Detta protokoll beskriver genereringen av en hudfascia explantad som kallas “SCar som vävnad i en maträtt” eller SCAD. Denna modell möjliggör oöverträffad visualisering av enstaka fibroblaster under ärrbildning.
Däggdjurets globala svar på tätning av djupa vävnadssår är genom ärrbildning och vävnadskontraktion, medierad av specialiserade fasciafibroblaster. Trots den kliniska betydelsen av ärrbildning och nedsatt sårläkning är vår förståelse av fasciafibroblastdynamik vid sårläkning kortfattad på grund av bristen på relevanta analyser som möjliggör direkt visualisering av fibroblastkoreografi och dynamik i komplexa miljöer som i hudsår. Detta dokument presenterar ett protokoll för att generera ex- situ hudärr med SCAD eller “SCar-liknande vävnad i en maträtt” som efterliknar den komplexa miljön av hudsår. I denna analys skärs 2 mm hud i full tjocklek ut och odlas upp och ner i media i 5 dagar, under vilka ärr och hudkontrakturer utvecklas enhetligt. Denna metodik, i kombination med fibroblast-härstamningsspecifika transgena musmodeller, möjliggör visualisering av enskilda fibroblastlinjer över hela sårreparationsprocessen. Sammantaget hjälper detta protokoll forskare att förstå grundläggande processer och mekanismer för sårreparation, direkt utforska effekterna av modulatorer på sårläkningsresultat.
Sårläkning är en process för restaurering av brutna sår. Vävnadsskador hos ryggradslösa djur resulterar i partiell eller fullständig regenerering. Däremot svarar däggdjur på djup skada genom ärrbildning, en process skräddarsydd för att snabbt täta sår med täta pluggar av matrisfibrer som minimerar det brutna området och samtidigt permanent deformerar det skadade stället 1,2,3. Stora hudbrännskador eller djupa öppna sår hos däggdjur resulterar i patologiska fenotyper som hypertrofiska eller keloidärr 4,5. Dessa sprudlande ärr orsakar en enorm börda för kliniska och globala sjukvårdssystem. Bara i USA kostar ärrhantering cirka 10 miljarder dollar årligen 6,7. Därför krävs utveckling av relevanta metoder för att bättre förstå de fundementala processer och mekanismer som är involverade i ärrbildning.
Under de senaste åren har ett brett spektrum av studier på möss avslöjat heterogena fibroblastpopulationer med distinkta funktionella potenser baserat på deras ursprung på vissa hudplatser 8,9,10. I bakhuden identifierade Rinkevich et al., 2015, att en specifik fibroblastpopulation med ett tidigt embryonalt uttryck av Engrailed-1 (En1), kallad EPF (Engrailed positive fibroblast) bidrar till kutan ärrbildning vid sårbildning. Omvänt bidrar en annan fibroblastlinje utan historia av insnärjt uttryck, Engrailed negative fibroblast (ENF), inte till ärrbildning8. Ödeskartläggning av dessa En1-linjer med hjälp av Cre-drivna transgena muslinjer korsade till fluorescensreportermuslinjer som R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) möjliggör visualisering av EPF- och ENF-populationer.
Att studera fibroblastmigration in vivo under flera dagar begränsas av etiska och tekniska begränsningar. Dessutom är sammansatta, virala och neutraliserande antikroppsbiblioteksskärmar för att modulera vägar som är involverade i ärrbildning tekniskt utmanande. Tidigare använda in vitro- eller ex vivo-modeller saknar förmågan att visualisera fibroblastmigration och ärrbildning i äkta hudmikromiljöer, enhetlighet i ärrutveckling samt vävnadskomplexitet som emulerar in vivo hudmiljöer11,12. För att övervinna ovanstående begränsningar utvecklade vi en ex vivo ärrbildningsanalys som kallas SCAD (SCar-liknande vävnad i en maträtt)13,14. Denna enkla analys kan utföras genom att excitera 2 mm fullhudshud som innehåller epidermis, dermis och subkutan fascia och odla dem i serumkompletterade DMSO-medier i upp till 5 dagar. Ärr som genereras från SCAD replikerar på ett tillförlitligt sätt transkriptomiska och proteomiska kännetecken för in vivo-ärr. Dessutom möjliggör SCAD: er genererade från relevanta transgena muslinjer (t.ex. En1-möss) korsade med fluorescerande reportermuslinjer visualisering av fibroblastmigrationsdynamik och ärrutveckling med en aldrig tidigare skådad upplösning. Dessutom kan denna modell enkelt anpassas för alla applikationer med hög genomströmning (t.ex. sammansatt bibliotek, antikroppsbibliotek eller viral screening)13,14. I den här artikeln beskriver vi ett optimerat protokoll för att generera SCADs och efterföljande nedströms bearbetningsapplikationer för att studera cell- och matrisdynamik i ärrutveckling.
Flera modeller har redan utvecklats för att förstå ärrbildning efter skada. Även om många framsteg har gjorts i detta avseende, men de faktiska mekanismerna är fortfarande inte tydliga. Till skillnad från den tidigare tekniken innehåller SCAD-modellen alla celltyper och kutana lager, vilket bibehåller komplexiteten hos den ursprungliga huden18,19. Denna metod kan generera grundläggande datamängder som är viktiga för att förstå molekylära mekanism…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner alla medförfattare till Jiang et al.2020 för att ha bidragit till utvecklingen av SCAD-metodik13. Vi tackar Dr. Steffen Dietzel och Bioimaging-kärnanläggningen vid Ludwig-Maximilans-Universität för tillgång till Multiphoton-systemet. Y.R. stöddes av Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) och LEO Foundation (LF-OC-21-000835).
10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |