Summary
Este protocolo describe la inducción de sepsis monobacteriana Gram-negativa en un sistema modelo de ratón. El modelo es útil para investigar las respuestas inflamatorias y letales del huésped durante la sepsis.
Abstract
La sepsis es una respuesta inmune desregulada del huésped a la invasión microbiana o daño tisular, que conduce a una lesión orgánica en un sitio distante del de la infección o daño. Actualmente, los modelos de sepsis de ratones ampliamente utilizados incluyen endotoxemia inducida por lipopolisacáridos (LPS), ligadura y punción cecal (CLP) y sistemas modelo de infección monobacteriana. Este protocolo describe un método para estudiar las respuestas del huésped durante la peritonitis séptica inducida por la infección por Salmonella Typhimurium en ratones. S. El typhimurium, un patógeno intracelular Gram-negativo, causa una enfermedad similar a la fiebre tifoidea en ratones.
Este protocolo elabora la preparación del cultivo, la inducción de la peritonitis séptica en ratones a través de la inyección intraperitoneal y los métodos para estudiar las respuestas sistémicas del huésped. Además, se presenta la evaluación de la carga bacteriana en diferentes órganos y el análisis citométrico de flujo del aumento del número de neutrófilos en el lavado peritoneal. Salmonella La sepsis inducida por typhimurium en ratones conduce a un aumento de las citoquinas proinflamatorias y a una rápida infiltración de neutrófilos en la cavidad peritoneal, lo que lleva a una menor supervivencia.
Cada paso en este protocolo ha sido optimizado, lo que resulta en una alta reproducibilidad de la patogénesis de la peritonitis séptica. Este modelo es útil para estudiar las respuestas inmunológicas durante la sepsis bacteriana, el papel de diferentes genes en la progresión de la enfermedad y los efectos de los fármacos para atenuar la sepsis.
Introduction
La sepsis se define como una respuesta inflamatoria e inmune sistémica desregulada a la invasión microbiana o daño tisular, que conduce a una lesión orgánica distante del sitio de infección o daño. El shock séptico es un subconjunto de sepsis caracterizado por hipotensión persistente durante la reanimación de volumen, con un riesgo sustancialmente mayor de mortalidad1. El público en general se ha vuelto más consciente de este trastorno durante la pandemia de COVID-19. A pesar de su alta mortalidad asociada, faltan datos epidemiológicos completos sobre la carga global de sepsis debido a la complejidad de su diagnóstico. En 2017, hubo 48,9 millones de incidencias de sepsis y 11 millones de muertes en todo el mundo, lo que representa el 19,7% de todas las muertes mundiales2. Además, un estudio sobre la prevalencia extendida de infección y sepsis relacionada en pacientes de unidades de cuidados intensivos encontró que el 62% de los aislamientos positivos de pacientes eran organismosgramnegativos 3.
Inicialmente, las investigaciones sobre la sepsis se centraron en delinear la patogénesis microbiana. Sin embargo, la comprensión de la "hipótesis del peligro", que dicta cómo el huésped distingue a sí mismo y no-yo, llevó a la inclinación del equilibrio de la investigación de la sepsis hacia la comprensión de la respuesta del huésped a un patógeno invasor. Los modelos de sepsis en ratones ampliamente utilizados incluyen el modelo de endotoxemia inducida por lipopolisacáridos (LPS), los modelos de sepsis polimicrobiana, la ligadura cecal y la punción (CLP) y la peritonitis del stent ascendente del colon (CASP), y los modelos de infección monobacteriana4.
