Summary
Detta protokoll beskriver induktionen av gramnegativ monobakteriell sepsis i ett musmodellsystem. Modellen är användbar för att undersöka de inflammatoriska och dödliga värdsvaren under sepsis.
Abstract
Sepsis är ett dysreglerat värdimmunsvar mot mikrobiell invasion eller vävnadsskada, vilket leder till organskada på en plats som är avlägsen från infektionen eller skadan. För närvarande inkluderar de allmänt använda mössmodellerna av sepsis lipopolysackarid (LPS) -inducerad endotoxemi, cecal ligering och punktering (CLP) och monobakteriella infektionsmodellsystem. Detta protokoll beskriver en metod för att studera värdsvaren under Salmonella Typhimurium-infektionsinducerad septisk peritonit hos möss. S. Typhimurium, en gramnegativ intracellulär patogen, orsakar tyfusliknande sjukdom hos möss.
Detta protokoll utarbetar odlingspreparatet, induktion av septisk peritonit hos möss genom intraperitoneal injektion och metoder för att studera systemiska värdsvar. Vidare presenteras bedömningen av bakteriebördan i olika organ och flödescytometrisk analys av ökat neutrofiltal i peritonealsköljningen. Salmonella Typhimuriuminducerad sepsis hos möss leder till en ökning av proinflammatoriska cytokiner och snabb infiltration av neutrofiler i bukhålan, vilket leder till lägre överlevnad.
Varje steg i detta protokoll har optimerats, vilket resulterar i hög reproducerbarhet av patogenesen av septisk peritonit. Denna modell är användbar för att studera immunologiska svar under bakteriell sepsis, olika geners roller i sjukdomsprogression och effekterna av läkemedel för att dämpa sepsis.
Introduction
Sepsis definieras som ett dysreglerat systemiskt inflammatoriskt och immunsvar mot mikrobiell invasion eller vävnadsskada, vilket leder till organskada långt från infektionsstället eller skadan. Septisk chock är en delmängd av sepsis som kännetecknas av hypotoni som kvarstår under volymåterupplivning, med en väsentligt ökad risk för dödlighet1. Allmänheten har blivit mer medveten om denna sjukdom under COVID-19-pandemin. Trots sin höga associerade dödlighet saknas omfattande epidemiologiska data om den globala bördan av sepsis på grund av komplexiteten i diagnosen. År 2017 fanns det 48,9 miljoner sepsisincidenser och 11 miljoner dödsfall över hela världen, vilket motsvarar 19,7% av alla globala dödsfall2. Vidare fann en studie om den förlängda prevalensen av infektion och relaterad sepsis hos intensivvårdspatienter att 62% av de positiva isolaten från patienter var gramnegativa organismer3.
Inledningsvis fokuserade undersökningarna om sepsis på att avgränsa mikrobiell patogenes. Att förstå "farohypotesen", som dikterar hur värden skiljer sig från jag och icke-själv, ledde dock till att balansen i sepsisforskningen lutades mot att förstå värdens svar på en invaderande patogen. De allmänt använda mössmodellerna av sepsis inkluderar lipopolysackarid (LPS) -inducerad endotoxemimodell, polymikrobiella sepsismodeller, cecal ligering och punktering (CLP) och kolonascendens stent peritonit (CASP) och monobakteriella infektionsmodeller4.
Vi har standardiserat ett musmodellsystem genom att inducera peritoneal sepsis med Salmonella Typhimurium. Denna modell är fördelaktig jämfört med andra eftersom Salmonella Typhimurium är en intracellulär patogen som efterliknar det kliniskt relevanta tillståndet för gramnegativ sepsis. Resultatet av peritonit sepsis i denna modell är systemisk, med 100% dödlighet inom 96 h efter infektion. Därför är denna modell avgörande för att studera de inflammatoriska och dödliga värdsvaren. I denna modell induceras sepsis genom att intraperitonealt injicera 0,5 miljoner kolonibildande enheter (CFU) av Salmonella Typhimurium i en 8-10 veckor gammal C57BL/6 mus. Systemisk infektion kan bekräftas genom att bedöma organbakteriell börda ~ 16 h efter infektion. Denna artikel visar Salmonella Typhimurium-inducerad peritonit sepsis hos möss, karakteriserar de resulterande förändringarna i peritoneal cellkomposition och kvantifierar bakteriebördan i olika organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med Salmonella Typhimurium utfördes i biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) anläggningar. Försiktighet måste vidtas för att använda korrekt personlig skyddsutrustning (PPE), säkerställa säkerheten och följa standard BSL-2 biohazard bortskaffningsmetoder. Alla mössexperiment utfördes enligt riktlinjer från Institutionella djurförsöksetiska kommittén, IISc. Möss föddes upp och underhålls vid IISc: s centrala djuranläggning (registreringsnummer: 48/1999/CPCSEA, daterad 1/3/1999), godkänd av ministeriet för miljö och skog, Indiens regering. Försöksprotokollen godkändes av Kommittén för ändamål och kontroll och övervakning av djurförsök med det godkända tillståndsnumret CAF/Ethics/797/2020.
