Summary
Denne protokol beskriver induktion af gramnegativ monobakterie sepsis i et musemodelsystem. Modellen er nyttig til at undersøge de inflammatoriske og dødelige værtsresponser under sepsis.
Abstract
Sepsis er et dysreguleret værtsimmunrespons på mikrobiel invasion eller vævsskade, hvilket fører til organskade på et sted fjernt fra infektionen eller skaden. I øjeblikket omfatter de meget anvendte musemodeller af sepsis lipopolysaccharid (LPS)-induceret endotoxæmi, cecal ligation og punktering (CLP) og monobakterielle infektionsmodelsystemer. Denne protokol beskriver en metode til at studere værtsresponserne under Salmonella Typhimurium-infektionsinduceret septisk peritonitis hos mus. S. Typhimurium, et gramnegativt intracellulært patogen, forårsager tyfuslignende sygdom hos mus.
Denne protokol uddyber kulturpræparatet, induktion af septisk peritonitis hos mus gennem intraperitoneal injektion og metoder til undersøgelse af systemiske værtsresponser. Desuden præsenteres vurderingen af bakteriebyrden i forskellige organer og den flowcytometriske analyse af øgede neutrofiltal i peritonealskylning. Salmonella Typhimurium-induceret sepsis hos mus fører til en stigning i proinflammatoriske cytokiner og hurtig infiltration af neutrofiler i bughulen, hvilket fører til lavere overlevelse.
Hvert trin i denne protokol er blevet optimeret, hvilket resulterer i høj reproducerbarhed af patogenesen af septisk peritonitis. Denne model er nyttig til at studere immunologiske reaktioner under bakteriel sepsis, forskellige geners roller i sygdomsprogression og virkningerne af lægemidler til at dæmpe sepsis.
Introduction
Sepsis defineres som et dysreguleret systemisk inflammatorisk og immunrespons på mikrobiel invasion eller vævsskade, hvilket fører til organskade fjernt fra infektionsstedet eller skaden. Septisk shock er en delmængde af sepsis karakteriseret ved hypotension, der vedvarer under volumen genoplivning, med en væsentligt øget risiko for dødelighed1. Den brede offentlighed er blevet mere opmærksom på denne lidelse under COVID-19-pandemien. På trods af den høje tilknyttede dødelighed mangler der omfattende epidemiologiske data om den globale byrde af sepsis på grund af diagnosens kompleksitet. I 2017 var der 48,9 millioner sepsisforekomst og 11 millioner dødsfald på verdensplan, hvilket tegner sig for 19,7% af alle globale dødsfald2. Endvidere viste en undersøgelse af den udvidede forekomst af infektion og relateret sepsis hos patienter på intensivafdelinger, at 62 % af de positive isolater fra patienter var gramnegative organismer3.
Indledningsvis fokuserede undersøgelserne på sepsis på at afgrænse mikrobiel patogenese. Forståelsen af "farehypotesen", som dikterer, hvordan værten skelner mellem sig selv og ikke-selv, førte imidlertid til hældningen af balancen i sepsisforskning mod at forstå værtsresponsen på et invaderende patogen. De meget anvendte musemodeller af sepsis omfatter lipopolysaccharid (LPS)-induceret endotoxæmimodel, polymikrobielle sepsismodeller, cecal ligation og punktering (CLP) og tyktarmsopstandere stent peritonitis (CASP) og monobakterielle infektionsmodeller4.
Vi har standardiseret et musemodelsystem ved at inducere peritoneal sepsis ved hjælp af Salmonella Typhimurium. Denne model er fordelagtig i forhold til andre, fordi Salmonella Typhimurium er et intracellulært patogen, der efterligner den klinisk relevante tilstand af gramnegativ sepsis. Resultatet af peritonitis sepsis i denne model er systemisk, med 100% dødelighed inden for 96 timer efter infektion. Derfor er denne model medvirkende til at studere de inflammatoriske og dødelige værtsresponser. I denne model induceres sepsis ved intraperitonealt injektion af 0,5 millioner kolonidannende enheder (CFU) af Salmonella Typhimurium i en 8-10 uger gammel C57BL/6 mus. Systemisk infektion kan bekræftes ved at vurdere organbakteriebyrde ~ 16 timer efter infektion. Denne artikel demonstrerer Salmonella Typhimurium-induceret peritonitis sepsis hos mus, karakteriserer de resulterende ændringer i peritonealcellesammensætning og kvantificerer bakteriebyrden i forskellige organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg med Salmonella Typhimurium blev udført i Bio Safety Level 2 (BSL-2) faciliteter. Der skal udvises forsigtighed med at bruge korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE), sikre sikkerhed og følge standard BSL-2 biohazard bortskaffelsesmetoder. Alle museforsøg blev udført efter retningslinjer fra Institutional Animal Ethics Committee, IISc. Mus blev opdrættet og vedligeholdt på Central Animal Facility of IISc (registreringsnummer: 48/1999/CPCSEA, dateret 1/3/1999), godkendt af Ministeriet for Miljø og Skov, Indiens regering. Forsøgsprotokollerne blev godkendt af Komitéen for Formål og Kontrol og Tilsyn med Dyreforsøg med det godkendte tilladelsesnummer CAF/Ethics/797/2020.
