אפיון סלמונלה טיפימוריום המושרה על ידי דלקת צפק ספטית בעכברים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של אלח דם מונובקטריאלי גראם שלילי במערכת מודל עכבר. המודל שימושי בחקירת תגובות הפונדקאי הדלקתיות והקטלניות במהלך אלח דם.
Abstract
אלח דם הוא תגובה חיסונית של פונדקאי לא מווסת לפלישה מיקרוביאלית או נזק לרקמות, מה שמוביל לפגיעה באיברים באתר מרוחק מזה של הזיהום או הנזק. נכון לעכשיו, המודלים הנפוצים של עכברים של אלח דם כוללים אנדוטוקסמיה המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS), קשירת צקל וניקוב (CLP) ומערכות מודל לזיהום חד-בקטריאלי. פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקור את תגובות המארח במהלך דלקת הצפק הספיגה הנגרמת על ידי זיהום סלמונלה טיפימוריום בעכברים. ב. טיפימוריום, פתוגן תוך-תאי גראם-שלילי, גורם למחלה דמוית טיפוס בעכברים.
פרוטוקול זה מפרט את הכנת התרבית, אינדוקציה של דלקת צפק ספטית בעכברים באמצעות הזרקה תוך-צפקית, ושיטות לחקר תגובות פונדקאיות סיסטמיות. יתר על כן, מוצגת הערכת נטל החיידקים באיברים שונים והניתוח הציטומטרי של הזרימה של מספרי נויטרופילים מוגברים בשטף הצפק. סלמונלה אלח דם הנגרם על ידי טיפימוריום בעכברים מוביל לעלייה בציטוקינים פרו-דלקתיים ולחדירה מהירה של נויטרופילים בחלל הצפק, מה שמוביל להישרדות נמוכה יותר.
כל שלב בפרוטוקול זה עבר אופטימיזציה, וכתוצאה מכך שכפול גבוה של הפתוגנזה של דלקת הצפק הספיגה. מודל זה שימושי לחקר תגובות אימונולוגיות במהלך אלח דם חיידקי, את התפקידים של גנים שונים בהתקדמות המחלה, ואת ההשפעות של תרופות כדי להחליש אלח דם.
Introduction
אלח דם מוגדר כתגובה דלקתית מערכתית ומערכתית לא מווסתת לפלישה מיקרוביאלית או נזק לרקמות, מה שמוביל לפגיעה באיברים המרוחקים ממקום ההדבקה או הנזק. הלם ספטי הוא תת-קבוצה של אלח דם המאופיינת בלחץ דם הנמשך במהלך החייאה נפחית, עם סיכון מוגבר באופן משמעותי לתמותה1. הציבור הרחב נעשה מודע יותר להפרעה זו במהלך מגיפת COVID-19. למרות התמותה הגבוהה הקשורה אליו, נתונים אפידמיולוגיים מקיפים על הנטל העולמי של אלח דם חסרים בגלל המורכבות של האבחנה שלו. בשנת 2017 היו 48.9 מיליון מקרי מקרים של אלח דם ו-11 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם, המהווים 19.7% מכלל מקרי המוות בעולם2. יתר על כן, מחקר על השכיחות המורחבת של זיהום ואלח דם קשור בחולי יחידות טיפול נמרץ מצא כי 62% מהבודדים החיוביים מהחולים היו אורגניזמים גראם שליליים3.
בתחילה, החקירות על אלח דם התמקדו בתיחום פתוגנזה מיקרוביאלית. עם זאת, הבנת “השערת הסכנה”, המכתיבה כיצד המארח מבחין בין העצמי ללא-עצמי, הובילה להטיית מאזן חקר אלח הדם לעבר הבנת תגובת המארח לפתוגן פולש. המודלים הנפוצים של אלח דם בעכברים כוללים את מודל האנדוטוקסמיה המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS), מודלים של אלח דם פולימיקרוביאלי, קשירת cecal ונקב (CLP) ומודלים של דלקת צפק מסוג stent scendens (CASP) של המעי הגס ומודלים של זיהום חד-בקטריאלי4.
תיקנו מערכת מודל עכבר על ידי גרימת אלח דם פריטוניאלי באמצעות סלמונלה טיפימוריום. מודל זה הוא יתרון על פני אחרים כי סלמונלה Typhimurium הוא פתוגן תוך תאי המחקה את המצב הרלוונטי מבחינה קלינית של אלח דם גראם שלילי. התוצאה של אלח דם של דלקת הצפק במודל זה היא מערכתית, עם 100% תמותה בתוך 96 שעות לאחר ההדבקה. לכן, מודל זה מסייע בחקר תגובות הפונדקאי הדלקתיות והקטלניות. במודל זה, אלח דם מושרה על ידי הזרקה תוך-צפקית של 0.5 מיליון יחידות יוצרות מושבה (CFU) של סלמונלה טיפימוריום לתוך עכבר C57BL/6 בן 8-10 שבועות. זיהום סיסטמי יכול להיות מאושר על ידי הערכת נטל חיידקי איברים ~ 16 שעות לאחר ההדבקה. מאמר זה מדגים אלח דם של דלקת הצפק הנגרמת על ידי סלמונלה טיפימוריום בעכברים, מאפיין את השינויים הנובעים מכך בהרכב תאי הצפק, ומכמת את עומס החיידקים באיברים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה של גרימת צורה חמורה של אלח דם חיידקי על ידי הזרקה תוך צפקית של סלמונלה טיפימוריום. מודל זה הוא יתרון על פני אחרים כמו סלמונלה Typhimurium הוא פתוגן תוך תאי, ולכן, פתוגני מאוד, מחקה את המצב הרלוונטי מבחינה קלינית של אלח דם גראם שלילי. התוצאה של אלח דם של דלקת הצפק במודל זה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למתקן המרכזי לבעלי חיים, IISc על שסיפק לנו עכברים למחקר. מחקר זה מומן על ידי מענקים ל- DpN מהמחלקה לביוטכנולוגיה ומועצת מחקר מדע והנדסה, ממשלת הודו. התמיכה התשתיתית מתוכנית DBT-IISc ומענקי DST-FIST זוכה להכרה רבה. אנו מודים לכל החברים הקודמים והנוכחיים במעבדת DpN על תמיכתם.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
