Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מלמטה למעלה בשיטות במבחנה כדי לבחון את הארגון האולטרה-סטרוקטורלי, עיצוב מחדש של הממברנה והתנהגות הרגישות לעקמומיות של מחיצות

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63889
Automatic Translation
*1, *1, 1,7, 1, 1, 2, 2, 3, 4, 5, *6, *1
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

Summary

ספטינים הם חלבונים ציטוסקטליים. הם מתקשרים עם ממברנות שומנים ויכולים לחוש אך גם ליצור עקמומיות ממברנה בקנה מידה של מיקרון. אנו מתארים בפרוטוקול זה מתודולוגיות in vitro מלמטה למעלה לניתוח עיוותים של ממברנות, קשירת ספטין רגישה לעקמומיות ואולטרה-מבנה של נימה ספטין.

Abstract

שיפוץ ממברנה מתרחש כל הזמן בקרום הפלזמה ובתוך אברוני התאים. כדי לנתח באופן מלא את תפקיד הסביבה (תנאים יוניים, הרכבי חלבונים ושומנים, עקמומיות הממברנה) ואת השותפים השונים הקשורים לתהליכי עיצוב מחדש של ממברנה ספציפיים, אנו נוקטים בגישות מלמטה למעלה במבחנה . בשנים האחרונות יש עניין רב בחשיפת תפקידם של חלבוני ספטין הקשורים למחלות גדולות. ספטינים הם חלבונים ציטוסקטליים חיוניים הנמצאים בכל מקום ומקיימים אינטראקציה עם קרום הפלזמה. הם מעורבים בחלוקת תאים, תנועתיות תאים, נוירו-מורפוגנזה, וזרעונים, בין תפקידים אחרים. לכן, חשוב להבין כיצד ספטינים מתקשרים ומתארגנים בממברנות כדי לגרום לאחר מכן לעיוותים של הממברנות וכיצד הם יכולים להיות רגישים לעקמומיות ממברנה ספציפית. מאמר זה נועד לפענח את יחסי הגומלין בין המבנה האולטרה-מבנה של ספטינים ברמה המולקולרית לבין שיפוץ הממברנה המתרחש בקנה מידה מיקרוני. לשם כך, שמרים ניצנים, ומתחמי ספטין של יונקים באו לידי ביטוי וטוהרו באופן רקומביננטי. לאחר מכן נעשה שימוש בשילוב של בדיקות חוץ גופיות כדי לנתח את ההרכבה העצמית של מחיצות בממברנה. דו-שכבתי שומנים נתמכים (SLBs), שלפוחיות חד-לשוניות ענקיות (GUVs), שלפוחיות חד-לשוניות גדולות (LUVs) ומצעים גליים שימשו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין הרכבה עצמית של ספטין, עיצוב מחדש של הממברנה ועקמומיות הממברנה.

Introduction

ספטינים הם חלבונים יוצרי חוטים ציטוסקטליים המקיימים אינטראקציה עם ממברנות שומנים. ספטינים נמצאים בכל מקום באאוקריוטים וחיוניים לתפקודים תאיים רבים. הם זוהו כמווסתים העיקריים של חלוקת תאים בשמרים ניצנים ויונקים 1,2. הם מעורבים באירועי עיצוב מחדש של הממברנות, ciliogenesis3, ו spermiogenesis4. בתוך תאי יונקים, ספטינים יכולים גם לקיים אינטראקציה עם אקטין ומיקרוטובולים 5,6,7 בקלסר של Rho GTPases (BORG) תלוי-אופן8. ברקמות שונות (נוירונים9, ריסונים3, זרעונים10), ספטינים זוהו כמווסתים של מחסומי דיפוזיה עבור רכיבים הקשורים לממברנה11. כמו כן, הודגם כי ספטינים מווסתים את התפוררות הממברנה ואת היווצרות הבליטה12. ספטינים, בהיותם חלבונים רב-משימתיים, מעורבים בהופעתן של מחלות שכיחות שונות13. הטעות שלהם קשורה להופעת סרטן14 ומחלות נוירודגנרטיביות15.

בהתאם לאורגניזם, כמה תת-יחידות ספטין (שתיים ב- Caenorhabditis elegans עד 13 בבני אדם) מתכנסות ליצירת קומפלקסים שארגונם משתנה באופן תלוי רקמות16. אבן הבניין הבסיסית של ספטין אוספת שתיים עד ארבע יחידות משנה, הקיימות בשני עותקים ומורכבות באופן פלינדרומי דמוי מוט. בשמרים ניצנים, ספטינים הם אוקטאמריים17,18. באתרו, מחיצות ממוקמות לעתים קרובות באתרים עם עקמומיות מיקרומטר; הם נמצאים באתרי התכווצות החטיבה, בבסיס הריסונים והדנדריטים, ובטבעות של זרעונים19,20. בממברנה, תפקידם של המחיצות נראה כפול: הם מעורבים בעיצוב מחדש של דו-שכבת השומנים ובשמירה על שלמות הממברנה21. לפיכך, חקירת התכונות הביופיזיות של חלבונים יוצרי נימה ספטין ו/או תת-יחידות בממברנה היא חיונית להבנת תפקידם. כדי לנתח תכונות ספציפיות של ספטינים בסביבה מבוקרת היטב, גישות מלמטה למעלה במבחנה מתאימות. עד כה, רק קבוצות מעטות תיארו את התכונות הביופיזיות של ספטינים במבחנה20,22,23. לפיכך, בהשוואה לחוטים ציטוסקטליים אחרים, הידע הנוכחי על התנהגות ספטינים במבחנה נותר מוגבל.

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן לנתח את הארגון של חוטי ספטין, עיצוב מחדש של הממברנה ורגישות לעקמומיות19. לשם כך נעשה שימוש בשילוב של שיטות מיקרוסקופיה אופטית ומיקרוסקופיית אלקטרונים (מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים [cryo-EM], ומיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת [SEM]). עיצוב מחדש של הממברנה של שלפוחיות חד-מיות ענקיות בגודל מיקרומטר (GUVs) ממחיש באמצעות מיקרוסקופיה אופטית פלואורסצנטית. ניתוח הסידור והאולטרה-מבנה של חוטי ספטין הקשורים לשלפוחיות שומנים מבוצע באמצעות cryo-EM. ניתוח רגישות עקמומיות ספטין מתבצע באמצעות SEM, על ידי לימוד ההתנהגות של חוטי ספטין הקשורים לדו-שכבתיות שומנים נתמכות מוצקות המופקדות על מצעים גליים של עקמומיות משתנה, המאפשרת ניתוח רגישות לעקמומיות עבור עקמומיות חיובית ושלילית כאחד. בהשוואה לניתוח הקודם20,24, כאן, אנו מציעים להשתמש בשילוב של שיטות כדי לנתח ביסודיות כיצד ספטינים יכולים להרכיב את עצמם, לעוות באופן סינרגטי את הממברנה ולהיות רגישים לעקמומיות. פרוטוקול זה הוא האמין להיות שימושי וניתן להתאמה לכל חלבון נימה המציג זיקה לממברנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קביעת עיצוב מחדש של הממברנה באמצעות שלפוחיות חד-עיניות ענקיות (GUVs)

הערה: בחלק זה, GUVs נוצרים כדי לחקות את עיוותי הממברנה שעשויים להיות מושרים על ידי ספטינים בהקשר תאי. ואכן, בתאים, ספטינים נמצאים לעתים קרובות באתרים עם עקמומיות מיקרומטר. לרכבי GUV יש גדלים הנעים בין כמה לעשרות מיקרומטרים והם יכולים להיות מעוותים. לפיכך הם מתאימים לבחון כל דפורמציה הנגרמת על ידי ספטין בקנה מידה של מיקרומטר. שומנים פלואורסצנטיים, כמו גם ספטינים המסומנים באופן פלואורסצנטי (באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP]), משמשים למעקב אחר התנהגותם של שומנים וחלבונים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

