Karakterisera salmonella Typhimurium-inducerad septisk peritonit hos möss
Summary
Detta protokoll beskriver induktionen av gramnegativ monobakteriell sepsis i ett musmodellsystem. Modellen är användbar för att undersöka de inflammatoriska och dödliga värdsvaren under sepsis.
Abstract
Sepsis är ett dysreglerat värdimmunsvar mot mikrobiell invasion eller vävnadsskada, vilket leder till organskada på en plats som är avlägsen från infektionen eller skadan. För närvarande inkluderar de allmänt använda mössmodellerna av sepsis lipopolysackarid (LPS) -inducerad endotoxemi, cecal ligering och punktering (CLP) och monobakteriella infektionsmodellsystem. Detta protokoll beskriver en metod för att studera värdsvaren under Salmonella Typhimurium-infektionsinducerad septisk peritonit hos möss. S. Typhimurium, en gramnegativ intracellulär patogen, orsakar tyfusliknande sjukdom hos möss.
Detta protokoll utarbetar odlingspreparatet, induktion av septisk peritonit hos möss genom intraperitoneal injektion och metoder för att studera systemiska värdsvar. Vidare presenteras bedömningen av bakteriebördan i olika organ och flödescytometrisk analys av ökat neutrofiltal i peritonealsköljningen. Salmonella Typhimuriuminducerad sepsis hos möss leder till en ökning av proinflammatoriska cytokiner och snabb infiltration av neutrofiler i bukhålan, vilket leder till lägre överlevnad.
Varje steg i detta protokoll har optimerats, vilket resulterar i hög reproducerbarhet av patogenesen av septisk peritonit. Denna modell är användbar för att studera immunologiska svar under bakteriell sepsis, olika geners roller i sjukdomsprogression och effekterna av läkemedel för att dämpa sepsis.
Introduction
Sepsis definieras som ett dysreglerat systemiskt inflammatoriskt och immunsvar mot mikrobiell invasion eller vävnadsskada, vilket leder till organskada långt från infektionsstället eller skadan. Septisk chock är en delmängd av sepsis som kännetecknas av hypotoni som kvarstår under volymåterupplivning, med en väsentligt ökad risk för dödlighet1. Allmänheten har blivit mer medveten om denna sjukdom under COVID-19-pandemin. Trots sin höga associerade dödlighet saknas omfattande epidemiologiska data om den globala bördan av sepsis på grund av komplexiteten i diagnosen. År 2017 fanns det 48,9 miljoner sepsisincidenser och 11 miljoner dödsfall över hela världen, vilket motsvarar 19,7% av alla globala dödsfall2. Vidare fann en studie om den förlängda prevalensen av infektion och relaterad sepsis hos intensivvårdspatienter att 62% av de positiva isolaten från patienter var gramnegativa organismer3.
Inledningsvis fokuserade undersökningarna om sepsis på att avgränsa mikrobiell patogenes. Att förstå “farohypotesen”, som dikterar hur värden skiljer sig från jag och icke-själv, ledde dock till att balansen i sepsisforskningen lutades mot att förstå värdens svar på en invaderande patogen. De allmänt använda mössmodellerna av sepsis inkluderar lipopolysackarid (LPS) -inducerad endotoxemimodell, polymikrobiella sepsismodeller, cecal ligering och punktering (CLP) och kolonascendens stent peritonit (CASP) och monobakteriella infektionsmodeller4.
Vi har standardiserat ett musmodellsystem genom att inducera peritoneal sepsis med Salmonella Typhimurium. Denna modell är fördelaktig jämfört med andra eftersom Salmonella Typhimurium är en intracellulär patogen som efterliknar det kliniskt relevanta tillståndet för gramnegativ sepsis. Resultatet av peritonit sepsis i denna modell är systemisk, med 100% dödlighet inom 96 h efter infektion. Därför är denna modell avgörande för att studera de inflammatoriska och dödliga värdsvaren. I denna modell induceras sepsis genom att intraperitonealt injicera 0,5 miljoner kolonibildande enheter (CFU) av Salmonella Typhimurium i en 8-10 veckor gammal C57BL/6 mus. Systemisk infektion kan bekräftas genom att bedöma organbakteriell börda ~ 16 h efter infektion. Denna artikel visar Salmonella Typhimurium-inducerad peritonit sepsis hos möss, karakteriserar de resulterande förändringarna i peritoneal cellkomposition och kvantifierar bakteriebördan i olika organ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna artikel beskriver en metod för att inducera en allvarlig form av bakteriell sepsis genom intraperitoneal injektion av Salmonella Typhimurium. Denna modell är fördelaktig jämfört med andra eftersom Salmonella Typhimurium är en intracellulär patogen och därmed högpatogen, som efterliknar det kliniskt relevanta tillståndet för gramnegativ sepsis. Resultatet av peritonit sepsis i denna modell är systemisk, med 100% dödlighet inom 96 h efter infektion. Därför är denna modell avgörande …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Central Animal Facility, IISc för att ha försett oss med möss för forskning. Denna studie finansierades av anslag till DpN från Institutionen för bioteknik och vetenskap och teknik Research Board, Indiens regering. Infrastrukturstödet från DBT-IISc-programmet och DST-FIST-bidragen är mycket erkänt. Vi tackar alla tidigare och nuvarande medlemmar i DpN-labbet för deras stöd.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