Hemos estandarizado un sistema modelo de ratón mediante la inducción de sepsis peritoneal utilizando Salmonella Typhimurium. Este modelo es ventajoso sobre otros porque Salmonella Typhimurium es un patógeno intracelular que imita la condición clínicamente relevante de la sepsis Gram-negativa. El resultado de la sepsis de peritonitis en este modelo es sistémico, con una mortalidad del 100% dentro de las 96 h posteriores a la infección. Por lo tanto, este modelo es fundamental en el estudio de las respuestas inflamatorias y letales del huésped. En este modelo, la sepsis es inducida por la inyección intraperitoneal de 0,5 millones de unidades formadoras de colonias (UFC) de Salmonella Typhimurium en un ratón C57BL/6 de 8-10 semanas de edad. La infección sistémica se puede confirmar mediante la evaluación de la carga bacteriana del órgano ~ 16 h después de la infección. Este artículo demuestra la sepsis de peritonitis inducida por Salmonella Typhimurium en ratones, caracteriza las alteraciones resultantes en la composición de células peritoneales y cuantifica la carga bacteriana en diferentes órganos.
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Protocol
Todos los experimentos con Salmonella Typhimurium se llevaron a cabo en instalaciones de Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2). Se debe tener cuidado de usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado, garantizar la seguridad y seguir los métodos estándar de eliminación de riesgos biológicos BSL-2. Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo siguiendo las pautas establecidas por el Comité Institucional de Ética Animal, IISc. Los ratones fueron criados y mantenidos en el Centro Central de Animales del IISc (número de registro: 48/1999/CPCSEA, de fecha 1/3/1999), aprobado por el Ministerio de Medio Ambiente y Bosques del Gobierno de la India. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Propósito y Control y Supervisión de Experimentos en Animales con el número de permiso aprobado CAF/Ethics/797/2020.
Definición de BSL2: Una clasificación BSL2 representa que los agentes biopeligrosos representan una amenaza moderada para el medio ambiente y el personal de laboratorio5.
1. Preparación del cultivo de Salmonella Typhimurium
- Añadir 100 μL de caldo de glicerol de Salmonella Typhimurium NCTC 12023 a 3 ml de caldo de Luria Bertani (LB). Incubar el cultivo a 160 rpm a 37 °C durante la noche.
- Rayar 50 μL del cultivo cultivado durante la noche en caldo LB en una placa de agar Salmonella Shigella (SS) e incubar a 37 °C durante ~12 h. Guarde la placa de agar SS con las colonias bacterianas a 4 °C durante varios días antes del experimento de infección in vivo .
- Elija una sola colonia de la placa de agar SS rayada usando una micropunta. Expulse la micropunta en 3 ml de caldo LB y cultive a 160 rpm a 37 °C durante la noche.
- Añadir 0,1 mL del cultivo bacteriano a 50 mL de caldo LB e incubar a 37 °C en una incubadora agitadora a 160 rpm durante 3-4 h para alcanzar la fase logarítmica de crecimiento. Diluir el cultivo por un factor de 2 usando caldo LB.
NOTA: Durante la fase logarítmica, las células bacterianas están en su mejor estado de salud y se están dividiendo activamente. - Mida la densidad óptica (OD) del cultivo a una longitud de onda de luz de 600 nm en un espectrofotómetro o lector de microplacas. Una vez que el OD alcance 1.0, hacer dos alícuotas de 1 mL de cultivo en tubos de microfuge de 1.5 mL.
- Centrifugar los tubos a 7.750 × g durante 15 min. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 1 ml de 1x PBS 2x. Centrifugar los tubos a 7.750 × g durante 15 min.
- Resuspender el pellet en 0.5 mL de 1x PBS en dos tubos de microfuge diferentes de 1.5 mL. Combine las suspensiones de ambos tubos en un tubo de 1.5 ml que ahora contiene ~ 2 × 108 unidades formadoras de colonias (UFC) / ml.
- Preparar una suspensión celular bacteriana de 1 × 106 UFC/ml diluyendo esta solución madre.
PRECAUCIÓN: Optimice la UFC correspondiente a la OD en condiciones específicas de laboratorio para determinar la CFU para OD 1.0 antes de iniciar los experimentos.
2. Ratones e infecciones
- Casa ratones machos C57BL / 6 de 8-10 semanas de edad que pesan ~ 20 g en la sala de aire limpio de la instalación de animales durante varios días para aclimatación.
