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Immunology and Infection

चूहों में साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम-प्रेरित सेप्टिक पेरिटोनिटिस की विशेषता

Published: July 29, 2022 doi: 10.3791/63695
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry, Indian Institute of Science, 2Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science, 3Undergraduate Program, Indian Institute of Science

Summary

यह प्रोटोकॉल माउस मॉडल सिस्टम में ग्राम-नकारात्मक मोनोबैक्टीरियल सेप्सिस के प्रेरण का वर्णन करता है। मॉडल सेप्सिस के दौरान भड़काऊ और घातक मेजबान प्रतिक्रियाओं की जांच करने में उपयोगी है।

Abstract

सेप्सिस माइक्रोबियल आक्रमण या ऊतक क्षति के लिए एक डिस्रेगुलेटेड मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, जिससे संक्रमण या क्षति से दूर एक साइट पर अंग की चोट होती है। वर्तमान में, सेप्सिस के व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले चूहों के मॉडल में लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) -प्रेरित एंडोटोक्सिमिया, सेकल बंधाव और पंचर (सीएलपी), और मोनोबैक्टीरियल संक्रमण मॉडल सिस्टम शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल चूहों में साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम संक्रमण-प्रेरित सेप्टिक पेरिटोनिटिस के दौरान मेजबान प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। एस। टाइफिम्यूरियम, एक ग्राम-नकारात्मक इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़, चूहों में टाइफाइड जैसी बीमारी का कारण बनता है।

यह प्रोटोकॉल संस्कृति की तैयारी, इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से चूहों में सेप्टिक पेरिटोनिटिस के प्रेरण और प्रणालीगत मेजबान प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के तरीकों को विस्तृत करता है। इसके अलावा, विभिन्न अंगों में जीवाणु बोझ का आकलन और पेरिटोनियल लैवेज में बढ़ी हुई न्यूट्रोफिल संख्याओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण को प्रस्तुत किया गया है। साल्मोनेला चूहों में टाइफिम्यूरियम-प्रेरित सेप्सिस प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन्स में वृद्धि और पेरिटोनियल गुहा में न्यूट्रोफिल की तेजी से घुसपैठ की ओर जाता है, जिससे कम अस्तित्व होता है।

इस प्रोटोकॉल में हर कदम को अनुकूलित किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप सेप्टिक पेरिटोनिटिस के रोगजनन की उच्च पुनरुत्पादन क्षमता होती है। यह मॉडल बैक्टीरियल सेप्सिस के दौरान प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, रोग की प्रगति में विभिन्न जीनों की भूमिकाएं, और सेप्सिस को क्षीण करने के लिए दवाओं के प्रभाव।

Introduction

सेप्सिस को माइक्रोबियल आक्रमण या ऊतक क्षति के लिए एक डिस्रेगुलेटेड प्रणालीगत भड़काऊ और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में परिभाषित किया गया है, जिससे संक्रमण या क्षति की साइट से दूर अंग की चोट होती है। सेप्टिक शॉक सेप्सिस का एक सबसेट है जो वॉल्यूम पुनर्जीवन के दौरान हाइपोटेंशन की विशेषता है, जिसमें मृत्यु दर के काफी हद तक बढ़ते जोखिम के साथ1। कोविड-19 महामारी के दौरान आम जनता इस विकार के प्रति अधिक जागरूक हो गई है। इसकी उच्च संबद्ध मृत्यु दर के बावजूद, सेप्सिस के वैश्विक बोझ पर व्यापक महामारी विज्ञान डेटा की कमी है क्योंकि इसके निदान की जटिलता है। 2017 में, दुनिया भर में 48.9 मिलियन सेप्सिस की घटनाएं और 11 मिलियन मौतें हुईं, जो सभी वैश्विक मौतों के 19.7% के लिए जिम्मेदारहैं। इसके अलावा, गहन देखभाल इकाई के रोगियों में संक्रमण और संबंधित सेप्सिस के विस्तारित प्रसार पर एक अध्ययन में पाया गया कि रोगियों से सकारात्मक आइसोलेट्स का 62% ग्राम-नकारात्मक जीवथे।

