Denne protokollen beskriver genereringen av en hudfascia utviset kalt “SCar like tissue in A Dish” eller SCAD. Denne modellen tillater enestående visualisering av enkle fibroblaster under arrdannelse.
Pattedyrets globale respons på tetting av dype vevssår er gjennom arrdannelse og vevskontraksjon, mediert av spesialiserte fasciafibroblaster. Til tross for den kliniske betydningen av arrdannelse og nedsatt sårheling, er vår forståelse av fascia fibroblastdynamikk i sårheling kortfattet på grunn av mangel på relevante analyser som muliggjør direkte visualisering av fibroblastkoreografi og dynamikk i komplekse miljøer som i hudsår. Dette papiret presenterer en protokoll for å generere ex-situ hud arr ved hjelp av SCAD eller “SCar-lignende vev i en tallerken” som etterligner det komplekse miljøet av hudsår. I denne analysen utskilles 2 mm hud med full tykkelse og dyrkes opp ned i media i 5 dager, hvor arr og hudkontrakturer utvikler seg jevnt. Denne metodikken, kombinert med fibroblast-avledningsspesifikke transgene musemodeller, muliggjør visualisering av individuelle fibroblastavledninger over hele sårreparasjonsprosessen. Samlet sett hjelper denne protokollen forskere med å forstå grunnleggende prosesser og mekanismer for sårreparasjon, og utforsker direkte effekten av modulatorer på sårhelingsresultater.
Sårheling er en prosess for restaurering av brutte sår. Vevsskader hos hvirvelløse dyr resulterer i delvis eller fullstendig regenerering. I motsetning reagerer pattedyr på dyp skade ved arrdannelse, en prosess skreddersydd for raskt å forsegle sår med tette plugger av matrisefibre som minimerer det brutte området og samtidig permanent deformerer det skadede stedet 1,2,3. Store hudforbrenninger eller dype åpne sår hos pattedyr resulterer i patologiske fenotyper som hypertrofiske eller keloid arr 4,5. Disse sprudlende arrene forårsaker en enorm byrde på kliniske og globale helsesystemer. Bare i USA koster arrhåndtering rundt 10 milliarder dollar årlig 6,7. Derfor er utviklingen av relevante metoder nødvendig for å bedre forstå de fundementale prosessene og mekanismene som er involvert i arrdannelse.
I de senere år har et bredt spekter av studier på mus avslørt heterogene fibroblastpopulasjoner med distinkte funksjonelle potenser basert på deres opprinnelse på visse hudsteder 8,9,10. I bakhuden identifiserte Rinkevich et al., 2015, at en bestemt fibroblastpopulasjon med et tidlig embryonalt uttrykk for Engrailed-1 (En1), kalt EPF (Engrailed positive fibroblast) bidrar til kutan arrdannelse ved såring. Motsatt bidrar en annen fibroblast avledning uten historie med innfelt uttrykk, Innfelt negativ fibroblast (ENF), ikke til arrdannelse8. Skjebnekartlegging av disse En1-linjene ved hjelp av Cre-drevne transgene muselinjer krysset til fluorescensreportermuselinjer som R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) tillater visualisering av EPF- og ENF-populasjoner.
Å studere fibroblast migrasjon in vivo over flere dager er begrenset av etiske og tekniske begrensninger. Videre er sammensatte, virale og nøytraliserende antistoffbibliotekskjermer for å modulere veier involvert i arrdannelse teknisk utfordrende. Tidligere brukte in vitro– eller ex vivo-modeller mangler evnen til å visualisere fibroblastmigrasjon og arrdannelse i ekte hudmikromiljøer, ensartethet i arrutvikling, samt vevskompleksitet som emulerer in vivo hudmiljøer11,12. For å overvinne de ovennevnte begrensningene utviklet vi en ex vivo scarring analyse kalt SCAD (SCar-lignende vev i A Dish)13,14. Denne enkle analysen kan utføres ved å utskille 2 mm fulltykkelseshud som inneholder epidermis, dermis og de subkutane fasciaområdene og dyrke dem i serum-supplerte DMSO-medier i opptil 5 dager. Arr generert fra SCAD gjenskaper pålitelig transkripsjons- og proteomiske kjennetegn på in vivo arr. I tillegg kan SCADer generert fra relevante transgene muselinjer (f.eks. En1-mus) krysset med fluorescerende reportermuslinjer tillate visualisering av fibroblast migrasjonsdynamikk og arrutvikling med en enestående oppløsning. Videre kan denne modellen enkelt tilpasses for alle bruksområder med høy gjennomstrømning (f.eks. sammensatt bibliotek, antistoffbibliotek eller viral screening)13,14. I denne artikkelen beskriver vi en optimalisert protokoll for å generere SCADs og påfølgende nedstrøms prosesseringsprogrammer for å studere cellulær og matrisedynamikk i arrutvikling.
Flere modeller er allerede utviklet for å forstå arrdannelse etter skade. Mens mange fremskritt har blitt gjengitt i denne forbindelse, men, er faktiske mekanismer fortsatt ikke klare. I motsetning til den forrige teknikken inkorporerer SCAD-modellen alle celletyper og kutane lag, og opprettholder dermed kompleksiteten i innfødt hud18,19. Denne metodikken er i stand til å generere grunnleggende datasett som er viktige for å forstå molekylære mekanismer som…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner alle medforfatterne av Jiang et al. 2020 for å bidra til utviklingen av SCAD-metodikk13. Vi takker Dr. Steffen Dietzel og Bioimaging kjerneanlegg på Ludwig-Maximilans-Universität for tilgang til Multiphoton-systemet. Y.R. ble støttet av Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) og LEO Foundation (LF-OC-21-000835).
10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |