Summary
败类是细胞骨架蛋白。它们与脂质膜相互作用，可以感测但也会产生微米级的膜曲率。我们在该协议中描述了用于分析膜变形，曲率敏感的隔膜结合和隔膜长丝超微结构的自下而上的 体外 方法。
Abstract
膜重塑不断发生在质膜和细胞器内。为了充分剖析环境的作用（离子条件，蛋白质和脂质组成，膜曲率）以及与特定膜重塑过程相关的不同伙伴，我们采用 体外 自下而上的方法。近年来，人们一直对揭示与主要疾病相关的隔膜蛋白的作用有着浓厚的兴趣。隔膜是与质膜相互作用的必需且无处不在的细胞骨架蛋白。它们与细胞分裂，细胞运动，神经形态发生和精子发生以及其他功能有关。因此，重要的是要了解隔膜上如何相互作用和组织以随后诱导膜变形，以及它们如何对特定的膜曲率敏感。本文旨在破译分子水平上隔膜的超结构与微米级膜重塑之间的相互作用。为此，对萌芽酵母和哺乳动物隔膜复合物进行重组表达和纯化。然后使用 体外 测定的组合来分析隔膜处的自组装。使用支撑的脂质双分子层（SLBs），巨型单层囊泡（GUV），大型单层囊泡（LUV）和波浪基质来研究隔膜自组装，膜重塑和膜曲率之间的相互作用。
Introduction
败类是与脂质膜相互作用的细胞骨架细丝形成蛋白。败类在真核生物中无处不在，对许多细胞功能至关重要。它们已被确定为萌芽酵母和哺乳动物细胞分裂的主要调节因子1，2。它们参与膜重塑事件，纤毛发生3和精子发生4。在哺乳动物细胞中，隔膜蛋白还可以以Rho GTPas酶（BORG）依赖性方式的结合剂8与肌动蛋白和微管5，6，7相互作用。在各种组织（神经元9，纤毛3，精子10）中，隔膜蛋白已被鉴定为膜结合组分11的扩散屏障的调节因子。隔膜也被证明可以调节膜起泡和突出形成12。败类是多任务蛋白质，与各种流行疾病的出现有关13.他们的失调与癌症14和神经退行性疾病15的出现有关。
根据生物体的不同，几个隔膜亚基（秀丽隐杆线虫中的两个到人类的13个）聚集在一起形成复合物，其组织以组织依赖性方式变化16。基本的隔膜构建块聚集了两到四个亚基，以两个副本存在并以棒状回文方式自我组装。在萌芽酵母中，七分素是八聚体17，18。在原位，隔膜通常局限于具有微米曲率的部位;它们被发现在分裂收缩部位，纤毛和树突的底部，以及精子19，20的环空。在膜上，隔膜的作用似乎是双重的：它们与重塑脂质双层和维持膜完整性有关21。因此，研究隔膜上形成隔膜的长丝蛋白和/或亚基的生物物理性质对于理解它们的作用至关重要。为了在控制良好的环境中解剖隔膜蛋白的特定性质，自下而上的体外方法是合适的。到目前为止，只有少数小组在体外描述了隔膜蛋白20，22，23的生物物理性质。因此，与其他细胞骨架丝相比，目前关于隔膜蛋白在体外行为的知识仍然有限。
该协议描述了如何分析隔膜长丝的组织，膜重塑和曲率敏感性19。为此，使用了光学和电子显微镜方法（荧光显微镜，冷冻电子显微镜[冷冻电镜]和扫描电子显微镜[SEM]）的组合。使用荧光光学显微镜可视化微米级巨型单层囊泡（GUV）的膜重塑。使用冷冻EM对与脂质囊泡结合的隔膜丝的排列和超微结构进行分析。使用SEM对沉积在可变曲率的波浪基板上的固体负载脂质双分子层结合的隔膜蛋白丝的行为，对隔膜曲率敏感性进行分析，从而可以分析正曲率和负曲率的曲率敏感性。与之前的分析20，24相比，本文建议结合使用多种方法，彻底分析隔膜自组装、协同变形膜和曲率敏感。该方案被认为是有用的，并且适用于任何对膜具有亲和力的丝状蛋白质。
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Protocol
1. 使用巨型单层囊泡 （GUV） 测定膜重塑
注意：在本节中，生成GUV是为了模拟隔膜在细胞环境中可能由隔膜引起的膜变形。事实上，在细胞中，隔膜蛋白经常在具有微米曲率的位点发现。GUV的尺寸从几微米到几十微米不等，可能会变形。因此，它们适用于测定任何微米级隔膜蛋白引起的变形。荧光脂质以及荧光标记的隔膜蛋白（使用绿色荧光蛋白[GFP]）用于 通过 荧光显微镜跟踪脂质和蛋白质的行为。
- 缓冲液和溶液的制备
- 制备GUV生长缓冲液（50 mM氯化钠，50 mM蔗糖和10mM三元组[pH = 7.8]）和观察缓冲液（75 mM氯化钠和10 mM三元组[pH = 7.8]）。
- 测量（使用商用渗透压计）并调整观察缓冲液和生长缓冲液（170 mOsmol·L-1，理论上）通过添加少量的NaCl，直到它们各自的渗透压相等。使用0.2μm过滤器过滤缓冲液。等分试样生长缓冲液并将其储存在-20°C以备进一步使用。将观察缓冲液储存在4°C。
