Summary
Questo protocollo descrive l'induzione della sepsi monobatterica Gram-negativa in un sistema di modelli murini. Il modello è utile per studiare le risposte infiammatorie e letali dell'ospite durante la sepsi.
Abstract
La sepsi è una risposta immunitaria dell'ospite disregolata all'invasione microbica o al danno tissutale, che porta a lesioni d'organo in un sito distante da quello dell'infezione o del danno. Attualmente, i modelli murini ampiamente utilizzati di sepsi includono endotossiemia indotta da lipopolisaccaride (LPS), legatura e puntura cecale (CLP) e sistemi modello di infezione monobatterica. Questo protocollo descrive un metodo per studiare le risposte dell'ospite durante la peritonite settica indotta da Salmonella Typhimurium nei topi. S. Il typhimurium, un agente patogeno intracellulare Gram-negativo, causa la malattia simile al tifo nei topi.
Questo protocollo elabora la preparazione della coltura, l'induzione della peritonite settica nei topi attraverso l'iniezione intraperitoneale e i metodi per studiare le risposte sistemiche dell'ospite. Inoltre, viene presentata la valutazione della carica batterica in diversi organi e l'analisi citometrica a flusso dell'aumento del numero di neutrofili nel lavaggio peritoneale. Salmonella La sepsi indotta da typhimurium nei topi porta ad un aumento delle citochine proinfiammatorie e alla rapida infiltrazione di neutrofili nella cavità peritoneale, portando a una minore sopravvivenza.
Ogni fase di questo protocollo è stata ottimizzata, con conseguente elevata riproducibilità della patogenesi della peritonite settica. Questo modello è utile per studiare le risposte immunologiche durante la sepsi batterica, i ruoli dei diversi geni nella progressione della malattia e gli effetti dei farmaci per attenuare la sepsi.
Introduction
La sepsi è definita come una risposta infiammatoria e immunitaria sistemica disregolata all'invasione microbica o al danno tissutale, che porta a lesioni d'organo distanti dal sito di infezione o danno. Lo shock settico è un sottogruppo di sepsi caratterizzata da ipotensione persistente durante la rianimazione di volume, con un rischio sostanzialmente aumentato di mortalità1. Il pubblico in generale è diventato più consapevole di questo disturbo durante la pandemia di COVID-19. Nonostante la sua elevata mortalità associata, mancano dati epidemiologici completi sul carico globale della sepsi a causa della complessità della sua diagnosi. Nel 2017, ci sono stati 48,9 milioni di incidenze di sepsi e 11 milioni di morti in tutto il mondo, pari al 19,7% di tutti i decessi globali2. Inoltre, uno studio sulla prevalenza estesa dell'infezione e della sepsi correlata nei pazienti delle unità di terapia intensiva ha rilevato che il 62% degli isolati positivi dei pazienti erano organismi Gram-negativi3.
Inizialmente, le indagini sulla sepsi si sono concentrate sulla delineazione della patogenesi microbica. Tuttavia, la comprensione dell'"ipotesi del pericolo", che determina il modo in cui l'ospite distingue se stesso e non sé, ha portato all'inclinazione dell'equilibrio della ricerca sulla sepsi verso la comprensione della risposta dell'ospite a un agente patogeno invasore. I modelli di sepsi murina ampiamente utilizzati includono il modello di endotossiemia indotta da lipopolisaccaride (LPS), modelli di sepsi polimicrobica, legatura cecale e puntura (CLP) e peritonite dello stent ascendente del colon (CASP) e modelli di infezione monobatterica4.
Abbiamo standardizzato un sistema di modelli murini inducendo la sepsi peritoneale utilizzando Salmonella Typhimurium. Questo modello è vantaggioso rispetto ad altri perché Salmonella Typhimurium è un patogeno intracellulare che imita la condizione clinicamente rilevante della sepsi Gram-negativa. L'esito della sepsi da peritonite in questo modello è sistemico, con una mortalità del 100% entro 96 ore dall'infezione. Pertanto, questo modello è strumentale nello studio delle risposte infiammatorie e letali dell'ospite. In questo modello, la sepsi è indotta dall'iniezione intraperitoneale di 0,5 milioni di unità formanti colonie (CFU) di Salmonella Typhimurium in un topo C57BL/6 di 8-10 settimane. L'infezione sistemica può essere confermata valutando la carica batterica dell'organo ~ 16 ore dopo l'infezione. Questo articolo dimostra la sepsi da peritonite indotta da Salmonella Typhimurium nei topi, caratterizza le alterazioni risultanti nella composizione delle cellule peritoneali e quantifica la carica batterica in diversi organi.