BSL2-definition: En BSL2-klassificering representerar att de biofarliga medlen utgör ett måttligt hot mot miljön och laboratoriepersonalen5.
1. Odlingsberedning av Salmonella Typhimurium
- Tillsätt 100 μL Salmonella Typhimurium NCTC 12023 glycerolbuljong till 3 ml Luria Bertani (LB) buljong. Inkubera kulturen vid 160 rpm vid 37 °C över natten.
- Stryk 50 μL av den över natten odlade kulturen i LB-buljong på en Salmonella Shigella (SS) agarplatta och inkubera vid 37 ° C i ~ 12 timmar. Förvara SS-agarplattan med bakteriekolonierna vid 4 °C i flera dagar före infektionsexperimentet in vivo .
- Välj en enda koloni från den strimmiga SS-agarplattan med en mikrotip. Mata ut mikrotoppen i 3 ml LB-buljong och kultur vid 160 rpm vid 37 °C över natten.
- Tillsätt 0,1 ml av bakteriekulturen till 50 ml LB-buljong och inkubera vid 37 °C i en skakinkubator vid 160 rpm i 3-4 timmar för att nå den logaritmiska tillväxtfasen. Späd kulturen med en faktor 2 med LB-buljong.
OBS: Under den logaritmiska fasen är bakterieceller vid sin bästa hälsa och delar sig aktivt. - Mät kulturens optiska densitet (OD) vid 600 nm våglängd av ljus i en spektrofotometer eller mikroplattläsare. När OD når 1,0, gör två alikvoter av 1 ml kultur i 1,5 ml mikrofugerör.
- Centrifugera rören vid 7 750 × g i 15 min. Kassera supernatanten och tvätta pelleten med 1 ml 1x PBS 2x. Centrifugera rören vid 7 750 × g i 15 min.
- Resuspendera pelleten i 0,5 ml 1x PBS i två olika 1,5 ml mikrofugerör. Kombinera suspensionerna från båda rören till ett 1,5 ml rör som nu innehåller ~ 2 × 108 kolonibildande enheter (CFU) / ml.
- Bered en bakteriecellsuspension på 1 × 106 CFU/ml genom spädning av denna stamlösning.
VARNING: Optimera CFU motsvarande OD under specifika laboratorieförhållanden för att bestämma CFU för OD 1.0 innan experimenten påbörjas.
2. Möss och infektioner
- Hus 8-10 veckor gamla hanar C57BL/6 möss som väger ~ 20 g i renluftsrummet på djuranläggningen i flera dagar för acklimatisering.
- På infektionsdagen, håll musen med en hand, torka bukhuden med 70% etanol och sprid bakbenen för bättre tillgänglighet i bukväggen.
- Injicera 0,5 ml 1 × 106 CFU/ml bakteriesuspension intraperitonealt med hjälp av en 1 ml spruta. Därför får varje mus 5 × 105 CFU. Kontroll, oinfekterade möss får 0,5 ml PBS ensam. Efter infektion, platta kulturen för att kontrollera den faktiska CFU injicerade, som kan variera från 0,2-0,8 miljoner CFU / 0,5 ml.
- Sätt tillbaka mössen i burarna enligt anvisningarna.
- Offra mössen med CO 2-kvävning ~ 12-18 h efter infektion för bästa svar. Vanligtvis dör alla infekterade möss inom 96 h. Under vissa experimentella ingrepp kan vissa möss överleva. Avliva dessa möss efter 96 h. Avliva också alla mus med en kroppstemperatur under 33,2 °C och akut nöd vid 96 timmar som ett humant effektmått.
OBS: I den här modellen kan vissa möss börja dö efter 12 timmars Salmonella-injektion . Planera därför experiment ordentligt med flera tidpunkter.