- El día de la infección, sostenga el ratón con una mano, limpie la piel abdominal con etanol al 70% y extienda las patas traseras para una mejor accesibilidad de la pared abdominal.
- Inyecte 0,5 ml de 1 × 106 UFC/ml de suspensión bacteriana por vía intraperitoneal con la ayuda de una jeringa de 1 ml. Por lo tanto, cada ratón recibe 5 × 105 UFC. Los ratones controlados no infectados reciben 0,5 ml de PBS solo. Después de la infección, coloque el cultivo para verificar la UFC real inyectada, que puede variar de 0.2-0.8 millones de UFC / 0.5 ml.
- Vuelva a colocar a los ratones en las jaulas según lo asignado.
- Sacrifique a los ratones usando asfixia por CO2 ~ 12-18 h después de la infección para obtener la mejor respuesta. Por lo general, todos los ratones infectados mueren dentro de las 96 h. Bajo algunas intervenciones experimentales, algunos ratones pueden sobrevivir. Sacrificar a estos ratones después de 96 h. Además, sacrificar a cualquier ratón con una temperatura corporal inferior a 33,2 ° C y angustia aguda a las 96 h como un punto final humano.
NOTA: En este modelo, algunos ratones pueden comenzar a morir después de 12 h de la inyección de Salmonella . Por lo tanto, planifique los experimentos correctamente que involucren múltiples puntos de tiempo.
3. Evaluación de órganos de la UFC
- Sacrifica al ratón infectado por asfixia de CO2 y limpia el abdomen con un trozo de algodón sumergido en etanol al 70%. Abra la piel abdominal. Consulte el artículo de Ray y Dittel para obtener un protocolo de video sobre cómo recolectar líquido de lavado peritoneal6. Cortar abrir la cavidad peritoneal y recoger los órganos de interés en los tubos de microfuge. Además, como la sangre en ratones con sepsis se coagula rápidamente y las cantidades son bajas, recójala rápidamente después del sacrificio.
NOTA: Este video demuestra la enumeración de la UFC de órganos del hígado a medida que el hígado sufre un daño histopatológico extenso en este modelo de sepsis. - Corte un pequeño trozo del hígado y colóquelo en un tubo de microfuge.
NOTA: Esto se puede almacenar en hielo durante un máximo de 2-3 h antes de continuar con el siguiente paso. - Pesar y transferir las piezas a tubos de microcentrífuga. Preferiblemente, piezas cortadas que pesen ~ 10-15 mg para una homogeneización adecuada. Use órganos enteros en el caso de los más pequeños, como los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) o el timo.
- Agregue 0.5 ml de 1x PBS al tubo y homogeneice los órganos usando un homogeneizador de mano. Asegúrese de que los órganos estén completamente homogeneizados. Aumente el volumen a 1 ml agregando 0.5 ml de 1x PBS.
- Centrifugar los tubos a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
- Recoja el sobrenadante en tubos de microfugas frescas y prepare diluciones de 1 × 10−1 y 10−2 en una placa de 96 pocillos.
- Extienda 50 μL del diluyente sobre placas de agar SS frescas e incube las placas a 37 °C durante 12 h.
- Cuente el número de colonias que aparecen en cada condición y normalice los datos con el peso del órgano usando la Ecuación (1):
UFC/mg =
(1)
NOTA: El número 20 se utiliza en la fórmula para convertir las colonias por placa a UFC/ml. A este número se llega dividiendo 1 mL por la cantidad de un volumen dado del cultivo chapado, en este caso, 50 μL.
Por ejemplo, si se encuentran 100 colonias en una placa de agar SS, donde se extienden 50 μL de una dilución de 1 × 10-1 de un órgano homogeneizado que pesa 10 mg, entonces
UFC/mg =
(1)
4. Análisis citométrico de flujo de diversas poblaciones de células inmunes en exudado peritoneal
- Recolectar las células peritoneales como se describió anteriormente por Ray y Dittel6.