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Protocol
Tutti gli esperimenti con Salmonella Typhimurium sono stati condotti in strutture di livello di sicurezza biologica 2 (BSL-2). È necessario prestare attenzione all'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), garantire la sicurezza e seguire i metodi standard di smaltimento a rischio biologico BSL-2. Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti seguendo le linee guida stabilite dal Comitato etico animale istituzionale, IISc. I topi sono stati allevati e mantenuti presso la Central Animal Facility di IISc (numero di registrazione: 48/1999 / CPCSEA, datato 1/3/1999), approvato dal Ministero dell'Ambiente e delle Foreste, Governo dell'India. I protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato per lo scopo e il controllo e la supervisione degli esperimenti sugli animali con il numero di autorizzazione approvato CAF/Ethics/797/2020.
Definizione BSL2: una classificazione BSL2 rappresenta che gli agenti biopericolosi rappresentano una minaccia moderata per l'ambiente e il personale di laboratorio5.
1. Preparazione della coltura di Salmonella Typhimurium
- Aggiungere 100 μL di Salmonella Typhimurium NCTC 12023 glicerolo a 3 mL di brodo Luria Bertani (LB). Incubare la coltura a 160 giri/min a 37 °C durante la notte.
- Strisciare 50 μL della coltura coltivata durante la notte in brodo LB su una piastra di agar Salmonella Shigella (SS) e incubare a 37 °C per ~ 12 ore. Conservare la piastra di agar SS con le colonie batteriche a 4 °C per diversi giorni prima dell'esperimento di infezione in vivo .
- Scegli una singola colonia dalla piastra di agar SS striata usando un microtip. Espellere il microtipo in 3 mL di brodo LB e coltivare a 160 giri/min a 37 °C durante la notte.
- Aggiungere 0,1 mL di coltura batterica a 50 mL di brodo LB e incubare a 37 °C in un incubatore shaker a 160 rpm per 3-4 h per raggiungere la fase logaritmica di crescita. Diluire la coltura di un fattore 2 usando il brodo LB.
NOTA: Durante la fase logaritmica, le cellule batteriche sono al loro meglio e si dividono attivamente. - Misurare la densità ottica (OD) della coltura a 600 nm di lunghezza d'onda della luce in uno spettrofotometro o in un lettore di micropiastre. Una volta che l'OD raggiunge 1,0, fare due aliquote di 1 mL di coltura in tubi di microfuga da 1,5 mL.
- Centrifugare i tubi a 7.750 × g per 15 min. Scartare il surnatante e lavare il pellet con 1 mL di 1x PBS 2x. Centrifugare i tubi a 7.750 × g per 15 min.
- Risospesciare il pellet in 0,5 mL di 1x PBS in due diversi tubi microfuga da 1,5 mL. Combinare le sospensioni di entrambi i tubi in un tubo da 1,5 mL ora contenente ~ 2 × 108 unità formanti colonie (CFU) / mL.
- Preparare una sospensione cellulare batterica di 1 × 106 CFU/mL diluendo questa soluzione madre.
ATTENZIONE: Ottimizzare il CFU corrispondente a OD in specifiche condizioni di laboratorio per determinare il CFU per OD 1.0 prima di iniziare gli esperimenti.
2. Topi e infezioni
- Casa topi maschi C57BL / 6 di 8-10 settimane del peso di ~ 20 g nella stanza dell'aria pulita della struttura per animali per diversi giorni per l'acclimatazione.
- Il giorno dell'infezione, tenere il mouse con una mano, pulire la pelle addominale con etanolo al 70% e diffondere le zampe posteriori per una migliore accessibilità della parete addominale.
