Karakterisering af Salmonella Typhimurium-induceret septisk peritonitis hos mus
Summary
Denne protokol beskriver induktion af gramnegativ monobakterie sepsis i et musemodelsystem. Modellen er nyttig til at undersøge de inflammatoriske og dødelige værtsresponser under sepsis.
Abstract
Sepsis er et dysreguleret værtsimmunrespons på mikrobiel invasion eller vævsskade, hvilket fører til organskade på et sted fjernt fra infektionen eller skaden. I øjeblikket omfatter de meget anvendte musemodeller af sepsis lipopolysaccharid (LPS)-induceret endotoxæmi, cecal ligation og punktering (CLP) og monobakterielle infektionsmodelsystemer. Denne protokol beskriver en metode til at studere værtsresponserne under Salmonella Typhimurium-infektionsinduceret septisk peritonitis hos mus. S. Typhimurium, et gramnegativt intracellulært patogen, forårsager tyfuslignende sygdom hos mus.
Denne protokol uddyber kulturpræparatet, induktion af septisk peritonitis hos mus gennem intraperitoneal injektion og metoder til undersøgelse af systemiske værtsresponser. Desuden præsenteres vurderingen af bakteriebyrden i forskellige organer og den flowcytometriske analyse af øgede neutrofiltal i peritonealskylning. Salmonella Typhimurium-induceret sepsis hos mus fører til en stigning i proinflammatoriske cytokiner og hurtig infiltration af neutrofiler i bughulen, hvilket fører til lavere overlevelse.
Hvert trin i denne protokol er blevet optimeret, hvilket resulterer i høj reproducerbarhed af patogenesen af septisk peritonitis. Denne model er nyttig til at studere immunologiske reaktioner under bakteriel sepsis, forskellige geners roller i sygdomsprogression og virkningerne af lægemidler til at dæmpe sepsis.
Introduction
Sepsis defineres som et dysreguleret systemisk inflammatorisk og immunrespons på mikrobiel invasion eller vævsskade, hvilket fører til organskade fjernt fra infektionsstedet eller skaden. Septisk shock er en delmængde af sepsis karakteriseret ved hypotension, der vedvarer under volumen genoplivning, med en væsentligt øget risiko for dødelighed1. Den brede offentlighed er blevet mere opmærksom på denne lidelse under COVID-19-pandemien. På trods af den høje tilknyttede dødelighed mangler der omfattende epidemiologiske data om den globale byrde af sepsis på grund af diagnosens kompleksitet. I 2017 var der 48,9 millioner sepsisforekomst og 11 millioner dødsfald på verdensplan, hvilket tegner sig for 19,7% af alle globale dødsfald2. Endvidere viste en undersøgelse af den udvidede forekomst af infektion og relateret sepsis hos patienter på intensivafdelinger, at 62 % af de positive isolater fra patienter var gramnegative organismer3.
Indledningsvis fokuserede undersøgelserne på sepsis på at afgrænse mikrobiel patogenese. Forståelsen af “farehypotesen”, som dikterer, hvordan værten skelner mellem sig selv og ikke-selv, førte imidlertid til hældningen af balancen i sepsisforskning mod at forstå værtsresponsen på et invaderende patogen. De meget anvendte musemodeller af sepsis omfatter lipopolysaccharid (LPS)-induceret endotoxæmimodel, polymikrobielle sepsismodeller, cecal ligation og punktering (CLP) og tyktarmsopstandere stent peritonitis (CASP) og monobakterielle infektionsmodeller4.
Vi har standardiseret et musemodelsystem ved at inducere peritoneal sepsis ved hjælp af Salmonella Typhimurium. Denne model er fordelagtig i forhold til andre, fordi Salmonella Typhimurium er et intracellulært patogen, der efterligner den klinisk relevante tilstand af gramnegativ sepsis. Resultatet af peritonitis sepsis i denne model er systemisk, med 100% dødelighed inden for 96 timer efter infektion. Derfor er denne model medvirkende til at studere de inflammatoriske og dødelige værtsresponser. I denne model induceres sepsis ved intraperitonealt injektion af 0,5 millioner kolonidannende enheder (CFU) af Salmonella Typhimurium i en 8-10 uger gammel C57BL/6 mus. Systemisk infektion kan bekræftes ved at vurdere organbakteriebyrde ~ 16 timer efter infektion. Denne artikel demonstrerer Salmonella Typhimurium-induceret peritonitis sepsis hos mus, karakteriserer de resulterende ændringer i peritonealcellesammensætning og kvantificerer bakteriebyrden i forskellige organer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikel beskriver en metode til at inducere en alvorlig form for bakteriel sepsis ved intraperitoneal injektion af Salmonella Typhimurium. Denne model er fordelagtig i forhold til andre, da Salmonella Typhimurium er et intracellulært patogent og dermed højpatogent, der efterligner den klinisk relevante tilstand af gramnegativ sepsis. Resultatet af peritonitis sepsis i denne model er systemisk, med 100% dødelighed inden for 96 timer efter infektion. Derfor er denne model medvirkende til at stude…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Central Animal Facility, IISc for at forsyne os med mus til forskning. Denne undersøgelse blev finansieret af tilskud til DpN fra Institut for Bioteknologi og Videnskab og Ingeniørforskning, Indiens regering. Den infrastrukturelle støtte fra DBT-IISc-programmet og DST-FIST-tilskud anerkendes i høj grad. Vi takker alle tidligere og nuværende medlemmer af DpN-laboratoriet for deres støtte.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
