברים וזיהומים
- ביתו זכר בן 8-10 שבועות C57BL/6 עכברים במשקל של כ-20 גרם בחדר האוויר הנקי של מתקן החיות במשך מספר ימים לצורך התאקלמות.
- ביום ההדבקה, החזיקו את העכבר ביד אחת, נגבו את עור הבטן ב-70% אתנול ופרשו את הרגליים האחוריות לנגישות טובה יותר של דופן הבטן.
- הזריקו 0.5 מ"ל של 1 × 106 CFU/mL תרחיף חיידקי תוך-צפק בעזרת מזרק של 1 מ"ל. לכן, כל עכבר מקבל 5 × 105 CFU. שליטה, עכברים לא נגועים מקבלים 0.5 מ"ל של PBS בלבד. לאחר ההדבקה, צלחת את התרבית כדי לבדוק את ה- CFU בפועל מוזרק, אשר עשוי לנוע בין 0.2-0.8 מיליון CFU / 0.5 מ"ל.
- החזירו את העכברים לכלובים כפי שהוקצו.
- הקרב את העכברים באמצעות חנק CO2 ~ 12-18 שעות לאחר ההדבקה לקבלת התגובה הטובה ביותר. בדרך כלל, כל העכברים הנגועים מתים תוך 96 שעות. תחת כמה התערבויות ניסיוניות, חלק מהעכברים עשויים לשרוד. המתת עכברים אלה לאחר 96 שעות. כמו כן, המתת כל עכבר עם טמפרטורת גוף מתחת ל -33.2 מעלות צלזיוס ומצוקה חריפה בשעה 96 כנקודת קצה הומאנית.
הערה: במודל זה, חלק מהעכברים עלולים להתחיל למות לאחר 12 שעות של הזרקת סלמונלה . לכן, תכננו ניסויים בצורה נכונה הכוללים מספר נקודות זמן.
3. הערכת CFU של איברים
- להקריב את העכבר הנגוע על ידי חנק CO2 , ולנגב את הבטן עם חתיכת כותנה טבולה ב 70% אתנול. חותכים את עור הבטן. עיין במאמר של ריי ודיטל לקבלת פרוטוקול וידאו כיצד לאסוף נוזל שטיפה פריטוניאלי6. חותכים לפתוח את חלל הצפק ולאסוף את האיברים המעניינים בצינורות מיקרופוגה. בנוסף, מכיוון שהדם בעכברים עם אלח דם נקרע במהירות והכמויות נמוכות, אספו אותו במהירות לאחר ההקרבה.
הערה: סרטון זה מדגים את הספירה של CFU של איברים מהכבד כאשר הכבד עובר נזק היסטופתולוגי נרחב במודל זה של אלח דם. - חותכים חתיכה קטנה מהכבד ומניחים אותה בצינור מיקרופוגה.
הערה: ניתן לאחסן זאת על קרח למשך 2-3 שעות לכל היותר לפני שתמשיך לשלב הבא. - שוקלים ומעבירים את החלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה. רצוי לחתוך חתיכות במשקל של כ-10-15 מ"ג להומוגניזציה נכונה. השתמש באיברים שלמים במקרה של קטנים יותר כגון בלוטות הלימפה המזנטריות (MLNs) או תימוס.
- הוסיפו 0.5 מ"ל של 1x PBS לצינור והומוגניזציה של האיברים באמצעות הומוגנייזר ידני. ודא כי האיברים הם הומוגניים לחלוטין. התאם את עוצמת הקול ל- 1 מ"ל על-ידי הוספת 0.5 מ"ל של 1x PBS.
- צנטריפוגה את הצינורות ב 200 × g במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).
- אספו את ה-supernatant לצינורות מיקרו-פוג'ים טריים והכינו דילולים של 1 × 10−1 ו-10−2 בצלחת של 96 בארות.
- מורחים 50 μL של מדולל על צלחות אגר SS טריות ודגירה של הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
- ספרו את מספר המושבות המופיעות בכל מצב ונרמלו את הנתונים עם משקל האיבר באמצעות משוואה (1):
CFU/mg =
(1)
הערה: המספר 20 משמש בנוסחה להמרת המושבות לכל לוח ל- CFU / mL. מספר זה מגיע על ידי חלוקת 1 מ"ל בסכום של נפח נתון של התרבית המצופה - במקרה זה, 50 μL.
לדוגמה, אם 100 מושבות נמצאות בצלחת אגר SS, שבה מתפשט 50 μL של 1 × 10-1 דילול של איבר הומוגני במשקל 10 מ"ג, אז
CFU/mg =
(1)
4. ניתוח ציטומטרי של זרימה של אוכלוסיות שונות של תאי חיסון בהפרשה פריטוניאלית
- אסוף את תאי הצפק כפי שתוארו קודם לכן על ידי ריי ודיטל6.