प्रारंभ में, सेप्सिस पर जांच माइक्रोबियल रोगजनन को चित्रित करने पर केंद्रित थी। हालांकि, "खतरे की परिकल्पना" को समझना, जो यह निर्धारित करता है कि मेजबान स्वयं और गैर-स्वयं को कैसे अलग करता है, एक हमलावर रोगज़नक़ के लिए मेजबान प्रतिक्रिया को समझने की दिशा में सेप्सिस अनुसंधान के संतुलन के झुकाव का नेतृत्व किया। सेप्सिस के व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले चूहों के मॉडल में लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) -प्रेरित एंडोटोक्सिमिया मॉडल, पॉलीमाइक्रोबियल सेप्सिस मॉडल, सेकल बंधाव और पंचर (सीएलपी) और बृहदान्त्र आरोही स्टेंट पेरिटोनिटिस (सीएएसपी) और मोनोबैक्टीरियल संक्रमण मॉडलशामिल हैं।

हमने साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम का उपयोग करके पेरिटोनियल सेप्सिस को प्रेरित करके एक माउस मॉडल प्रणाली को मानकीकृत किया है। यह मॉडल दूसरों पर फायदेमंद है क्योंकि साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम एक इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ है जो ग्राम-नकारात्मक सेप्सिस की नैदानिक रूप से प्रासंगिक स्थिति की नकल करता है। इस मॉडल में पेरिटोनिटिस सेप्सिस का परिणाम प्रणालीगत है, जिसमें संक्रमण के बाद 96 घंटे के भीतर 100% मृत्यु दर होती है। इसलिए, यह मॉडल भड़काऊ और घातक मेजबान प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस मॉडल में, सेप्सिस को इंट्रापेरिटोनियल रूप से 8-10 सप्ताह पुराने C57BL / 6 माउस में साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम की 0.5 मिलियन कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (CFU) को इंजेक्ट करने से प्रेरित किया जाता है। प्रणालीगत संक्रमण की पुष्टि अंग जीवाणु बोझ का आकलन करके की जा सकती है ~ 16 ज संक्रमण के बाद। यह लेख चूहों में साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम-प्रेरित पेरिटोनिटिस सेप्सिस को दर्शाता है, पेरिटोनियल सेल संरचना में परिणामी परिवर्तनों की विशेषता है, और विभिन्न अंगों में बैक्टीरिया के बोझ को निर्धारित करता है।

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Protocol

साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम का उपयोग करके सभी प्रयोग जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) सुविधाओं में आयोजित किए गए थे। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करने, सुरक्षा सुनिश्चित करने और मानक बीएसएल -2 बायोहैजार्ड निपटान विधियों का पालन करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। सभी चूहों के प्रयोग संस्थागत पशु नैतिकता समिति, आईआईएससी द्वारा बताए गए दिशानिर्देशों का पालन करते हुए आयोजित किए गए थे। चूहों को पर्यावरण और वन मंत्रालय, भारत सरकार द्वारा अनुमोदित आईआईएससी की केंद्रीय पशु सुविधा (पंजीकरण संख्या: 48/1999/CPCSEA, दिनांक 1/3/1999) में नस्ल और रखरखाव किया गया था। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को अनुमोदित परमिट संख्या सीएएफ / नैतिकता / 797 / 2020 के साथ जानवरों पर प्रयोगों के उद्देश्य और नियंत्रण और पर्यवेक्षण के लिए समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

BSL2 परिभाषा: एक BSL2 रेटिंग का प्रतिनिधित्व करता है कि biohazardous एजेंट पर्यावरण और प्रयोगशाला कर्मचारियों के लिए एक मध्यम खतरा पैदा करतेहैं।