  1. הכנת מאגרים ופתרונות
    1. הכן את מאגר הצמיחה של GUV (50 mM NaCl, 50 mM סוכרוז ו- 10 mM Tris [pH = 7.8]) ואת מאגר התצפית (75 mM NaCl ו- 10 mM Tris [pH = 7.8]).
    2. למדוד (באמצעות אוסמומטר מסחרי) ולהתאים את האוסמולריות של מאגרי התצפית והגדילה (170 mOsmol· L-1, בתיאוריה) על ידי הוספת כמויות קטנות של NaCl עד שהאוסמולריות המתאימות שלהן שוות. סנן את המאגרים באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר. Aliquot את מאגר הצמיחה ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף. אחסן את מאגר התצפית ב-4 °C.
      הערה: ההבדל באוסמולריות בין שני המאגרים לא יעלה על 5%.
    3. הכינו תמיסת β-קזאין של 5 מ"ג·מ"ל-1 במאגר התצפית. ודא פירוק מלא (לאחר מספר שעות ב 4 מעלות צלזיוס עם ערבוב מגנטי). סנן את התמיסה עם מסנן 0.2 מיקרומטר, aliquot, ולאחסן ב -20 °C.
  2. מכינים את תערובות השומנים בריכוז שומנים כולל של 3 מ"ג·מ"ל-1 בכלורופורם. יש להשתמש בהרכב (מול%) של 56.8% L-α-פוספטידילכולין (EggPC), 15% כולסטרול, 10% 1,2-דיאולאויל-sn-גליצרו-3-פוספואתנולמין (DOPE), 10% 1,2-דיאולאויל-sn-גליצרו-3-פוספו-L-סרין (DOPS), 8% L-α-פוספטידילינוזיטול-4,5-ביספוספט (PI(4,5)P 2), ו-0.2% בודיפי-TR-סרמיד כדי לשפר את האינטראקציות חלבון-שומנים ולהעדיף שילוב של PI(4,5)P2 25.
    הערה: טפל בכלורופורם מתחת למכסה אדים באמצעות כפפות ניטריל ומשקפי בטיחות. פיפטה תמיסות כלורופורם עם מזרקי זכוכית והימנעו מפלסטיק מכיוון שכלורופורם ממיס פלסטיק. לפני ואחרי השימוש, יש לשטוף את המזרקים על ידי פיפטינג כלורופורם 5x-10x. השתמש במזרקים נפרדים כדי פיפטה שומנים פלואורסצנטיים ספציפיים כדי למנוע זיהום צולב. ניתן לאחסן שומנים בכלורופורם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בבקבוקון זכוכית ענבר מכוסה טפלון. יש למלא את הבקבוקונים בארגון לפני הסגירה ולאטום אותם בפרפילם כדי למנוע חמצון שומנים.
  3. אלקטרו-היווצרות של רכבי שטח באמצעות מערך חוטי פלטינה
    הערה: איור 1 מציג את ערכת שלבי הניסוי ותמונה של החדר.
    1. נקו היטב את חוטי התא והפלטינה באופן הבא כדי להסיר שאריות שומנים.
    2. לצלול את החוטים ואת החדר אצטון ו sonicate במשך 10 דקות. נגבו אותם בזהירות עם טישו מנייר באמצעות אצטון.
    3. להרכיב את החדר על ידי החדרת החוטים, לצלול שוב אצטון, ו sonicate במשך 10 דקות. נגבו פעם נוספת עם אצטון, וודאו כי החוטים מנוקים לחלוטין. יש לצלול את התא באתנול, לסוניק במשך 10 דקות ולנגב עם אתנול.
    4. לבסוף, לצלול את החדר במים deionized, sonicate במשך 10 דקות, ויבש עם זרם של חנקן או אוויר.
      הערה: תא הטפלון (איור 1B) נוצר בהתאמה אישית בסדנה הביתית. הוא מכיל שלושה תאים הניתנים לאיטום משני הצדדים באמצעות כיסויי זכוכית. חוטי פלטינה ניתן להכניס לתוך החדר דרך חורים בקוטר 1.3 מ"מ.
    5. לאחר ניקוי התא, יש להפקיד 3-4 טיפות לכל תא (כל טיפה היא בערך 0.1 μL)) של תערובת השומנים 3 mg·mL-1 על כל חוט פלטינה. סובבו את החוטים ב-180° והפקידו 3-4 טיפות שומנים לכל תא בצד הנגדי של כל חוט פלטינה. ודאו שהטיפות אינן נוגעות זו בזו. כ 5 μL של תערובת השומנים נדרש לכל תא שלם.
    6. מניחים את תא הגידול בתא ואקום למשך 30 דקות כדי להסיר כל זכר לכלורופורם.
      הערה: ואקום עמוק (0.1 mbar) הוא הטוב ביותר. כאשר מיובש, שומנים פגיעים חמצון, ולכן, לא צריך להישאר באוויר במשך יותר מכמה דקות.
    7. השקיעו שומנים גבוהים בוואקום בתחתית התא (הצד הקרוב ביותר לחוטים) לאורך שולי שלושת התאים באמצעות מזרק ולחצו על מכסה נקי (22 מ"מ x 40 מ"מ) כנגד השומן כדי להבטיח איטום מושלם. אוטמים את שתי הגפיים של התא (כלומר, באתרי הכניסה/יציאה של החוטים) באמצעות משחת איטום (לוחות שעווה). באופן דומה, להחיל גריז ואקום בצד השני של התא.
    8. מלא את התאים בחיץ צמיחה (~ 1 מ"ל לכל תא) באמצעות פיפטה. אין לערבב את התמיסה מהר מדי או חזק מדי כדי למנוע כל ניתוק של הסרט השומנים מן החוטים. אטמו את החלק העליון של התא בצורה הרמטית באמצעות כיסוי בגודל 22 מ"מ על 40 מ"מ על ידי לחיצה עליו כנגד השומן. כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר, לחץ בעדינות על מכסה הזכוכית מהמרכז לקצוות.
      1. מניחים את התא במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומחברים את החוטים למחולל פונקציית גל (פונקציית סינוס ב-500 הרץ). הגדר מתח אפקטיבי של 350 mV לתקופת צמיחה קצרה יותר (כלומר, 6 שעות) או 250 mV לתקופת גידול ארוכה יותר (כלומר, 12-16 שעות), כפי שכבר הוצג ומוטב במחקר של Beber et al.25.
    9. הסירו את הכיסויים, נגבו את חומר האיטום והשומן והסירו את החוטים. שטפו וקרצפו את התא עם טישו מנייר באמצעות מים ואתנול (≥70%) לסירוגין.
      הערה: סולם המתח והזמן האופטימליים לגידול GUV תלויים בפרמטרים רבים, מריכוז מלח המאגר ועד לגיאומטריית התא (כלומר, המרחק בין החוטים וגודל התא). השתמש באותו תא בכל פעם שהניסוי חוזר על עצמו כדי להבטיח יכולת שכפול. החוטים נמצאים בסמיכות לתחתית התא, כך שניתן לדמות את השומנים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. דמיינו את השומנים בכל שלב (ראו איור 1C,D) כדי לוודא שתהליך היווצרות האלקטרו מוצלח.
  4. דגירה של ספטין עם הבועיות
    1. אסוף רכבי שטח מהחוטים באמצעות קצוות פיפטה חתוכים מראש (~ 1 מ"מ פתיחה) המובאים בקרבת החוטים. לאחר מכן, פיפטה את הפתרון לאורך כל החוט. הליך זה מונע יצירת זרמי lamellar חזקים שעלולים לשבש את ה- GUVs. בעקבות שלב זה, חיתוך טיפים פיפטה כבר לא נדרש. ואכן, זרמי lamellar אינם פוגעים ב- GUVs בתמיסה.
      הערה: בשל נוכחותו של PI(4,5)P 2 בתערובת השומנים, יש לאחסן רכבי שטח שנאספו לא יותרמ-2-3 שעות לפני הניסוי. ואכן, PI(4,5)P2 מקבל solubilized במהירות ו septins כבר לא נקשר לממברנות כמה שעות לאחר היווצרותם. עם זאת, ברגע מחיצות קשורות לממברנה, הם נשארים קשורים במשך כמה ימים.
    2. לדלל את תמיסת מלאי המחיצות ב- Tris 10 mM (pH 8) אך ורק כדי להגיע לאוסמולריות השווה לזו של מאגר הצמיחה; במידת הצורך, דילל את תמיסת ספטין עוד יותר במאגר התצפית. הוסף את הנפח המיועד של רכבי שטח שנאספו (50-100 μL עבור נפח כולל של 200 μL). בצע את הדגירה ישירות בתא התצפית לאחר פסיבציה עם β-קזאין (ראה להלן). זמן המתנה של 20-30 דקות נדרש כדי להגיע לשיווי משקל.
      הערה: הביטוי והטיהור של קומפלקסים אוקטאמריים ספטין (שמרים אנושיים או ניצנים) מתוארים בהרחבה בסעיפים אחרים17. בקצרה, ספטינים באו לידי ביטוי ב-Escherichia coli, טוהרו במעבדה באמצעות צעדי זיקה, הרחקת גודל וחילוף יונים, ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס בתמיסה מימית של 50 mM Tris-HCl (pH 8), 300 mM KCl ו-5 mM MgCl2 בריכוז ~1 mg·mL-1 (3 μM). ריכוז מלח גבוה משמש כדי למנוע צבירה septin. אין לרכז מתחמי ספטין באמצעות מכשיר צנטריפוגה מסנן, אשר משרה צבירה ובכך מקטין את תפוקת החלבון.
  5. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ דיסק קונפוקלי ו/או מסתובב
    1. כדי למנוע מה-GUVs להידבק לפני השטח ו/או להתפוצץ, העבירו את תא התצפית על ידי דגירה שלו בתמיסת β-קזאין של 5 מ"ג·mL-1 למשך 30 דקות.
    2. הסר את תמיסת β קזאין והעבר את תמיסת ספטין-GUV (שלב 1.4.2.) לתא התצפית באמצעות פיפטה. תנו לשקעי ה-GUVs לרדת לתחתית התא למשך 10-15 דקות.
      הערה: פער ההרכב בין פנים ה-GUV לבין המאגר החיצוני יוצר אי-התאמה של צפיפות ומקדם השבירה. בשל חוסר ההתאמה של מקדם השבירה, ה- GUVs נראים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית של אור שידור.
    3. באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, דמיינו את האות הפלואורסצנטי של השומנים כדי לבדוק את איכות ה-GUVs ואת מצב הלמליאריות של הממברנה. הערך את צפיפות המחיצות הקשורות ל- GUVs על ידי רישום האות הפלואורסצנטי של ספטינים לאחר ביצוע כיול תקין25. בצע רכישות Z-stack במרווח מרחבי של 0.4 מיקרומטר כדי לנתח ולהמחיש את העיוותים התלת-ממדיים של הבועיות המושרות על-ידי האינטראקציה בין המחיצות לבין הממברנה.
      הערה: נעשה שימוש ביעדי טבילת שמן עם הגדלה של פי 60 או 100. נעשה שימוש במיקרוסקופי דיסק קונפוקליים או מסתובבים סטנדרטיים (טבלת חומרים) עם גדלי פיקסלים של 250 ננומטר ו-110 ננומטר, בהתאמה. יש להתאים את תנאי ההדמיה לציוד נתון. לא נוספו לתמיסה חומרי הלבנה ספציפיים נגד תמונות.