注意：两种缓冲液之间的渗透压差不应超过5%。 - 在观察缓冲液中制备5mg·mL-1 β酪蛋白溶液。确保完全溶解（在磁力搅拌下在4°C下几个小时后）。用0.2μm过滤器过滤溶液，等分试样，并储存在-20°C。
- 在氯仿中以总脂质浓度为3mg·mL-1 制备脂质混合物。使用56.8%鸡蛋L-α-磷脂酰胆碱（EggPC），15%胆固醇，10%1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE），10%1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（DOPS），8%脑L-α-磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PI（4，5）P2）和0.2%Bodipy-TR-神经酰胺的成分（摩尔%）来增强蛋白质 - 脂质相互作用并有利于PI（4，5）P225的掺入。
注意：使用丁腈手套和安全眼镜在通风橱下处理氯仿。用玻璃注射器移取氯仿溶液，避免使用塑料，因为氯仿会溶解塑料。使用前后，通过移液氯仿5x-10x冲洗注射器。使用单独的注射器移液特定的荧光脂质，以防止交叉污染。脂质可以在-20°C的氯仿中储存在装有特氟龙的琥珀色玻璃小瓶中。在关闭之前，小瓶必须充满氩气，并用石蜡膜密封，以防止任何脂质氧化。 - 使用铂线设置电形成GUV
注： 图1 显示了实验步骤的方案和腔室的图片。- 彻底清洁腔室和铂线，以除去任何脂质残留物。
- 将导线和腔室放入丙酮中并超声处理10分钟。使用丙酮用纸巾仔细擦拭。
- 通过插入导线组装腔室，再次浸入丙酮中，超声处理10分钟。再次用丙酮擦拭，确保电线已完全清洁。将腔室浸入乙醇中，超声处理10分钟，然后用乙醇擦拭。
- 最后，将腔室浸入去离子水中，超声处理10分钟，并用氮气或空气流干燥。
注：特氟龙腔室（图1B）是在内部车间定制的。它可容纳三个隔间，可以使用玻璃盖玻片在两侧密封。铂金线可以通过直径为1.3 mm的孔插入腔室中。 - 清洁腔室后，在每根铂丝上沉积每个隔室3-4滴（每滴约0.1μL）的3mg·mL-1 脂质混合物。将导线旋转180°，并在每根铂丝的另一侧为每个隔室沉积3-4个脂质液滴。确保液滴不会相互接触。每个整个腔室需要约5μL脂质混合物。
- 将生长室置于真空室中30分钟以除去任何痕量的氯仿。
注意：深真空（0.1 毫巴）是最好的。干燥时，脂质容易氧化，因此不应在空气中停留超过几分钟。 - 使用注射器将高真空润滑脂沿着三个隔室的外围沉积在腔室的底部（最靠近电线的一侧），并将干净的（22 mm x 40 mm）盖玻片压在润滑脂上，以确保完美密封。使用密封膏（蜡板）密封腔室的两端（即电线的入口/出口处）。同样，在腔室的另一侧涂抹真空润滑脂。
- 使用移液管用生长缓冲液（每个腔室约1 mL）填充隔室。不要太快或太强烈地搅拌溶液，以防止脂质膜从电线上脱落。使用 22 mm x 40 mm 盖玻片将其压在润滑脂上，密封腔室顶部。为避免形成气泡，请从中心到边缘轻轻按压玻璃盖玻片。
- 将腔室置于4°C冰箱中，并将电线连接到波函数发生器（500 Hz的正弦函数）。将有效电压设置为350 mV，用于较短的生长期（即6小时）或250 mV用于较长的生长期（即12-16小时），正如Beber等人的一项研究中已经提出和优化的那样。
- 取下盖玻片，擦去密封剂和油脂，然后取下电线。用水和乙醇（≥70%）交替用纸巾清洗和擦洗腔室。
注意：GUV生长的最佳电压和时间尺度取决于许多参数，从缓冲盐浓度到腔室几何形状（即导线之间的距离和腔室尺寸）。每次重复实验时使用相同的腔室以确保再现性。导线靠近腔室的底部，因此可以使用荧光显微镜对脂质进行成像。对每个步骤的脂质进行成像（见 图1C，D），以确保电形成过程成功。
- 隔膜与囊泡孵育
- 使用靠近导线的预切移液器吸头（约 1 mm 开口）从导线中收集 GUV。然后，沿着导线移液溶液。此过程可防止产生可能破坏GUV的强层状流动。完成此步骤后，不再需要切割移液器吸头。实际上，层状流动不会损坏溶液中的GUV。
注意：由于脂质混合物中存在PI（4，5）P2 ，因此在实验前必须储存不超过2-3小时的GUV。事实上，PI（4，5）P2 迅速溶解，隔膜在形成后几个小时内不再与膜结合。然而，一旦隔膜结合，它们就会保持结合几天。 - 在Tris 10 mM（pH 8）中稀释隔膜储备溶液，以达到等于生长缓冲液的渗透压;如果需要，在观察缓冲液中进一步稀释隔膜溶液。加入预期体积的收集的GUV（50-100μL，总体积为200μL）。用β酪蛋白钝化后，直接在观察室中进行孵育（见下文）。需要20-30分钟的等待时间才能达到平衡。
