Caracterizando Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis em camundongos
Summary
Este protocolo descreve a indução da sepse monobacteriana Gram-negativa em um sistema modelo de rato. O modelo é útil na investigação das respostas inflamatórias e letais do hospedeiro durante a sepse.
Abstract
A sepse é uma resposta imune disregulada ao dano microbiano ou de tecido, levando a lesões de órgãos em um local distante do da infecção ou dano. Atualmente, os modelos de sepse amplamente utilizados incluem endotoxemia induzida por lipopolípido (LPS), ligante cecal e punção (CLP), e sistemas modelo de infecção monobacteriana. Este protocolo descreve um método para estudar as respostas do hospedeiro durante a peritonite séptica induzida por infecção por Salmonella Typhimurium em camundongos. S. Typhimurium, um patógeno intracelular gram-negativo, causa doença semelhante a tifoide em camundongos.
Este protocolo elabora a preparação da cultura, a indução de peritonite séptica em camundongos através de injeção intraperitoneal e métodos para estudar respostas sistêmicas do hospedeiro. Além disso, apresenta-se a avaliação da carga bacteriana em diferentes órgãos e a análise citométrica do fluxo do aumento do número de neutrófilos na lavagem peritoneal. Salmonella A sepse induzida por titriério em camundongos leva a um aumento de citocinas proinflamatórias e à rápida infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal, levando a uma menor sobrevivência.
Cada passo deste protocolo foi otimizado, resultando em alta reprodutibilidade da patogênese da peritonite séptica. Este modelo é útil para estudar respostas imunológicas durante a sepse bacteriana, os papéis de diferentes genes na progressão da doença e os efeitos das drogas para atenuar a sepse.
Introduction
A sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica disregulada e imune à invasão microbiana ou danos teciduais, levando à lesão de órgãos distante do local da infecção ou dano. O choque séptico é um subconjunto de sepse caracterizado pela hipotensão que persiste durante a ressuscitação do volume, com um risco substancialmente aumentado de mortalidade1. O público em geral tornou-se mais consciente desse transtorno durante a pandemia COVID-19. Apesar de sua alta mortalidade associada, faltam dados epidemiológicos abrangentes sobre a carga global da sepse devido à complexidade de seu diagnóstico. Em 2017, houve 48,9 milhões de incidências de sepse e 11 milhões de mortes em todo o mundo, representando 19,7% de todas as mortes globais2. Além disso, um estudo sobre a prevalência prolongada de infecção e sepse relacionada em pacientes de unidade de terapia intensiva constatou que 62% dos isolados positivos dos pacientes eram organismos Gram-negativos3.
Inicialmente, as investigações sobre sepse se concentraram na delineamento da patogênese microbiana. No entanto, compreender a “hipótese de perigo”, que dita como o hospedeiro distingue a si mesmo e a si mesmo, levou à inclinação do equilíbrio da pesquisa de sepse para entender a resposta do hospedeiro a um patógeno invasor. Os modelos de sepse amplamente utilizados incluem o modelo de endotoxemia induzido por lipopolípido (LPS), modelos de sepse polimicrobiana, ligação cecal e punção (CLP) e peritonite stent ascendentes de cólon (CASP), e modelos de infecção monobacteriana4.
Padronizamos um sistema de modelo de camundongos induzindo sepse peritoneal usando Salmonella Typhimurium. Este modelo é vantajoso em relação aos outros porque Salmonella Typhimurium é um patógeno intracelular que imita a condição clinicamente relevante da sepse Gram-negativa. O resultado da peritonite sepse nesse modelo é sistêmico, com 100% de mortalidade dentro de 96 h pós infecção. Portanto, este modelo é fundamental no estudo das respostas inflamatórias e letais do hospedeiro. Neste modelo, a sepse é induzida por injeção intraperitoneal de 0,5 milhões de unidades formadoras de colônias (UFC) de Salmonella Typhimurium em um rato C57BL/6 de 8-10 semanas de idade. A infecção sistêmica pode ser confirmada avaliando a carga bacteriana dos órgãos ~16 h após a infecção. Este artigo demonstra salmonella typhimurium-induced peritonitis sepse em camundongos, caracteriza as alterações resultantes na composição celular peritoneal, e quantifica a carga bacteriana em diferentes órgãos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve um método de induzir uma forma grave de sepse bacteriana por injeção intraperitoneal de Salmonella Typhimurium. Este modelo é vantajoso em relação aos outros, pois Salmonella Typhimurium é um patógeno intracelular e, portanto, altamente patogênico, imitando a condição clinicamente relevante da sepse Gram-negativa. O resultado da peritonite sepse nesse modelo é sistêmico, com 100% de mortalidade dentro de 96 h pós infecção. Portanto, esse modelo é fundamental no estu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Centro de Animais, IISc, por nos fornecer ratos para pesquisa. Este estudo foi financiado por subvenções ao DpN do Departamento de Biotecnologia e Ciência e Pesquisa de Engenharia, Governo da Índia. O apoio infra-estrutural do programa DBT-IISc e das subvenções DST-FIST são muito reconhecidos. Agradecemos a todos os membros anteriores e atuais do laboratório dpn pelo apoio.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
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