1. साल्मोनेला Typhimurium की संस्कृति की तैयारी         

  1. साल्मोनेला Typhimurium NCTC 12023 ग्लिसरॉल स्टॉक के 100 μL को लुरिया बर्टानी (एलबी) शोरबा के 3 मिलीलीटर में जोड़ें। रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 160 आरपीएम पर संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  2. एक साल्मोनेला शिगेला (एसएस) अगर प्लेट पर एलबी शोरबा में रातोंरात उगाई गई संस्कृति की लकीर 50 μL और ~ 12 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। में विवो संक्रमण प्रयोग से पहले कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु उपनिवेशों के साथ एसएस अगर प्लेट स्टोर करें।
  3. एक microtip का उपयोग कर लकीरदार एसएस अगर प्लेट से एक एकल कॉलोनी उठाओ. माइक्रोटिप को एलबी शोरबा और संस्कृति के 3 मिलीलीटर में 160 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में बाहर निकालें।
  4. एलबी शोरबा के 50 मिलीलीटर में 0.1 मिलीलीटर बैक्टीरिया संस्कृति जोड़ें और विकास के लॉगरिदमिक चरण तक पहुंचने के लिए 3-4 घंटे के लिए 160 आरपीएम पर एक शेकर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एलबी शोरबा का उपयोग करके 2 के कारक से संस्कृति को पतला करें।
    नोट: लॉगरिदमिक चरण के दौरान, बैक्टीरियल कोशिकाएं अपने सर्वोत्तम स्वास्थ्य पर होती हैं और सक्रिय रूप से विभाजित होती हैं।
  5. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या माइक्रोप्लेट रीडर में प्रकाश के 600 एनएम तरंग दैर्ध्य पर संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापें। एक बार जब ओडी 1.0 तक पहुंच जाता है, तो 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में 1 एमएल संस्कृति के दो एलीकोट बनाएं।
  6. 15 मिनट के लिए 7,750 × ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant त्यागें और 1x PBS 2x के 1 mL के साथ गोली धोएं। 15 मिनट के लिए 7,750 × ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. दो अलग-अलग 1.5 mL microfuge ट्यूबों में 1x PBS के 0.5 mL में गोली resuspend. एक 1.5 mL ट्यूब में दोनों ट्यूबों से निलंबन गठबंधन अब ~ 2 × 108 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU)/ mL युक्त.
  8. इस स्टॉक समाधान को पतला करके 1 × 106 CFU / mL का एक जीवाणु सेल निलंबन तैयार करें।
    चेतावनी: प्रयोगों को शुरू करने से पहले ओडी 1.0 के लिए सीएफयू निर्धारित करने के लिए विशिष्ट प्रयोगशाला स्थितियों के तहत ओडी के अनुरूप सीएफयू को अनुकूलित करें।

2. चूहों और संक्रमण

  1. घर 8-10-सप्ताह पुराने पुरुष C57BL / 6 चूहों का वजन ~ 20 ग्राम पशु सुविधा के स्वच्छ हवा के कमरे में कई दिनों के लिए acclimation के लिए।
  2. संक्रमण के दिन, माउस को एक हाथ से पकड़ें, 70% इथेनॉल के साथ पेट की त्वचा को पोंछें, और पेट की दीवार की बेहतर पहुंच के लिए हिंद पैरों को फैलाएं।
  3. 1 × 106 CFU / mL बैक्टीरियल सस्पेंशन इंट्रापेरिटोनियल रूप से 1 एमएल सिरिंज की मदद से 0.5 मिलीलीटर इंजेक्ट करें। इसलिए, प्रत्येक माउस 5 × 105 CFU प्राप्त करता है। नियंत्रण, असंक्रमित चूहों को अकेले पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर प्राप्त होते हैं। संक्रमण के बाद, वास्तविक सीएफयू इंजेक्शन की जांच करने के लिए संस्कृति को प्लेट करें, जो 0.2-0.8 मिलियन सीएफयू / 0.5 एमएल से भिन्न हो सकता है।
  4. चूहों को वापस पिंजरों में रखो के रूप में सौंपा.
  5. सबसे अच्छी प्रतिक्रिया के लिए सीओ2 श्वासावरोध ~ 12-18 ज पोस्ट संक्रमण का उपयोग कर चूहों का बलिदान। आमतौर पर, सभी संक्रमित चूहे 96 घंटे के भीतर मर जाते हैं। कुछ प्रयोगात्मक हस्तक्षेपों के तहत, कुछ चूहे जीवित रह सकते हैं। 96 घंटे के बाद इन चूहों euthanize. इसके अलावा, 33.2 डिग्री सेल्सियस से नीचे शरीर के तापमान और एक मानवीय समापन बिंदु के रूप में 96 ज पर तीव्र संकट के साथ किसी भी माउस को euthanize करें।
    नोट: इस मॉडल में, कुछ चूहे साल्मोनेला इंजेक्शन के 12 ज के बाद मरना शुरू कर सकते हैं। इसलिए, कई समय बिंदुओं को शामिल करने वाले प्रयोगों की योजना बनाएं।

