Summary
Este protocolo descreve a indução da sepse monobacteriana Gram-negativa em um sistema modelo de rato. O modelo é útil na investigação das respostas inflamatórias e letais do hospedeiro durante a sepse.
Abstract
A sepse é uma resposta imune disregulada ao dano microbiano ou de tecido, levando a lesões de órgãos em um local distante do da infecção ou dano. Atualmente, os modelos de sepse amplamente utilizados incluem endotoxemia induzida por lipopolípido (LPS), ligante cecal e punção (CLP), e sistemas modelo de infecção monobacteriana. Este protocolo descreve um método para estudar as respostas do hospedeiro durante a peritonite séptica induzida por infecção por Salmonella Typhimurium em camundongos. S. Typhimurium, um patógeno intracelular gram-negativo, causa doença semelhante a tifoide em camundongos.
Este protocolo elabora a preparação da cultura, a indução de peritonite séptica em camundongos através de injeção intraperitoneal e métodos para estudar respostas sistêmicas do hospedeiro. Além disso, apresenta-se a avaliação da carga bacteriana em diferentes órgãos e a análise citométrica do fluxo do aumento do número de neutrófilos na lavagem peritoneal. Salmonella A sepse induzida por titriério em camundongos leva a um aumento de citocinas proinflamatórias e à rápida infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal, levando a uma menor sobrevivência.
Cada passo deste protocolo foi otimizado, resultando em alta reprodutibilidade da patogênese da peritonite séptica. Este modelo é útil para estudar respostas imunológicas durante a sepse bacteriana, os papéis de diferentes genes na progressão da doença e os efeitos das drogas para atenuar a sepse.
Introduction
A sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica disregulada e imune à invasão microbiana ou danos teciduais, levando à lesão de órgãos distante do local da infecção ou dano. O choque séptico é um subconjunto de sepse caracterizado pela hipotensão que persiste durante a ressuscitação do volume, com um risco substancialmente aumentado de mortalidade1. O público em geral tornou-se mais consciente desse transtorno durante a pandemia COVID-19. Apesar de sua alta mortalidade associada, faltam dados epidemiológicos abrangentes sobre a carga global da sepse devido à complexidade de seu diagnóstico. Em 2017, houve 48,9 milhões de incidências de sepse e 11 milhões de mortes em todo o mundo, representando 19,7% de todas as mortes globais2. Além disso, um estudo sobre a prevalência prolongada de infecção e sepse relacionada em pacientes de unidade de terapia intensiva constatou que 62% dos isolados positivos dos pacientes eram organismos Gram-negativos3.
Inicialmente, as investigações sobre sepse se concentraram na delineamento da patogênese microbiana. No entanto, compreender a "hipótese de perigo", que dita como o hospedeiro distingue a si mesmo e a si mesmo, levou à inclinação do equilíbrio da pesquisa de sepse para entender a resposta do hospedeiro a um patógeno invasor. Os modelos de sepse amplamente utilizados incluem o modelo de endotoxemia induzido por lipopolípido (LPS), modelos de sepse polimicrobiana, ligação cecal e punção (CLP) e peritonite stent ascendentes de cólon (CASP), e modelos de infecção monobacteriana4.
Padronizamos um sistema de modelo de camundongos induzindo sepse peritoneal usando Salmonella Typhimurium. Este modelo é vantajoso em relação aos outros porque Salmonella Typhimurium é um patógeno intracelular que imita a condição clinicamente relevante da sepse Gram-negativa. O resultado da peritonite sepse nesse modelo é sistêmico, com 100% de mortalidade dentro de 96 h pós infecção. Portanto, este modelo é fundamental no estudo das respostas inflamatórias e letais do hospedeiro. Neste modelo, a sepse é induzida por injeção intraperitoneal de 0,5 milhões de unidades formadoras de colônias (UFC) de Salmonella Typhimurium em um rato C57BL/6 de 8-10 semanas de idade. A infecção sistêmica pode ser confirmada avaliando a carga bacteriana dos órgãos ~16 h após a infecção. Este artigo demonstra salmonella typhimurium-induced peritonitis sepse em camundongos, caracteriza as alterações resultantes na composição celular peritoneal, e quantifica a carga bacteriana em diferentes órgãos.
