Charakterisierung der Salmonella Typhimurium-induzierten septischen Peritonitis bei Mäusen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Induktion einer gramnegativen monobakteriellen Sepsis in einem Mausmodellsystem. Das Modell ist nützlich bei der Untersuchung der entzündlichen und tödlichen Wirtsreaktionen während der Sepsis.
Abstract
Sepsis ist eine fehlregulierte Immunantwort des Wirts auf mikrobielle Invasion oder Gewebeschäden, die zu Organverletzungen an einer Stelle führt, die von der der Infektion oder des Schadens entfernt ist. Derzeit umfassen die weit verbreiteten Mäusemodelle der Sepsis Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Endotoxämie, cecal ligation and puncture (CLP) und monobakterielle Infektionsmodellsysteme. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung der Wirtsreaktionen während der durch Salmonella Typhimurium-Infektion induzierten septischen Peritonitis bei Mäusen. S. Typhimurium, ein gramnegativer intrazellulärer Erreger, verursacht bei Mäusen eine typhusähnliche Erkrankung.
Dieses Protokoll entwickelt die Kulturvorbereitung, die Induktion einer septischen Peritonitis bei Mäusen durch intraperitoneale Injektion und Methoden zur Untersuchung systemischer Wirtsreaktionen. Weiterhin wird die Beurteilung der Keimbelastung in verschiedenen Organen und die durchflusszytometrische Analyse erhöhter Neutrophilenzahlen in der Peritonealspülung vorgestellt. Salmonelle Typhimurium-induzierte Sepsis bei Mäusen führt zu einem Anstieg der proinflammatorischen Zytokine und einer schnellen Infiltration von Neutrophilen in der Peritonealhöhle, was zu einem geringeren Überleben führt.
Jeder Schritt in diesem Protokoll wurde optimiert, was zu einer hohen Reproduzierbarkeit der Pathogenese der septischen Peritonitis führt. Dieses Modell ist nützlich für die Untersuchung immunologischer Reaktionen während bakterieller Sepsis, der Rolle verschiedener Gene im Krankheitsverlauf und der Auswirkungen von Medikamenten zur Abschwächung der Sepsis.
Introduction
Sepsis ist definiert als eine fehlregulierte systemische Entzündungs- und Immunantwort auf mikrobielle Invasion oder Gewebeschäden, die zu Organverletzungen führen, die weit vom Ort der Infektion oder Schädigung entfernt sind. Der septische Schock ist eine Untergruppe der Sepsis, die durch eine Hypotonie gekennzeichnet ist, die während der Volumenreanimation anhält, mit einem wesentlich erhöhten Mortalitätsrisiko1. Die breite Öffentlichkeit ist sich dieser Störung während der COVID-19-Pandemie bewusster geworden. Trotz der hohen assoziierten Mortalität fehlen aufgrund der Komplexität der Diagnose umfassende epidemiologische Daten zur globalen Belastung durch Sepsis. Im Jahr 2017 gab es weltweit 48,9 Millionen Sepsis-Inzidenzen und 11 Millionen Todesfälle, was 19,7% aller weltweiten Todesfälleentspricht2. Darüber hinaus ergab eine Studie über die erweiterte Prävalenz von Infektionen und damit verbundenen Sepsis bei Patienten auf der Intensivstation, dass 62% der positiven Isolate von Patienten gramnegative Organismenwaren 3.
Zunächst konzentrierten sich die Untersuchungen zur Sepsis auf die Abgrenzung der mikrobiellen Pathogenese. Das Verständnis der “Gefahrenhypothese”, die diktiert, wie der Wirt das Selbst und das Nicht-Selbst unterscheidet, führte jedoch dazu, dass das Gleichgewicht der Sepsisforschung in Richtung Verständnis der Reaktion des Wirts auf einen eindringenden Krankheitserreger kippte. Zu den weit verbreiteten Mäusemodellen der Sepsis gehören das Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Endotoxämiemodell, polymikrobielle Sepsismodelle, cecal ligation and puncture (CLP) und colon ascendens stent peritonitis (CASP) und monobakterielle Infektionsmodelle4.
Wir haben ein Mausmodellsystem standardisiert, indem wir eine Peritoneussepsis mit Salmonella Typhimurium induzieren. Dieses Modell ist vorteilhaft gegenüber anderen, da Salmonella Typhimurium ein intrazellulärer Erreger ist, der den klinisch relevanten Zustand der gramnegativen Sepsis nachahmt. Das Ergebnis der Peritonitis-Sepsis in diesem Modell ist systemisch, mit 100% Mortalität innerhalb von 96 h nach der Infektion. Daher ist dieses Modell maßgeblich an der Untersuchung der entzündlichen und tödlichen Wirtsreaktionen beteiligt. In diesem Modell wird Sepsis induziert, indem intraperitoneal 0,5 Millionen koloniebildende Einheiten (CFU) Salmonella Typhimurium in eine 8-10 Wochen alte C57BL / 6-Maus injiziert werden. Eine systemische Infektion kann durch die Beurteilung der Organbakterienbelastung ~ 16 h nach der Infektion bestätigt werden. Dieser Artikel zeigt die Salmonella Typhimurium-induzierte Peritonitis-Sepsis bei Mäusen, charakterisiert die daraus resultierenden Veränderungen in der peritonealen Zellzusammensetzung und quantifiziert die bakterielle Belastung in verschiedenen Organen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Induktion einer schweren Form der bakteriellen Sepsis durch intraperitoneale Injektion von Salmonella Typhimurium. Dieses Modell ist vorteilhaft gegenüber anderen, da Salmonella Typhimurium ein intrazellulärer Erreger und daher hoch pathogen ist und den klinisch relevanten Zustand der gramnegativen Sepsis nachahmt. Das Ergebnis der Peritonitis-Sepsis in diesem Modell ist systemisch, mit 100% Mortalität innerhalb von 96 h nach der Infektion. Daher ist dieses …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Central Animal Facility, IISc, für die Bereitstellung von Mäusen für die Forschung. Diese Studie wurde durch Zuschüsse an DpN vom Department of Biotechnology and Science and Engineering Research Board der indischen Regierung finanziert. Die infrastrukturelle Unterstützung durch das DBT-IISc-Programm und die DST-FIST-Zuschüsse werden sehr anerkannt. Wir danken allen bisherigen und aktuellen Mitgliedern des DpN-Labors für ihre Unterstützung.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
