Karakterisering av Salmonella Typhimurium-indusert septisk peritonitt hos mus
Summary
Denne protokollen beskriver induksjonen av Gram-negativ monobakteriell sepsis i et musemodellsystem. Modellen er nyttig for å undersøke de inflammatoriske og dødelige vertsresponsene under sepsis.
Abstract
Sepsis er en dysregulert vert immunrespons på mikrobiell invasjon eller vevsskade, noe som fører til organskade på et sted fjernt fra infeksjonen eller skaden. For tiden inkluderer de mye brukte musmodellene av sepsis lipopolysakkarid (LPS)-indusert endotoksemi, cecal ligation og punktering (CLP) og monobakterielle infeksjonsmodellsystemer. Denne protokollen beskriver en metode for å studere vertsresponsene under Salmonella Typhimurium infeksjonsindusert septisk peritonitt hos mus. S. Typhimurium, et Gram-negativt intracellulært patogen, forårsaker tyfuslignende sykdom hos mus.
Denne protokollen utdyper kulturforberedelsen, induksjon av septisk peritonitt hos mus gjennom intraperitoneal injeksjon, og metoder for å studere systemiske vertsresponser. Videre presenteres vurderingen av bakteriell byrde i forskjellige organer og strømningscytometrisk analyse av økte nøytrofiltall i bukskytonal lavage. Salmonella Typhimurium-indusert sepsis hos mus fører til en økning i proinflammatoriske cytokiner og rask infiltrasjon av nøytrofiler i bukhulen, noe som fører til lavere overlevelse.
Hvert trinn i denne protokollen er optimalisert, noe som resulterer i høy reproduserbarhet av patogenesen av septisk peritonitt. Denne modellen er nyttig for å studere immunologiske responser under bakteriell sepsis, rollene til forskjellige gener i sykdomsprogresjon, og effekten av legemidler for å dempe sepsis.
Introduction
Sepsis er definert som en dysregulert systemisk inflammatorisk og immunrespons på mikrobiell invasjon eller vevsskade, noe som fører til organskade fjernt fra infeksjonsstedet eller skaden. Septisk sjokk er en undergruppe av sepsis preget av hypotensjon som vedvarer under volumredning, med en betydelig økt risiko for dødelighet1. Allmennheten har blitt mer oppmerksom på denne lidelsen under COVID-19-pandemien. Til tross for sin høye assosierte dødelighet mangler omfattende epidemiologiske data om den globale byrden av sepsis på grunn av kompleksiteten i diagnosen. I 2017 var det 48,9 millioner sepsisforekomster og 11 millioner dødsfall over hele verden, noe som utgjorde 19,7% av alle globale dødsfall2. Videre fant en studie om utvidet forekomst av infeksjon og relatert sepsis hos intensivpasienter at 62% av de positive isolasjonene fra pasienter var Gram-negative organismer3.
I utgangspunktet fokuserte undersøkelsene på sepsis på avgrensing av mikrobiell patogenese. Men å forstå “farehypotesen”, som dikterer hvordan verten skiller seg selv og ikke-selv, førte til tilting av balansen mellom sepsisforskning mot å forstå vertsresponsen på et invaderende patogen. De mye brukte musene modeller av sepsis inkluderer lipopolysakkarid (LPS)-indusert endotoksemi modell, polymikrobielle sepsis modeller, cecal ligation og punktering (CLP) og kolon ascendens stent peritonitt (CASP), og monobakterielle infeksjonsmodeller4.
Vi har standardisert et musemodellsystem ved å indusere peritoneal sepsis ved hjelp av Salmonella Typhimurium. Denne modellen er fordelaktig over andre fordi Salmonella Typhimurium er et intracellulært patogen som etterligner den klinisk relevante tilstanden til Gram-negativ sepsis. Utfallet av peritonitt sepsis i denne modellen er systemisk, med 100% dødelighet innen 96 timer etter infeksjon. Derfor er denne modellen medvirkende til å studere de inflammatoriske og dødelige vertsresponsene. I denne modellen induseres sepsis ved intraperitoneally injisering av 0,5 millioner kolonidannende enheter (CFU) av Salmonella Typhimurium i en 8-10 uker gammel C57BL / 6 mus. Systemisk infeksjon kan bekreftes ved å vurdere organbakteriell byrde ~ 16 timer etter infeksjon. Denne artikkelen demonstrerer Salmonella Typhimurium-indusert peritonitt sepsis hos mus, karakteriserer de resulterende endringene i peritoneal cellesammensetning, og kvantifiserer bakteriell byrde i forskjellige organer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen beskriver en metode for å indusere en alvorlig form for bakteriell sepsis ved intraperitoneal injeksjon av Salmonella Typhimurium. Denne modellen er fordelaktig over andre da Salmonella Typhimurium er et intracellulært patogen og dermed svært patogen, etterligner den klinisk relevante tilstanden til Gram-negativ sepsis. Utfallet av peritonitt sepsis i denne modellen er systemisk, med 100% dødelighet innen 96 timer etter infeksjon. Derfor er denne modellen medvirkende til å studere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Central Animal Facility, IISc for å forsyne oss med mus for forskning. Denne studien ble finansiert av tilskudd til DpN fra Institutt for bioteknologi og vitenskaps- og ingeniørforskning, Regjeringen i India. Den infrastrukturelle støtten fra DBT-IISc-programmet og DST-FIST-tilskudd er sterkt anerkjent. Vi takker alle tidligere og nåværende medlemmer av DpN-laboratoriet for deres støtte.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
