Summary
Denne protokollen beskriver induksjonen av Gram-negativ monobakteriell sepsis i et musemodellsystem. Modellen er nyttig for å undersøke de inflammatoriske og dødelige vertsresponsene under sepsis.
Abstract
Sepsis er en dysregulert vert immunrespons på mikrobiell invasjon eller vevsskade, noe som fører til organskade på et sted fjernt fra infeksjonen eller skaden. For tiden inkluderer de mye brukte musmodellene av sepsis lipopolysakkarid (LPS)-indusert endotoksemi, cecal ligation og punktering (CLP) og monobakterielle infeksjonsmodellsystemer. Denne protokollen beskriver en metode for å studere vertsresponsene under Salmonella Typhimurium infeksjonsindusert septisk peritonitt hos mus. S. Typhimurium, et Gram-negativt intracellulært patogen, forårsaker tyfuslignende sykdom hos mus.
Denne protokollen utdyper kulturforberedelsen, induksjon av septisk peritonitt hos mus gjennom intraperitoneal injeksjon, og metoder for å studere systemiske vertsresponser. Videre presenteres vurderingen av bakteriell byrde i forskjellige organer og strømningscytometrisk analyse av økte nøytrofiltall i bukskytonal lavage. Salmonella Typhimurium-indusert sepsis hos mus fører til en økning i proinflammatoriske cytokiner og rask infiltrasjon av nøytrofiler i bukhulen, noe som fører til lavere overlevelse.
Hvert trinn i denne protokollen er optimalisert, noe som resulterer i høy reproduserbarhet av patogenesen av septisk peritonitt. Denne modellen er nyttig for å studere immunologiske responser under bakteriell sepsis, rollene til forskjellige gener i sykdomsprogresjon, og effekten av legemidler for å dempe sepsis.
Introduction
Sepsis er definert som en dysregulert systemisk inflammatorisk og immunrespons på mikrobiell invasjon eller vevsskade, noe som fører til organskade fjernt fra infeksjonsstedet eller skaden. Septisk sjokk er en undergruppe av sepsis preget av hypotensjon som vedvarer under volumredning, med en betydelig økt risiko for dødelighet1. Allmennheten har blitt mer oppmerksom på denne lidelsen under COVID-19-pandemien. Til tross for sin høye assosierte dødelighet mangler omfattende epidemiologiske data om den globale byrden av sepsis på grunn av kompleksiteten i diagnosen. I 2017 var det 48,9 millioner sepsisforekomster og 11 millioner dødsfall over hele verden, noe som utgjorde 19,7% av alle globale dødsfall2. Videre fant en studie om utvidet forekomst av infeksjon og relatert sepsis hos intensivpasienter at 62% av de positive isolasjonene fra pasienter var Gram-negative organismer3.
I utgangspunktet fokuserte undersøkelsene på sepsis på avgrensing av mikrobiell patogenese. Men å forstå "farehypotesen", som dikterer hvordan verten skiller seg selv og ikke-selv, førte til tilting av balansen mellom sepsisforskning mot å forstå vertsresponsen på et invaderende patogen. De mye brukte musene modeller av sepsis inkluderer lipopolysakkarid (LPS)-indusert endotoksemi modell, polymikrobielle sepsis modeller, cecal ligation og punktering (CLP) og kolon ascendens stent peritonitt (CASP), og monobakterielle infeksjonsmodeller4.
Vi har standardisert et musemodellsystem ved å indusere peritoneal sepsis ved hjelp av Salmonella Typhimurium. Denne modellen er fordelaktig over andre fordi Salmonella Typhimurium er et intracellulært patogen som etterligner den klinisk relevante tilstanden til Gram-negativ sepsis. Utfallet av peritonitt sepsis i denne modellen er systemisk, med 100% dødelighet innen 96 timer etter infeksjon. Derfor er denne modellen medvirkende til å studere de inflammatoriske og dødelige vertsresponsene. I denne modellen induseres sepsis ved intraperitoneally injisering av 0,5 millioner kolonidannende enheter (CFU) av Salmonella Typhimurium i en 8-10 uker gammel C57BL / 6 mus. Systemisk infeksjon kan bekreftes ved å vurdere organbakteriell byrde ~ 16 timer etter infeksjon. Denne artikkelen demonstrerer Salmonella Typhimurium-indusert peritonitt sepsis hos mus, karakteriserer de resulterende endringene i peritoneal cellesammensetning, og kvantifiserer bakteriell byrde i forskjellige organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter med Salmonella Typhimurium ble utført i Bio Safety Level 2 (BSL-2) anlegg. Det må utvises forsiktighet for å bruke riktig personlig verneutstyr (PVU), sikre sikkerhet og følge standard BSL-2 biofare avhendingsmetoder. Alle museeksperimenter ble utført etter retningslinjer fastsatt av Institutional Animal Ethics Committee, IISc. Mus ble oppdrettet og vedlikeholdt ved Central Animal Facility of IISc (Registreringsnummer: 48/1999/CPCSEA, datert 03.01.1999), godkjent av Miljø- og skogdepartementet, Indias regjering. De eksperimentelle protokollene ble godkjent av Komiteen for formål og kontroll og tilsyn med forsøk på dyr med godkjent tillatelsesnummer CAF/Etikk/797/2020.