- Iniettare 0,5 mL di 1 × 106 CFU/mL sospensione batterica per via intraperitoneale con l'aiuto di una siringa da 1 mL. Pertanto, ogni mouse riceve 5 × 105 CFU. Controllo, i topi non infetti ricevono 0,5 ml di PBS da solo. Dopo l'infezione, placcare la coltura per controllare l'effettivo CFU iniettato, che può variare da 0,2-0,8 milioni di CFU / 0,5 ml.
- Rimetti i topi nelle gabbie come assegnato.
- Sacrificare i topi usando l'asfissia co2 ~ 12-18 ore dopo l'infezione per la migliore risposta. Di solito, tutti i topi infetti muoiono entro 96 ore. Sotto alcuni interventi sperimentali, alcuni topi possono sopravvivere. Eutanasia di questi topi dopo 96 h. Inoltre, l'eutanasia di qualsiasi topo con una temperatura corporea inferiore a 33,2 °C e angoscia acuta a 96 ore come endpoint umano.
NOTA: In questo modello, alcuni topi possono iniziare a morire dopo 12 ore di iniezione di Salmonella . Pertanto, pianificare correttamente gli esperimenti che coinvolgono più punti temporali.
3. Valutazione degli organi dei CFU
- Sacrifica il topo infetto per asfissia di CO2 e pulisci l'addome con un pezzo di cotone immerso nel 70% di etanolo. Tagliare la pelle addominale. Fare riferimento all'articolo di Ray e Dittel per un protocollo video su come raccogliere il liquido di lavaggio peritoneale6. Tagliare la cavità peritoneale e raccogliere gli organi di interesse in tubi di microfuga. Inoltre, poiché il sangue nei topi con sepsi si coagula velocemente e le quantità sono basse, raccoglierlo rapidamente dopo il sacrificio.
NOTA: Questo video mostra l'enumerazione dei CFU d'organo dal fegato mentre il fegato subisce un ampio danno istopatologico in questo modello di sepsi. - Tagliare un piccolo pezzo di fegato e metterlo in un tubo di microfuga.
NOTA: Questo può essere conservato su ghiaccio per un massimo di 2-3 ore prima di procedere al passaggio successivo. - Pesare e trasferire i pezzi in tubi microcentrifuga. Preferibilmente, tagliare pezzi del peso di ~ 10-15 mg per una corretta omogeneizzazione. Utilizzare interi organi nel caso di quelli più piccoli come i linfonodi mesenterici (MLN) o timo.
- Aggiungere 0,5 ml di 1x PBS al tubo e omogeneizzare gli organi usando un omogeneizzatore a mano. Assicurarsi che gli organi siano completamente omogeneizzati. Aumentare il volume a 1 mL aggiungendo 0,5 mL di 1x PBS.
- Centrifugare i tubi a 200 × g per 5 min a 4 °C.
- Raccogliere il surnatante in provette di microfuga fresche e preparare diluizioni di 1 × 10−1 e 10−2 in una piastra a 96 pozzetti.
- Distribuire 50 μL del diluente su piastre di agar SS fresche e incubare le piastre a 37 °C per 12 ore.
- Contare il numero di colonie che appaiono in ogni condizione e normalizzare i dati con il peso dell'organo usando l'equazione (1):
CFU/mg =
(1)
NOTA: Il numero 20 viene utilizzato nella formula per convertire le colonie per piastra in CFU/mL. Questo numero si ottiene dividendo 1 mL per la quantità di un dato volume della coltura placcata, in questo caso 50 μL.
Ad esempio, se si trovano 100 colonie in una piastra di agar SS, dove vengono diffusi 50 μL di una diluizione di 1 × 10-1 di un organo omogeneizzato del peso di 10 mg, allora
CFU/mg =
(1)
4. Analisi citometrica a flusso di varie popolazioni di cellule immunitarie nell'essudato peritoneale
- Raccogliere le cellule peritoneali come descritto in precedenza da Ray e Dittel6.
