Caractérisation de la péritonite septique induite par Salmonella Typhimurium chez la souris
Summary
Ce protocole décrit l’induction d’une septicémie monobactérienne à Gram négatif dans un système modèle murin. Le modèle est utile pour étudier les réponses inflammatoires et létales de l’hôte pendant la septicémie.
Abstract
La septicémie est une réponse immunitaire dérégulée de l’hôte à une invasion microbienne ou à des lésions tissulaires, entraînant des lésions organiques à un site éloigné de celui de l’infection ou des dommages. Actuellement, les modèles de septicémie largement utilisés chez la souris comprennent l’endotoxémie induite par les lipopolysaccharides (LPS), la ligature et la ponction cæcales (CLP) et les systèmes modèles d’infection monobactérienne. Ce protocole décrit une méthode pour étudier les réponses de l’hôte au cours de la péritonite septique induite par l’infection à Salmonella Typhimurium chez la souris. S. Le typhimurium, un agent pathogène intracellulaire à Gram négatif, provoque une maladie semblable à la typhoïde chez la souris.
Ce protocole élabore la préparation de la culture, l’induction de la péritonite septique chez la souris par injection intrapéritonéale et les méthodes d’étude des réponses systémiques de l’hôte. En outre, l’évaluation de la charge bactérienne dans différents organes et l’analyse cytométrique en flux de l’augmentation du nombre de neutrophiles dans le lavage péritonéal sont présentées. Salmonelle La septicémie induite par le typhimurium chez la souris entraîne une augmentation des cytokines pro-inflammatoires et une infiltration rapide des neutrophiles dans la cavité péritonéale, entraînant une survie plus faible.
Chaque étape de ce protocole a été optimisée, ce qui a entraîné une reproductibilité élevée de la pathogenèse de la péritonite septique. Ce modèle est utile pour étudier les réponses immunologiques au cours de la septicémie bactérienne, les rôles de différents gènes dans la progression de la maladie et les effets des médicaments pour atténuer la septicémie.
Introduction
La septicémie est définie comme une réponse inflammatoire et immunitaire systémique dérégulée à une invasion microbienne ou à des lésions tissulaires, entraînant une lésion d’organe éloignée du site de l’infection ou des dommages. Le choc septique est un sous-ensemble de septicémie caractérisé par une hypotension persistant pendant la réanimation volumique, avec un risque considérablement accru de mortalité1. Le grand public est devenu plus conscient de ce trouble pendant la pandémie de COVID-19. Malgré la forte mortalité associée, des données épidémiologiques complètes sur le fardeau mondial de la septicémie font défaut en raison de la complexité de son diagnostic. En 2017, il y a eu 48,9 millions d’incidents de septicémie et 11 millions de décès dans le monde, ce qui représente 19,7 % de tous les décès dans le monde2. En outre, une étude sur la prévalence étendue de l’infection et de la septicémie associée chez les patients en unité de soins intensifs a révélé que 62% des isolats positifs des patients étaient des organismes à Gram négatif3.
Initialement, les recherches sur la septicémie se sont concentrées sur la délimitation de la pathogenèse microbienne. Cependant, la compréhension de « l’hypothèse du danger », qui dicte la façon dont l’hôte se distingue de soi et de non-soi, a conduit à faire pencher la balance de la recherche sur la septicémie vers la compréhension de la réponse de l’hôte à un agent pathogène envahissant. Les modèles de septicémie largement utilisés chez la souris comprennent le modèle d’endotoxémie induite par les lipopolysaccharides (LPS), les modèles de septicémie polymicrobienne, la ligature et la ponction cæcales (CLP) et la péritonite de stent ascendante du côlon (CASP) et les modèles d’infection monobactérienne4.
Nous avons normalisé un système de modèle murin en induisant une septicémie péritonéale à l’aide de Salmonella Typhimurium. Ce modèle est avantageux par rapport à d’autres parce que Salmonella Typhimurium est un agent pathogène intracellulaire qui imite l’état cliniquement pertinent de la septicémie à Gram négatif. Le résultat de la septicémie péritonite dans ce modèle est systémique, avec une mortalité de 100% dans les 96 heures suivant l’infection. Par conséquent, ce modèle joue un rôle déterminant dans l’étude des réponses inflammatoires et létales de l’hôte. Dans ce modèle, la septicémie est induite par l’injection intrapéritonéale de 0,5 million d’unités formant des colonies (UFC) de Salmonella Typhimurium dans une souris C57BL/6 âgée de 8 à 10 semaines. L’infection systémique peut être confirmée en évaluant la charge bactérienne des organes ~ 16 h après l’infection. Cet article démontre la septicémie de péritonite induite par Salmonella Typhimurium chez la souris, caractérise les altérations résultantes de la composition cellulaire péritonéale et quantifie la charge bactérienne dans différents organes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit une méthode d’induction d’une forme grave de septicémie bactérienne par injection intrapéritonéale de Salmonella Typhimurium. Ce modèle est avantageux par rapport à d’autres car Salmonella Typhimurium est un agent pathogène intracellulaire et, par conséquent, hautement pathogène, imitant l’état cliniquement pertinent de la septicémie à Gram négatif. Le résultat de la septicémie péritonite dans ce modèle est systémique, avec une mortalité de 100% dans les 9…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l’Installation centrale pour animaux, IISc, de nous avoir fourni des souris pour la recherche. Cette étude a été financée par des subventions au DpN du Department of Biotechnology and Science and Engineering Research Board, gouvernement de l’Inde. Le soutien infrastructurel du programme DBT-IISc et des subventions DST-FIST est grandement reconnu. Nous remercions tous les membres précédents et actuels du laboratoire DpN pour leur soutien.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