BSL2-definisjon: En BSL2-vurdering representerer at biofarlige midler utgjør en moderat trussel mot miljøet og laboratoriepersonalet5.
1. Kultur forberedelse av Salmonella Typhimurium
- Tilsett 100 μL Salmonella Typhimurium NCTC 12023 glyserol lager til 3 ml Luria Bertani (LB) buljong. Inkuber kulturen ved 160 o/min ved 37 °C over natten.
- Streak 50 μL av den over natten dyrket kultur i LB buljong på en Salmonella Shigella (SS) agar plate og inkubere ved 37 °C i ~12 timer. Oppbevar SS agarplaten med bakteriekoloniene ved 4 °C i flere dager før in vivo-infeksjonseksperimentet.
- Velg en enkelt koloni fra den stripete SS agarplaten ved hjelp av en mikrotip. Løs ut mikrotipset i 3 ml LB buljong og kultur ved 160 o/min ved 37 °C over natten.
- Tilsett 0,1 ml av bakteriekulturen til 50 ml LB buljong og inkuber ved 37 °C i en shaker-inkubator ved 160 o/min i 3-4 timer for å nå den logaritmiske vekstfasen. Fortynn kulturen med en faktor på 2 ved hjelp av LB buljong.
MERK: I den logaritmiske fasen er bakterieceller på sitt beste og deler seg aktivt. - Mål kulturens optiske tetthet (OD) ved 600 nm bølgelengde i et spektrofotometer eller mikroplateleser. Når OD når 1,0, lag to aliquots av 1 ml kultur i 1,5 ml mikrofugerør.
- Sentrifuger rørene på 7750 × g i 15 min. Kast supernatanten og vask pelletsen med 1 ml 1x PBS 2x. Sentrifuger rørene på 7750 × g i 15 min.
- Resuspend pellet i 0,5 ml 1x PBS i to forskjellige 1,5 ml mikrofugerør. Kombiner suspensjonene fra begge rørene i ett 1,5 ml rør som nå inneholder ~2 × 108 kolonidannende enheter (CFU)/ml.
- Forbered en bakteriell celle suspensjon på 1 × 106 CFU / ml ved å fortynne denne lagerløsningen.
FORSIKTIG: Optimaliser CFU tilsvarende OD under spesifikke laboratorieforhold for å bestemme CFU for OD 1.0 før du starter forsøkene.
2. Mus og infeksjoner
- Hus 8-10 uker gamle mannlige C57BL / 6 mus som veier ~ 20 g i renluftsrommet på dyreanlegget i flere dager for akklimatisering.
- På infeksjonsdagen holder du musen med en hånd, tørker bukhuden med 70% etanol og sprer bakbenene for bedre tilgjengelighet av bukveggen.
- Injiser 0,5 ml 1 × 106 CFU/ml bakteriell suspensjon intraperitonealt ved hjelp av en 1 ml sprøyte. Derfor mottar hver mus 5 × 105 CFU. Kontroll, uinfiserte mus får 0,5 ml PBS alene. Etter infeksjon, plate kulturen for å sjekke den faktiske CFU injisert, som kan variere fra 0,2-0,8 millioner CFU / 0,5 ml.
- Sett musene tilbake i burene som tildelt.
- Ofre musene ved hjelp av CO 2-kvelning ~ 12-18 h postinfeksjon for best respons. Vanligvis dør alle infiserte mus innen 96 timer. Under noen eksperimentelle intervensjoner kan noen mus overleve. Euthanize disse musene etter 96 timer. Avlivet også enhver mus med en kroppstemperatur under 33,2 °C og akutt nød ved 96 timer som et humant endepunkt.
MERK: I denne modellen kan noen mus begynne å dø etter 12 timers Salmonella-injeksjon . Planlegg derfor eksperimenter som involverer flere tidspunkter på riktig måte.