- יש להחיות את גלולת התאים מנוזל שטיפת הצפק ב-1 מ"ל של RPMI בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS). ציין את מספרי התאים הכוללים בשטיפת הצפק באמצעות המוציטומטר. התאם את מספר התא כך שכל צינור יקבל 0.2-0.5 מיליון תאים.
הערה: שטיפת פריטונאל בעכברים עם אלח דם עשויה להכיל RBCs, אשר כנראה מופיעים עקב דימום. הקפידו לא לכלול RBCs בעת ספירת תאי הצפק. במיקרוסקופ הבהיר, RBCs נראים קטנים בהרבה מתאי החיסון. אלה מופיעים כדיסקים שטוחים או סופגניות, עגולים, עם כניסה במרכז, אך לא חלולים. ניתן להוסיף שלב ל-LYSE RBCs7. - סובבו את התאים כלפי מטה ב-200 × גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את התאים פי 1 עם 1x PBS קר. צנטריפוגה את התאים ב 200 × גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות.
- חסום את קולטני ה-Fc ב-PECs באמצעות חוסם FcR (דילול של 1:400), שהוכן במאגר חסימה המורכב מ-5% FBS ו-0.02% נתרן אזיד ב-PBS. דגירה על קרח במשך 15 דקות.
- צנטריפוגה התאים ב 200 × גרם ב 4 °C (64 °F) במשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט. דיללו את הנוגדנים המצומדים לפלואורוכרום בעלי עניין בחסימת מאגר. השתמש בדילול של 1:500 של LY6G נגד עכברים כדי להכתים את הנויטרופילים.
הערה: ניתן לזהות אוכלוסיות אחרות של תאי מערכת החיסון גם באמצעות, לדוגמה, B220 נגד עכברים עבור תאי B, CD3 נגד עכבר עבור תאי T, ו- F4/80 נגד עכברים עבור מקרופאגים. - הדגירה של כ-0.2 מיליון תאים ב-200 μL של התמיסות המדוללות של נוגדנים בצינורות נפרדים. כבקרה שלילית, הניחו בצד צינור אחד בכל סוג פלואורואורוכרום עבור הבקרה הלא מוכתמת כדי לדגום את התאים עם 200 μL של חיץ חוסם ללא נוגדנים.
- דגירו את הדגימות על הקרח במשך 45 דקות עם הקשה לסירוגין כל 15 דקות.
- צנטריפוגה את התאים ב 200 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F). השליכו את הסופרנאטנט. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך ~ 15 דקות בטמפרטורת החדר אם הם צריכים להיות מאוחסנים במשך מספר ימים. עם זאת, עדיף להשיג נתונים מדגימות מוכתמות טריות בציטומטר זרימה.
- בצעו החייאה של התאים ב-200 μL של מאגר צביעת FACS (2% FBS ב-PBS). רכוש את הנתונים בציטומטר זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אפיון מפורט של התגובה החיסונית של המארח באמצעות מודל מסוים זה מוצג בפרסומים קודמים 8,9. כמה תוצאות מייצגות של הפרוטוקול המתואר מתוארות בסעיף זה. מודל זה נועד לגרום לזיהום מערכתי של S. טיפימוריום על ידי הזרקה תוך-צפקית של תרבית החיידקים כדי לגרום לאלח דם. כדי לאשר את הזיהום, התפשטו הליזטים של הכבד והטחול מעכברים ספיגה על צלחות אגר של SS, ומספר המושבות נספר. באיור 1, התמונות של לוחות אגר SS מצביעות על נטל ה-CFU של האיברים בכבד ועל הטחול של עכברי ספיגה. הליסאטים של האיברים ההומוגניים הופצו בדילול של 1 × 10−1 והודגמו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הפיגמנט השחור S. מושבות טיפימוריום הופיעו לאחר ~ 12 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס. יתר על כן, עם זיהום של עכברים, תרביות מדם ושטיפת הצפק מדווחות כחיוביות לתאי חיידקים8. תוצאות אלה הצביעו על כך שתאי החיידקים שהוזרקו באופן תוך-צפקי הופצו באופן מערכתי והתיישבו באיברים הפנימיים. חלק מהצלחת מוצג ככניסה מוגדלת כדי להדגיש את המושבות. הפתוגן הפיץ בהצלחה באופן שיטתי והתיישב באיברים הפנימיים.