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Protocol
Todos os experimentos utilizando Salmonella Typhimurium foram realizados nas instalações do Nível de Bio Segurança 2 (BSL-2). Deve-se tomar cuidado para utilizar equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, garantir a segurança e seguir os métodos padrão de descarte de risco biológico BSL-2. Todos os experimentos com camundongos foram realizados seguindo diretrizes do Comitê de Ética Animal Institucional, IISc. Os camundongos foram criados e mantidos no Centro de Animais do IISc (Número de registro: 48/1999/CPCSEA, datado de 3/1/1999), aprovado pelo Ministério do Meio Ambiente e Floresta, Governo da Índia. Os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Propósito e Controle e Supervisão de Experimentos em Animais com o número de autorização aprovado CAF/Ética/797/2020.
Definição BSL2: Uma classificação BSL2 representa que os agentes de risco biológico representam uma ameaça moderada ao meio ambiente e à equipe de laboratório5.
1. Preparação cultural de Salmonella Typhimurium
- Adicione 100 μL de Salmonella Typhimurium NCTC 12023 glicerol a 3 mL de caldo de Luria Bertani (LB). Incubar a cultura a 160 rpm a 37 °C durante a noite.
- Raia 50 μL da cultura cultivada durante a noite em caldo LB em uma placa de ágar Salmonella Shigella (SS) e incubar a 37 °C por ~12 h. Armazene a placa de ágar SS com as colônias bacterianas a 4 °C por vários dias antes do experimento de infecção in vivo .
- Escolha uma única colônia da placa de ágar SS listrada usando uma microtipa. Ejete a microfina em 3 mL de caldo LB e cultura a 160 rpm a 37 °C durante a noite.
- Adicione 0,1 mL da cultura bacteriana a 50 mL de caldo LB e incubar a 37 °C em uma incubadora shaker a 160 rpm por 3-4 h para alcançar a fase logarítmica de crescimento. Diluir a cultura por um fator de 2 usando caldo LB.
NOTA: Durante a fase logarítmica, as células bacterianas estão em sua melhor saúde e estão se dividindo ativamente. - Meça a densidade óptica (OD) da cultura a 600 nm de comprimento de onda de luz em um leitor de espectrofotômetro ou microplaca. Uma vez que o OD atinja 1.0, faça duas alíquotas de 1 mL de cultura em tubos de microfuge de 1,5 mL.
- Centrifugar os tubos a 7.750 × g por 15 min. Descarte o supernatante e lave a pelota com 1 mL de 1x PBS 2x. Centrifugar os tubos a 7.750 × g por 15 min.
- Resuspenja a pelota em 0,5 mL de 1x PBS em dois tubos diferentes de microfuça de 1,5 mL. Combine as suspensões de ambos os tubos em um tubo de 1,5 mL agora contendo ~2 × 108 unidades formadoras de colônias (CFU)/mL.
- Prepare uma suspensão celular bacteriana de 1 × 106 UFC/mL diluindo esta solução de estoque.
ATENÇÃO: Otimize a UFC correspondente ao OD em condições laboratoriais específicas para determinar a UFC para OD 1.0 antes de iniciar os experimentos.
2. Camundongos e infecções
- Casa de 8-10 semanas macho C57BL/6 ratos pesando ~20 g na sala de ar limpo da instalação animal por vários dias para aclimatação.
- No dia da infecção, segure o rato com uma mão, limpe a pele abdominal com 70% de etanol e espalhe as patas traseiras para melhor acessibilidade da parede abdominal.
- Injete 0,5 mL de 1 × suspensão bacteriana 106 CFU/mL intraperitonealmente com a ajuda de uma seringa de 1 mL. Portanto, cada rato recebe 5 × 105 UFC. Controle, camundongos não infectados recebem 0,5 mL apenas de PBS. Pós-infecção, emplaque a cultura para verificar a CFU real injetada, que pode variar de 0,2-0,8 milhões de UFC/0,5 mL.
- Coloque os ratos de volta nas gaiolas como atribuído.
- Sacrifique os camundongos usando asfixia de CO2 ~12-18 h de infecção pós para obter a melhor resposta. Normalmente, todos os camundongos infectados morrem dentro de 96 h. Sob algumas intervenções experimentais, alguns ratos podem sobreviver. Eutanize esses ratos depois das 96 h. Além disso, eutanize qualquer rato com uma temperatura corporal abaixo de 33,2 °C e angústia aguda a 96 h como um ponto final humano.
NOTA: Neste modelo, alguns camundongos podem começar a morrer após 12 h de injeção de Salmonella . Portanto, planeje experimentos adequadamente envolvendo vários pontos de tempo.