Figure 1
איור 1: אלקטרו-היווצרות של רכבי שטח . (A) ייצוג סכמטי של תהליך היווצרות האלקטרו באמצעות חוטי פלטינה. (B) תמונה של מכשיר טפלון תוצרת בית המורכב מחוטי פלטינה המשמשים לייצור רכבי שטח על ידי היווצרות אלקטרו. החוטים הם בקוטר 0.5 מ"מ ובמרחק של 3 מ"מ זה מזה. (C) GUVs (עצמים כדוריים) שנצפו על ידי מיקרוסקופיה אופטית של שידור במהלך תהליך הגידול. האזור האטום בתחתית התמונה הוא חוט הפלטינה. (D) GUVs (עצמים פלואורסצנטיים עגולים) שנצפו במיקרוסקופיה פלואורסצנטית במהלך הצמיחה על חוט הפלטינה. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. ניתוח של ארגון אולטרה-סטרוקטורלי של חוטי ספטין על ידי מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים

הערה: בועיות אינן מתאימות להדמיה בשיטות סטנדרטיות של מיקרוסקופיית אלקטרונים. ואכן, דגימות מיובשות בשיטות סטנדרטיות של כתמים שליליים. עם התייבשות, שלפוחיות צפויות לעבור דפורמציות לא ספציפיות, וכתוצאה מכך לעתים קרובות בליטות שומנים. מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים היא אפוא אסטרטגיה טובה בהרבה להתבוננות בדפורמציות ספציפיות של שלפוחית. באמצעות cryo-EM, הדגימות מוטבעות בתוך שכבה דקה (~ 100-200 ננומטר) של קרח זגוגי, אשר משמרת את הדגימות קרוב למצב המקומי. עם זאת, רכבי שטח גדולים מדי (כמה עשרות מיקרומטרים) מכדי להיות מוטמעים בתוך קרח דק, ולכן הם מצולמים על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים. לפיכך, בועיות חד-עיניות גדולות (LUVs), שקוטרן נע בין ~50-500 ננומטר, נוצרות כדי לקבוע כיצד ספטינים יכולים לעוות שלפוחיות וכיצד הם מסודרים על שלפוחית.