3. CFU-bedömning av organ
- Offra den infekterade musen genom CO 2-kvävning och torka buken med en bit bomull doppad i 70% etanol. Skär upp bukhuden. Se artikeln av Ray och Dittel för ett videoprotokoll om hur man samlar peritoneal sköljvätska6. Skär upp bukhålan och samla organen av intresse i mikrofugerör. Dessutom, eftersom blodet hos möss med sepsis blir koagulerat snabbt och mängderna är låga, samla det snabbt efter att ha offrats.
OBS: Denna video visar uppräkningen av organ CFU från levern eftersom levern genomgår omfattande histopatologisk skada i denna modell av sepsis. - Skär en liten bit av levern och placera den i ett mikrofugerör.
OBS: Detta kan förvaras på is i max 2-3 h innan du går vidare till nästa steg. - Väg och överför bitarna till mikrocentrifugrör. Skär helst bitar som väger ~ 10-15 mg för korrekt homogenisering. Använd hela organ när det gäller mindre som de mesenteriska lymfkörtlarna (MLN) eller tymus.
- Tillsätt 0,5 ml 1x PBS till röret och homogenisera organen med en handhomogenisator. Se till att organen är helt homogeniserade. Fyll på volymen till 1 ml genom att tillsätta 0,5 ml 1x PBS.
- Centrifugera rören vid 200 × g i 5 min vid 4 °C.
- Samla supernatanten i färska mikrofugerör och förbered utspädningar på 1 × 10-1 och 10-2 i en 96-brunnsplatta.
- Sprid 50 μL spädningsvätska på färska SS-agarplattor och inkubera plattorna vid 37 °C i 12 timmar.
- Räkna antalet kolonier som visas i varje tillstånd och normalisera data med organvikten med hjälp av ekvation (1):
CFU/mg =
(1)
OBS: Siffran 20 används i formeln för att konvertera kolonierna per platta till CFU / ml. Detta tal uppnås genom att dividera 1 ml med mängden av en given volym av den kulturpläterade - i detta fall 50 μL.
Till exempel, om 100 kolonier finns i en SS-agarplatta, där 50 μL av en 1 × 10-1 utspädning av ett homogeniserat organ som väger 10 mg sprids, sprids då
CFU/mg =
(1)
4. Flödescytometrisk analys av olika immuncellpopulationer i peritonealt exsudat
- Samla peritonealcellerna som beskrivits tidigare av Ray och Dittel6.
- Resuspendera cellpelleten från peritonealsköljningsvätska i 1 ml RPMI kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). Räkna upp det totala cellantalet i peritonealsköljningen med hjälp av en hemocytometer. Justera cellnumret så att varje rör får 0,2-0,5 miljoner celler.
OBS: Peritonealsköljning hos möss med sepsis kan innehålla RBC, som troligen uppträder på grund av blödning. Var noga med att utesluta RBC när du räknar peritoneala celler. I ljusfältmikroskopet verkar RBC: er mycket mindre än immuncellerna. Dessa visas som platta skivor eller munkar, runda, med en indragning i mitten, men inte ihåliga. Ett steg för att lyse RBC kan läggas till7. - Snurra ner cellerna vid 200 × g vid 4 °C i 10 minuter, kassera supernatanten och tvätta cellerna 1x med 1x kall PBS. Centrifugera cellerna vid 200 × g vid 4 °C i 10 minuter.
- Blockera Fc-receptorerna på PEC med fcR-blockerare (1:400 utspädning), framställd i blockerande buffert bestående av 5% FBS och 0,02% natriumazid i PBS. Inkubera på is i 15 min.
- Centrifugera cellerna vid 200 × g vid 4 °C i 10 minuter. Kassera supernatanten. Späd de fluorokromkonjugerade antikropparna av intresse för att blockera buffert. Använd en 1:500 utspädning av antimus LY6G för att färga neutrofilerna.
OBS: Andra immuncellpopulationer kan också detekteras med hjälp av till exempel anti-mus B220 för B-celler, anti-mus CD3 för T-celler och anti-mus F4 / 80 för makrofager. - Inkubera ~0,2 miljoner celler i 200 μl av de utspädda lösningarna av antikroppar i separata rör. Som en negativ kontroll, avsätt ett rör i varje fluorokromtyp för den oskadade kontrollen för att inkubera cellerna med 200 μL blockerande buffert utan antikropp.
- Inkubera proverna på is i 45 min med intermittent tappning var 15: e minut.
- Centrifugera cellerna vid 200 × g i 10 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten. Fixa cellerna med 4% paraformaldehyd i ~ 15 min vid rumstemperatur om de behöver lagras i flera dagar. Det är dock bäst att skaffa data från nyfärgade prover i en flödescytometer.