3. CFU-vurdering av organer
- Ofre den infiserte musen ved CO 2-kvelning, og tørk magen med et stykke bomull dyppet i 70% etanol. Klipp åpne bukhuden. Se artikkelen av Ray og Dittel for en videoprotokoll om hvordan du samler peritoneal lavagevæske6. Klipp åpne bukhulen og samle organer av interesse for mikrofuge rør. I tillegg, som blodet i mus med sepsis blir koagulert raskt og mengdene er lave, samle det raskt etter ofring.
MERK: Denne videoen demonstrerer opplisting av organ CFU fra leveren som leveren gjennomgår omfattende histopatologiske skader i denne modellen av sepsis. - Klipp et lite stykke av leveren og legg den i et mikrofugerør.
MERK: Dette kan oppbevares på is i maksimalt 2-3 timer før du går videre til neste trinn. - Vei og overfør brikkene til mikrocentrifuge rør. Fortrinnsvis kutt stykker som veier ~ 10-15 mg for riktig homogenisering. Bruk hele organer i tilfelle av mindre som mesenteriske lymfeknuter (MLNer) eller thymus.
- Tilsett 0,5 ml 1x PBS i røret og homogeniser organene ved hjelp av en håndhomogenisator. Pass på at organene er helt homogenisert. Utgjør volumet til 1 ml ved å legge til 0,5 ml 1x PBS.
- Sentrifuger rørene ved 200 × g i 5 min ved 4 °C.
- Samle supernatanten i friske mikrofunksjonsrør og lag fortynning på 1 × 10−1 og 10−2 i en 96-brønnsplate.
- Spred 50 μL av fortynningsmiddelet på friske SS agarplater og inkuber platene ved 37 °C i 12 timer.
- Tell antall kolonier som vises i hver tilstand, og normaliser dataene med organvekten ved hjelp av ligning (1):
CFU/mg =
(1)
MERK: Tallet 20 brukes i formelen til å konvertere koloniene per plate til CFU/ml. Dette tallet er ankommet ved å dele 1 ml med mengden av et gitt volum av kulturen belagt i dette tilfellet, 50 μL.
For eksempel, hvis 100 kolonier finnes i en SS agarplate, hvor 50 μL av en 1 × 10-1 fortynning av et homogenisert organ som veier 10 mg, deretter
CFU/mg =
(1)
4. Strømningscytometrisk analyse av ulike immuncellepopulasjoner i bukhinneekssudat
- Samle peritoneal cellene som beskrevet tidligere av Ray og Dittel6.
- Resuspend cellepellet fra peritoneal lavagevæske i 1 ml RPMI supplert med 10% foster bovint serum (FBS). Nummerer de totale celletallene i bukskytealtoalen ved hjelp av et hemocytometer. Juster cellenummeret slik at hvert rør mottar 0,2-0,5 millioner celler.
MERK: Peritoneal lavage hos mus med sepsis kan inneholde RBCer, som sannsynligvis vises på grunn av blødning. Vær forsiktig med å ekskludere RBCer mens du teller peritoneale celler. I brightfield-mikroskopet ser RBCer mye mindre ut enn immuncellene. Disse vises som flate disker eller smultringer, runde, med innrykk i midten, men ikke hul. Et trinn for å lyse RBCer kan legges til7. - Snurr cellene ned ved 200 × g ved 4 °C i 10 minutter, kast supernatanten og vask cellene 1x med 1x kald PBS. Sentrifuger cellene ved 200 × g ved 4 °C i 10 minutter.
- Blokker Fc-reseptorene på PECer ved hjelp av FcR-blokkering (1:400 fortynning), fremstilt i blokkeringsbuffer bestående av 5% FBS og 0,02% natriumazid i PBS. Inkuber på is i 15 min.
- Sentrifuger cellene ved 200 × g ved 4 °C i 10 minutter. Kast supernatanten. Fortynn de fluorokromkonjugede antistoffene av interesse for blokkering av buffer. Bruk en 1:500 fortynning av antimus LY6G for å flekke nøytrofiler.
MERK: Andre immuncellepopulasjoner kan også oppdages ved hjelp av for eksempel antimus B220 for B-celler, antimus CD3 for T-celler og antimus F4/80 for makrofager. - Inkuber ~0,2 millioner celler i 200 μL av de fortynnede løsningene av antistoffer i separate rør. Som en negativ kontroll, sett av ett rør i hver fluorokromtype for den uoppdagede kontrollen for å inkubere cellene med 200 μL blokkeringsbuffer uten antistoff.
- Inkuber prøvene på is i 45 min med periodisk tapping hvert 15.