  1. דור של שלפוחיות חד-לשוניות גדולות (LUVs)
    1. הכינו 50 מיקרוגרם של תערובת שומנים מסולפת בכלורופורם עם הרכב טוחן של 57% EggPC, 15% כולסטרול, 10% DOPE, 10% DOPS ו-8% מוח PI(4,5)P2), אשר ממוטב כדי לשפר את האינטראקציה ספטין עם הממברנה בבקבוקון זכוכית.
    2. יבשו את התמיסה תחת זרימת ארגון כדי ליצור שכבת שומנים מיובשת בבקבוקון. שים את הבקבוקון תחת ואקום במשך 30 דקות כדי לייבש לחלוטין את השומנים.
    3. יש לשחזר את שכבת השומנים ב-50 מיקרו-ליטר של תמיסה מימית (50 mM Tris-HCl [pH 8]; 50 mM KCl; 2 mM MgCl2) כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ"ג·mL-1, מערבולת במשך 10 שניות, ולהעביר את התמיסה לצינור.
      הערה: יש להשתמש ב- LUVs בבת אחת לדגירה עם ספטינים. אחרת, האינטראקציה בין חלבון לשומנים תהיה חלשה בגלל סולוביזציה של PI(4,5)P2. תהליך ה-re-solubilization הגולמי הזה מייצר אוכלוסייה הטרוגנית של שלפוחיות בקטרים הנעים בין 50 ננומטר ל-500 ננומטר. לפיכך, טווח שלם של קטרים ולכן עקמומיות נבדקים בו זמנית.
  2. דגירה של המחיצות עם השומנים המסיסים בריכוזי השומנים והספטין הסופיים של 0.1 מ"ג·מ"ל-1 (כ-300 ננומטר) ו-20 ננומטר, בהתאמה, במאגר עתיר מלח (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2). לדגור את הדגימה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  3. הקפאת צלילה כדי להגדיל את הדגימה
    1. רשתות פחמן חוריות פריקה זוהרת (300 רשת) בצד הפחמן למשך 30 שניות ב-5 mA באמצעות ציוד גנרטור פלזמה והכנסת הרשת לתוך מכונת הקפאת צלילה בסביבה לחה.
    2. ספיחה של 4 μL של הדגימה (שלב 2.2.) בצד הפחמן הזוהר של הרשת. מיד לפני ספיחת הדגימה, הוסף חרוזי זהב 5-10 ננומטר לתמיסה, למקרה שהדגימות ישמשו ליצירת סדרות מוטות על ידי קריו-טומוגרפיה.
      הערה: צפיפות חרוזי הזהב חייבת להיות מסוננת ומותאמת אמפירית ותלויה בספק. הצפיפות הממוטבת היא 10-15 חרוזי זהב בשדה הראייה.
    3. כתם לייבש את הדגימות מהצד החשוף כדי לשאוף את טיפת הדגימה בצד הנגדי.
      הערה: זמן הכתם הוא בדרך כלל 4 שניות, והמיקום של נייר הסינון וכוח הכתם מותאמים אמפירית על ידי בדיקה וסינון של מיקומים חלופיים של נייר הסינון כדי למטב את איכות הקרח (עובי) ואת צפיפות החומר.
    4. העבירו את הרשתות למיקרוסקופ או אחסנו אותן במיכל חנקן נוזלי.
      הערה: השימוש ברשתות פחמן חוריות חיוני כדי להתאים את הפולידיספרסיה בגודל הבועיות. הכתמת הדגימה מהצד הנגדי מעדיפה ספיחה משופרת של החומר הביולוגי ברשת.
  4. הדמיית מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים
    1. הכנס את הרשתות למיקרוסקופ אלקטרונים (EM) המצויד לתצפית קריו-EM. סנן את כל הרשת על-ידי יצירת מפה של כל הדגימה בהגדלה נמוכה (בדרך כלל בהגדלה של 120x) כדי לבחור אזורים המציגים קרח טוב יותר (כלומר, דק ומלוטש היטב).
    2. לאיסוף נתונים דו-ממדיים של cryo-EM, אסוף תמונות בגודל פיקסל של כ- 2 Å לפיקסל כדי לבדוק את איכות הדגימה. ודא כי הן חוטי ספטין ואת bilayer שומנים גלויים.
    3. לאיסוף נתוני טומוגרפיה קריו-אלקטרונית, בחר תחומי עניין המציגים שלפוחיות מעוותות. ודא כי מספיק חרוזי זהב (לפחות 10) נמצאים בשדה הראייה.
    4. על פי התוכנה המשמשת לאיסוף נתוני סדרה מוטה, בחר מיקוד ומיקומי מעקב כדי להיות רחוק מספיק מאזור העניין. אסוף סדרות מוטות על-ידי שינוי זווית ההטיה מ- -60° ל- +60°, ואיסוף תמונה כל 2°-3° מעלות.
      הערה: המינון הכולל צריך להיות בערך, או פחות מ-100 אלקטרונים/Å2. גודל הפיקסלים משתנה בין 1.3 Å ל- 2.1 Å, בהתאם למיקרוסקופ המשמש לאיסוף נתונים. באופן אידיאלי, תוכנית סימטרית זוויתית לאיסוף נתונים עדיפה כדלקמן: 0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°. עם זאת, גוניומטרים של מיקרוסקופים בעלי כניסה צדדית אינם מספקים יציבות מכנית מספקת כדי להשיג את אותן סכמות סימטריות. לחלופין, ניתן להתחיל את הרכישה ב-0° עד 34°, לאחר מכן ברצף זוויתי שני מ-2°- עד -60°, ולהסתיים ברצף סופי מ-36° עד 60°. המטרה היא לאסוף את התמונות הראשונות (עם נזקי הקרינה הנמוכים ביותר) בזוויות הנמוכות ביותר. יתר על כן, כדי לדמיין את המבנה האולטרה-מבני של שלפוחיות וחוטי ספטין קשורים, ניתן להשתמש במיקרוסקופ קריו-EM סטנדרטי (200 קילו-וולט, נימה של לנתנום הקסבוריד (LaB6) וכניסה צדדית לדוגמה). עם זאת, אם שואפים להמשיך בעיבוד תמונה נוסף (ממוצע תת-טומוגרמה, למשל), עדיף להשתמש במיקרוסקופים מהדור האחרון של תותחי פליטת שדה (FEG) המצוידים בגלאים ישירים. בפרוטוקול זה, אנו מגבילים את התיאור שלנו לרכישת שחזורים תלת-ממדיים ומשאירים ממוצע תת-טומוגרמה.
  5. שחזור תלת-ממדי מקריו-טומוגרפיה וסגמנטציה
    1. השתמש בחבילת התוכנה של משרד הביטחון (טבלת חומרים) ליישור תמונה מסדרה מוטה ולשחזור תלת-ממדי26,27. בתוך משרד הביטחון, בצע יישור סדרות הטיה המבוסס על מיקום פידוקיאלים (חרוזי זהב). בנוסף, במידת הצורך, לבצע קביעה ותיקון של פונקציית העברת ניגודיות (CTF) בתוך משרד הביטחון26. לבסוף, השג שחזור תלת-ממדי עם משרד הביטחון, תוך ביצוע קפדני של כל שלב.
    2. פלח באופן ידני את השומנים ואת חוטי הספטין באמצעות 3Dmod27 מחבילת התוכנה של משרד הביטחון, לתצוגה.

3. ניתוח רגישות העקמומיות של ספטין באמצעות SEM

הערה: כדי להבין כיצד ספטינים יכולים להיות רגישים לעקמומיות מיקרומטר, נעשה שימוש בגישה חוץ-גופית כדי לדגום קומפלקסים של חוטי ספטין עם דו-שכבות שומנים נתמכות מוצקות שהופקדו על תבניות גליות גליות בקנה מידה של מיקרומטר.