BSL2-definition: En BSL2-klassificering repræsenterer, at de biofarlige stoffer udgør en moderat trussel mod miljøet oglaboratoriepersonalet 5.
1. Dyrkningsforberedelse af Salmonella Typhimurium
- Tilsæt 100 μL Salmonella Typhimurium NCTC 12023 glycerolbestand til 3 ml Luria Bertani (LB) bouillon. Inkuber kulturen ved 160 o / min ved 37 ° C natten over.
- Streak 50 μL af den natlige dyrkede kultur i LB bouillon på en Salmonella Shigella (SS) agarplade og inkuber ved 37 ° C i ~ 12 timer. Opbevar SS-agarpladen med bakteriekolonierne ved 4 °C i flere dage før in vivo-infektionsforsøget .
- Vælg en enkelt koloni fra den stribede SS-agarplade ved hjælp af en mikrospids. Skub mikrospidsen ud i 3 ml LB bouillon og kultur ved 160 o / min ved 37 ° C natten over.
- Tilsæt 0,1 ml af bakteriekulturen til 50 ml LB bouillon og inkuber ved 37 °C i en shakerinkubator ved 160 o / min i 3-4 timer for at nå den logaritmiske vækstfase. Fortynd kulturen med en faktor 2 ved hjælp af LB bouillon.
BEMÆRK: I den logaritmiske fase har bakterieceller deres bedste helbred og deler sig aktivt. - Mål den optiske densitet (OD) af kulturen ved 600 nm bølgelængde af lys i et spektrofotometer eller mikropladelæser. Når OD når 1,0, skal du lave to alikvoter på 1 ml kultur i 1,5 ml mikrofugerør.
- Centrifuger rørene ved 7.750 × g i 15 min. Kassér supernatanten og vask pillen med 1 ml 1x PBS 2x. Centrifuger rørene ved 7.750 × g i 15 min.
- Resuspend pelleten i 0,5 ml 1x PBS i to forskellige 1,5 ml mikrofugerør. Kombiner suspensionerne fra begge rør til et 1,5 ml rør, der nu indeholder ~ 2 × 108 kolonidannende enheder (CFU) / ml.
- En bakteriecellesuspension på 1 × 106 CFU/ml forberedes ved at fortynde denne stamopløsning.
FORSIGTIG: Optimer CFU svarende til OD under specifikke laboratoriebetingelser for at bestemme CFU for OD 1.0, inden forsøgene påbegyndes.
2. Mus og infektioner
- Hus 8-10 uger gamle han-C57BL/6 mus, der vejer ~20 g i dyreanlæggets renluftsrum i flere dage til akklimatisering.
- På infektionsdagen skal du holde musen med den ene hånd, tørre mavehuden med 70% ethanol og sprede bagbenene for bedre adgang til abdominalvæggen.
- 0,5 ml 1 × 106 CFU/ml bakteriel suspension intraperitonealt ved hjælp af en 1 ml sprøjte. Derfor modtager hver mus 5 × 105 CFU. Kontrol, uinficerede mus modtager 0,5 ml PBS alene. Efter infektion, plade kulturen for at kontrollere den faktiske CFU injiceret, som kan variere fra 0,2-0,8 millioner CFU / 0,5 ml.
- Sæt musene tilbage i burene som tildelt.
- Ofre musene ved hjælp af CO2 -kvælning ~ 12-18 timer efter infektion for det bedste svar. Normalt dør alle inficerede mus inden for 96 timer. Under nogle eksperimentelle indgreb kan nogle mus overleve. Afliv disse mus efter 96 timer. Afliv også enhver mus med en kropstemperatur under 33,2 ° C og akut nød ved 96 timer som et humant endepunkt.
BEMÆRK: I denne model kan nogle mus begynde at dø efter 12 timers salmonellainjektion . Planlæg derfor eksperimenter korrekt, der involverer flere tidspunkter.