- Resuspendera cellerna i 200 μL FACS-färgningsbuffert (2% FBS i PBS). Hämta data i en flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En detaljerad karakterisering av värdens immunsvar med hjälp av denna speciella modell visas i tidigare publikationer 8,9. Några representativa resultat av det beskrivna protokollet visas i det här avsnittet. Denna modell syftar till att inducera systemisk infektion av S. Typhimurium genom intraperitoneal injektion av bakteriekulturen för att inducera sepsis. För att bekräfta infektionen spreds leverens och mjältens lysater från septiska möss på SS-agarplattor och antalet kolonier räknades. I figur 1 indikerar bilderna av SS-agarplattor organets CFU-börda i levern och mjälten hos septiska möss. De homogeniserade organlysaterna spreds vid en utspädning av 1 × 10−1 och inkuberades vid 37 °C. Den svartpigmenterade S. Typhimuriumkolonier uppträdde efter ~12 timmars inkubation vid 37 °C. Vid infektion av möss rapporteras dessutom kulturerna från blod- och peritonealsköljning vara positiva för bakterieceller8. Dessa resultat indikerade att de intraperitonealt injicerade bakteriecellerna disseminerade systemiskt och koloniserade de inre organen. En del av plattan visas som en inzoomad insats för att markera kolonierna. Patogenen sprids framgångsrikt systemiskt och koloniserade de inre organen.
Figur 2 visar serum isolerade från friska och septiska möss. Volymen samlarbart blod genom hjärtpunktion från septiska möss är vanligtvis 100-200 μL, vilket är lägre än mängden från friska möss, där ~ 500 μL blod kan erhållas. Som ett resultat är serumvolymen isolerad från septiskt musblod låg. Detta fenomen händer på grund av ökad koagulering av blodet hos septiska möss. Dessutom visar serum från septiska möss distinkt röd färg, vilket indikerar förekomsten av omfattande hemolys 8,9.
Som visas i figur 3 utfördes flödescytometribaserad immunofenotypning av peritoneala exsudatceller för att bedöma infiltrationen av neutrofiler i bukhålan hos friska och septiska möss. Eftersom neutrofiler uttrycker LY6G-protein på cellytan användes FITC-taggad anti-LY6G-antikropp för att färga neutrofilcellpopulationen. Dessa bilder representerar data från en frisk och två infekterade möss. Efter datainsamlingen gatedades cellerna för att endast inkludera singlets i ett FSC-A kontra SSC-A-diagram. Därefter ritades histogramplottarna och punktdiagrammet. Här visade septiska mössen ökad infiltration av neutrofiler i bukhålan.
Figur 1: Visualisering av organ CFU efter infektion. Organ homogeniserades enligt beskrivningen i protokollet. Lysaten spreds på SS-agarplattor med hjälp av en spridare. Bilder av plattor spridda med en 1 × 10-1 utspädning av homogeniserade lysater av (A) lever och (B) mjälte. En del av plattan visas som en zoomad insats för att markera kolonierna. Infälld förstoring = 13x (yta). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Förbättrad hemolys hos septiska möss. Blodet samlades upp i mikrocentrifugrör och lämnades ostört vid rumstemperatur i 30 minuter. Proppen avlägsnades genom centrifugering av rören vid 2 000 × g i 10 minuter i en kylcentrifug. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Flödescytometrisk profilering av neutrofilpopulationen i peritoneal sköljvätska. Peritoneal sköljvätska samlades 16 h efter infektion. Peritonealcellerna färgades med FITC-taggad anti-LY6G-antikropp. Septiska möss visade ökad infiltration av neutrofiler i bukhålan. Förkortningar: FITC = fluoresceinisotiocyanat; LY6G = lymfocytantigen 6 komplex locus G6D; SSC-A = sidospridningsområde. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel beskriver en metod för att inducera en allvarlig form av bakteriell sepsis genom intraperitoneal injektion av Salmonella Typhimurium. Denna modell är fördelaktig jämfört med andra eftersom Salmonella Typhimurium är en intracellulär patogen och därmed högpatogen, som efterliknar det kliniskt relevanta tillståndet för gramnegativ sepsis. Resultatet av peritonit sepsis i denna modell är systemisk, med 100% dödlighet inom 96 h efter infektion. Därför är denna modell avgörande för att studera de inflammatoriska och dödliga värdsvaren8 och effekterna av terapeutisk intervention för att dämpa sepsis.