  1. תכנון העתק NOA גלי (דבק אופטי נורלנד) מתבניות פולידימתילסילוקסן גליות (PDMS)
    1. השתמש בדפוסים גליים של PDMS של משרעת 250 ננומטר ומחזוריות רוחבית של 2 מיקרומטר או ממדים אחרים כדי לבחון את העקמומיות המתאימה לחלבון המעניין.
      הערה: תבניות גליות PDMS מעוצבות ונוצרות כמתואר ב- Nania et al.28,29.
    2. בסביבת חדר נקי, יש להפקיד 5 μL של NOA נוזלי על מכסה זכוכית עגול בקוטר 1 ס"מ ולהניח את תבנית PDMS על הטיפות. יש לטפל עם אור UV (320 ננומטר) למשך 5 דקות כדי לבצע פוטו-פילמר של ה-NOA הנוזלי לסרט פולימרי דק. לאחר מכן, יש לקלף בעדינות את תבנית ה-PDMS מהכיסוי עם ה-NOA הפולימרי הטרי.
      הערה: NOA הוא דבק שקוף אופטית נפוץ המתאים להדמיית מיקרוסקופיה אופטית. בנוסף, NOA עמידה בפני תהליכי הקיבוע והכתמים הכימיים המתבצעים לפני הדמיית SEM. ניתן להשתמש גם בשרפים NOA 71 וגם NOA 81 עם תוצאות דומות. ניתן להשתמש בתבנית PDMS הראשונית מספר פעמים כדי לייצר עותקים משוכפלים של NOA. העתקי NOA שהתקבלו יכולים להישמר בקופסה בטמפרטורת החדר במשך חודשים.
  2. יצירת דו-שכבת שומנים נתמכת ודגירה של חלבונים
    1. טפל ביריעות NOA באמצעות מנקה פלזמה אוויר במשך 5 דקות כדי להפוך את פני השטח הידרופיליים.
    2. הכינו תמיסה של שלפוחיות חד-עיניות קטנות (רכבי שטח) עם הרכב טוחן של 57% EggPC, 15% כולסטרול, 10% DOPE, 10% DOPS ו-8% PI(4,5)P2 במוח בריכוז שומנים כולל של 1 מ"ג·mL-1. הכן את רכבי השטח על ידי החייאת סרט שומנים מיובש במאגר התצפית, כמתואר בשלב 2.1.3. ניתן לונתק בעדינות את התמיסה באמצעות סוניק אמבטיה למשך 5-10 דקות עד שהפתרון שקוף.
      הערה: ניתן לאחסן את הפתרון של רכבי שטח קפואים במשך מספר שבועות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    3. הכנס את הכיסויים התומכים בתבניות NOA בתוך הבארות של תיבות תרבית תאים. יש להפקיד 100 μL של תמיסת SUV של 1 מ"ג·mL-1 על תבניות NOA שזה עתה השתחררו זוהר (שלב 3.2.1.) ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שלב זה גורם למיזוג של רכבי שטח עם פני השטח של תבנית NOA כדי ליצור דו-שכבת שומנים נתמכת.
    4. שטפו את השקופיות ביסודיות פי 6 עם מאגר ספטין (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) כדי להסיר רכב שטח לא מחובר. לאחר כל שטיפה, לעולם אל תתנו לדגימה להתייבש לחלוטין.
    5. דילול תמיסת מלאי הספטין האוקטמרית במאגר ספטין עתיר מלח (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl 2) באמצעות חיץ ספטין (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) לריכוזים סופיים הנעים בין 10 ננומטר ל-100 ננומטר, ונפחים של 1 מ"ל. לדגור את תמיסת החלבון על השקופיות במשך ~ 1 שעה בטמפרטורת החדר.
      הערה: הנפח גדול מספיק כדי שלא תהיה בעיה של אידוי.
  3. הכנת מדגם לניתוח SEM
    הערה: פרוטוקולים שונים פותחו במיקרוסקופיית אלקטרונים לניתוח מבני חלבונים והרכבתם. הפרוטוקול הנוכחי משמר את ארגון חוטי ספטין, באמצעות פרוטוקול קיבוע הנגזר מ- Svitkina et al.30 זה קל ליישום. חוץ מזה, פרוטוקול זה מייעל תצפיות SEM ברזולוציה גבוהה.
    1. הכנת ריאגנטים ופתרונות מלאי
      הערה: פרוטוקול זה דורש מספר ריאגנטים ופתרונות שניתן להכין מראש או ממש לפני הדגירה. בצע את ההוראות שסופקו כדי למנוע ממצאים או חוסר תגובתיות כימית.
      1. נתרן קקודילאט 0.2 M תמיסת ציר: כדי להכין תמיסה זו בעוצמה כפולה, יש להמיס 2.14 גרם של אבקת נתרן קקודילאט ב~ 40 מ"ל של מים מזוקקים תחת ערבוב מגנטי. לאחר פירוק מלא, התאם את ה- pH ל- 7.4 על ידי הוספה עדינה של 0.1 M HCl (~ 1 מ"ל עבור 50 מ"ל של תמיסה) והשלם את הנפח הסופי עם מים מזוקקים. ניתן לאחסן תמיסה זו למשך 24-48 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      2. 2% גלוטראלדהיד (GA) בנתרן קקודילאט 0.1 M (תמיסה מתקבעת): הכן תמיסה זו ממש לפני השימוש על-ידי דילול GA טהור מאוד בדרגה EM עם תמיסת נתרן קקודילאט 0.2 M (ראה לעיל). השתמש בפתרון מלאי GA מסחרי של 25%-50% הודות לקיבולת האחסון הממוטבת שלו ב-4 °C. להכנת 10 מ"ל של תמיסה מתקבעת, לדלל 0.8 מ"ל של 25% תמיסת GA מסחרית עם 4.2 מ"ל של מים מזוקקים ו 5 מ"ל של 0.2 M נתרן קקודילט.
      3. 1% אוסמיום טטרוקסיד (OsO 4) בנתרן קקודילאט 0.1 M: הכן את התמיסה המקובעת השנייה ממש לפני השימוש על ידי דילול תמיסת המלאי המסחרית 4% OsO4 עם 0.2 M נתרן קקודילאט (ראה לעיל). עבור 4 מ"ל של תמיסה מקובעת OsO 4, לדלל 1 מ"ל של 4% תמיסת OsO4 מסחרית עם 1 מ"ל של מים מזוקקים ו 2 מ"ל של 0.2 M נתרן קקודילט.
        הערה: השתמש בפתרון מלאי מסחרי של 4% OsO4 בנורות זכוכית מחשוף בגלל תכונות האחסון והטיפול שלהן. שים לב כי OsO4 הוא תגובתי מאוד. ודא כי צבעו הוא צהוב מעט ולא כהה.
      4. 1% חומצה טאנית (TA) במים: הכינו את התמיסה הזו ממש לפני השימוש. הכינו את תמיסת TA לקבלת ריכוז סופי של 1% TA במים מזוקקים בטמפרטורת החדר. יש להמיס 10 מ"ג ב-1 מ"ל של מים מזוקקים ומערבולת למשך מספר דקות. לא ניתן לאחסן תמיסת TA ויש לסנן אותה עם מסנן 0.2 מיקרומטר לפני השימוש.
      5. תמיסת 1% אורניל אצטט (UA) במים הכן תמיסת UA כדי להשיג ריכוז סופי של 1% UA במים מזוקקים. יש להמיס 10 מ"ג ב-1 מ"ל של מים מזוקקים ומערבולות למשך 30 דקות עד שעה לפחות על ידי מערבולת או ניעור בטמפרטורת החדר. פתרון זה יכול להיות מאוחסן במשך חודש אחד ב 4 מעלות צלזיוס אבל יכול בקלות לזרז חייב, ולכן, להיות מסונן עם מסנן 0.2 מיקרומטר לפני השימוש.
      6. סדרה מדורגת של תמיסות אתנול הכן תמיסות 50%, 70%, 95% ו-100% אתנול במים. הכינו את האמבטיה האחרונה מבקבוקים חדשים שנפתחו של 100% אתנול או מ-100% אתנול שהתייבש במשך 24 שעות לפחות עם מסננות מולקולריות (קוטר נקבוביות נומינלי = 4 Å) כדי להסיר מהדגימות את כל עקבות המים שעלולים להפריע לייבוש וציפוי. היזהר לא לנער פתרון זה כפי שהוא עלול לגרום resuspension של חלקיקי סיליקט.
        הערה: היזהר בעת טיפול בריאגנטים הכימיים המשמשים בפרוטוקול זה. גלוטרלדהיד, אוסמיום טטרוקסיד, נתרן קקודילאט ואורניל אצטט הם כולם רעילים מאוד, אורניל אצטט הוא גם רדיואקטיבי. כל מניפולציה של הריאגנטים והפסולת שלהם חייבת להיעשות באמצעות אינדיבידואל (כפפות, מעילי מעבדה, משקפי בטיחות) והגנה קולקטיבית (מנדפים אדים ומגני פרספקס), על פי הנהלים הספציפיים למעבדה.
    2. קיבוע לדוגמה
      1. שטפו את הדגימות (כלומר, שקופיות NOA עם דו-שכבתי שומנים נתמכים שהתמזגו וחלבון מודגר) עם PBS. החלף PBS בפתרון קיבוע GA שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס ותן לתגובה להמשיך במשך 15 דקות. לאחר מכן ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      2. הסר את התמיסה המקובעת ושטוף את הדגימות הקבועות פי 3 עם 0.1 M נתרן קקודילאט (5 דקות לשטיפה) עם ניעור עדין.
      3. דגירה של הדגימות בפתרון המקבע OsO4 למשך 10 דקות עם הגנה מרבית מפני אור כדי לאפשר קיבוע של מבנים ממברניים ולהגדיל את המוליכות החשמלית של הדגימות. הסר את התמיסה המקובעת ושטוף את הדגימות 3x במים מזוקקים (5 דקות לכל שטיפה) עם ניעור עדין.
      4. דגירה של הדגימות השטופות בתמיסת הקיבוע TA המסוננת למשך 10 דקות לכל היותר. הסר את תמיסת TA ושטוף את הדגימות 3x במים מזוקקים (5 דקות לכל כביסה) עם ניעור עדין.
      5. דגרו את הדגימות השטופות בתמיסת קיבוע UA מסוננת טרייה למשך 10 דקות עם הגנה מרבית מפני אור. הסר את תמיסת ה- UA ושטוף את הדגימות 3x במים מזוקקים (5 דקות לשטיפה) עם ניעור עדין.
    3. התייבשות לדוגמה וייבוש נקודה קריטית
      הערה: ייבוש באוויר אינו מותר כדי למנוע נזק לדגימות כתוצאה ממתחי פנים לא רצויים בעת מעבר מהנוזל למצב גזי. שתי שיטות נקבעו ב- EM: השיטה הפיזיקלית להגיע למצב העל-קריטי של CO2 ועקיפת הנקודה הקריטית שלו (31 °C, 74 בר), או השיטה הכימית של אידוי הקסמתיל-דיסילאזאן (HMDS), חומר ייבוש עם מתח פנים מופחת. CO2 ו- HMDS אינם ניתנים לערבוב עם מים. כתוצאה מכך, יש להחליף את כל עקבות המים בממס מעבר (אתנול) כדי למנוע נזק מאוחר יותר במהלך תהליכי הייבוש.
      1. דגירה את הדגימות במשך 2-3 דקות בכל תמיסת אתנול, החל מ 50% עד 100% (נטול מים) אתנול אמבטיה.
        הערה: מכיוון שהתאידוי של אתנול בין אמבטיות הוא מהיר, גם הטיפול בדגימה חייב להיות מהיר כדי למנוע ייבוש באוויר.
      2. העבירו את שקופיות הזכוכית בתוך מייבש הנקודות הקריטיות הממולא מראש באתנול ופעלו לפי הוראות היצרן.
        הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש במנגנון אוטומטי, אך ניתן להשתמש בכל מערכת. הפרוטוקולים עשויים להיות שונים עבור כל מנגנון, אך יש לייעל אותם כדי להסיר לחלוטין אתנול (25 אמבטיות בפרוטוקול זה) ולהפחית את המהירויות עבור חילופי הממסים השונים (כניסות CO 2 ושקעי אתנול / CO2) ואת הדיכאון הסופי (כמעט 1 שעה בפרוטוקול זה).
      3. בתום ייבוש הנקודה הקריטית, יש לאחסן מיד את הדגימות במייבש עד להרכבה וציפוי. מכיוון שדוגמאות יבשות הן היגרוסקופיות מאוד, מצפים אותן (ראו בהמשך) בהקדם האפשרי.
        הערה: לחלופין, HMDS יכול להציע שיטה זולה ומהירה יותר. למרות ש-HDMS מעולם לא נבדק על הדגימות שלנו, גישה זו הניבה תוצאות טובות לתצפית על חלבונים בפנים הפנימיות של קרומי התאים31,32.
    4. הרכבה וציפוי לדוגמה.
      הערה: מאחר שדגימות ביולוגיות מציגות תכונות מוליכות חשמלית ירודות, יש לצפות אותן בסרט מתכת מוליך לפני תצפית SEM. לפיכך נעשה שימוש בהתזת פלזמה-מגנטרון.
      1. חברו את הכיסוי לסטובים שישמשו לתצפיות SEM עתידיות. השתמש בצבע כסף בגלל המוליכות החשמלית המשופרת שלו, בהשוואה לדיסקי פחמן. הוסיפו רצועה של צבע כסוף לפנים העליונות של הכיסוי וודאו שהחיבור עם הכיסוי משביע רצון. הימנעו מכל אגרגלומרטים של צבע.
        הערה: פס הצבע הכסוף חייב להיות דק כדי למנוע מגע בין הדגימה לעדשה האובייקטיבית של ה- SEM בעת עבודה ברזולוציות גבוהות (כלומר, מרחק עבודה נמוך).
      2. המתן עד שהממס יתאדה לחלוטין.
        הערה: משך שלב זה עשוי להשתנות בהתאם לכמות ולעובי של משקעי צבע הכסף. ניתן לקצר שלב זה באמצעות צנצנת פעמון או מעיל ואקום ראשוני למשך 10-30 דקות.
      3. השתמש במנגנון המצויד בראש מפיץ פלזמה-מגנטרון ובשלב סיבובי-פלנטרי, ופעל לפי פרוטוקולים סטנדרטיים המסופקים על ידי היצרן. כאן, המנגנון פונה ל 2.5 x 10-5 mbar, טיהור 1x עם ארגון באיכות גבוהה, ולאחר מכן מותאם 8.0 x 10-3 mbar.
      4. בצע התזת מקדים (120 mA למשך 60 שניות) כדי להסיר את שכבת התחמוצת על פני השטח. לאחר מכן, הפקדה 1.5 ננומטר של טונגסטן (90 mA, מרחק עבודה = 50 מ"מ) בעזרת צג עובי הסרט.
        הערה: יש לנקות את המעיל בצורה מושלמת כדי להבטיח את יכולת השכפול של אידוי הסרט. יש להפסיק את הציפוי לאחר ההגעה לעובי הממוקד. עובי הסרט הסופי מחושב ומתוקן לאחר מכן. סרטים של כ 1.5 ננומטר יש, בממוצע, לאחר תיקון של 0.7 ננומטר באמצעות המנגנון שלנו. מכיוון שערכי תיקון אלה קרובים ליעד, מבוצעת סדרה של ציפויים כדי להעריך ולאחר מכן להחסיר תיקון זה מערך היעד.
      5. אחסן את הדגימות תחת ואקום כדי להגן עליהן מפני אוויר הסביבה עד ולאורך כל ניתוחי ה- SEM.
        הערה: אופי המתכת המשמשת להתזה חשוב. Pt, למרות היותו חומר נפוץ, גורם לציפוי באיכות ירודה בעובי סרט Pt המותאם לחוטים ספטין (1.5 ננומטר). ברזולוציות גבוהות, סרט Pt של 1.5 ננומטר חסר לכידות; הגודל של אשכולות ה-Pt והחוטים של ספטין הופך להיות דומה, מה שמוביל לפרשנויות שגויות במהלך תהליך סגמנטציה של נימה33 (ראו איור 2A, inset). טונגסטן הוא חלופה טובה ל-Pt מכיוון שהוא מציג גודל גרגר קטן יותר, שבקושי נראה ב-SEM ברזולוציה גבוהה (ראו איור 2B, inset). עם זאת, טונגסטן טהור מתחמצן בקלות, מה שמוביל לתוצרי אפקט טעינה חזקים במהלך תצפית SEM אם ההליך מפורט בשלב 3.3.4. לא מקפידים עליו.
  4. קבל את התמונות באמצעות מיקרוסקופ SEM (FESEM) עם פליטת שדה.
    הערה: טכנולוגיות SEM שודרגו לאחרונה כדי לשפר את הרזולוציה, והטכנולוגיות תלויות ביצרן (למשל, אופטיקת אלקטרונים, האטת קרן, עדשה מגנטית). רווח זה ברזולוציה (נגיש עם מספר יצרנים), במיוחד במתח מואץ נמוך (ליד הננומטר ב-1 קילו-וולט), נחוץ כדי לפתור מבנים ננומטריים הדומים לרשתות ספטין.
    1. השג הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות זיהוי אלקטרונים משניים ראשוניים (SE1) באמצעות גלאי "בתוך העדשה" באמצעות ההגדרות הבאות.
    2. הגדר את מתח ההאצה ל-3 קילו-וולט. תקן את זרם הקרן עם מפתח צמצם של 20 מיקרומטר (עבור עמודות Zeiss Gemini I, או שווה ערך ל- 34 pA) או עם מפתח צמצם של 15 מיקרומטר (עבור עמודות Zeiss Gemini I, או שווה ערך ל- 18.5 pA), אם יש צורך בדיכוי אפקטים של טעינה.
    3. לתצפיות, השתמש ברזולוציות הנעות בין 21.25 ננומטר/פיקסל ל-1.224 ננומטר/פיקסל, ולניתוח נתונים, השתמש ברזולוציה של ~5.58 ננומטר/פיקסל (הגדלה של 20,000x לפי הפניה לפולארויד 545).
    4. הגדר את מרחק העבודה בין 1 מ"מ ל- 2 מ"מ לתצפית ברזולוציה גבוהה, וכ- 3 מ"מ אם נדרש עומק שדה מוגבר. התאם את מהירות הסריקה ואת שילוב הקו באופן רציף כדי להבטיח יחס אות לרעש קבוע עם זמן רכישה של כ-30-45 שניות לתמונה.