3. CFU's vurdering af organer
- Ofre den inficerede mus ved CO2 -kvælning, og tør maven med et stykke bomuld dyppet i 70% ethanol. Skær op i mavehuden. Se artiklen af Ray og Dittel for en videoprotokol om, hvordan man opsamler peritoneal skylningsvæske6. Skær bughulen op og saml organerne af interesse i mikrofugerør. Derudover, da blodet i mus med sepsis bliver koaguleret hurtigt, og mængderne er lave, skal du samle det hurtigt efter ofring.
BEMÆRK: Denne video demonstrerer opregningen af organ CFU fra leveren, da leveren gennemgår omfattende histopatologisk skade i denne model af sepsis. - Skær et lille stykke af leveren og læg det i et mikrofugerør.
BEMÆRK: Dette kan opbevares på is i maksimalt 2-3 timer, før du fortsætter til næste trin. - Vej og overfør stykkerne til mikrocentrifugerør. Skær fortrinsvis stykker, der vejer ~ 10-15 mg for korrekt homogenisering. Brug hele organer i tilfælde af mindre, såsom de mesenteriske lymfeknuder (MLN'er) eller thymus.
- Tilsæt 0,5 ml 1x PBS til røret og homogeniser organerne ved hjælp af en håndhomogenisator. Sørg for, at organerne er fuldstændig homogeniserede. Der fyldes lydstyrken op til 1 ml ved at tilføje 0,5 ml 1x PBS.
- Centrifugering af rørene ved 200 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Opsaml supernatanten i friske mikrofugerør og tilbered fortyndinger på 1 × 10-1 og 10-2 i en plade med 96 brønde.
- 50 μL af fortyndingsuret spredes på friske SS-agarplader, og pladerne inkuberes ved 37 °C i 12 timer.
- Tæl antallet af kolonier, der vises i hver tilstand, og normaliser dataene med organvægten ved hjælp af ligning (1):
CFU/mg =
(1)
BEMÆRK: Tallet 20 bruges i formlen til at konvertere kolonierne pr. plade til CFU / ml. Dette tal opnås ved at dividere 1 ml med mængden af et givet volumen af den belagte kultur - i dette tilfælde 50 μL.
For eksempel, hvis 100 kolonier findes i en SS-agarplade, hvor 50 μL af en 1 × 10-1 fortynding af et homogeniseret organ, der vejer 10 mg, spredes, spredes, så spredes
CFU/mg =
(1)
4. Flowcytometrisk analyse af forskellige immuncellepopulationer i peritoneale ekssudat
- Saml peritonealcellerne som tidligere beskrevet af Ray og Dittel6.
- Resuspend cellepillen fra peritoneal skylningsvæske i 1 ml RPMI suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS). Opregne de samlede celletal i peritonealskylning ved hjælp af et hæmocytometer. Juster cellenummeret, så hvert rør modtager 0,2-0,5 millioner celler.
BEMÆRK: Peritoneal skylning hos mus med sepsis kan indeholde RBC'er, som sandsynligvis forekommer på grund af blødning. Vær forsigtig med at udelukke RBC'er, mens du tæller peritoneale celler. I lysfeltmikroskopet forekommer RBC'er meget mindre end immuncellerne. Disse vises som flade skiver eller donuts, runde, med en indrykning i midten, men ikke hule. Et trin til at lyse RBC'er kan tilføjes7. - Spin cellerne ned ved 200 × g ved 4 ° C i 10 minutter, kassér supernatanten og vask cellerne 1x med 1x kold PBS. Centrifugering af cellerne ved 200 × g ved 4 °C i 10 minutter.
- Bloker Fc-receptorerne på PEC'er ved hjælp af FcR-blokker (1:400 fortynding), fremstillet i blokerende buffer bestående af 5% FBS og 0,02% natriumazid i PBS. Inkuber på is i 15 min.
- Centrifugering af cellerne ved 200 × g ved 4 °C i 10 minutter. Kassér supernatanten. Fortynd de fluorokromkonjugerede antistoffer af interesse for blokering af buffer. Brug en 1:500 fortynding af anti-mus LY6G til at plette neutrofilerne.
BEMÆRK: Andre immuncellepopulationer kan også påvises ved hjælp af for eksempel anti-mus B220 til B-celler, anti-mus CD3 til T-celler og anti-mus F4/80 til makrofager. - Inkuber ~ 0,2 millioner celler i 200 μL af de fortyndede opløsninger af antistoffer i separate rør. Som en negativ kontrol skal du afsætte et rør i hver fluorokromtype til den ufarvede kontrol for at inkubere cellerne med 200 μL blokerende buffer uden antistof.
- Inkuber prøverne på is i 45 minutter med intermitterende tapping hvert 15. minut.