注：隔膜蛋白八美复合物（人或萌芽酵母）的表达和纯化在其他第17条中有广泛描述。简而言之，隔膜蛋白在 大肠杆菌中表达，在实验室中使用亲和力，尺寸排阻和离子交换色谱步骤纯化，并在-80°C下储存在50 mM Tris-HCl（pH 8），300 mM KCl和5 mM MgCl2 的水溶液中，浓度为〜1mg·mL-1 （3μM）。使用高盐浓度以避免隔膜蛋白聚集。隔膜复合物不应通过过滤离心装置浓缩，这会诱导聚集从而降低蛋白质产量。
- 使用靠近导线的预切移液器吸头（约 1 mm 开口）从导线中收集 GUV。然后，沿着导线移液溶液。此过程可防止产生可能破坏GUV的强层状流动。完成此步骤后，不再需要切割移液器吸头。实际上，层状流动不会损坏溶液中的GUV。
- 使用共聚焦和/或旋转圆盘显微镜进行成像
- 为了防止GUV粘附在表面上和/或爆炸，通过用5mg·mL-1 β酪蛋白溶液孵育观察室30分钟来钝化观察室。
- 取出β酪蛋白溶液，并使用移液管将隔膜-GUV溶液（步骤1.4.2）转移到观察室中。让GUV沉淀到腔室底部10-15分钟。
注意：GUV内部和外部缓冲器之间的成分差异会产生密度和折射率不匹配。由于折射率不匹配，通过透射光光学显微镜可以看到GUV。 - 使用共聚焦显微镜，可视化脂质的荧光信号，以检查GUV质量和膜层状结构状态。通过执行适当校准后记录隔膜的荧光信号来评估与GUV结合的隔膜的密度25。以0.4μm的空间间隔进行Z-stack采集，以分析和可视化由隔膜和膜之间的相互作用引起的囊泡的3D变形。
注：使用放大倍率为60倍或100倍的油浸式物镜。使用像素尺寸为250 nm和110 nm的标准共聚焦或旋转圆盘显微镜（材料表）。必须使成像条件适应给定的设备。没有向溶液中加入特定的抗光漂白剂。
图 1：GUV 的电形成 （A） 使用铂线的电形成过程的示意图。（B）特氟龙自制设备的图片，该设备由用于通过电形成产生GUV的铂线组装而成。电线直径为 0.5 mm，间距为 3 mm。（C）在生长过程中通过透射光学显微镜观察到的GUV（球形物体）。图像底部的不透明区域是铂线。（D）在铂丝上生长期间用荧光显微镜观察GUV（圆形荧光物体）。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
2. 冷冻电子显微镜分析隔膜丝的超微结构组织
注意：囊泡不适合使用标准电子显微镜方法进行成像。事实上，使用标准的负染色方法干燥样品。脱水后，囊泡可能会发生非特异性变形，经常导致脂质突出。因此，冷冻电子显微镜是观察囊泡特定变形的更好策略。使用冷冻电镜，将样品嵌入薄薄的（约100-200nm）玻璃化冰层中，从而保存样品接近天然状态。然而，GUV太大（几十微米），无法嵌入薄冰中，因此可以通过透射电子显微镜成像。因此，产生直径范围为~50-500nm的大型单层囊泡（LUVs），以确定隔膜如何使囊泡变形以及它们如何在囊泡上排列。
- 生成大型单层囊泡 （LUV）
- 制备50μg溶解在氯仿中的脂质混合物，摩尔成分为57%EggPC，15%胆固醇，10%DOPE，10%DOPS和8%脑PI（4，5）P2），其优化以增强隔膜与玻璃瓶中膜的相互作用。
- 在氩气流下干燥溶液以在小瓶中产生干燥的脂质膜。将小瓶置于真空下30分钟以完全干燥脂质。
- 将脂质膜在50μL水溶液（50 mM Tris-HCl [pH 8]; 50mM KCl; 2 mMMgCl2）中重新溶解，以获得终浓度为1mg·mL-1，涡旋10秒，并将溶液转移到管中。
注意：LUV必须与隔膜一起孵育。否则，由于PI（4，5）P2的增溶，蛋白质 - 脂质相互作用将很弱。这种粗的再溶解过程产生直径范围为50 nm至500 nm的异质囊泡群。因此，可以同时测定整个直径范围和曲率。
- 将隔膜与溶解的脂质一起孵育，最终脂质和隔膜蛋白浓度分别为0.1mg·mL-1 （约300nM）和20nM，在高盐缓冲液（50mM Tris-HCl [pH 8]，300mM KCl，2mMMgCl2）中。将样品在室温下孵育1小时。
- 暴冻以玻璃化样品
- 使用等离子发生器设备在碳侧的辉光放电孔状碳网格（300目）在5 mA下30秒，并将网格插入潮湿环境中的小型冷冻机内。
- 将4μL样品（步骤2.2）吸附在网格的辉光放电碳侧。在样品吸附之前，立即将5-10nm金珠加入溶液中，以防样品用于通过冷冻断层扫描产生倾斜系列。