- Risospesso il pellet cellulare dal liquido di lavaggio peritoneale in 1 mL di RPMI integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS). Enumerare i numeri totali delle cellule nel lavaggio peritoneale usando un emocitometro. Regolare il numero di cella in modo che ogni tubo riceva 0,2-0,5 milioni di celle.
NOTA: Il lavaggio peritoneale nei topi con sepsi può contenere globuli rossi, che probabilmente compaiono a causa di emorragia. Fare attenzione a escludere i globuli rossi durante il conteggio delle cellule peritoneali. Nel microscopio a campo luminoso, i globuli rossi appaiono molto più piccoli delle cellule immunitarie. Questi appaiono come dischi piatti o ciambelle, rotondi, con una rientranza al centro, ma non vuoti. È possibile aggiungere un passaggio per lisare i globuli rossi7. - Far girare le cellule a 200 × g a 4 °C per 10 minuti, scartare il surnatante e lavare le cellule 1x con 1x PBS freddo. Centrifugare le celle a 200 × g a 4 °C per 10 min.
- Bloccare i recettori Fc sui PEC utilizzando il bloccante FcR (diluizione 1:400), preparato in tampone di blocco costituito da 5% FBS e 0,02% di azide di sodio in PBS. Incubare su ghiaccio per 15 min.
- Centrifugare le celle a 200 × g a 4 °C per 10 min. Scartare il surnatante. Diluire gli anticorpi coniugati al fluorocromo di interesse nel tampone bloccante. Utilizzare una diluizione 1:500 di anti-topo LY6G per macchiare i neutrofili.
NOTA: Altre popolazioni di cellule immunitarie possono anche essere rilevate utilizzando, ad esempio, anti-topo B220 per le cellule B, anti-topo CD3 per le cellule T e anti-topo F4/80 per i macrofagi. - Incubare ~ 0,2 milioni di cellule in 200 μL delle soluzioni diluite di anticorpi in tubi separati. Come controllo negativo, mettere da parte un tubo in ogni tipo di fluorocromo per il controllo non macchiato per incubare le cellule con 200 μL di tampone bloccante senza anticorpi.
- Incubare i campioni sul ghiaccio per 45 minuti con un tocco intermittente ogni 15 minuti.
- Centrifugare le celle a 200 × g per 10 min a 4 °C. Scartare il surnatante. Fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide per ~ 15 minuti a temperatura ambiente se devono essere conservate per diversi giorni. Tuttavia, è meglio acquisire dati da campioni appena macchiati in un citometro a flusso.
- Risospesere le cellule in 200 μL di tampone di colorazione FACS (2% FBS in PBS). Acquisire i dati in un citometro a flusso.
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Representative Results
Una caratterizzazione dettagliata della risposta immunitaria dell'ospite utilizzando questo particolare modello è mostrata nelle precedenti pubblicazioni 8,9. In questa sezione sono riportati alcuni risultati rappresentativi del protocollo descritto. Questo modello mira a indurre l'infezione sistemica di S. Typhimurium mediante iniezione intraperitoneale della coltura batterica per indurre la sepsi. Per confermare l'infezione, i lisati del fegato e della milza dei topi settici sono stati diffusi su piastre di agar SS e il numero di colonie è stato contato. Nella Figura 1, le immagini delle placche di agar SS indicano il carico di CFU d'organo nel fegato e nella milza dei topi settici. I lisati d'organo omogeneizzati sono stati diffusi a una diluizione di 1 × 10-1 e incubati a 37 °C. Il nero pigmentato S. Le colonie di Typhimurium sono apparse dopo ~ 12 ore di incubazione a 37 ° C. Inoltre, in caso di infezione dei topi, le colture da sangue e lavaggio peritoneale sono segnalate come positive per le cellule batteriche8. Questi risultati hanno indicato che le cellule batteriche iniettate per via intraperitoneale si sono disseminate sistemicamente e hanno colonizzato gli organi interni. Una parte della piastra è mostrata come un inserto ingrandito per evidenziare le colonie. L'agente patogeno ha disseminato con successo sistemicamente e colonizzato gli organi interni.
