Caratterizzazione della peritonite settica indotta da Salmonella Typhimurium nei topi
Summary
Questo protocollo descrive l’induzione della sepsi monobatterica Gram-negativa in un sistema di modelli murini. Il modello è utile per studiare le risposte infiammatorie e letali dell’ospite durante la sepsi.
Abstract
La sepsi è una risposta immunitaria dell’ospite disregolata all’invasione microbica o al danno tissutale, che porta a lesioni d’organo in un sito distante da quello dell’infezione o del danno. Attualmente, i modelli murini ampiamente utilizzati di sepsi includono endotossiemia indotta da lipopolisaccaride (LPS), legatura e puntura cecale (CLP) e sistemi modello di infezione monobatterica. Questo protocollo descrive un metodo per studiare le risposte dell’ospite durante la peritonite settica indotta da Salmonella Typhimurium nei topi. S. Il typhimurium, un agente patogeno intracellulare Gram-negativo, causa la malattia simile al tifo nei topi.
Questo protocollo elabora la preparazione della coltura, l’induzione della peritonite settica nei topi attraverso l’iniezione intraperitoneale e i metodi per studiare le risposte sistemiche dell’ospite. Inoltre, viene presentata la valutazione della carica batterica in diversi organi e l’analisi citometrica a flusso dell’aumento del numero di neutrofili nel lavaggio peritoneale. Salmonella La sepsi indotta da typhimurium nei topi porta ad un aumento delle citochine proinfiammatorie e alla rapida infiltrazione di neutrofili nella cavità peritoneale, portando a una minore sopravvivenza.
Ogni fase di questo protocollo è stata ottimizzata, con conseguente elevata riproducibilità della patogenesi della peritonite settica. Questo modello è utile per studiare le risposte immunologiche durante la sepsi batterica, i ruoli dei diversi geni nella progressione della malattia e gli effetti dei farmaci per attenuare la sepsi.
Introduction
La sepsi è definita come una risposta infiammatoria e immunitaria sistemica disregolata all’invasione microbica o al danno tissutale, che porta a lesioni d’organo distanti dal sito di infezione o danno. Lo shock settico è un sottogruppo di sepsi caratterizzata da ipotensione persistente durante la rianimazione di volume, con un rischio sostanzialmente aumentato di mortalità1. Il pubblico in generale è diventato più consapevole di questo disturbo durante la pandemia di COVID-19. Nonostante la sua elevata mortalità associata, mancano dati epidemiologici completi sul carico globale della sepsi a causa della complessità della sua diagnosi. Nel 2017, ci sono stati 48,9 milioni di incidenze di sepsi e 11 milioni di morti in tutto il mondo, pari al 19,7% di tutti i decessi globali2. Inoltre, uno studio sulla prevalenza estesa dell’infezione e della sepsi correlata nei pazienti delle unità di terapia intensiva ha rilevato che il 62% degli isolati positivi dei pazienti erano organismi Gram-negativi3.
Inizialmente, le indagini sulla sepsi si sono concentrate sulla delineazione della patogenesi microbica. Tuttavia, la comprensione dell'”ipotesi del pericolo”, che determina il modo in cui l’ospite distingue se stesso e non sé, ha portato all’inclinazione dell’equilibrio della ricerca sulla sepsi verso la comprensione della risposta dell’ospite a un agente patogeno invasore. I modelli di sepsi murina ampiamente utilizzati includono il modello di endotossiemia indotta da lipopolisaccaride (LPS), modelli di sepsi polimicrobica, legatura cecale e puntura (CLP) e peritonite dello stent ascendente del colon (CASP) e modelli di infezione monobatterica4.
Abbiamo standardizzato un sistema di modelli murini inducendo la sepsi peritoneale utilizzando Salmonella Typhimurium. Questo modello è vantaggioso rispetto ad altri perché Salmonella Typhimurium è un patogeno intracellulare che imita la condizione clinicamente rilevante della sepsi Gram-negativa. L’esito della sepsi da peritonite in questo modello è sistemico, con una mortalità del 100% entro 96 ore dall’infezione. Pertanto, questo modello è strumentale nello studio delle risposte infiammatorie e letali dell’ospite. In questo modello, la sepsi è indotta dall’iniezione intraperitoneale di 0,5 milioni di unità formanti colonie (CFU) di Salmonella Typhimurium in un topo C57BL/6 di 8-10 settimane. L’infezione sistemica può essere confermata valutando la carica batterica dell’organo ~ 16 ore dopo l’infezione. Questo articolo dimostra la sepsi da peritonite indotta da Salmonella Typhimurium nei topi, caratterizza le alterazioni risultanti nella composizione delle cellule peritoneali e quantifica la carica batterica in diversi organi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive un metodo per indurre una forma grave di sepsi batterica mediante iniezione intraperitoneale di Salmonella Typhimurium. Questo modello è vantaggioso rispetto ad altri in quanto la Salmonella Typhimurium è un patogeno intracellulare e, quindi, altamente patogeno, imitando la condizione clinicamente rilevante della sepsi Gram-negativa. L’esito della sepsi da peritonite in questo modello è sistemico, con una mortalità del 100% entro 96 ore dall’infezione. Pertanto, questo model…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Central Animal Facility, IISc per averci fornito topi per la ricerca. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni a DpN dal Dipartimento di Biotecnologia e Scienza e Ingegneria Research Board, Governo dell’India. Il sostegno infrastrutturale del programma DBT-IISc e le sovvenzioni DST-FIST sono ampiamente riconosciuti. Ringraziamo tutti i membri precedenti e attuali del laboratorio DpN per il loro supporto.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