注意：金珠的密度必须根据经验进行筛选和调整，并取决于提供者。优化后的密度是视野中的10-15颗金珠。 - 从裸露的一侧吸干样品以吸出另一侧的样品液滴。
注意：转印时间通常为4秒，滤纸的位置和吸墨力通过测试和筛选滤纸的替代位置来根据经验进行调整，以优化冰的质量（厚度）和材料密度。 - 将网格转移到显微镜中或将其储存在液氮容器中。
注意：使用多孔碳网格对于适应囊泡尺寸的多分散性至关重要。从另一侧对样品进行印迹有利于增强生物材料在网格上的吸附。
- 冷冻电子显微镜成像
- 将网格插入配备冷冻电镜观察的电子显微镜（EM）中。通过在低放大倍率（通常为120倍放大倍率）下生成整个样品的地图来筛选整个网格，以选择显示更好冰的区域（即薄且玻璃化良好）。
- 对于冷冻电镜2D数据收集，以每像素约2 Å的像素大小收集图像，以检查样品的质量。确保隔膜长丝和脂质双层都可见。
- 对于冷冻电子断层扫描数据收集，请选择显示变形囊泡的感兴趣区域。确保视野中存在足够的金珠（至少10个）。
- 根据用于倾斜序列数据收集的软件，选择焦点和跟踪位置，使其离感兴趣区域足够远。通过将倾斜角度从 -60° 更改为 +60° 来收集倾斜序列，每 2°-3° 收集一张图像。
注意：总剂量应约为或小于100电子/ Å2。像素尺寸从1.3 Å到2.1 Å不等，具体取决于用于数据收集的显微镜。理想情况下，最好采用角度对称的数据收集方案，如下所示：0°、-3°、+3°、-6°、+6°、+6°、-9°、+9° [...] -60°、+60°。然而，侧入显微镜的测角仪不能提供足够的机械稳定性来实现这些对称方案。或者，采集可以从0°到34°开始，然后是从-2°到-60°的第二个角序列，然后从36°到60°结束最终序列。目的是以最低的角度收集第一批图像（辐射损伤最低）。此外，为了可视化囊泡和结合的隔膜丝的超微结构，可以使用标准的冷冻电镜（200 kV，六硼化镧（LaB6）丝和样品侧进入）。但是，如果打算进行进一步的图像处理（例如，亚断层扫描平均），最好使用配备直接探测器的最后一代场发射枪（FEG）显微镜。在该协议中，我们将描述限制为获取3D重建，并省略了子断层扫描平均值。
- 通过冷冻断层扫描和分割进行 3D 重建
- 使用 IMOD 软件套件（材料表）进行倾斜系列图像对齐和 3D 重建26，27。在 IMOD 中，根据基准（金珠）定位执行倾斜系列对齐。此外，如果需要，在 IMOD26 内进行造影剂传递函数 （CTF） 测定和校正。最后，使用 IMOD 实现 3D 重建，严格遵循每个步骤。
- 使用 IMOD 软件套件中的 3Dmod27 手动分割脂质双层和隔膜长丝以进行显示。
3. 使用SEM分析隔膜的曲率敏感性
注意：为了了解隔膜如何对微米曲率敏感，已经使用了一种 体外 方法来孵育隔膜蛋白丝复合物，其中固体支撑的脂质双分子层沉积在微米级的波浪起伏图案上。
- 设计波浪形 NOA（诺兰光学粘合剂）复制品，采用波浪形聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 图案
- 使用250nm振幅和2μm横向周期性或其他尺寸的PDMS起伏图案来测定适合目标蛋白质的曲率。
注：PDMS 起伏模式的设计和生成如 Nania 等人 28，29 中所述。 - 在洁净室环境中，将5μL液体NOA沉积在直径为1厘米的圆形玻璃盖玻片上，然后将PDMS模板放在液滴上。用紫外光（320nm）处理5分钟，将液体NOA光聚合成薄聚合物膜。然后，用新鲜聚合的NOA轻轻地从盖玻片上剥离PDMS模板。
注意：NOA是一种常见的光学透明胶，适用于光学显微镜成像。此外，NOA对SEM成像之前进行的化学固定和染色过程具有抗性。NOA 71 和 NOA 81 树脂均可获得相似的结果。最初的 PDMS 模式可以多次用于生成 NOA 副本。获得的NOA复制品可以在室温下保存在盒子中数月。
- 使用250nm振幅和2μm横向周期性或其他尺寸的PDMS起伏图案来测定适合目标蛋白质的曲率。
- 生成支持的脂质双层和蛋白质孵育
- 使用空气等离子体清洁剂处理NOA薄膜5分钟，使表面亲水。
- 以1mg·mL-1的总脂质浓度制备具有57%EggPC，15%胆固醇，10%DOPE，10%DOPS和8%脑PI（4，5）P2的臼齿组成的小单层囊泡（SUV）溶液。通过在观察缓冲液中重悬干燥的脂质膜来制备SUV，如步骤2.1.3所述。使用浴超声仪轻轻超声处理溶液5-10分钟，直到溶液透明。