איור 2 מראה את הסרה מבודדת מעכברים בריאים וספגניים. נפח הדם האספני באמצעות ניקור לב מעכברים ספטיים הוא בדרך כלל 100-200 μL, שהוא נמוך מהכמות מעכברים בריאים, שם ניתן להשיג ~ 500 μL של דם. כתוצאה מכך, נפח הסרום שבודד מדם עכברי ספיגה הוא נמוך. תופעה זו מתרחשת בגלל קרישה מוגברת של הדם בעכברים ספיגה. יתר על כן, הסרה מעכברי ספיגה מראים צבע אדום מובהק, המציין את הופעתה של המוליזה נרחבת 8,9.
כפי שניתן לראות באיור 3, אימונופנוטיפ מבוסס ציטומטריה של זרימה של תאי הפרשה של הצפק בוצע כדי להעריך את חדירתם של נויטרופילים בחלל הצפק של עכברים בריאים וספגניים. כאשר נויטרופילים מבטאים חלבון LY6G על פני התא, נעשה שימוש בנוגדן אנטי-LY6G המתויג על-ידי FITC כדי להכתים את אוכלוסיית התאים הנויטרופילים. תמונות אלה מייצגות נתונים מעכבר בריא אחד ושני עכברים נגועים. לאחר איסוף הנתונים, התאים היו מגודרים כך שיכללו רק סינגלטים בעלילה של FSC-A לעומת SSC-A. לאחר מכן צוירו עלילות ההיסטוגרמה ועלילת הנקודות. כאן, עכברי הספיגה הראו חדירה מוגברת של נויטרופילים בחלל הצפק.
איור 1: הדמיה של CFU איברים לאחר זיהום. האיברים היו הומוגניים כמתואר בפרוטוקול. הליזאט נמרח על צלחות אגר של SS באמצעות מפזר. תמונות של צלחות מתפשטות עם דילול של 1 × 10-1 של ליזטים הומוגניים של (A) כבד ו-(B) טחול. חלק מהצלחת מוצג ככניסה מוגדלת כדי להדגיש את המושבות. הגדלה משובצת = 13x (שטח). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: המוליזה מוגברת בעכברים ספטיים. הדם נאסף בצינורות מיקרוצנטריפוגה והושאר ללא הפרעה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. הקריש הוסר על ידי צנטריפוגה של הצינורות במהירות של 2,000 × גרם למשך 10 דקות בצנטריפוגה מקוררת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: פרופיל ציטומטרי של זרימה של אוכלוסיית הנויטרופילים בנוזל שטיפה פריטוניאלי. נוזל שטיפת הצפק נאסף 16 שעות לאחר ההדבקה. תאי הצפק הוכתמו בנוגדן אנטי-LY6G המתויג על ידי FITC. עכברים ספטיים הראו חדירה מוגברת של נויטרופילים בחלל הצפק. קיצורים: FITC = פלואורסציין איזותיוציאנט; LY6G = אנטיגן לימפוציטים 6 לוקוס מורכב G6D; SSC-A = אזור פיזור צדדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה של גרימת צורה חמורה של אלח דם חיידקי על ידי הזרקה תוך צפקית של סלמונלה טיפימוריום. מודל זה הוא יתרון על פני אחרים כמו סלמונלה Typhimurium הוא פתוגן תוך תאי, ולכן, פתוגני מאוד, מחקה את המצב הרלוונטי מבחינה קלינית של אלח דם גראם שלילי. התוצאה של אלח דם של דלקת הצפק במודל זה היא מערכתית, עם 100% תמותה בתוך 96 שעות לאחר ההדבקה. לכן, מודל זה מסייע בחקר תגובות הפונדקאיות הדלקתיות והקטלניות8 ואת ההשפעות של התערבות טיפולית בהחלשת אלח דם.
במערכת מודל זו, ההרכב התאי של חלל הצפק משתנה באופן דרמטי כדי להילחם בפתוגן המחוסן. מספר גדול של נויטרופילים מסוג LY6G+ מסתננים לחלל הצפק, עם ירידה בו-זמנית במקרופאג'ים F4/80+, וכתוצאה מכך תגובת ההיעלמות של המקרופאגים (MDR)8,10. לכן, מודל זה שימושי בחקר השינויים הקינטיים בהרכבי תאי מערכת החיסון ובתפקודיהם במהלך אלח דם, שהוא עדיין אזור שעדיין לא נחקר במידה רבה. סלמונלה טיפימוריום מדביק באופן שיטתי, שוכן ומתרבה באיברי עכברים. הציטוקינים הפרו-דלקתיים בסרום כגון TNF-α, IL-6 ו-IFN-γ גם הם עוליםב-8. מפל של תגובות פרו-דלקתיות מוביל גם להמוליזה וקרישה של הדם, אשר הופך להיות גלוי עם כריתת העכברים הנגועים10,11. יחסי הגומלין בין תגובת הפונדקאי לנטל החיידקי הזה לבין ההשפעות המזיקות של החיידקים מובילים לארכיטקטורת רקמות מעוותת, לאובדן תפקודים ולנמק רקמות, במיוחד בכבד.