3. Avaliação da UFC dos órgãos
- Sacrifique o rato infectado por asfixia de CO2 , e limpe o abdômen com um pedaço de algodão mergulhado em 70% de etanol. Abra a pele abdominal. Consulte o artigo de Ray e Dittel para um protocolo de vídeo sobre como coletar fluido de lavage peritoneal6. Abra a cavidade peritoneal e colete os órgãos de interesse em tubos de microfuge. Além disso, à medida que o sangue em camundongos com sepse é coagulado rapidamente e as quantidades são baixas, colecione-o rapidamente após o sacrifício.
NOTA: Este vídeo demonstra a enumeração do órgão CFU do fígado à medida que o fígado sofre extensos danos histopatológicos neste modelo de sepse. - Corte um pequeno pedaço do fígado e coloque-o em um tubo de microfuça.
NOTA: Isso pode ser armazenado no gelo por um máximo de 2-3 horas antes de prosseguir para a próxima etapa. - Pesar e transferir as peças para tubos de microcentrifuuagem. De preferência, corte peças pesando ~10-15 mgs para homogeneização adequada. Use órgãos inteiros no caso de menores, como os linfonodos mesentéricos (MLNs) ou timo.
- Adicione 0,5 mL de 1x PBS ao tubo e homogeneize os órgãos usando um homogeneizador de mão. Certifique-se de que os órgãos estão completamente homogeneizados. Coma o volume de 1 mL adicionando 0,5 mL de 1x PBS.
- Centrifugar os tubos a 200 × g por 5 min a 4 °C.
- Colete o supernatante em tubos de microfuge frescos e prepare diluições de 1 × 10−1 e 10-2 em uma placa de 96 poços.
- Espalhe 50 μL do diluído em placas frescas de ágar SS e incubar as placas a 37 °C por 12 h.
- Conte o número de colônias que aparecem em cada condição e normalize os dados com o peso do órgão usando Equação (1):
CFU/mg =
(1)
NOTA: O número 20 é usado na fórmula para converter as colônias por placa em CFU/mL. Este número é chegado dividindo 1 mL pela quantidade de um determinado volume da cultura banhada neste caso, 50 μL.
Por exemplo, se 100 colônias forem encontradas em uma placa de ágar SS, onde 50 μL de uma diluição de 1 × 10-1 de um órgão homogeneizado pesando 10 mgs é espalhado, então
CFU/mg =
(1)
4. Análise citométrica de fluxo de várias populações de células imunes em exsudato peritoneal
- Coletar as células peritoneal como descrito anteriormente por Ray e Dittel6.
- Resuspend a pelota celular do fluido de lavage peritoneal em 1 mL de RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS). Enumerar os números totais de células na lavage peritoneal usando um hemócito. Ajuste o número da célula para que cada tubo receba 0,2-0,5 milhões de células.
NOTA: O lavado peritoneal em camundongos com sepse pode conter RBCs, que provavelmente aparecem devido à hemorragia. Tenha cuidado para excluir RBCs enquanto conta as células peritoneais. No microscópio brightfield, os RBCs parecem muito menores do que as células imunes. Estes aparecem como discos planos ou donuts, redondos, com um recuo no centro, mas não oco. Um passo para lise RBCs pode ser adicionado7. - Gire as células a 200 × g a 4 °C por 10 minutos, descarte o sobrenante e lave as células 1x com PBS 1x frio. Centrifugar as células a 200 × g a 4 °C por 10 min.
- Bloqueie os receptores Fc em PECs usando bloqueador de FcR (diluição 1:400), preparado no buffer de bloqueio composto por 5% de FBS e 0,02% de azida de sódio no PBS. Incubar no gelo por 15 minutos.
- Centrifugar as células a 200 × g a 4 °C por 10 min. Descarte o supernatante. Diluir os anticorpos conjugados fluorocromo de interesse em bloquear o buffer. Use uma diluição de 1:500 do anti-rato LY6G para manchar os neutrófilos.
NOTA: Outras populações de células imunes também podem ser detectadas usando, por exemplo, o anti-rato B220 para células B, CD3 anti-rato para células T e f4/80 anti-rato para macrófagos. - Incubar ~0,2 milhões de células em 200 μL das soluções diluídas de anticorpos em tubos separados. Como controle negativo, reserve um tubo em cada tipo fluorocromo para o controle não manchado para incubar as células com 200 μL de tampão de bloqueio sem anticorpo.
- Incubar as amostras no gelo por 45 minutos com toques intermitentes a cada 15 minutos.
- Centrifugar as células a 200 × g por 10 min a 4 °C. Descarte o supernatante. Fixar as células com 4% de paraformaldeído por ~15 min em temperatura ambiente se precisarem ser armazenadas por vários dias. No entanto, é melhor adquirir dados de amostras recém-manchadas em um citômetro de fluxo.