- Centrifugering af cellerne ved 200 × g i 10 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten. Fastgør cellerne med 4% paraformaldehyd i ~ 15 minutter ved stuetemperatur, hvis de skal opbevares i flere dage. Det er dog bedst at indhente data fra nyfarvede prøver i et flowcytometer.
- Resuspend cellerne i 200 μL FACS-farvningsbuffer (2% FBS i PBS). Hent dataene i et flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En detaljeret karakterisering af værtsimmunresponset ved hjælp af denne særlige model er vist i tidligere publikationer 8,9. Et par repræsentative resultater af den beskrevne protokol er afbildet i dette afsnit. Denne model har til formål at fremkalde systemisk infektion af S. Typhimurium ved intraperitoneal injektion af bakteriekulturen for at inducere sepsis. For at bekræfte infektionen blev lysaterne i leveren og milten fra septiske mus spredt på SS-agarplader, og antallet af kolonier blev talt. I figur 1 angiver billederne af SS-agarplader organets CFU-byrde i leveren og milten hos septiske mus. De homogeniserede organlysater blev spredt ved en fortynding på 1 × 10-1 og inkuberet ved 37 °C. Det sortpigmenterede S. Typhimuriumkolonier dukkede op efter ~ 12 timers inkubation ved 37 ° C. Ved infektion af mus rapporteres det desuden, at kulturerne fra blod og peritoneal skylning er positive for bakterieceller8. Disse resultater viste, at de intraperitonealt injicerede bakterieceller spredte sig systemisk og koloniserede de indre organer. En del af pladen vises som et zoomet ind-ind-ind for at fremhæve kolonierne. Patogenet formidlede med succes systemisk og koloniserede de indre organer.
Figur 2 viser sera isoleret fra raske og septiske mus. Mængden af opsamleligt blod gennem hjertepunktering fra septiske mus er normalt 100-200 μL, hvilket er lavere end mængden fra raske mus, hvor ~500 μL blod kan opnås. Som følge heraf er serumvolumenet isoleret fra septisk museblod lavt. Dette fænomen sker på grund af den øgede koagulation af blodet i septiske mus. Desuden viser sera fra septiske mus tydelig rød farve, hvilket indikerer forekomsten af omfattende hæmolyse 8,9.
Som vist i figur 3 blev flowcytometribaseret immunfænotyping af peritoneale ekssudatceller udført for at vurdere infiltrationen af neutrofiler i bughulen hos raske og septiske mus. Da neutrofiler udtrykker LY6G-protein på celleoverfladen, blev FITC-mærket anti-LY6G-antistof brugt til at plette neutrofilcellepopulationen. Disse billeder repræsenterer data fra en sund og to inficerede mus. Efter dataindsamling blev cellerne gated til kun at omfatte singler i et FSC-A versus SSC-A-plot. Derefter blev histogrammeplottene og dot-plottet tegnet. Her viste de septiske mus øget infiltration af neutrofiler i bughulen.
Figur 1: Visualisering af organ CFU efter infektion. Organer blev homogeniseret som beskrevet i protokollen. Lysatet blev spredt på SS agar plader ved hjælp af en spreder. Billeder af plader spredt med en 1 × 10-1 fortynding af homogeniserede lysater af (A) lever og (B) milt. En del af pladen vises som et zoomet indstæt for at fremhæve kolonierne. Indforstørrelse = 13x (areal). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Forbedret hæmolyse hos septiske mus. Blodet blev opsamlet i mikrocentrifugerør og efterladt uforstyrret ved stuetemperatur i 30 minutter. Blodproppen blev fjernet ved centrifugering af rørene ved 2.000 × g i 10 minutter i en kølecentrifuge. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Flowcytometrisk profilering af neutrofilpopulation i peritoneal skylningsvæske. Peritoneal skylningsvæske blev opsamlet 16 timer efter infektion. Peritonealcellerne blev farvet med FITC-mærket anti-LY6G-antistof. Septiske mus viste øget infiltration af neutrofiler i bughulen. Forkortelser: FITC = fluoresceinisothiocyanat; LY6G = lymfocytantigen 6 kompleks locus G6D; SSC-A = sidespredningsområde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver en metode til at inducere en alvorlig form for bakteriel sepsis ved intraperitoneal injektion af Salmonella Typhimurium. Denne model er fordelagtig i forhold til andre, da Salmonella Typhimurium er et intracellulært patogent og dermed højpatogent, der efterligner den klinisk relevante tilstand af gramnegativ sepsis. Resultatet af peritonitis sepsis i denne model er systemisk, med 100% dødelighed inden for 96 timer efter infektion. Derfor er denne model medvirkende til at studere de inflammatoriske og dødelige værtsresponser8 og virkningerne af terapeutisk intervention i dæmpende sepsis.