注意：SUV的溶液可以在-20°C下冷冻储存数周。 - 将支持NOA模式的盖玻片插入细胞培养盒的孔中。将100μL 1mg·mL-1 SUV溶液沉积在新鲜发光的NOA图案上（步骤3.2.1.），并在室温下孵育30分钟。该步骤诱导SUV与NOA图案表面的融合，以产生支撑的脂质双层。
- 用隔膜缓冲液（50 mM 三盐酸 [pH 8]、50 mM 氯化铵、2 mM MgCl 2）彻底冲洗载玻片 6 倍，以去除未融合的 SUV。每次冲洗后，切勿让样品完全干燥。
- 使用隔膜缓冲液（50 mM 三盐酸 [pH 8]、50 mM KCl、2 mM MgCl2）将八聚一体隔膜储备溶液稀释在隔膜高盐缓冲液（50 mM 三盐酸盐 [pH 8]、300 mM 氯化三氯化物、2 mM MgCl2）中，最终浓度范围为 10 nM 至 100 nM，体积为 1 mL。在室温下将蛋白质溶液在载玻片上孵育约1小时。
注意：体积足够大，因此蒸发不是问题。
- 用于扫描电镜分析的样品制备
注意：电子显微镜已经开发了各种方案来分析蛋白质结构及其组装。目前的方案保留了隔膜蛋白丝的组织，使用从Svitkina等人衍生的固定方案。30 这很容易实现。此外，该协议还优化了高分辨率SEM观测。- 试剂和储备溶液的制备
注意：该方案需要几种试剂和溶液，可以提前或在孵育前制备。按照提供的说明进行操作，以避免任何伪影或缺乏化学反应性。- 二甲砷酸钠0.2 M储备溶液：为了制备这种双倍强度溶液，在磁力搅拌下将2.14g二甲砷酸钠粉末溶解在〜40 mL蒸馏水中。完全溶解后，通过轻轻加入0.1 M HCl（50 mL溶液约1 mL）将pH调节至7.4，并用蒸馏水组成最终体积。该溶液可在4°C下储存24-48小时。
- 0.1M二甲砷酸钠（固定溶液）中的2%戊二醛（GA）：使用前用0.2M卡考代酸钠溶液稀释高纯度EM级GA（见上文）制备该溶液。使用 25%-50% 的商业 GA 库存解决方案，因为它在 4 °C 时具有优化的存储容量。 为了制备10 mL固定剂溶液，用4.2 mL蒸馏水和5 mL 0.2 MM卡考代酸钠稀释0.8 mL 25%商用GA溶液。
- 1%四氧化锇（OsO4）在0.1M二甲苯二甲酸钠中：通过在使用前用0.2 M二甲二酸钠稀释商业4%OsO4 储备溶液来制备第二种固定溶液（见上文）。对于 4 mL OsO4 固定剂溶液，用 1 mL 蒸馏水和 2 mL 0.2 M 卡考代酸钠稀释 1 mL 4% 商用 OsO4 溶液。
注意：在可切割的玻璃灯泡中使用商业4%OsO4 储备溶液，因为它们具有储存和处理特性。请注意，OsO4 具有高度反应性。确保它的颜色略带黄色，而不是深色。 - 1%单宁酸（TA）在水中：使用前准备此溶液。制备TA溶液，在室温下在蒸馏水中获得1%TA的最终浓度。将10毫克溶于1毫升蒸馏水中，涡旋几分钟。TA溶液不能储存，必须在使用前用0.2μm过滤器过滤。
- 在水中加入1%乙酸铀酰（UA）溶液 制备UA溶液，在蒸馏水中得到终浓度为1%的UA。将10mg溶解在1mL蒸馏水中，并通过在室温下涡旋或摇动涡旋至少30分钟至1小时。该溶液可以在4°C下储存1个月，但很容易沉淀，因此必须在使用前用0.2μm过滤器过滤。
- 分级系列乙醇溶液在水中制备50%、70%、95%和100%乙醇溶液。用分子筛（标称孔径= 4 Å）从新打开的100%乙醇瓶或100%乙醇中准备最终浴，以除去可能干扰干燥和涂层的所有微量水。小心不要摇晃这种溶液，因为它可能会导致硅酸盐颗粒的重悬。
注意：处理本方案中使用的化学试剂时要小心。戊二醛、四氧化锇、二甲砷酸钠和乙酸铀酰都是剧毒的，乙酸铀酰也具有放射性。根据实验室特定的程序，试剂及其废物的所有操作必须使用单独的（手套，实验室外套，安全眼镜）和集体保护（通风橱和有机玻璃防护罩）来完成。
- 样品固定
- 用PBS洗涤样品（即，具有融合的支撑脂质双层和孵育蛋白质的NOA载玻片）。将PBS替换为在37°C下预热的GA固定溶液，并让反应进行15分钟。然后样品可以储存在4°C。
- 取出固定剂溶液，用0.1M二甲砷酸钠（每次洗涤5分钟）轻轻摇动将固定样品洗涤3x。
- 将样品在OsO4 固定溶液中孵育10分钟，具有最大的避光保护，以允许固定膜结构并增加样品的导电性。取出固定剂溶液，用蒸馏水（每次洗涤5分钟）洗涤样品3x，轻轻摇动。
- 将洗涤的样品在过滤的TA固定剂溶液中孵育最多10分钟。取出TA溶液，用蒸馏水（每次洗涤5分钟）轻轻摇动样品3x。
- 将洗涤的样品在新鲜过滤的UA固定剂溶液中孵育10分钟，具有最大的避光保护。取出UA溶液，并在蒸馏水中洗涤样品3x（每次洗涤5分钟），轻轻摇动。