- Resuspensar as células em 200 μL de tampão de coloração FACS (2% FBS em PBS). Adquira os dados em um citômetro de fluxo.
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Representative Results
Uma caracterização detalhada da resposta imune do hospedeiro usando este modelo em particular é mostrada em publicações anteriores 8,9. Alguns resultados representativos do protocolo descrito são retratados nesta seção. Este modelo visa induzir a infecção sistêmica de S. Tiquitário por injeção intraperitoneal da cultura bacteriana para induzir a sepse. Para confirmar a infecção, os lises do fígado e do baço de camundongos sépticos foram espalhados em placas de ágar SS, e o número de colônias foi contado. Na Figura 1, as imagens das placas de ágar SS indicam a carga de CFU do órgão no fígado e o baço de camundongos sépticos. Os lises de órgão homogeneizados foram espalhados a uma diluição de 1 × 10-1 e incubados a 37 °C. O S pigmentado preto. Colônias de typhimurium apareceram após ~12 h de incubação a 37 °C. Além disso, após a infecção de camundongos, as culturas do sangue e da lavagem peritoneal são relatadas como positivas para as células bacterianas8. Esses resultados indicaram que as células bacterianas injetadas intraperitoneal se disseminaram sistematicamente e colonizaram os órgãos internos. Uma parte da placa é mostrada como um inset de zoom para destacar as colônias. O patógeno disseminou sistematicamente e colonizou os órgãos internos.
A Figura 2 mostra a soro isolada de camundongos saudáveis e sépticos. O volume de sangue colecionável através de punção cardíaca de camundongos sépticos é geralmente de 100-200 μL, que é menor do que a quantidade de camundongos saudáveis, onde ~500 μL de sangue pode ser obtido. Como resultado, o volume de soro isolado do sangue do rato séptico é baixo. Esse fenômeno acontece devido ao aumento da coagulação do sangue em camundongos sépticos. Além disso, a sera de camundongos sépticos apresentam coloração vermelha distinta, indicando a ocorrência de hemolise extensiva 8,9.
Como mostrado na Figura 3, a imunofenotipagem baseada em citometria de fluxo de células exsudatos peritoneal foi realizada para avaliar a infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal de camundongos saudáveis e sépticos. Como os neutrófilos expressam proteína LY6G na superfície celular, o anticorpo anti-LY6G marcado pelo FITC foi usado para manchar a população de células neutrófilas. Essas imagens representam dados de um camundongo saudável e dois infectados. Após a aquisição de dados, as células foram fechadas para incluir apenas singlets em um lote FSC-A versus SSC-A. Em seguida, as tramas histogramas e dot-plot foram desenhados. Aqui, os camundongos sépticos apresentaram aumento da infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal.
Figura 1: Visualização de órgão pós-infecção pós CFU. Os órgãos foram homogeneizados conforme descrito no protocolo. O lysate foi espalhado em placas de ágar SS usando um espalhador. Imagens de placas espalhadas com uma diluição de 1 × 10-1 de lises homogeneizadas de (A) fígado e (B) baço. Uma parte da placa é mostrada como um conjunto ampliado para destacar as colônias. Ampliação de inset = 13x (área). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Hemólise aprimorada em camundongos sépticos. O sangue foi coletado em tubos de microcentrifuuge e deixado imperturbável à temperatura ambiente por 30 minutos. O coágulo foi removido por centrifugação dos tubos a 2.000 × g por 10 min em uma centrífuga refrigerada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Perfil citométrico de fluxo da população de neutrófilos em fluido de lavage peritoneal. O fluido de lavage peritoneal foi coletado 16 h após infecção. As células peritoneal foram manchadas com anticorpo anti-LY6G marcado pelo FITC. Camundongos sépticos apresentaram aumento da infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal. Abreviaturas: FITC = isoticianato de fluoresceína; LY6G = antígeno linfócito 6 lócus complexo G6D; SSC-A = área de dispersão lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo descreve um método de induzir uma forma grave de sepse bacteriana por injeção intraperitoneal de Salmonella Typhimurium. Este modelo é vantajoso em relação aos outros, pois Salmonella Typhimurium é um patógeno intracelular e, portanto, altamente patogênico, imitando a condição clinicamente relevante da sepse Gram-negativa. O resultado da peritonite sepse nesse modelo é sistêmico, com 100% de mortalidade dentro de 96 h pós infecção. Portanto, esse modelo é fundamental no estudo das respostas inflamatórias e letais do hospedeiro8 e os efeitos da intervenção terapêutica na atenuação da sepse.