I dette modelsystem ændres den cellulære sammensætning af bughulen dramatisk for at bekæmpe det podede patogen. Et stort antal LY6G + neutrofiler infiltrerer bughulen med et samtidigt fald i F4/80+ makrofager, hvilket resulterer i makrofagens forsvindensreaktion (MDR) 8,10. Derfor er denne model nyttig til at studere de kinetiske ændringer i immuncellesammensætninger og funktioner under sepsis, som stadig er et meget uudforsket område. Salmonella Typhimurium inficerer systemisk, opholder sig i og formerer sig i musenes organer. Serumproinflammatoriske cytokiner såsom TNF-α, IL-6 og IFN-γ øges også8. En kaskade af proinflammatoriske reaktioner fører også til hæmolyse og koagulation af blodet, som bliver synlig ved dissektion af de inficerede mus 10,11. Samspillet mellem værtsresponsen på denne bakteriebyrde og bakteriernes skadelige virkninger fører til vansiret vævsarkitektur, tab af funktioner og vævsnekrose, især i leveren.
Desuden har tidligere rapporter fra laboratoriet vist, at sådanne virkninger moduleres af den opregulerede ekspression af nitrogenoxidsyntase 2 (NOS2), hvilket fører til øgede reaktive oxygenarter (ROS) og højere niveauer af proinflammatoriske cytokiner, hvilket fører til et forbedret inflammatorisk respons8. Denne musesepsismodel er fordelagtig i forhold til andre, fordi induktionen af sepsis er hurtigere med mere dødelige virkninger. Det kræver ikke teknisk ekspertise at udføre operationen på anæstesierede mus, som det er tilfældet med den nuværende guldstandard CLP-sepsis musemodel. I CLP-sepsis-modellen udvikler kun en delmængde af mus sepsis, mens alle mus udvikler sepsis i den her beskrevne model.
Sammenlignet med den LPS-inducerede endotoxæmi sepsismodel er denne model desuden mere klinisk relevant for gramnegativ monobakterie sepsis. Modellen er også nyttig til at forstå stigningerne i intracellulær ROS, proinflammatoriske cytokinniveauer, hæmolyse og blodkoagulation, som alle sker under sepsis. Det er rapporteret, at brugen af nitrogenoxiddonorlægemidlet DETA-NONOate giver en overlevelsesfordel hos Nos2 knockout-mus med sepsis ved hjælp af denne model8. Dette tyder på, at denne model kan bruges til at identificere nye lægemidler til behandling af sepsis. Denne model kan også hurtigt vedtages af ethvert laboratorium udstyret med BSL-2-faciliteter.
Under brug af denne model skal der træffes forholdsregler på niveau med bakteriecellesundhed og CFU-nummeret for at opnå optimale resultater. Man bør altid bruge friskstribede salmonellakolonier fra SS-agarplader. Det anbefales også at optimere processen med kulturforberedelse ved at finde OD-værdien i spektrofotometeret svarende til den nævnte CFU.
Ulempen ved at bruge denne model er, at effekten af sepsis hos mus er intenst dødelig inden for 96 timer efter infektion. Dette begrænser undersøgelsen af værtsimmunresponser på sene tidspunkter. Det kan overvindes ved at bruge en mere svækket bakteriestamme af Salmonella Typhimurium.
Der er forskelle mellem humane patienter, der lider af sepsis, og musemodeller, der forsøger at efterligne human sepsis. For eksempel tager patienter længere tid at udvikle sepsis og sættes på støttende interventioner og terapi. Sepsis i musemodeller udvikler sig dog meget hurtigere, og understøttende interventioner udføres ikke4. Der er dog nogle ligheder mellem sepsis hos mennesker og mus, hvor patienter med sepsis viser højere niveauer af proinflammatoriske cytokiner, blodkoagulation og hæmolyse i kliniske omgivelser. Alle disse efterlignes i denne musemodel af sepsis. Derfor er nogle aflæsninger af denne model relevante for kliniske scenarier, selvom en direkte korrelation muligvis ikke er tilrådelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Central Animal Facility, IISc for at forsyne os med mus til forskning. Denne undersøgelse blev finansieret af tilskud til DpN fra Institut for Bioteknologi og Videnskab og Ingeniørforskning, Indiens regering. Den infrastrukturelle støtte fra DBT-IISc-programmet og DST-FIST-tilskud anerkendes i høj grad. Vi takker alle tidligere og nuværende medlemmer af DpN-laboratoriet for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | - | - | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