3. अंगों के CFU मूल्यांकन

  1. सीओ2 श्वासावरोध द्वारा संक्रमित माउस का बलिदान करें, और 70% इथेनॉल में डूबे कपास के एक टुकड़े के साथ पेट को पोंछें। पेट की त्वचा को काटें। पेरिटोनियल लैवेज द्रव6 को इकट्ठा करने के तरीके पर एक वीडियो प्रोटोकॉल के लिए रे और डिटेल द्वारा लेख का संदर्भ लें। पेरिटोनियल गुहा को काटें और माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में रुचि के अंगों को इकट्ठा करें। इसके अतिरिक्त, जैसा कि सेप्सिस वाले चूहों में रक्त तेजी से जमा हो जाता है और मात्रा कम होती है, बलिदान करने के बाद इसे जल्दी से इकट्ठा करें।
    नोट: यह वीडियो जिगर से अंग सीएफयू की गणना को दर्शाता है क्योंकि जिगर सेप्सिस के इस मॉडल में व्यापक हिस्टोपैथोलॉजिकल क्षति से गुजरता है।
  2. जिगर के एक छोटे से टुकड़े को काटें और इसे एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब में रखें।
    नोट: यह अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले अधिकतम 2-3 घंटे के लिए बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. वजन और सूक्ष्मकेंद्र ट्यूबों के लिए टुकड़ों को स्थानांतरित. अधिमानतः, उचित homogenization के लिए ~ 10-15 मिलीग्राम वजन के टुकड़े काटें। छोटे लोगों के मामले में पूरे अंगों का उपयोग करें जैसे कि मेसेन्टेरिक लिम्फ नोड्स (एमएलएन) या थाइमस।
  4. ट्यूब के लिए 1x PBS के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और एक हाथ homogenizer का उपयोग कर अंगों homogenize. सुनिश्चित करें कि अंग पूरी तरह से homogenized हैं। 1x PBS के 0.5 mL जोड़कर 1 mL करने के लिए मात्रा बनाएँ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 × जी पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. ताजा microfuge ट्यूबों में supernatant ले लीजिए और एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में 1 × 10-1 और 10-2 के dilutions तैयार करें।
  7. ताजा एसएस अगर प्लेटों पर डिलुएंट के 50 μL फैलाएं और 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  8. प्रत्येक स्थिति में दिखाई देने वाली कॉलोनियों की संख्या की गणना करें और समीकरण (1) का उपयोग करके अंग वजन के साथ डेटा को सामान्य करें:
    CFU/mg = Equation 1 (1)
    नोट: संख्या 20 का उपयोग सूत्र में प्रति प्लेट कालोनियों को CFU/mL में कनवर्ट करने के लिए किया जाता है। यह संख्या 1 मिलीलीटर को मढ़वाया संस्कृति की एक दी गई मात्रा की मात्रा से विभाजित करके प्राप्त की जाती है- इस मामले में, 50 μL।
    उदाहरण के लिए, यदि एक एसएस अगर प्लेट में 100 उपनिवेश पाए जाते हैं, जहां 1 के 50 μL × 10 मिलीग्राम वजन वाले एक homogenized अंग का 10-1 कमजोर पड़ने का प्रसार होता है, तो
    CFU/mg = Equation 2

