Farelerde Salmonella Typhimurium ile İndüklenen Septik Peritonitin Karakterizasyonu
Summary
Bu protokol, bir fare modeli sisteminde Gram-negatif monobakteriyel sepsisin indüksiyonunu açıklar. Model, sepsis sırasında inflamatuar ve ölümcül konakçı yanıtlarının araştırılmasında yararlıdır.
Abstract
Sepsis, mikrobiyal invazyon veya doku hasarına karşı düzensiz bir konakçı immün tepkisidir ve enfeksiyon veya hasardan uzak bir bölgede organ hasarına yol açar. Günümüzde sepsisin yaygın olarak kullanılan fare modelleri arasında lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı endotoksemi, çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) ve monobakteriyel enfeksiyon modeli sistemleri bulunmaktadır. Bu protokol, farelerde Salmonella Typhimurium enfeksiyonuna bağlı septik peritonit sırasında konakçı yanıtlarını incelemek için bir yöntemi açıklar. S. Gram-negatif hücre içi patojen olan tifimuryum, farelerde tifo benzeri hastalığa neden olur.
Bu protokol, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla farelerde septik peritonitin indüklenmesi ve sistemik konakçı yanıtlarını incelemek için kullanılan yöntemler hakkında kültür hazırlığı, indüksiyon konularını detaylandırır. Ayrıca, farklı organlardaki bakteri yükünün değerlendirilmesi ve periton lavajında artmış nötrofil sayılarının akış sitometrik analizi sunulmaktadır. Salmonella Farelerde tifimuryuma bağlı sepsis, proinflamatuar sitokinlerde bir artışa ve periton boşluğunda nötrofillerin hızlı infiltrasyonuna yol açarak daha düşük sağkalıma yol açar.
Bu protokoldeki her adım optimize edilmiş ve septik peritonit patogenezinin yüksek tekrarlanabilirliği ile sonuçlanmıştır. Bu model, bakteriyel sepsis sırasında immünolojik yanıtları, farklı genlerin hastalık progresyonundaki rollerini ve ilaçların sepsiyi zayıflatma etkilerini incelemek için yararlıdır.
Introduction
Sepsis, mikrobiyal invazyon veya doku hasarına karşı düzensiz sistemik inflamatuar ve immün yanıt olarak tanımlanır ve enfeksiyon veya hasar bölgesinden uzakta organ hasarına yol açar. Septik şok, hacim resüsitasyonu sırasında devam eden hipotansiyon ile karakterize bir sepsis alt kümesidir ve mortalite riski önemli ölçüde artmıştır1. Genel halk, COVID-19 pandemisi sırasında bu bozukluğun daha fazla farkına varmıştır. Yüksek ilişkili mortalitesine rağmen, sepsisin küresel yükü ile ilgili kapsamlı epidemiyolojik veriler, tanısının karmaşıklığı nedeniyle eksiktir. 2017 yılında, dünya çapında 48,9 milyon sepsis insidansı ve 11 milyon ölüm meydana gelmiş olup, tüm küresel ölümlerin %19,7’sini oluşturmaktadır2. Ayrıca, yoğun bakım hastalarında enfeksiyon ve buna bağlı sepsis prevalansının uzaması üzerine yapılan bir çalışmada, hastalardan pozitif izolatların% 62’sinin Gram-negatif organizmalar olduğu bulunmuştur3.
Sepsis üzerine yapılan araştırmalar başlangıçta mikrobiyal patogenezi tanımlamaya odaklanmıştır. Bununla birlikte, konağın kendini ve benlik olmayanı nasıl ayırt ettiğini belirleyen “tehlike hipotezini” anlamak, sepsis araştırmasının dengesinin, istilacı bir patojene karşı konakçı tepkisini anlamaya doğru eğilmesine yol açmıştır. Sepsisin yaygın olarak kullanılan fare modelleri arasında lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı endotoksemi modeli, polimikrobiyal sepsis modelleri, çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) ve kolon ascendens stent peritonit (CASP) ve monobakteriyel enfeksiyon modelleri4 bulunmaktadır.
Salmonella Typhimurium kullanarak periton sepsisini indükleyerek fare model sistemi standartlaştırdık. Bu model diğerlerine göre avantajlıdır, çünkü Salmonella Typhimurium, Gram-negatif sepsisin klinik olarak ilgili durumunu taklit eden hücre içi bir patojendir. Bu modelde peritonit sepsisinin sonucu sistemiktir ve enfeksiyon sonrası 96 saat içinde %100 mortalite vardır. Bu nedenle, bu model enflamatuar ve ölümcül konakçı yanıtlarını incelemede etkilidir. Bu modelde sepsis, intraperitoneal olarak 0.5 milyon koloni oluşturan Salmonella Typhimurium biriminin (CFU) 8-10 haftalık bir C57BL / 6 fareye enjekte edilmesiyle indüklenir. Sistemik enfeksiyon, enfeksiyon sonrası organ bakteri yükünün ~ 16 saat değerlendirilmesiyle doğrulanabilir. Bu makalede, farelerde Salmonella Typhimurium kaynaklı peritonit sepsisi gösterilmektedir, periton hücre kompozisyonunda ortaya çıkan değişiklikleri karakterize etmekte ve farklı organlardaki bakteri yükünü ölçmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, Salmonella Typhimurium’un intraperitoneal enjeksiyonu ile ciddi bir bakteriyel sepsis formunu indükleme yöntemi açıklanmaktadır. Bu model, Salmonella Typhimurium’un hücre içi bir patojen olması ve dolayısıyla Gram-negatif sepsisin klinik olarak ilgili durumunu taklit eden oldukça patojenik olması nedeniyle diğerlerine göre avantajlıdır. Bu modelde peritonit sepsisinin sonucu sistemiktir ve enfeksiyon sonrası 96 saat içinde %100 mortalite vardır. Bu nedenle, bu model enfla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Merkezi Hayvan Tesisi, IISc’ye araştırma için bize fareler sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü ve Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu’ndan DpN’ye verilen hibelerle finanse edilmiştir. DBT-IISc programından gelen altyapı desteği ve DST-FIST hibeleri büyük ölçüde kabul edilmektedir. DpN laboratuvarının önceki ve mevcut tüm üyelerine destekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
