살모넬라 티피뮤리움-유도된 마우스의 패혈성 복막염의 특징
Summary
이 프로토콜은 마우스 모델 시스템에서 그람 음성 단세균 패혈증의 유도를 기술한다. 상기 모델은 패혈증 동안 염증성 및 치명적인 숙주 반응을 조사하는데 유용하다.
Abstract
패혈증은 미생물 침윤 또는 조직 손상에 대한 조절이 어려운 숙주 면역 반응으로, 감염 또는 손상으로부터 멀리 떨어진 부위에서 장기 손상을 유발한다. 현재, 패혈증의 널리 사용되는 마우스 모델은 리포폴리사카라이드 (LPS)-유도된 내독소혈증, 맹장 결찰 및 천자 (CLP), 및 단세균 감염 모델 시스템을 포함한다. 이 프로토콜은 마우스에서 살모넬라 티피뮤리움 감염-유도된 패혈성 복막염 동안 숙주 반응을 연구하는 방법을 기술한다. S. 그람 음성 세포 내 병원균 인 티피뮤리움은 생쥐에서 장티푸스와 같은 질병을 일으 킵니다.
이 프로토콜은 배양 준비, 복강 내 주사를 통한 마우스의 패혈성 복막염 유도 및 전신 숙주 반응을 연구하는 방법을 정교하게 설명합니다. 또한, 상이한 기관에서의 박테리아 부담의 평가 및 복막 세척에서 증가된 호중구 수의 유세포 분석이 제시된다. 살모넬라 균 마우스에서 티피뮤리움-유도된 패혈증은 전염증성 사이토카인의 증가와 복강 내의 호중구의 빠른 침윤을 유도하여, 생존율을 낮춘다.
이 프로토콜의 모든 단계가 최적화되어 패혈성 복막염의 발병기전을 재현 할 수 있습니다. 이 모델은 세균성 패혈증 동안 면역학적 반응, 질병 진행에서 상이한 유전자의 역할, 및 패혈증을 약화시키는 약물의 효과를 연구하는데 유용하다.
Introduction
패혈증은 미생물 침윤 또는 조직 손상에 대한 조절되지 않는 전신성 염증 및 면역 반응으로 정의되며, 감염 또는 손상 부위로부터 멀리 떨어진 장기 손상을 초래한다. 패혈성 쇼크는 부피 소생술 동안 지속되는 저혈압을 특징으로 하는 패혈증의 하위 집합으로, 사망 위험이 실질적으로 증가한다1. 일반 대중은 COVID-19 전염병 동안이 장애를 더 잘 알게되었습니다. 높은 관련 사망률에도 불구하고, 패혈증의 세계적 부담에 대한 포괄적 인 역학 데이터는 진단의 복잡성 때문에 부족합니다. 2017 년에는 전 세계적으로 48.9 백만 패혈증 발생률과 11 백만 명의 사망자가 있었으며 전 세계 사망자2의 19.7 %를 차지했습니다. 또한, 중환자실 환자에서 감염 및 관련 패혈증의 연장 유병률에 관한 연구에 따르면 환자로부터의 양성 격리물의 62%가 그람 음성 유기체3이었다.
처음에는 패혈증에 대한 조사가 미생물 병인을 묘사하는 데 중점을 두었습니다. 그러나 숙주가 자신과 비 자아를 구별하는 방법을 지시하는 “위험 가설”을 이해하면 침입하는 병원체에 대한 숙주 반응을 이해하는 방향으로 패혈증 연구의 균형이 기울어졌습니다. 패혈증의 널리 사용되는 마우스 모델은 리포폴리사카라이드(LPS)-유도된 내독소혈증 모델, 다미생물 패혈증 모델, 맹장 결찰 및 천자(CLP) 및 결장 상승 스텐트 복막염(CASP), 및 단세균 감염 모델4를 포함한다.
우리는 살모넬라 티피뮤리움을 사용하여 복막 패혈증을 유도하여 마우스 모델 시스템을 표준화했습니다. 이 모델은 살모넬라 티피뮤리움이 그람 음성 패혈증의 임상적으로 관련된 상태를 모방하는 세포 내 병원체이기 때문에 다른 모델보다 유리합니다. 이 모델에서 복막염 패혈증의 결과는 전신적이며, 감염 후 96 시간 이내에 100 % 사망률이 있습니다. 따라서이 모델은 염증 및 치명적인 숙주 반응을 연구하는 데 도움이됩니다. 이 모델에서, 패혈증은 살모넬라 티피뮤리움의 0.5백만 콜로니 형성 단위(CFU)를 8-10주령의 C57BL/6 마우스에 복강내 주입함으로써 유도된다. 전신 감염은 감염 후 ∼16 h 장기 박테리아 부담을 평가함으로써 확인할 수 있다. 이 기사는 마우스에서 살모넬라 티피뮤리움으로 인한 복막염 패혈증을 시연하고, 복막 세포 조성의 결과 변화를 특성화하고, 다른 장기에서 박테리아 부담을 정량화합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 글은 살모넬라 티피뮤리움의 복강내 주사에 의해 심각한 형태의 세균성 패혈증을 유도하는 방법을 설명한다. 이 모델은 살모넬라 티피뮤리움이 세포내 병원체이고, 따라서, 병원성이 높고, 그람 음성 패혈증의 임상적으로 관련된 상태를 모방하기 때문에 다른 모델보다 유리하다. 이 모델에서 복막염 패혈증의 결과는 전신적이며, 감염 후 96 시간 이내에 100 % 사망률이 있습니다. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 연구를 위해 생쥐를 공급해 주신 중앙 동물 시설, IISc에 감사드립니다. 이 연구는 인도 정부의 생명 공학 및 과학 및 공학 연구위원회에서 DpN에 대한 보조금으로 자금을 지원했습니다. DBT-IISc 프로그램 및 DST-FIST 보조금의 인프라 지원은 크게 인정됩니다. DpN 연구소의 이전 및 현재 구성원 모두에게 도움을 주셔서 감사합니다.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