- 样品脱水和临界点干燥
注意：不允许空气干燥，以避免在从液体状态变为气态时通过不必要的表面张力损坏样品。在EM中已经建立了两种方法：达到CO2 的超临界状态并绕过其临界点（31°C，74 bar）的物理方法，或蒸发六甲基二硅氮烷（HMDS）的化学方法，这是一种具有降低表面张力的干燥剂。CO2 和 HMDS 与水的混溶性较差。因此，所有微量的水都必须用过渡溶剂（乙醇）代替，以避免在干燥过程中后期造成任何损坏。- 将样品在每个乙醇溶液中孵育2-3分钟，从50%至100%（无水）乙醇浴开始。
注意：由于乙醇在浴槽之间的蒸发速度很快，样品处理也必须快速，以避免任何空气干燥。 - 将载玻片转移到预先填充乙醇的关键点干燥器内，并按照制造商的说明进行操作。
注意：在此协议中，使用了自动设备，但可以使用任何系统。每个装置的方案可能不同，但必须优化以完全去除乙醇（本方案中的25个浴）并降低不同溶剂交换（CO2 入口和乙醇/ CO2 出口）和最终减压（在该方案中几乎1小时）的速度。 - 在临界点干燥结束时，立即将样品储存在干燥器中，直到安装和涂覆。由于干燥的样品具有高度吸湿性，请尽快涂覆（见下文）。
注意：或者，HMDS可以提供更便宜，更快捷的方法。虽然HDMS从未在我们的样品上进行测试，但这种方法在细胞膜内侧的蛋白质观察31，32产生了良好的结果。
- 将样品在每个乙醇溶液中孵育2-3分钟，从50%至100%（无水）乙醇浴开始。
- 样品安装和涂层。
注意：由于生物样品的导电性能较差，因此在观察SEM之前需要涂覆导电金属膜。因此，使用等离子体磁控溅射。- 将盖玻片附加到将用于将来 SEM 观测的存根。使用银漆，因为它与碳盘相比，其导电性得到改善。在盖玻片的上表面添加一条银色油漆，并确保与存根的连接令人满意。避免任何油漆结块。
注意：在高分辨率（即低工作距离）下工作时，银漆条必须很薄，以避免样品与SEM物镜之间的任何接触。 - 等待溶剂完全蒸发。
注意：此步骤的持续时间可能因银漆沉积物的数量和厚度而异。通过使用钟形罐或涂布机和初级真空10-30分钟，可以缩短此步骤。 - 使用配备等离子磁控溅射头和旋转行星载物台的装置，并遵循制造商提供的标准协议。在这里，将设备抽真空至2.5 x 10-5 毫巴，用高质量氩气吹扫1倍，然后调节至8.0×10-3 毫巴。
- 进行预溅射（120 mA，持续60秒）以除去表面的氧化层。然后，借助薄膜厚度监视器沉积1.5nm的钨（90 mA，工作距离= 50 mm）。
注意：涂布机必须经过完美清洁，以确保薄膜蒸发的再现性。一旦达到目标厚度，必须停止涂层。计算最终的薄膜厚度，然后进行校正。使用我们的设备，大约1.5 nm的薄膜平均具有0.7 nm的后校正。由于这些校正值接近目标值，因此执行一系列涂层来评估，然后从目标值中减去此校正。 - 将样品储存在真空下，以保护它们免受环境空气的影响，直到并贯穿所有SEM分析。
注：用于溅射的金属的性质很重要。尽管Pt是一种常见的材料，但会导致涂层质量差，其Pt薄膜厚度适应隔膜长丝（1.5nm）。在高分辨率下，1.5 nm Pt薄膜缺乏内聚性;因此，Pt簇和隔膜细丝的大小变得相似，导致在细丝分割过程中的误解33 （见 图2A，插图）。钨是Pt的良好替代品，因为它显示出较小的晶粒尺寸，在高分辨率SEM下几乎看不见（见 图2B，插图）。尽管如此，纯钨很容易被氧化，如果在步骤3.3.4中详细说明了步骤3.3.4中详细介绍的步骤，则在SEM观察期间导致强烈的充电效应伪影。没有严格遵守。
- 将盖玻片附加到将用于将来 SEM 观测的存根。使用银漆，因为它与碳盘相比，其导电性得到改善。在盖玻片的上表面添加一条银色油漆，并确保与存根的连接令人满意。避免任何油漆结块。
- 试剂和储备溶液的制备
- 使用场发射扫描电镜（FESEM）显微镜获取图像。
注意：SEM技术最近进行了升级以提高分辨率，并且技术取决于制造商（例如， 电子光学，光束减速，磁性透镜）。这种分辨率增益（可与几家制造商一起使用），特别是在低加速电压（1 kV时接近纳米）下，对于解析类似于septin网络的纳米结构是必要的。- 使用以下设置，使用“镜头内”探测器检测初级二次电子 （SE1）， 从而实现高分辨率成像。
- 将加速电压设置为 3 kV。如果需要抑制充电效应，则使用20μm孔径（对于蔡司双子座I色谱柱，或相当于34 pA）或15μm孔径（对于蔡司双子I色谱柱，或相当于18.5 pA）固定光束电流。