I detta modellsystem förändras den cellulära sammansättningen av bukhålan dramatiskt för att bekämpa den inokulerade patogenen. Ett stort antal LY6G+ neutrofiler infiltrerar bukhålan, med en samtidig minskning av F4/80+ makrofager, vilket resulterar i makrofagens försvinnande reaktion (MDR)8,10. Därför är denna modell användbar för att studera de kinetiska förändringarna i immuncellsammansättningar och funktioner under sepsis, vilket fortfarande är ett mycket outforskat område. Salmonella Typhimurium infekterar systemiskt, bor i och sprider sig i organen hos möss. Serumproinflammatoriska cytokiner som TNF-α, IL-6 och IFN-γ också öka8. En kaskad av proinflammatoriska svar leder också till hemolys och koagulering av blodet, vilket blir synligt vid dissektion av de infekterade mössen10,11. Samspelet mellan värdens svar på denna bakteriebörda och bakteriernas skadliga effekter leder till vanställd vävnadsarkitektur, förlust av funktioner och vävnadsnekros, särskilt i levern.
Dessutom har tidigare rapporter från laboratoriet visat att sådana effekter moduleras av det uppreglerade uttrycket av kväveoxidsyntas 2 (NOS2), vilket leder till ökade reaktiva syrearter (ROS) och högre nivåer av proinflammatoriska cytokiner, vilket leder till ett förbättrat inflammatoriskt svar8. Denna mus sepsis modell är fördelaktig jämfört med andra eftersom induktionen av sepsis är snabbare med mer dödliga effekter. Det kräver inte teknisk expertis för att utföra operationen på sövda möss, vilket är fallet med den nuvarande guldstandarden CLP-sepsis musmodell. I CLP-sepsismodellen utvecklar endast en delmängd möss sepsis, medan alla möss utvecklar sepsis i den modell som beskrivs här.
Dessutom, jämfört med den LPS-inducerade endotoxemi sepsismodellen, är denna modell mer kliniskt relevant för gramnegativ monobakteriell sepsis. Modellen är också användbar för att förstå ökningarna av intracellulär ROS, proinflammatoriska cytokinnivåer, hemolys och blodkoagulation, som alla händer under sepsis. Det rapporteras att användningen av kväveoxiddonatorläkemedlet DETA-NONOate ger en överlevnadsfördel hos Nos2 knockout-möss med sepsis med denna modell8. Detta tyder på att denna modell kan användas för att identifiera nya läkemedel för att behandla sepsis. Denna modell kan också snabbt antas av alla laboratorier utrustade med BSL-2-anläggningar.
Vid användning av denna modell måste försiktighetsåtgärder vidtas på nivån av bakteriell cellhälsa och CFU-numret för att uppnå optimala resultat. Man bör alltid använda nystrimmade Salmonellakolonier från SS-agarplattor. Det rekommenderas också att optimera processen för odlingsberedning genom att hitta OD-värdet i spektrofotometern som motsvarar den nämnda CFU.
Nackdelen med att använda denna modell är att effekten av sepsis hos möss är intensivt dödlig inom 96 h efter infektion. Detta begränsar studien av värdimmunsvar vid sena tidpunkter. Det kan övervinnas genom att använda en mer försvagad bakteriestam av Salmonella Typhimurium.
Det finns skillnader mellan mänskliga patienter som lider av sepsis och mössmodeller som försöker efterlikna human sepsis. Till exempel tar patienter längre tid att utveckla sepsis och sätts på stödjande ingrepp och terapier. Sepsis i musmodeller utvecklas dock mycket snabbare, och stödjande ingrepp görs inte4. Det finns dock vissa likheter mellan sepsis hos människor och möss, med patienter med sepsis som visar högre nivåer av proinflammatoriska cytokiner, blodkoagulation och hemolys i kliniska miljöer. Alla dessa efterliknas i denna musmodell av sepsis. Därför är vissa avläsningar av denna modell relevanta för kliniska scenarier, även om en direkt korrelation kanske inte är tillrådlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Central Animal Facility, IISc för att ha försett oss med möss för forskning. Denna studie finansierades av anslag till DpN från Institutionen för bioteknik och vetenskap och teknik Research Board, Indiens regering. Infrastrukturstödet från DBT-IISc-programmet och DST-FIST-bidragen är mycket erkänt. Vi tackar alla tidigare och nuvarande medlemmar i DpN-labbet för deras stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | - | - | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