Figure 2
איור 2: השפעת החומר שהופקד על חוטי ספטין על תבניות PDMS גליות. SEM של חוטי ספטין המצופים על ידי התזה ב-(A) 1.5 ננומטר של פלטינה, המציגים את תבנית "האדמה הסדוקה הצחיחה" האופיינית לחוסר לכידות בין צבירי גרעיני הפלטינה, או (B) 1.5 ננומטר של טונגסטן המכוסים בשכבה חלקה ומגובשת. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. תיבות מרובעות לבנות מייצגות את התצוגות המוגדלות בפינה הימנית התחתונה. הכדוריות הכדוריות הן שלפוחיות ליפידים קטנות המתקשרות עם המחיצות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עיוותים של רכבי שטח
תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות טיפוסיות של רכבי שטח שעוצבו מחדש לאחר דגירה באמצעות ספטינים מוצגות באיור 3, בתנאים שבהם ספטינים מתפלמרים. רכבי שטח חשופים (איור 3A) היו כדוריים לחלוטין. עם הדגירה עם יותר מ 50 nM ניצני שמרים חוטים septin, שלפוחית נראה מעוות. עד לריכוז של 100 ננומטר שמרים ניצנים ספטין אוקטאמרים, הבועיות נראו מעוותות, והעיוותים נשארו סטטיים ולכן לא השתנו (איור 3B). מעל 200 ננומטר שמרים ניצנים, כאשר הממברנה הייתה רוויה בספטינים, נצפו דפורמציות תקופתיות (איור 3C). באמצעות ניצני שמרים ניצנים, קוצים הודגמו עם מחזוריות המשתנה בין 2 μm ל 6 μm ועם משרעת של כ 1 μm. לפיכך, ספטינים מעצבים מחדש את הממברנות בצורה מסוימת. אמפליטודות אלה והעקמומיות הקשורה של העיוותים הנצפים משקפים באופן בולט את הזיקה של מחיצות לעקמומיות מיקרומטר שנצפתה בתאים. רכבי שטח, בהיותם מעוותים, מתאימים אפוא לבחון כיצד חלבונים מעצבים מחדש את הממברנות.