יתר על כן, דיווחים קודמים מהמעבדה הראו כי השפעות כאלה מווסתות על ידי הביטוי המווסת של תחמוצת החנקן סינתאז 2 (NOS2), מה שמוביל למיני חמצן תגובתי מוגברים (ROS) ורמות גבוהות יותר של ציטוקינים פרו-דלקתיים, מה שמוביל לתגובה דלקתית משופרת8. מודל זה של אלח דם בעכבר הוא יתרון על פני אחרים מכיוון שהאינדוקציה של אלח דם מהירה יותר עם השפעות קטלניות יותר. זה לא דורש מומחיות טכנית כדי לבצע את הניתוח על עכברים מורדמים, כפי שקורה עם מודל העכבר הנוכחי CLP-אלח דם בתקן זהב. במודל CLP-אלח דם, רק תת-קבוצה של עכברים מפתחת אלח דם, בעוד שכל העכברים מפתחים אלח דם במודל המתואר כאן.
יתר על כן, בהשוואה למודל אלח דם אנדוטוקסמיה המושרה על ידי LPS, מודל זה רלוונטי יותר מבחינה קלינית עבור אלח דם מונובקטריאלי גראם שלילי. המודל שימושי גם להבנת העליות ב-ROS תוך-תאי, ברמות הציטוקינים הפרו-דלקתיים, בהמוליזה ובקרישת הדם, שכולם מתרחשים במהלך אלח דם. הוא דיווח כי השימוש בתרופה התורמת תחמוצת החנקן DETA-NONOate מספק יתרון הישרדות בעכברי נוקאאוט Nos2 עם אלח דם באמצעות מודל זה8. זה מצביע על כך שניתן להשתמש במודל זה כדי לזהות תרופות חדשניות לטיפול באלח דם. כמו כן, מודל זה יכול להיות מאומץ במהירות על ידי כל מעבדה מצויד במתקני BSL-2.
בעת השימוש במודל זה, יש לנקוט באמצעי זהירות ברמת בריאות תאי החיידקים ובמספר ה-CFU כדי להשיג תוצאות מיטביות. תמיד צריך להשתמש במושבות סלמונלה מפוספסות טריות מצלחות אגר של SS. מומלץ גם לייעל את תהליך הכנת התרבית על ידי מציאת ערך OD בספקטרופוטומטר המתאים ל- CFU שהוזכר.
החיסרון בשימוש במודל זה הוא שהשפעת אלח דם בעכברים היא קטלנית מאוד תוך 96 שעות לאחר ההדבקה. זה מגביל את המחקר של תגובות חיסוניות של המארח בנקודות זמן מאוחרות. ניתן להתגבר עליו באמצעות זן חיידקי מוחלש יותר של סלמונלה טיפימוריום.
ישנם הבדלים בין מטופלים אנושיים הסובלים מאלח דם לבין מודלים של עכברים המנסים לחקות אלח דם אנושי. לדוגמה, למטופלים לוקח זמן רב יותר לפתח אלח דם והם מקבלים התערבויות וטיפולים תומכים. עם זאת, אלח דם במודלים של עכברים מתפתח הרבה יותר מהר, והתערבויות תומכות אינן נעשות4. עם זאת, ישנם כמה קווי דמיון בין אלח דם בבני אדם לעכברים, כאשר חולים עם אלח דם מראים רמות גבוהות יותר של ציטוקינים פרו-דלקתיים, קרישת דם והמוליזה במסגרות קליניות. כל אלה מחקים במודל העכבר הזה של אלח דם. לכן, כמה קריאות של מודל זה רלוונטיות לתרחישים קליניים, אם כי מתאם ישיר עשוי להיות לא מומלץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למתקן המרכזי לבעלי חיים, IISc על שסיפק לנו עכברים למחקר. מחקר זה מומן על ידי מענקים ל- DpN מהמחלקה לביוטכנולוגיה ומועצת מחקר מדע והנדסה, ממשלת הודו. התמיכה התשתיתית מתוכנית DBT-IISc ומענקי DST-FIST זוכה להכרה רבה. אנו מודים לכל החברים הקודמים והנוכחיים במעבדת DpN על תמיכתם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | - | - | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