4. पेरिटोनियल एक्सूडेट में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण

  1. पेरिटोनियल कोशिकाओं को इकट्ठा करें जैसा कि पहले रे और डिट्टेल6 द्वारा वर्णित है।
  2. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक आरपीएमआई के 1 मिलीलीटर में पेरिटोनियल लैवेज तरल पदार्थ से सेल पैलेट को फिर से निलंबित कर दिया। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके पेरिटोनियल लैवेज में कुल सेल संख्याओं की गणना करें। सेल संख्या को समायोजित करें ताकि प्रत्येक ट्यूब को 0.2-0.5 मिलियन कोशिकाएं प्राप्त हों।
    नोट: सेप्सिस के साथ चूहों में पेरिटोनियल लैवेज में आरबीसी हो सकते हैं, जो संभवतः रक्तस्राव के कारण दिखाई देते हैं। पेरिटोनियल कोशिकाओं की गिनती करते समय आरबीसी को बाहर करने के लिए सावधान रहें। ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप में, आरबीसी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तुलना में बहुत छोटे दिखाई देते हैं। ये सपाट डिस्क या डोनट्स के रूप में दिखाई देते हैं, गोल, केंद्र में इंडेंटेशन के साथ, लेकिन खोखले नहीं। RBCs lyse करने के लिए एक कदम 7 जोड़ा जा सकताहै।
  3. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 200 × जी पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें, supernatant को छोड़ दें, और कोशिकाओं को 1x ठंडे पीबीएस के साथ 1x धोएं। 200 पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें × 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जी ।
  4. FcR ब्लॉकर (1: 400 कमजोर पड़ने) का उपयोग करके PECs पर Fc रिसेप्टर्स को ब्लॉक करें, जो पीबीएस में 5% FBS और 0.02% सोडियम एज़ाइड से मिलकर बफर को अवरुद्ध करने में तैयार किया गया है। 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  5. 200 × g पर कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 4 °C पर सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant को छोड़ दें। बफर को अवरुद्ध करने में रुचि के फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी को पतला करें। न्यूट्रोफिल को दागने के लिए एंटी-माउस एलवाई 6 जी के 1: 500 कमजोर पड़ने का उपयोग करें।
    नोट: अन्य प्रतिरक्षा सेल आबादी का भी पता लगाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, बी कोशिकाओं के लिए एंटी-माउस बी 220, टी कोशिकाओं के लिए एंटी-माउस सीडी 3, और मैक्रोफेज के लिए एंटी-माउस एफ 4/80।
  6. अलग-अलग ट्यूबों में एंटीबॉडी के पतले समाधानों के 200 μL में ~ 0.2 मिलियन कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एंटीबॉडी के बिना बफर को अवरुद्ध करने के 200 μL के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने के लिए unstained नियंत्रण के लिए प्रत्येक फ्लोरोक्रोम प्रकार में एक ट्यूब को अलग रखें।
  7. हर 15 मिनट में आंतरायिक दोहन के साथ 45 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant को छोड़ दें। कमरे के तापमान पर ~ 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें यदि उन्हें कई दिनों तक संग्रहीत करने की आवश्यकता है। हालांकि, प्रवाह साइटोमीटर में ताजा दाग वाले नमूनों से डेटा प्राप्त करना सबसे अच्छा है।
  9. FACS धुंधला बफर (PBS में 2% FBS) के 200 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। एक प्रवाह साइटोमीटर में डेटा प्राप्त करें।

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Representative Results

इस विशेष मॉडल का उपयोग करके मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक विस्तृत लक्षण वर्णन पिछले प्रकाशनों 8,9 में दिखाया गया है। वर्णित प्रोटोकॉल के कुछ प्रतिनिधि परिणामों को इस अनुभाग में दर्शाया गया है। इस मॉडल का उद्देश्य एस के प्रणालीगत संक्रमण को प्रेरित करना है। सेप्सिस को प्रेरित करने के लिए जीवाणु संस्कृति के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा टाइफिम्यूरियम। संक्रमण की पुष्टि करने के लिए, सेप्टिक चूहों से जिगर और तिल्ली के लिसेट एसएस अगर प्लेटों पर फैल गए थे, और उपनिवेशों की संख्या की गणना की गई थी। चित्रा 1 में, एसएस अगर प्लेटों की छवियां सेप्टिक चूहों के जिगर और प्लीहा में अंग सीएफयू बोझ को इंगित करती हैं। homogenized अंग lysates 1 × 10−1 के कमजोर पड़ने पर फैल गए थे और 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था।  काले पिगमेंटेड एस। टाइफिम्यूरियम कॉलोनियां 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के ~ 12 घंटे के बाद दिखाई दीं। इसके अलावा, चूहों के संक्रमण पर, रक्त और पेरिटोनियल लैवेज से संस्कृतियों को जीवाणु कोशिकाओं के लिए सकारात्मक होने की सूचना दी जातीहै। इन परिणामों ने संकेत दिया कि इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट की गई जीवाणु कोशिकाओं ने व्यवस्थित रूप से प्रसारित किया और आंतरिक अंगों का उपनिवेश किया। प्लेट का एक हिस्सा कॉलोनियों को उजागर करने के लिए ज़ूम-इन इनसेट के रूप में दिखाया गया है। रोगज़नक़ ने सफलतापूर्वक व्यवस्थित रूप से प्रसारित किया और आंतरिक अंगों का उपनिवेश किया।