- 对于观察，使用从21.25 nm /像素到1.224 nm /像素的分辨率，对于数据分析，使用~5.58 nm /像素的分辨率（根据宝丽来545参考的20，000倍放大倍率）。
- 将工作距离设置在 1 mm 到 2 mm 之间以进行高分辨率观察，如果需要增加景深，则工作距离设置为 3 mm 左右。连续调整扫描速度和线积分，以确保恒定的信噪比，每张图像的采集时间约为30-45秒。
图2：沉积在隔膜长丝上的材料对波浪形PDMS图案的影响。 隔膜长丝的扫描电镜通过溅射涂覆有（A）1.5nm铂，表现出典型的“干旱开裂土壤”模式，典型的铂核簇之间缺乏内聚力，或（B）1.5nm钨覆盖有光滑和粘稠层。比例尺 = 200 nm。白色方框表示右下角放大的视图。球形球状小球是与隔膜相互作用的小脂质囊泡。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
无人机变形
在隔膜蛋白聚合的条件下， 图3显示了与隔膜蛋白一起孵育后重塑的GUV的典型共聚焦荧光图像。裸露的GUV（图3A）是完全球形的。在与超过50 nM的萌芽酵母隔膜丝孵育时，囊泡出现变形。浓度高达100nM的芽酵母隔膜八聚体，囊泡出现小平面，变形保持静态，因此不波动（图3B）。高于200nM的发芽酵母隔板，膜被隔膜饱和，观察到周期性变形（图3C）。使用发芽酵母隔膜，以2μm至6μm的周期性和约1μm的幅度可视化尖峰。因此，隔膜以特定的方式强烈地重塑膜。观察到的变形的这些振幅和相关曲率惊人地反映了隔膜对细胞中观察到的微米曲率的亲和力。因此，GUV是可变形的，因此适用于测定蛋白质如何重塑膜。
图3：（A）控制GUV的赤道平面，用0.5%罗丹明PE标记并通过共聚焦显微镜成像。比例尺= 3μm.（B）GFP-隔膜蛋白（100 nM）结合到变形的GUV上并通过荧光共聚焦显微镜成像。比例尺= 1μm.（C）GFP隔膜（600 nM）结合到变形的GUV上，并通过荧光旋转盘显微镜成像。比例尺 = 10 μm。GUV由摩尔比为56.8%的蛋酚，15%的胆固醇，10%的DOPE，10%的DOPS，8%的脑PI（4，5）P2和0.2%的博迪皮-TR-神经酰胺组成。观察缓冲液包括 75 mM 氯化钠和 10 mM 三（pH = 7.8）。请点击此处查看此图的大图。
与冷冻电镜成像的 LUV 结合的隔膜长丝的自组装
与荧光显微镜相比，冷冻电镜提供了更好的空间分辨率。因此，可以在图像中明确地辨别单个隔膜丝和脂质双分子层。 图4A 显示了在50 nM下用发芽的酵母隔膜丝装饰的LUV的图像（其中一些以蓝色突出显示）。在LUV上观察到平行的细丝组，相距约10nm。此典型图像是 2D 投影。因此，为了破译任何3D变形并知道隔膜丝是否直接与膜相互作用，进行了冷冻电子断层扫描（图4B 和 图4C）。 图4B 显示了3D重建中的切片，而 图4C 显示了同一区域的分割，以黄色突出显示膜，以蓝色突出显示隔膜。从侧面观察可以看出，隔膜纤维丝基本上保持与脂质体直接结合，与裸露的球形囊泡相比，囊泡相当扁平。
图 4：与 LUV 结合的隔膜长丝的自组装。 （A）与囊泡结合的隔膜丝的冷冻电镜图像。一些灯丝以蓝色突出显示，以提高可见性。暗点是金基准，通常用于对齐断层扫描的数据。比例尺 = 100 nm。（B）和（C）从倾斜序列获得的3D重建。脂质以黄色突出显示，而隔膜以蓝色分段。比例尺 = 200 nm。 请点击此处查看此图的大图。
通过SEM可视化的隔膜长丝的曲率依赖性排列
隔膜蛋白位于显示微米曲率的位点（例如，在细胞分裂沟，纤毛基部等）的细胞中。此外， 体外 研究表明，如上所述，隔膜可以重塑膜，使它们最终显示出微米曲率。为了测定隔膜对正（凸）和负（凹）曲率的曲率敏感性，将隔膜与与上述波浪图案融合的支撑脂质双层一起孵育。结果如图 5 所示。 图5A 概述了获得样品所需的不同步骤。 图5B 显示了低放大倍率下的波浪图案，其中负曲率和正曲率的周期性清晰可见。两个连续的波浪由橙色实线表示。与波近似正交的缺陷由白色箭头表示。 图5C 和 图5D 显示了在较高放大倍率下隔膜丝的超微结构组织。隔膜组装成一组平行的细丝，其方向取决于曲率（参见以蓝色突出显示的细丝）。事实上，隔膜长丝不是随机定向的。相反，当与负（凹）曲率相互作用以遵循施加的曲率时，隔膜可以弯曲。相反，在正曲率上，隔膜细丝保持笔直，未弯曲并沿凸波对齐。因此，隔膜可以与正曲率和负曲率相互作用，但在给定的曲率上采用特定的组织。因此，这种方法似乎特别相关，以突出丝状蛋白结合和自组装的曲率敏感性。