La Figura 2 mostra i sieri isolati da topi sani e settici. Il volume di sangue raccoglibile attraverso la puntura cardiaca da topi settici è di solito 100-200 μL, che è inferiore alla quantità di topi sani, dove si possono ottenere ~ 500 μL di sangue. Di conseguenza, il volume sierico isolato dal sangue settico del topo è basso. Questo fenomeno si verifica a causa dell'aumento della coagulazione del sangue nei topi settici. Inoltre, i sieri dei topi settici mostrano una netta colorazione rossa, indicando il verificarsi di un'emolisi estesa 8,9.
Come mostrato nella Figura 3, è stata eseguita l'immunofenotipizzazione basata sulla citometria a flusso delle cellule dell'essudato peritoneale per valutare l'infiltrazione di neutrofili nella cavità peritoneale di topi sani e settici. Poiché i neutrofili esprimono la proteina LY6G sulla superficie cellulare, l'anticorpo anti-LY6G marcato con FITC è stato utilizzato per macchiare la popolazione di cellule neutrofile. Queste immagini rappresentano i dati di un topo sano e due infetti. Dopo l'acquisizione dei dati, le celle sono state chiuse per includere solo singoletti in un grafico FSC-A contro SSC-A. Quindi, sono stati disegnati i grafici dell'istogramma e il dot-plot. Qui, i topi settici hanno mostrato una maggiore infiltrazione di neutrofili nella cavità peritoneale.
Figura 1: Visualizzazione del CFU dell'organo post infezione. Gli organi sono stati omogeneizzati come descritto nel protocollo. Il lisato veniva sparso su piastre di agar delle SS usando uno spargitore. Le immagini di piastre si diffondono con una diluizione 1 × 10-1 di lisati omogeneizzati di fegato (A) e (B) milza. Una parte della piastra è mostrata come un inserto ingrandito per evidenziare le colonie. Ingrandimento dell'inserto = 13x (area). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Emolisi potenziata nei topi settici. Il sangue è stato raccolto in tubi di microcentrifuga e lasciato indisturbato a temperatura ambiente per 30 minuti. Il coagulo è stato rimosso centrifugando i tubi a 2.000 × g per 10 minuti in una centrifuga refrigerata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Profilo citometrico a flusso della popolazione di neutrofili nel liquido di lavaggio peritoneale. Il liquido di lavaggio peritoneale è stato raccolto 16 ore dopo l'infezione. Le cellule peritoneali sono state colorate con anticorpo anti-LY6G marcato con FITC. I topi settici hanno mostrato una maggiore infiltrazione di neutrofili nella cavità peritoneale. Abbreviazioni: FITC = isotiocianato di fluoresceina; LY6G = antigene linfocitario 6 locus complesso G6D; SSC-A = area di dispersione laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo articolo descrive un metodo per indurre una forma grave di sepsi batterica mediante iniezione intraperitoneale di Salmonella Typhimurium. Questo modello è vantaggioso rispetto ad altri in quanto la Salmonella Typhimurium è un patogeno intracellulare e, quindi, altamente patogeno, imitando la condizione clinicamente rilevante della sepsi Gram-negativa. L'esito della sepsi da peritonite in questo modello è sistemico, con una mortalità del 100% entro 96 ore dall'infezione. Pertanto, questo modello è strumentale nello studio delle risposte infiammatorie e letali dell'ospite8 e degli effetti dell'intervento terapeutico nell'attenuazione della sepsi.
In questo sistema modello, la composizione cellulare della cavità peritoneale cambia drasticamente per combattere l'agente patogeno inoculato. Un gran numero di neutrofili LY6G+ si infiltra nella cavità peritoneale, con una diminuzione simultanea dei macrofagi F4/80+, con conseguente reazione di scomparsa dei macrofagi (MDR)8,10. Pertanto, questo modello è utile per studiare i cambiamenti cinetici nelle composizioni e nelle funzioni delle cellule immunitarie durante la sepsi, che è ancora un'area ampiamente inesplorata. Salmonella Il typhimurium infetta sistematicamente, risiede e prolifera negli organi dei topi. Anche le citochine proinfiammatorie sieriche come TNF-α, IL-6 e IFN-γ aumentaredi 8. Una cascata di risposte proinfiammatorie porta anche all'emolisi e alla coagulazione del sangue, che diventa visibile dopo la dissezione dei topi infetti10,11. L'interazione tra la risposta dell'ospite a questa carica batterica e gli effetti dannosi dei batteri porta all'architettura tissutale sfigurata, alla perdita di funzioni e alla necrosi tissutale, specialmente nel fegato.