Figure 3
איור 3: דפורמציה הנגרמת על-ידי ספטין של GUVs. (A) מישור קו המשווה של בקרת רכבי שטח המסומנים ב-0.5% רודמין PE ומצולמים על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. סרגל קנה מידה = 3 μm. (B) GFP-septins (100 nM) קשור ל- GUV מעוות ומצולם על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית. סרגל קנה מידה = 1 μm. (C) GFP-septins (600 nM) קשור ל-GUV מעוות ומצולם על ידי מיקרוסקופיית דיסק מסתובבת פלואורסצנטית. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. רכבי ה-GUV עשויים מיחס טוחן של 56.8% EggPC, 15% כולסטרול, 10% DOPE, 10% DOPS, 8% מוח PI(4,5)P 2 ו-0.2% Bodipy-TR-Ceramide. מאגר התצפית כולל 75 mM NaCl ו-10 mM Tris (pH = 7.8). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הרכבה עצמית של חוטי ספטין הקשורים לרכבי LUV שצולמו על ידי cryo-EM
בהשוואה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, cryo-EM מספק רזולוציה מרחבית טובה יותר. לפיכך, ניתן להבחין באופן חד משמעי בחוטים בודדים של ספטין ודו-גלגלי שומנים בתמונות. איור 4A מציג תמונה של רכבי שטח מעוטרים בחוטים של שמרים ניצניים (חלקם מודגשים בכחול) בעוצמה של 50 ננומטר. קבוצות מקבילות של חוטים, במרחק של כ-10 ננומטר זו מזו, נצפו על גבי ה-LUVs. תמונה טיפוסית זו היא הקרנה דו-ממדית. לפיכך, כדי לפענח כל עיוות תלת-ממדי ולדעת אם חוטי ספטין מתקשרים ישירות עם הממברנה, בוצעה טומוגרפיה קריו-אלקטרונית (איור 4B ואיור 4C). איור 4B מציג פרוסה בשחזור תלת-ממדי, ואילו איור 4C מציג סגמנטציה של אותו אזור המדגיש את הממברנה בצהוב ואת חוטי הספטין בכחול. כפי שניתן לראות במבט מהצד, חוטי ספטין נשארו קשורים במהותם ישר לליפוזום והשלפוחית הושטחה במידה ניכרת בהשוואה לשלפוחיות הכדוריות העירומות.

Figure 4
איור 4: הרכבה עצמית של חוטי ספטין הקשורים ל-LUVs. (A) תמונת Cryo-EM של חוטי ספטין הקשורים לשלפוחית. חלק מהחוטים מודגשים בכחול לנראות. הנקודות הכהות הן פידוקיאלים מוזהבים המשמשים בדרך כלל ליישור נתונים לטומוגרפיה. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. (B) ו-(C) שחזור תלת-ממדי המתקבל מסדרה מוטה. השומנים מודגשים בצהוב, ואילו המחיצות מפולחות בכחול. סרגלי קנה מידה = 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סידור תלוי עקמומיות של חוטי ספטין הממחישים על ידי SEM
ספטינים מתמקמים בתאים באתרים המציגים עקמומיות מיקרומטר (למשל, בתלם חלוקת התא, בבסיס הריסונים וכו'). בנוסף, מחקרים במבחנה מראים כי ספטינים, כפי שראינו לעיל, יכולים לעצב מחדש ממברנות כך שבסופו של דבר הן יציגו עקמומיות מיקרומטר. כדי לבחון את רגישות העקמומיות של ספטינים הן עבור עקמומיות חיובית (קמורה) והן שלילית (קעורה), מחיצות דוגרו עם דו-שכבת שומנים נתמכת שהתמזגה עם התבניות הגליות שתוארו לעיל. התוצאה מוצגת באיור 5. איור 5A מסכם את השלבים השונים הנדרשים כדי לקבל את הדגימות. איור 5B מציג תבנית גלית בהגדלה נמוכה, שבה המחזוריות של עקמומיות שלילית וחיובית נראית בבירור. שני גלים עוקבים מסומנים על ידי קווים מוצקים כתומים. פגמים בערך אורתוגונליים לגלים מסומנים על ידי חיצים לבנים. איור 5C ואיור 5D מציגים את הארגון האולטרה-סטרוקטורלי של חוטי ספטין בהגדלה גבוהה יותר. המחיצות הורכבו לקבוצות של חוטים מקבילים, שכיווניהם היו תלויים בעקמומיות (ראו חוטים מודגשים בכחול). ואכן, חוטי הספטין לא היו מכוונים באופן אקראי. במקום זאת, ספטינים יכולים להתכופף בעת אינטראקציה עם עקמומיות שלילית (קעורה) כדי לעקוב אחר העקמומיות המוטלת. לעומת זאת, על עקמומיות חיובית, חוטי ספטין נשארו ישרים, לא סחוטים ומיושרים לאורך הגלים הקמורים. לפיכך, ספטינים יכולים לקיים אינטראקציה עם עקמומיות חיובית ושלילית כאחד, אך לאמץ ארגונים ספציפיים על עקמומיות נתונה. מתודולוגיה זו נראית אפוא רלוונטית במיוחד כדי להדגיש את הרגישות לעקמומיות של קשירה והרכבה עצמית של חלבונים נימה.