Neste sistema modelo, a composição celular da cavidade peritoneal muda drasticamente para combater o patógeno inoculado. Um grande número de neutrófilos LY6G+ infiltram-se na cavidade peritoneal, com uma diminuição simultânea nos macrófagos F4/80+, resultando na reação de desaparecimento do macrófago (MDR)8,10. Portanto, este modelo é útil no estudo das alterações cinéticas nas composições e funções das células imunes durante a sepse, que ainda é uma área muito inexplorada. Salmonella O typhimurium infecta sistematicamente, reside e prolifera nos órgãos dos camundongos. As citocinas proinflamatórias do soro, como TNF-α, IL-6 e IFN-γ também aumentam8. Uma cascata de respostas proinflamatórias também leva à hemólise e coagulação do sangue, que se torna visível após a dissecção dos camundongos infectados10,11. A interação entre a resposta do hospedeiro a essa carga bacteriana e os efeitos nocivos da bactéria leva à arquitetura de tecido desfigurada, perda de funções e necrose tecidual, especialmente no fígado.
Além disso, relatórios anteriores do laboratório mostraram que tais efeitos são modulados pela expressão regulamentada de sintetizador de óxido nítrico 2 (NOS2), o que leva ao aumento das espécies reativas de oxigênio (ROS) e níveis mais elevados de citocinas proinflamatórias, levando a uma resposta inflamatória aprimorada8. Este modelo de sepse do camundongo é vantajoso em relação aos outros porque a indução da sepse é mais rápida com efeitos mais letais. Não é necessário conhecimento técnico para realizar a cirurgia em camundongos anestesiados, como é o caso do atual modelo de rato CLP-sepse padrão-ouro. No modelo CLP-sepse, apenas um subconjunto de camundongos desenvolve sepse, enquanto todos os camundongos desenvolvem sepse no modelo descrito aqui.
Além disso, em comparação com o modelo de sepse endotoxemia induzida pelo LPS, este modelo é mais clinicamente relevante para a sepse monobacteriana Gram-negativa. O modelo também é útil na compreensão dos aumentos de ROS intracelular, níveis de citocinas proinflamatórias, hemolise e coagulação sanguínea, tudo isso acontece durante a sepse. Relata-se que o uso da droga doador de óxido nítrico DETA-NONOate proporciona um benefício de sobrevivência em ratos de nocaute Nos2 com sepse usando este modelo8. Isso sugere que este modelo pode ser usado para identificar novas drogas para tratar a sepse. Além disso, este modelo pode ser rapidamente adotado por qualquer laboratório equipado com instalações BSL-2.
Ao utilizar este modelo, devem ser tomadas precauções ao nível da saúde celular bacteriana e do número da UFC para obter resultados ideais. Deve-se sempre usar colônias de Salmonella recém-listradas de placas de ágar SS. Recomenda-se também otimizar o processo de preparação da cultura, encontrando o valor de OD no espectrômetro correspondente à CFU mencionada.
A desvantagem de usar este modelo é que o efeito da sepse em camundongos é intensamente letal dentro de 96 h pós infecção. Isso limita o estudo das respostas imunes do hospedeiro em momentos tardios. Pode ser superado usando uma cepa bacteriana mais atenuada de Salmonella Typhimurium.
Há diferenças entre pacientes humanos que sofrem de sepse e modelos de camundongos que tentam imitar a sepse humana. Por exemplo, os pacientes demoram mais para desenvolver a sepse e são colocados em intervenções e terapêuticas de apoio. No entanto, a sepse nos modelos de mouses se desenvolve muito mais rápido, e intervenções de suporte não são feitas4. No entanto, há algumas semelhanças entre a sepse em humanos e camundongos, com pacientes com sepse mostrando níveis mais elevados de citocinas proinflamatórias, coagulação sanguínea e hemólise em ambientes clínicos. Todos estes são imitados neste modelo de sepse. Portanto, algumas leituras desse modelo são relevantes para os cenários clínicos, embora uma correlação direta possa não ser aconselhável.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Centro de Animais, IISc, por nos fornecer ratos para pesquisa. Este estudo foi financiado por subvenções ao DpN do Departamento de Biotecnologia e Ciência e Pesquisa de Engenharia, Governo da Índia. O apoio infra-estrutural do programa DBT-IISc e das subvenções DST-FIST são muito reconhecidos. Agradecemos a todos os membros anteriores e atuais do laboratório dpn pelo apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | - | - | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
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