- Sentrifuger cellene ved 200 × g i 10 min ved 4 °C. Kast supernatanten. Fest cellene med 4% paraformaldehyd i ~ 15 min ved romtemperatur hvis de må lagres i flere dager. Det er imidlertid best å innhente data fra nyfargede prøver i et strømningscytometer.
- Resuspend cellene i 200 μL av FACS farging buffer (2% FBS i PBS). Hent dataene i et strømningscytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En detaljert karakterisering av vertens immunrespons ved hjelp av denne modellen er vist i tidligere publikasjoner 8,9. Noen få representative resultater av den beskrevne protokollen er avbildet i denne delen. Denne modellen tar sikte på å indusere systemisk infeksjon av S. Typhimurium ved intraperitoneal injeksjon av bakteriekulturen for å indusere sepsis. For å bekrefte infeksjonen ble lysatene i leveren og milten fra septiske mus spredt på SS agarplater, og antall kolonier ble talt. I figur 1 indikerer bildene av SS agarplater organet CFU byrde i leveren og milten av septiske mus. De homogeniserte organlysene ble spredt ved en fortynning på 1 × 10-1 og inkubert ved 37 °C. Den svarte pigmenterte S. Typhimurium kolonier dukket opp etter ~ 12 h inkubasjon ved 37 °C. Videre, ved infeksjon av mus, rapporteres kulturer fra blod og bukenal lavage å være positive for bakterielle celler8. Disse resultatene indikerte at de intraperitonealt injiserte bakteriecellene spredte seg systemisk og koloniserte de indre organene. En del av platen vises som et innfellingssett med zoom for å markere koloniene. Patogenet spredte seg systemisk og koloniserte de indre organene.
Figur 2 viser sera isolert fra sunne og septiske mus. Volumet av samleblod gjennom hjerte punktering fra septiske mus er vanligvis 100-200 μL, som er lavere enn mengden fra sunne mus, hvor ~ 500 μL blod kan oppnås. Som et resultat er serumvolumet isolert fra septisk museblod lavt. Dette fenomenet skjer på grunn av økt koagulasjon av blodet i septikmus. Videre viser sera fra septiske mus tydelig rød farge, noe som indikerer forekomsten av omfattende hemolyse 8,9.
Som vist i figur 3 ble strømningscytometribasert immunofenotyping av peritoneale ekssudatceller utført for å vurdere infiltrasjon av nøytrofiler i bukhulen av sunne og septiske mus. Som nøytrofiler uttrykker LY6G protein på celleoverflaten, FITC-merket anti-LY6G antistoff ble brukt til å flekke nøytrofil celle populasjonen. Disse bildene representerer data fra en sunn og to infiserte mus. Etter datainnsamling ble cellene inngjerdet for å inkludere bare singlets i en FSC-A versus SSC-A-tomt. Deretter ble histogramplottene og prikkplottet tegnet. Her viste septikmusene økt infiltrasjon av nøytrofiler i bukhulen.
Figur 1: Visualisering av organ CFU etter infeksjon. Organer ble homogenisert som beskrevet i protokollen. Lysatet ble spredt på SS agarplater ved hjelp av en spreder. Bilder av plater spredt med en 1 × 10-1 fortynning av homogeniserte lysater av (A) lever og (B) milt. En del av platen vises som en zoomet innfelling for å markere koloniene. Innfelt forstørrelse = 13x (område). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Forbedret hemolyse hos septikmus. Blodet ble samlet inn i mikrocentrifuge rør og forlatt uforstyrret ved romtemperatur i 30 min. Blodproppen ble fjernet ved å sentrifugere rørene ved 2000 × g i 10 min i en nedkjølt sentrifuge. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Strømningscytometrisk profilering av nøytrofilpopulasjon i bukskytal lavagevæske. Peritoneal lavagevæske ble samlet inn 16 timer etter infeksjon. Bukhinnecellene ble farget med FITC-merket anti-LY6G antistoff. Septiske mus viste økt infiltrasjon av nøytrofiler i bukhulen. Forkortelser: FITC = fluorescein isothiocyanate; LY6G = lymfocyttantigen 6 kompleks locus G6D; SSC-A = sidespredningsområde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver en metode for å indusere en alvorlig form for bakteriell sepsis ved intraperitoneal injeksjon av Salmonella Typhimurium. Denne modellen er fordelaktig over andre da Salmonella Typhimurium er et intracellulært patogen og dermed svært patogen, etterligner den klinisk relevante tilstanden til Gram-negativ sepsis. Utfallet av peritonitt sepsis i denne modellen er systemisk, med 100% dødelighet innen 96 timer etter infeksjon. Derfor er denne modellen medvirkende til å studere de inflammatoriske og dødelige vertsresponsene8 og effekten av terapeutisk inngrep i demping av sepsis.