- Resuspend el pellet celular del líquido de lavado peritoneal en 1 ml de RPMI suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%. Enumere el número total de células en el lavado peritoneal utilizando un hemocitómetro. Ajuste el número de celda para que cada tubo reciba 0.2-0.5 millones de células.
NOTA: El lavado peritoneal en ratones con sepsis puede contener glóbulos rojos, que probablemente aparecen debido a una hemorragia. Tenga cuidado de excluir los glóbulos rojos mientras cuenta las células peritoneales. En el microscopio de campo brillante, los glóbulos rojos parecen mucho más pequeños que las células inmunes. Estos aparecen como discos planos o rosquillas, redondos, con una hendidura en el centro, pero no huecos. Se puede agregar un paso para lisar los glóbulos rojos7. - Haga girar las células hacia abajo a 200 × g a 4 °C durante 10 minutos, deseche el sobrenadante y lave las células 1x con 1x PBS frío. Centrifugar las células a 200 × g a 4 °C durante 10 min.
- Bloquear los receptores Fc en los PECs utilizando el bloqueador FcR (dilución 1:400), preparado en tampón de bloqueo que consiste en 5% FBS y 0.02% de azida de sodio en PBS. Incubar en hielo durante 15 min.
- Centrifugar las células a 200 × g a 4 °C durante 10 min. Deseche el sobrenadante. Diluir los anticuerpos conjugados con fluorocromo de interés en el tampón de bloqueo. Use una dilución 1:500 de LY6G anti-ratón para teñir los neutrófilos.
NOTA: Otras poblaciones de células inmunes también se pueden detectar utilizando, por ejemplo, B220 anti-ratón para células B, CD3 anti-ratón para células T y F4/80 anti-ratón para macrófagos. - Incubar ~ 0.2 millones de células en 200 μL de las soluciones diluidas de anticuerpos en tubos separados. Como control negativo, reserve un tubo en cada tipo de fluorocromo para que el control no teñido incube las células con 200 μL de tampón de bloqueo sin anticuerpos.
- Incubar las muestras en hielo durante 45 min con tapping intermitente cada 15 min.
- Centrifugar las células a 200 × g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Fije las células con paraformaldehído al 4% durante ~ 15 minutos a temperatura ambiente si necesitan almacenarse durante varios días. Sin embargo, es mejor adquirir datos de muestras recién teñidas en un citómetro de flujo.
- Resuspend las células en 200 μL de tampón de tinción FACS (2% FBS en PBS). Adquiera los datos en un citómetro de flujo.
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Representative Results
Una caracterización detallada de la respuesta inmune del huésped utilizando este modelo particular se muestra en publicaciones anteriores 8,9. En esta sección se muestran algunos resultados representativos del protocolo descrito. Este modelo tiene como objetivo inducir la infección sistémica de S. Typhimurium por inyección intraperitoneal del cultivo bacteriano para inducir sepsis. Para confirmar la infección, los lisados del hígado y el bazo de ratones sépticos se extendieron en placas de agar SS, y se contó el número de colonias. En la Figura 1, las imágenes de las placas de agar SS indican la carga de ufc de órgano en el hígado y el bazo de ratones sépticos. Los lisados de órganos homogeneizados se extendieron a una dilución de 1 × 10−1 y se incubaron a 37 °C. La S pigmentada negra. Las colonias de typhimurium aparecieron después de ~ 12 h de incubación a 37 ° C. Además, tras la infección de ratones, se informa que los cultivos de sangre y lavado peritoneal son positivos para células bacterianas8. Estos resultados indicaron que las células bacterianas inyectadas intraperitonealmente se diseminaron sistémicamente y colonizaron los órganos internos. Una parte de la placa se muestra como un recuadro ampliado para resaltar las colonias. El patógeno se diseminó con éxito sistémicamente y colonizó los órganos internos.