（A）获得“波浪形”样品所需的步骤的示意图，旨在通过SEM分析隔膜弯曲灵敏度（B）具有结合的隔膜细丝的波浪图案的低放大倍率SEM图像，在此分辨率下无法分辨。两个连续的波浪以橙色突出显示。正交缺陷由白色箭头表示。比例尺 = 10 μm. （C） SEM 图像，放大倍率为 10，000 倍，其中可以看到隔膜长丝。比例尺 = 1 μm. （D） SEM 图像，放大倍率为 20，000 倍。一些灯丝以蓝色突出显示，以提高可见性。比例尺 = 200 nm。图像中存在的球形物体是与隔膜和基质相互作用的小囊泡。在B-D中将隔膜蛋白浓度设定为200 nM。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
如上所述，已经使用了脂质混合物来增强脂质双层内的PI（4，5）P2 掺入，从而促进隔膜相互作用。事实上，我们已经在其他地方展示了25 ，萌芽的酵母隔膜以PI（4，5）P2特异性方式与囊泡相互作用。该脂质组成通过筛选多种组合物进行经验调整，现在被作者广泛使用。PI（4，5）P2 脂质必须小心处理。储备溶液必须小体积等分，以便特定小瓶不会打开两次以上进行移液。此外，脂质等分试样应储存在氩气下，以防止脂质氧化。最后，一旦脂质混合物溶解在水溶液中，混合物必须立即使用，并且不能储存用于进一步的实验。值得注意的是，在GUV重建或支持脂质双层融合后，隔膜与脂质之间的相互作用在2 h后大大降低。
使用八聚体芽酵母隔膜复合物（包含Cdc10，Cdc11，Cdc12和Cdc3）获得的一些结果已在此处呈现;然而，用于分析来自其他物种的隔膜复合物的行为所遵循的实验程序应该是相同的。
为了产生GUV，我们更喜欢使用铂线的电形成方法，而不是在ITO板上电形成或PVA膨胀。如前面25所示，该方法可重复地产生质量良好的单层GUV，没有任何缺陷。
波浪基板可以设计成具有广泛的曲率。在筛选各种设计后，一直使用周期为2μm，振幅为250nm的图案，其产生-3.5μm-1至3.5μm-1（±0.5 um-1）的曲率范围。使用周期性短且振幅较高的图案，脂质双分子层不能很好地与表面相吻合。通常，在曲率较高的情况下，双层将悬浮在两个凸波之间，而不是在NOA基板上完全支撑。具有较低的振幅和较大的周期性，隔膜以随机的向列状方向组织，表明图案过于平坦。此外，使用波浪图案代替圆柱形管20或球体20的好处是可以同时测试正曲率和负曲率。将来，检查细丝在高斯“马鞍状”曲率上的行为将与模拟更现实的细胞环境的曲率有关。
在溶液中，将LUV与隔膜蛋白混合即使在低浓度的蛋白质和脂质下也能诱导隔膜脂质聚集体的产生。因此，样本是异质的，明智的做法是寻找更薄的冰域，在那里发现更小和更明确的隔膜囊泡物体。在选择将要进行冷冻断层扫描的感兴趣区域时，这一点尤其重要。通常，即使在低放大倍率下，与球形囊泡相比，显示强烈变形突出的囊泡也更有可能具有高密度的隔膜细丝。该协议的重点是获得仿生膜上细丝的整体超微结构的描述。目前，可以达到更高的分辨率。分辨率限制是由于映像可用的视图数量有限造成的。但是，这仍然超出了本协议的范围。
我们通过该协议表明，互补方法的组合对于理解和解剖细胞骨架隔膜丝的特定排列如何以曲率依赖性方式感知和重塑膜至关重要。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢帕特里夏·巴塞罗和丹尼尔·莱维的有益建议和讨论。这项工作得益于国家研究机构（ANR-13-JSV8-0002-01）、ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014和“SEPTSCORT”项目ANR-20-CE11-0014-01的支持。B. Chauvin由巴黎高等医学院“ED564：法兰西岛的体质”和医学研究基金会资助。K.中泽得到了索邦大学（AAP新兴）的支持。G.H.科恩德林克得到了荷兰组织联合会（NWO/OCW）通过“BaSyC-构建合成细胞”的支持。引力授予（024.003.019）。我们感谢拉博细胞（n）量表（ANR-11-LABX0038）和巴黎科学与文学（ANR-10-IDEX-0001-02）。我们感谢法国国家研究基础设施法国生物成像（ANR10-INBS-04）成员居里研究所的细胞和组织成像（PICT-IBiSA）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
References
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