I dette modellsystemet endres den cellulære sammensetningen av bukhulen dramatisk for å bekjempe det inokulerte patogenet. Et stort antall LY6G+ nøytrofiler infiltrerer bukhulen, med en samtidig reduksjon i F4/80+ makrofager, noe som resulterer i makrofagforsvinningsreaksjonen (MDR) 8,10. Derfor er denne modellen nyttig for å studere kinetiske endringer i immuncellesammensetninger og funksjoner under sepsis, som fortsatt er et enormt uutforsket område. Salmonella Typhimurium infiserer, ligger i og sprer seg i musenes organer. Serumproinflammatoriske cytokiner som TNF-α, IL-6 og IFN-γ også øke8. En kaskade av proinflammatoriske responser fører også til hemolyse og koagulasjon av blodet, som blir synlig ved disseksjon av de infiserte musene10,11. Samspillet mellom vertsresponsen på denne bakterielle byrden og de skadelige effektene av bakteriene fører til disfigured vevsarkitektur, tap av funksjoner og vevnekrose, spesielt i leveren.
Videre har tidligere rapporter fra laboratoriet vist at slike effekter moduleres av det oppregulerte uttrykket for nitrogenoksidsyntase 2 (NOS2), noe som fører til økt reaktiv oksygenart (ROS) og høyere nivåer av proinflammatoriske cytokiner, noe som fører til en forbedret inflammatorisk respons8. Denne musen sepsis modellen er fordelaktig over andre fordi induksjon av sepsis er raskere med mer dødelige effekter. Det krever ikke teknisk ekspertise for å utføre operasjonen på bedøvede mus, som det er tilfelle med den nåværende gullstandard CLP-sepsis musemodellen. I CLP-sepsis-modellen utvikler bare en undergruppe av mus sepsis, mens alle mus utvikler sepsis i modellen som er beskrevet her.
Videre, sammenlignet med den LPS-induserte endotoksemi sepsis-modellen, er denne modellen mer klinisk relevant for Gram-negativ monobakteriell sepsis. Modellen er også nyttig for å forstå økningen i intracellulær ROS, proinflammatoriske cytokinnivåer, hemolyse og blodkoagulasjon, som alle skjer under sepsis. Det rapporteres at bruk av nitrogenoksid donor stoffet DETA-NONOate gir en overlevelse fordel i Nos2 knockout mus med sepsis ved hjelp av denne modellen8. Dette antyder at denne modellen kan brukes til å identifisere nye stoffer for å behandle sepsis. Denne modellen kan også raskt vedtas av ethvert laboratorium utstyrt med BSL-2-anlegg.
Når du bruker denne modellen, må forholdsregler tas på nivået av bakteriell cellehelse og CFU-nummeret for å oppnå optimale resultater. Man bør alltid bruke nystripete Salmonella-kolonier fra SS agarplater. Det anbefales også å optimalisere prosessen med kulturforberedelse ved å finne OD-verdien i spektrofotometeret som tilsvarer nevnte CFU.
Ulempen med å bruke denne modellen er at effekten av sepsis hos mus er intenst dødelig innen 96 timer etter infeksjon. Dette begrenser studiet av vertsimmuneresponser på sene tidspunkter. Det kan overvinnes ved å bruke en mer svekket bakteriestamme av Salmonella Typhimurium.
Det er forskjeller mellom menneskelige pasienter som lider av sepsis og musmodeller som forsøker å etterligne menneskelig sepsis. For eksempel tar pasienter lengre tid å utvikle sepsis og blir satt på støttende intervensjoner og terapeutiske stoffer. Sepsis i musemodeller utvikler seg imidlertid mye raskere, og støttende intervensjoner gjøres ikke4. Imidlertid er det noen likheter mellom sepsis hos mennesker og mus, med pasienter med sepsis som viser høyere nivåer av proinflammatoriske cytokiner, blodkoagulasjon og hemolyse i kliniske omgivelser. Alle disse er mimicked i denne musemodellen av sepsis. Derfor er noen avlesninger av denne modellen relevante for kliniske scenarier, selv om en direkte korrelasjon kanskje ikke er tilrådelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Central Animal Facility, IISc for å forsyne oss med mus for forskning. Denne studien ble finansiert av tilskudd til DpN fra Institutt for bioteknologi og vitenskaps- og ingeniørforskning, Regjeringen i India. Den infrastrukturelle støtten fra DBT-IISc-programmet og DST-FIST-tilskudd er sterkt anerkjent. Vi takker alle tidligere og nåværende medlemmer av DpN-laboratoriet for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | - | - | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