La Figura 2 muestra los sueros aislados de ratones sanos y sépticos. El volumen de sangre coleccionable a través de la punción cardíaca de ratones sépticos suele ser de 100-200 μL, que es inferior a la cantidad de ratones sanos, donde se pueden obtener ~ 500 μL de sangre. Como resultado, el volumen sérico aislado de la sangre séptica del ratón es bajo. Este fenómeno ocurre debido al aumento de la coagulación de la sangre en ratones sépticos. Además, los sueros de ratones sépticos muestran una coloración roja distinta, lo que indica la aparición de hemólisis extensa 8,9.
Como se muestra en la Figura 3, se realizó inmunofenotipado basado en citometría de flujo de células de exudados peritoneales para evaluar la infiltración de neutrófilos en la cavidad peritoneal de ratones sanos y sépticos. Como los neutrófilos expresan la proteína LY6G en la superficie celular, se utilizó el anticuerpo anti-LY6G marcado con FITC para teñir la población de células de neutrófilos. Estas imágenes representan datos de un ratón sano y dos infectados. Después de la adquisición de datos, las células se cerraron para incluir solo singletes en una gráfica FSC-A versus SSC-A. Luego, se dibujaron las gráficas de histograma y la gráfica de puntos. Aquí, los ratones sépticos mostraron una mayor infiltración de neutrófilos en la cavidad peritoneal.
Figura 1: Visualización de la UFC orgánica después de la infección. Los órganos fueron homogeneizados como se describe en el protocolo. El lisado se extendió en placas de agar SS utilizando un esparcidor. Imágenes de placas extendidas con una dilución de 1 × 10-1 de lisados homogeneizados de (A) hígado y (B) bazo. Una parte de la placa se muestra como un recuadro ampliado para resaltar las colonias. Aumento insertado = 13x (área). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Hemólisis mejorada en ratones sépticos. La sangre se recogió en tubos de microcentrífuga y se dejó sin perturbar a temperatura ambiente durante 30 minutos. El coágulo se eliminó centrifugando los tubos a 2.000 × g durante 10 minutos en una centrífuga refrigerada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Perfil citométrico de flujo de la población de neutrófilos en líquido de lavado peritoneal. El líquido de lavado peritoneal se recolectó 16 h después de la infección. Las células peritoneales se tiñeron con anticuerpos anti-LY6G marcados con FITC. Los ratones sépticos mostraron una mayor infiltración de neutrófilos en la cavidad peritoneal. Abreviaturas: FITC = isotiocianato de fluoresceína; LY6G = antígeno de linfocitos 6 locus complejo G6D; SSC-A = área de dispersión lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo describe un método para inducir una forma grave de sepsis bacteriana mediante la inyección intraperitoneal de Salmonella Typhimurium. Este modelo es ventajoso sobre otros, ya que Salmonella Typhimurium es un patógeno intracelular y, por lo tanto, altamente patógeno, imitando la condición clínicamente relevante de la sepsis Gram-negativa. El resultado de la sepsis de peritonitis en este modelo es sistémico, con una mortalidad del 100% dentro de las 96 h posteriores a la infección. Por lo tanto, este modelo es fundamental en el estudio de las respuestas inflamatorias y letales del huésped8 y los efectos de la intervención terapéutica en la atenuación de la sepsis.
En este sistema modelo, la composición celular de la cavidad peritoneal cambia drásticamente para combatir el patógeno inoculado. Un gran número de neutrófilos LY6G+ se infiltran en la cavidad peritoneal, con una disminución simultánea de los macrófagos F4/80+, lo que resulta en la reacción de desaparición de macrófagos (MDR)8,10. Por lo tanto, este modelo es útil para estudiar los cambios cinéticos en las composiciones y funciones de las células inmunes durante la sepsis, que todavía es un área muy inexplorada. Salmonella El typhimurium infecta, reside y prolifera sistémicamente en los órganos de los ratones. Las citoquinas proinflamatorias séricas como TNF-α, IL-6 e IFN-γ también aumentan8. Una cascada de respuestas proinflamatorias también conduce a la hemólisis y coagulación de la sangre, que se hace visible tras la disección de los ratones infectados10,11. La interacción entre la respuesta del huésped a esta carga bacteriana y los efectos dañinos de las bacterias conduce a la arquitectura del tejido desfigurado, la pérdida de funciones y la necrosis tisular, especialmente en el hígado.