चित्रा 2 स्वस्थ और सेप्टिक चूहों से अलग सेरा को दर्शाता है। सेप्टिक चूहों से कार्डियक पंचर के माध्यम से संग्रहणीय रक्त की मात्रा आमतौर पर 100-200 μL होती है, जो स्वस्थ चूहों से मात्रा से कम होती है, जहां ~ 500 μL रक्त प्राप्त किया जा सकता है। नतीजतन, सेप्टिक माउस रक्त से अलग सीरम की मात्रा कम होती है। यह घटना सेप्टिक चूहों में रक्त के बढ़े हुए जमावट के कारण होती है। इसके अलावा, सेप्टिक चूहों से सेरा अलग-अलग लाल रंग दिखाता है, जो व्यापक हेमोलिसिस 8,9 की घटना का संकेत देता है।

जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, स्वस्थ और सेप्टिक चूहों के पेरिटोनियल गुहा में न्यूट्रोफिल की घुसपैठ का आकलन करने के लिए पेरिटोनियल एक्सूडेट कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित इम्युनोफेनोटाइपिंग का प्रदर्शन किया गया था। जैसा कि न्यूट्रोफिल सेल सतह पर एलवाई 6 जी प्रोटीन व्यक्त करते हैं, एफआईटीसी-टैग किए गए एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी का उपयोग न्यूट्रोफिल सेल आबादी को दागने के लिए किया गया था। ये छवियां एक स्वस्थ और दो संक्रमित चूहों से डेटा का प्रतिनिधित्व करती हैं। डेटा अधिग्रहण के बाद, कोशिकाओं को एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए प्लॉट में केवल सिंगल्स को शामिल करने के लिए गेटेड किया गया था। फिर, हिस्टोग्राम भूखंड और डॉट-प्लॉट तैयार किए गए थे। यहां, सेप्टिक चूहों ने पेरिटोनियल गुहा में न्यूट्रोफिल की घुसपैठ में वृद्धि देखी।

Figure 1
चित्रा 1: अंग CFU पोस्ट संक्रमण के विज़ुअलाइज़ेशन. अंगों को प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में homogenized थे। लाइसेट को एक स्प्रेडर का उपयोग करके एसएस अगर प्लेटों पर फैलाया गया था। प्लेटों की छवियां (ए) जिगर और (बी) प्लीहा के homogenized lysates के 1 × 10-1 कमजोर पड़ने के साथ फैलती हैं। प्लेट के एक हिस्से को उपनिवेशों को उजागर करने के लिए ज़ूम किए गए इनसेट के रूप में दिखाया गया है। इनसेट आवर्धन = 13x (क्षेत्र)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सेप्टिक चूहों में बढ़ाया हेमोलिसिस। रक्त को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एकत्र किया गया था और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अबाधित छोड़ दिया गया था। थक्के को एक प्रशीतित सेंट्रीफ्यूज में 10 मिनट के लिए 2,000 × ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करके हटा दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पेरिटोनियल लैवेज तरल पदार्थ में न्यूट्रोफिल आबादी का फ्लो साइटोमेट्रिक प्रोफाइलिंग। पेरिटोनियल लैवेज द्रव को संक्रमण के बाद 16 घंटे एकत्र किया गया था। पेरिटोनियल कोशिकाओं को FITC-टैग किए गए एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। सेप्टिक चूहों ने पेरिटोनियल गुहा में न्यूट्रोफिल की घुसपैठ में वृद्धि देखी। संक्षिप्त रूप: FITC = fluorescein isothiocyanate; LY6G = लिम्फोसाइट एंटीजन 6 जटिल लोकस G6D; SSC-A = साइड-स्कैटर क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह आलेख साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा बैक्टीरियल सेप्सिस के गंभीर रूप को प्रेरित करने की एक विधि का वर्णन करता है। यह मॉडल दूसरों पर फायदेमंद है क्योंकि साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम एक इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ है और इसलिए, अत्यधिक रोगजनक, ग्राम-नकारात्मक सेप्सिस की नैदानिक रूप से प्रासंगिक स्थिति की नकल करता है। इस मॉडल में पेरिटोनिटिस सेप्सिस का परिणाम प्रणालीगत है, जिसमें संक्रमण के बाद 96 घंटे के भीतर 100% मृत्यु दर होती है। इसलिए, यह मॉडल भड़काऊ और घातक मेजबान प्रतिक्रियाओं8 और क्षीण सेप्सिस में चिकित्सीय हस्तक्षेप के प्रभावों का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

