Caracterización de la peritonitis séptica inducida por Salmonella Typhimurium en ratones
Summary
Este protocolo describe la inducción de sepsis monobacteriana Gram-negativa en un sistema modelo de ratón. El modelo es útil para investigar las respuestas inflamatorias y letales del huésped durante la sepsis.
Abstract
La sepsis es una respuesta inmune desregulada del huésped a la invasión microbiana o daño tisular, que conduce a una lesión orgánica en un sitio distante del de la infección o daño. Actualmente, los modelos de sepsis de ratones ampliamente utilizados incluyen endotoxemia inducida por lipopolisacáridos (LPS), ligadura y punción cecal (CLP) y sistemas modelo de infección monobacteriana. Este protocolo describe un método para estudiar las respuestas del huésped durante la peritonitis séptica inducida por la infección por Salmonella Typhimurium en ratones. S. El typhimurium, un patógeno intracelular Gram-negativo, causa una enfermedad similar a la fiebre tifoidea en ratones.
Este protocolo elabora la preparación del cultivo, la inducción de la peritonitis séptica en ratones a través de la inyección intraperitoneal y los métodos para estudiar las respuestas sistémicas del huésped. Además, se presenta la evaluación de la carga bacteriana en diferentes órganos y el análisis citométrico de flujo del aumento del número de neutrófilos en el lavado peritoneal. Salmonella La sepsis inducida por typhimurium en ratones conduce a un aumento de las citoquinas proinflamatorias y a una rápida infiltración de neutrófilos en la cavidad peritoneal, lo que lleva a una menor supervivencia.
Cada paso en este protocolo ha sido optimizado, lo que resulta en una alta reproducibilidad de la patogénesis de la peritonitis séptica. Este modelo es útil para estudiar las respuestas inmunológicas durante la sepsis bacteriana, el papel de diferentes genes en la progresión de la enfermedad y los efectos de los fármacos para atenuar la sepsis.
Introduction
La sepsis se define como una respuesta inflamatoria e inmune sistémica desregulada a la invasión microbiana o daño tisular, que conduce a una lesión orgánica distante del sitio de infección o daño. El shock séptico es un subconjunto de sepsis caracterizado por hipotensión persistente durante la reanimación de volumen, con un riesgo sustancialmente mayor de mortalidad1. El público en general se ha vuelto más consciente de este trastorno durante la pandemia de COVID-19. A pesar de su alta mortalidad asociada, faltan datos epidemiológicos completos sobre la carga global de sepsis debido a la complejidad de su diagnóstico. En 2017, hubo 48,9 millones de incidencias de sepsis y 11 millones de muertes en todo el mundo, lo que representa el 19,7% de todas las muertes mundiales2. Además, un estudio sobre la prevalencia extendida de infección y sepsis relacionada en pacientes de unidades de cuidados intensivos encontró que el 62% de los aislamientos positivos de pacientes eran organismosgramnegativos 3.
Inicialmente, las investigaciones sobre la sepsis se centraron en delinear la patogénesis microbiana. Sin embargo, la comprensión de la “hipótesis del peligro”, que dicta cómo el huésped distingue a sí mismo y no-yo, llevó a la inclinación del equilibrio de la investigación de la sepsis hacia la comprensión de la respuesta del huésped a un patógeno invasor. Los modelos de sepsis en ratones ampliamente utilizados incluyen el modelo de endotoxemia inducida por lipopolisacáridos (LPS), los modelos de sepsis polimicrobiana, la ligadura cecal y la punción (CLP) y la peritonitis del stent ascendente del colon (CASP), y los modelos de infección monobacteriana4.
Hemos estandarizado un sistema modelo de ratón mediante la inducción de sepsis peritoneal utilizando Salmonella Typhimurium. Este modelo es ventajoso sobre otros porque Salmonella Typhimurium es un patógeno intracelular que imita la condición clínicamente relevante de la sepsis Gram-negativa. El resultado de la sepsis de peritonitis en este modelo es sistémico, con una mortalidad del 100% dentro de las 96 h posteriores a la infección. Por lo tanto, este modelo es fundamental en el estudio de las respuestas inflamatorias y letales del huésped. En este modelo, la sepsis es inducida por la inyección intraperitoneal de 0,5 millones de unidades formadoras de colonias (UFC) de Salmonella Typhimurium en un ratón C57BL/6 de 8-10 semanas de edad. La infección sistémica se puede confirmar mediante la evaluación de la carga bacteriana del órgano ~ 16 h después de la infección. Este artículo demuestra la sepsis de peritonitis inducida por Salmonella Typhimurium en ratones, caracteriza las alteraciones resultantes en la composición de células peritoneales y cuantifica la carga bacteriana en diferentes órganos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe un método para inducir una forma grave de sepsis bacteriana mediante la inyección intraperitoneal de Salmonella Typhimurium. Este modelo es ventajoso sobre otros, ya que Salmonella Typhimurium es un patógeno intracelular y, por lo tanto, altamente patógeno, imitando la condición clínicamente relevante de la sepsis Gram-negativa. El resultado de la sepsis de peritonitis en este modelo es sistémico, con una mortalidad del 100% dentro de las 96 h posteriores a la infección. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Instalación Central de Animales, IISc por suministrarnos ratones para la investigación. Este estudio fue financiado por subvenciones a DpN del Departamento de Biotecnología y la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería del Gobierno de la India. El apoyo de infraestructura del programa DBT-IISc y las subvenciones DST-FIST son muy reconocidos. Agradecemos a todos los miembros anteriores y actuales del laboratorio DpN por su apoyo.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