Además, informes previos del laboratorio han demostrado que tales efectos están modulados por la expresión regulada al alza de la óxido nítrico sintasa 2 (NOS2), lo que conduce a un aumento de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y mayores niveles de citoquinas proinflamatorias, lo que lleva a una respuesta inflamatoria mejorada8. Este modelo de sepsis de ratón es ventajoso sobre otros porque la inducción de sepsis es más rápida con efectos más letales. No requiere experiencia técnica para realizar la cirugía en ratones anestesiados, como es el caso del modelo actual de ratón CLP-sepsis estándar de oro. En el modelo CLP-sepsis, solo un subconjunto de ratones desarrolla sepsis, mientras que todos los ratones desarrollan sepsis en el modelo descrito aquí.
Además, en comparación con el modelo de sepsis por endotoxemia inducida por LPS, este modelo es clínicamente más relevante para la sepsis monobacteriana Gram-negativa. El modelo también es útil para comprender los aumentos en las ROS intracelulares, los niveles de citoquinas proinflamatorias, la hemólisis y la coagulación de la sangre, todo lo cual ocurre durante la sepsis. Se informa que el uso del fármaco donante de óxido nítrico DETA-NONOate proporciona un beneficio de supervivencia en ratones knockout Nos2 con sepsis utilizando este modelo8. Esto sugiere que este modelo se puede utilizar para identificar nuevos fármacos para tratar la sepsis. Además, este modelo puede ser adoptado rápidamente por cualquier laboratorio equipado con instalaciones BSL-2.
Al utilizar este modelo, se deben tomar precauciones a nivel de la salud de las células bacterianas y el número de UFC para obtener resultados óptimos. Uno siempre debe usar colonias de Salmonella recién rayadas de placas de agar SS. También se recomienda optimizar el proceso de preparación del cultivo encontrando el valor de OD en el espectrofotómetro correspondiente a la UFC mencionada.
La desventaja de usar este modelo es que el efecto de la sepsis en ratones es intensamente letal dentro de las 96 h posteriores a la infección. Esto limita el estudio de las respuestas inmunes del huésped en los últimos puntos de tiempo. Se puede superar mediante el uso de una cepa bacteriana más atenuada de Salmonella Typhimurium.
Existen diferencias entre los pacientes humanos que sufren de sepsis y los modelos de ratones que intentan imitar la sepsis humana. Por ejemplo, los pacientes tardan más en desarrollar sepsis y se les realizan intervenciones de apoyo y terapias. Sin embargo, la sepsis en modelos de ratón se desarrolla mucho más rápido, y no se realizan intervenciones de apoyo4. Sin embargo, hay algunas similitudes entre la sepsis en humanos y ratones, con pacientes con sepsis que muestran niveles más altos de citoquinas proinflamatorias, coagulación sanguínea y hemólisis en entornos clínicos. Todo esto se imita en este modelo de ratón de sepsis. Por lo tanto, algunas lecturas de este modelo son relevantes para los escenarios clínicos, aunque una correlación directa puede no ser aconsejable.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Instalación Central de Animales, IISc por suministrarnos ratones para la investigación. Este estudio fue financiado por subvenciones a DpN del Departamento de Biotecnología y la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería del Gobierno de la India. El apoyo de infraestructura del programa DBT-IISc y las subvenciones DST-FIST son muy reconocidos. Agradecemos a todos los miembros anteriores y actuales del laboratorio DpN por su apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | - | - | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
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