इस मॉडल प्रणाली में, पेरिटोनियल गुहा की सेलुलर संरचना संक्रमित रोगज़नक़ का मुकाबला करने के लिए नाटकीय रूप से बदल जाती है। बड़ी संख्या में एलवाई 6 जी + न्यूट्रोफिल पेरिटोनियल गुहा में घुसपैठ करते हैं, एफ 4 / 80 + मैक्रोफेज में एक साथ कमी के साथ, जिसके परिणामस्वरूप मैक्रोफेज गायब होने की प्रतिक्रिया (एमडीआर) 8,10 होती है। इसलिए, यह मॉडल सेप्सिस के दौरान प्रतिरक्षा कोशिका रचनाओं और कार्यों में गतिज परिवर्तनों का अध्ययन करने में उपयोगी है, जो अभी भी एक बहुत ही अनपेक्षित क्षेत्र है। साल्मोनेला Typhimurium व्यवस्थित रूप से संक्रमित करता है, में रहता है, और चूहों के अंगों में फैलता है। सीरम प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स जैसे टीएनएफ-α, आईएल -6 और आईएफएन-γ भी 8 में वृद्धि करतेहैं। प्रोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं का एक झरना भी रक्त के हेमोलिसिस और जमावट की ओर जाता है, जो संक्रमित चूहों के विच्छेदन पर दिखाई देता है10,11। इस जीवाणु बोझ के लिए मेजबान प्रतिक्रिया और बैक्टीरिया के हानिकारक प्रभावों के बीच इंटरप्ले विकृत ऊतक वास्तुकला, कार्यों के नुकसान, और ऊतक परिगलन की ओर जाता है, विशेष रूप से जिगर में।

इसके अलावा, प्रयोगशाला से पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि इस तरह के प्रभावों को नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ 2 (एनओएस 2) की अपरेगुलेटेड अभिव्यक्ति द्वारा संशोधित किया जाता है, जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के उच्च स्तर की ओर जाता है, जिससे एक बढ़ी हुई भड़काऊ प्रतिक्रियाहोती है। यह माउस सेप्सिस मॉडल दूसरों पर फायदेमंद है क्योंकि सेप्सिस का प्रेरण अधिक घातक प्रभावों के साथ तेज है। इसे एनेस्थेटिक चूहों पर सर्जरी करने के लिए तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं होती है, जैसा कि वर्तमान सोने के मानक सीएलपी-सेप्सिस माउस मॉडल के मामले में है। सीएलपी-सेप्सिस मॉडल में, चूहों का केवल एक सबसेट सेप्सिस विकसित करता है, जबकि सभी चूहे यहां वर्णित मॉडल में सेप्सिस विकसित करते हैं।

इसके अलावा, एलपीएस-प्रेरित एंडोटोक्समिया सेप्सिस मॉडल की तुलना में, यह मॉडल ग्राम-नकारात्मक मोनोबैक्टीरियल सेप्सिस के लिए अधिक नैदानिक रूप से प्रासंगिक है। मॉडल इंट्रासेल्युलर आरओएस, प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकाइन के स्तर, हेमोलिसिस और रक्त जमावट में वृद्धि को समझने में भी उपयोगी है, जो सभी सेप्सिस के दौरान होते हैं। यह बताया गया है कि नाइट्रिक ऑक्साइड दाता दवा DETA-NONOate का उपयोग इस मॉडल 8 का उपयोग करके सेप्सिस के साथ Nos2 नॉकआउट चूहों में एक उत्तरजीविता लाभ प्रदान करताहै। इससे पता चलता है कि इस मॉडल का उपयोग सेप्सिस के इलाज के लिए उपन्यास दवाओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस मॉडल को बीएसएल -2 सुविधाओं से लैस किसी भी प्रयोगशाला द्वारा जल्दी से अपनाया जा सकता है।