Inoltre, precedenti rapporti del laboratorio hanno dimostrato che tali effetti sono modulati dall'espressione sovraregolata dell'ossido nitrico sintasi 2 (NOS2), che porta ad un aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) e livelli più elevati di citochine proinfiammatorie, portando ad una maggiore risposta infiammatoria8. Questo modello di sepsi murina è vantaggioso rispetto ad altri perché l'induzione della sepsi è più veloce con effetti più letali. Non richiede competenze tecniche per eseguire l'intervento chirurgico su topi anestetizzati, come nel caso dell'attuale modello di topo CLP-sepsi gold standard. Nel modello CLP-sepsi, solo un sottogruppo di topi sviluppa sepsi, mentre tutti i topi sviluppano sepsi nel modello descritto qui.
Inoltre, rispetto al modello di sepsi da endotossiemia indotta da LPS, questo modello è clinicamente più rilevante per la sepsi monobatterica Gram-negativa. Il modello è anche utile per comprendere gli aumenti dei ROS intracellulari, dei livelli di citochine proinfiammatorie, dell'emolisi e della coagulazione del sangue, che si verificano tutti durante la sepsi. È stato riferito che l'uso del farmaco donatore di ossido nitrico DETA-NONOate fornisce un beneficio di sopravvivenza nei topi knockout Nos2 con sepsi utilizzando questo modello8. Ciò suggerisce che questo modello può essere utilizzato per identificare nuovi farmaci per il trattamento della sepsi. Inoltre, questo modello può essere rapidamente adottato da qualsiasi laboratorio dotato di strutture BSL-2.
Durante l'utilizzo di questo modello, è necessario prendere precauzioni a livello di salute delle cellule batteriche e del numero CFU per ottenere risultati ottimali. Si dovrebbero sempre usare colonie di Salmonella appena striate da piastre di agar SS. Si raccomanda inoltre di ottimizzare il processo di preparazione della coltura trovando il valore OD nello spettrofotometro corrispondente al CFU menzionato.
Lo svantaggio dell'utilizzo di questo modello è che l'effetto della sepsi nei topi è intensamente letale entro 96 ore dall'infezione. Ciò limita lo studio delle risposte immunitarie dell'ospite in punti temporali tardivi. Può essere superato utilizzando un ceppo batterico più attenuato di Salmonella Typhimurium.
Ci sono differenze tra i pazienti umani affetti da sepsi e i modelli di topi che tentano di imitare la sepsi umana. Ad esempio, i pazienti impiegano più tempo a sviluppare la sepsi e vengono sottoposti a interventi e terapie di supporto. Tuttavia, la sepsi nei modelli murini si sviluppa molto più velocemente e gli interventi di supporto non vengono eseguiti4. Tuttavia, ci sono alcune somiglianze tra sepsi negli esseri umani e nei topi, con pazienti con sepsi che mostrano livelli più elevati di citochine proinfiammatorie, coagulazione del sangue ed emolisi in contesti clinici. Tutti questi sono imitati in questo modello murino di sepsi. Pertanto, alcune letture di questo modello sono rilevanti per gli scenari clinici, anche se una correlazione diretta potrebbe non essere consigliabile.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo la Central Animal Facility, IISc per averci fornito topi per la ricerca. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni a DpN dal Dipartimento di Biotecnologia e Scienza e Ingegneria Research Board, Governo dell'India. Il sostegno infrastrutturale del programma DBT-IISc e le sovvenzioni DST-FIST sono ampiamente riconosciuti. Ringraziamo tutti i membri precedenti e attuali del laboratorio DpN per il loro supporto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | - | - | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
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