इस मॉडल का उपयोग करते समय, इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए बैक्टीरिया सेल स्वास्थ्य और सीएफयू संख्या के स्तर पर सावधानी बरती जानी चाहिए। एक हमेशा एसएस आगर प्लेटों से ताजा लकीरदार साल्मोनेला उपनिवेशों का उपयोग करना चाहिए। उल्लिखित सीएफयू के अनुरूप स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में ओडी मूल्य को ढूंढकर संस्कृति की तैयारी की प्रक्रिया को अनुकूलित करने की भी सिफारिश की जाती है।

इस मॉडल का उपयोग करने का नुकसान यह है कि चूहों में सेप्सिस का प्रभाव संक्रमण के बाद 96 घंटे के भीतर तीव्रता से घातक है। यह देर से समय बिंदुओं पर मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को सीमित करता है। यह साल्मोनेला Typhimurium के एक अधिक क्षीण जीवाणु तनाव का उपयोग करके दूर किया जा सकता है।

सेप्सिस से पीड़ित मानव रोगियों और मानव सेप्सिस की नकल करने का प्रयास करने वाले चूहों के मॉडल के बीच अंतर हैं। उदाहरण के लिए, रोगियों को सेप्सिस विकसित करने में अधिक समय लगता है और सहायक हस्तक्षेप और चिकित्सीय पर रखा जाता है। हालांकि, माउस मॉडल में सेप्सिस बहुत तेजी से विकसित होता है, और सहायक हस्तक्षेप नहीं किए जाते हैं4। हालांकि, मनुष्यों और चूहों में सेप्सिस के बीच कुछ समानताएं हैं, सेप्सिस वाले रोगियों में नैदानिक सेटिंग्स में प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स, रक्त जमावट और हेमोलिसिस के उच्च स्तर को दिखाया गया है। सेप्सिस के इस माउस मॉडल में इन सभी की नकल की जाती है। इसलिए, इस मॉडल के कुछ रीडआउट नैदानिक परिदृश्यों के लिए प्रासंगिक हैं, हालांकि एक प्रत्यक्ष सहसंबंध उचित नहीं हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम अनुसंधान के लिए चूहों के साथ हमें आपूर्ति करने के लिए केंद्रीय पशु सुविधा, आईआईएससी को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को जैव प्रौद्योगिकी विभाग और विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड, भारत सरकार से डीपीएन को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। DBT-IISc कार्यक्रम और DST-FIST अनुदान से अवसंरचनात्मक समर्थन को बहुत स्वीकार किया जाता है। हम उनके समर्थन के लिए डीपीएन प्रयोगशाला के सभी पिछले और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
1 mL Sterile Syringe with 26 G needle Beckton Dickinson, Singapore 303060
1.5 mL Microcentrifuge Tube Tarsons, USA 500010
10 mL Sterile Syringe with 21 G needle Beckton Dickinson, Spain 307758
50 mL Conical Flask Tarsons, USA 441150
50 mL Graduated Centrifuge Tube Tarsons, USA 546041
50 mL Graduated Centrifuge Tube Tarsons, USA 546021
Cell spreader VWR, USA VWRU60828-680
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline HiMedia, Mumbai, India TS1006
Ethanol Merck 100983
FcR blocker BD Biosciences 553142
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106
FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 551460
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Hand based Homogenizer - -
Hemocytometer (Neubauer counting chamber) Rohem, India I.S. 10269
Luria Bertani Broth HiMedia, Mumbai, India M1245
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Petriplates Tarsons, USA 460091
RPMI Himedia, Mumbai, India AT060-10X1L
Salmonella-Shigella Agar HiMedia, Mumbai, India M108
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Equipments
Centrifuge Kubota
Flow cytometer BD FACSverse
Incubator N-biotek
Spectrophotometer Shimadzu
Weighing machine Sartorius

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References

  1. Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
  2. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  3. Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
  4. Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
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  10. Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
  11. Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 185
चूहों में <em>साल्मोनेला</em> टाइफिम्यूरियम-प्रेरित सेप्टिक पेरिटोनिटिस की विशेषता
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Chattopadhyay, A., Joseph, J. P.,… More

Chattopadhyay, A., Joseph, J. P., Shyam, S., Nandi, D. Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice. J. Vis. Exp. (185), e63695, doi:10.3791/63695 (2022).

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