Figure 5
איור 5: סידור תלוי עקמומיות של חוטי ספטין. (A) ייצוג סכמטי של השלבים הנדרשים לקבלת דגימות "גליות" שנועדו לנתח רגישות לעקמומיות ספטין באמצעות SEM. (B) תמונת SEM בהגדלה נמוכה של תבנית גלית עם חוטי ספטין מאוגדים שאינם נפתרים ברזולוציה זו. שני גלים עוקבים מודגשים בכתום. פגמים אורתוגונליים מסומנים על ידי חצים לבנים. סרגל קנה מידה = 10 μm. (C) תמונת SEM בהגדלה של 10,000x שבה ניתן לראות חוטי ספטין. סרגל קנה מידה = 1 μm. (D) תמונת SEM בהגדלה של 20,000x. חלק מהחוטים מודגשים בכחול לנראות. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. העצמים הכדוריים הקיימים בתמונות הם בועיות קטנות המתקשרות עם המחיצות והמצע. ריכוז ספטין נקבע על 200 ננומטר ב- B-D. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאמור, נעשה שימוש בתערובת שומנים המשפרת את שילוב PI(4,5)P2 בתוך דו-שכבת השומנים ובכך מקלה על אינטראקציות בין ממברנת ספטין. ואכן, הראינו במקומות אחרים25 כי מחיצות שמרים ניצנים אינטראקציה עם שלפוחית באופן ספציפי PI(4,5)P2. הרכב שומנים זה הותאם אמפירית מסינון יצירות מרובות וכעת נעשה בו שימוש נרחב על ידי המחברים. PI(4,5)P2 ליפידים צריכים להיות מטופלים בזהירות. פתרונות מלאי חייבים להיות aliquoted בכמויות קטנות, כך בקבוקון מסוים לא נפתח יותר מפעמיים עבור pipetting. חוץ מזה, יש לאחסן אליקוטים של שומנים תחת ארגון כדי למנוע חמצון שומנים. לבסוף, לאחר תערובות השומנים מסולפות בתמיסה מימית, יש להשתמש בתערובת בבת אחת ולא ניתן לאחסן אותה לניסויים נוספים. יש לציין כי לאחר שחזור GUV או היתוך דו-שכבתי של שומנים נתמכים, האינטראקציה בין ספטינים לשומנים פחתה מאוד לאחר שעתיים.

חלק מהתוצאות שהתקבלו עם מתחמי ספטין של שמרים ניצנים אוקטמריים (המקיפים את Cdc10, Cdc11, Cdc12 ו- Cdc3) הוצגו כאן; עם זאת, נהלי הניסוי שבוצעו כדי לנתח את ההתנהגות של מתחמי ספטין ממינים אחרים צריכים להיות זהים.

כדי ליצור GUVs, אנו מעדיפים את שיטת האלקטרו-היווצרות באמצעות חוטי פלטינה על פני אלקטרו-היווצרות על לוחות ITO או נפיחות PVA. כפי שהוכח קודםלכן 25, שיטה זו מייצרת באופן משחזר GUVs unilamellar באיכות טובה ללא כל פגמים.

ניתן לעצב את המצעים הגליים עם מגוון רחב של עקמומיות. לאחר סינון עיצובים שונים, תבניות עם מחזוריות של 2 μm ומשרעת של 250 ננומטר, אשר מייצרים עקמומיות הנעה בין -3.5 μm-1 ל 3.5 μm-1 (± 0.5 um-1), שימשו באופן עקבי. באמצעות דפוסים עם מחזוריות קצרה ומשרעת גבוהה יותר, דו-שכבתי השומנים לא התאימו יפה לפני השטח. לעתים קרובות, במקרה של עקמומיות גבוהה יותר, הדו-שכבה תהיה תלויה בין שני גלים קמורים במקום להיות נתמכת באופן מלא על מצע NOA. עם משרעת נמוכה יותר ומחזוריות גדולה יותר, ספטינים מאורגנים בכיוונים אקראיים דמויי נמטיים, המצביעים על כך שהתבניות היו שטוחות מדי. חוץ מזה, שימוש בתבניות גליות במקום צינורות גליליים 20 או כדורים20 יש את היתרון כי הן עקמומיות חיובית ושלילית ניתן לבדוק בו זמנית. בעתיד, בחינת ההתנהגות של חוטים על עקמומיות "דמוית אוכף" של גאוס תהיה רלוונטית כדי לחקות את העקמומיות של הקשרים תאיים מציאותיים יותר.

בתמיסה, ערבוב LUVs עם ספטינים גרם ליצירת אגרגטים של ספטין-ליפידים גם בריכוזים נמוכים של חלבונים ושומנים. הדגימות היו אפוא הטרוגניות, וכדאי לחפש תחומי קרח דקים יותר שבהם נמצאים עצמים קטנים ומוגדרים יותר של שלפוחית ספטין. זה חיוני במיוחד בעת בחירת תחומי עניין שבהם תבוצע קריו-טומוגרפיה. לעתים קרובות, אפילו בהגדלה נמוכה, שלפוחיות המציגות בליטות של דפורמציות חזקות, בהשוואה לשלפוחיות כדוריות, נוטות יותר להיות בעלות צפיפות גבוהה של חוטי ספטין קשורים. פרוטוקול זה מתמקד בקבלת תיאור של המבנה האולטרה-ממדי העולמי של חוטים על ממברנות ביומימטיות. נכון לעכשיו, ניתן להגיע לרזולוציות גבוהות יותר. מגבלת הרזולוציה נובעת ממספר הצפיות המוגבל הזמין על-ידי הדמיה. עם זאת, זה נשאר מעבר להיקף של פרוטוקול זה.

הראינו באמצעות פרוטוקול זה כי שילוב של שיטות משלימות הוא חיוני כדי להבין ולנתח כיצד הסידור הספציפי של חוטי ספטין ציטוסקטליים יכול לחוש ולעצב מחדש ממברנות באופן תלוי עקמומיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לפטרישיה בסראו ודניאל לוי על העצות והדיונים המועילים שלהם. עבודה זו נהנתה מתמיכת ANR (הסוכנות הלאומית דה לה רשרש) למימון הפרויקט "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, והפרויקט "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin ממומן על ידי אקול דוקטורלה "ED564: Physique en Ile de France" ו- Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa נתמך על ידי אוניברסיטת סורבון (AAP Emergence). G.H. Koenderink נתמך על ידי ארגון Nederlandse voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) באמצעות 'BaSyC-בניית תא סינתטי'. מענק כבידה (024.003.019). אנו מודים לסולם התאים של Labex (n) (ANR-11-LABX0038) ולפריז Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). אנו מודים להדמיית תאים ורקמות (PICT-IBiSA), מכון קירי, חבר בתשתית המחקר הלאומית הצרפתית צרפת-ביו-דימות (ANR10-INBS-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids 840035
Bath sonicator Elma Elmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramide invitrogen, Thermo Fischer scientific 11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol Sigma Aldrich
Confocal microscope nikon spinning disk or confocal
Critical point dryer Leica microsystems CPD300
Deionized water generator MilliQ F1CA38083B MilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051
Field Emission Gun SEM (FESEM) Carl Zeiss Gemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution Thermo Fischer scientific 50-262-19
High vacuum grease, Dow corning VWR
IMOD software https://bio3d.colorado.edu/imod/ software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids Eloise 01883-F
Lipids Avanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046
Metal evaporator Leica microsystems EM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 Norland Products NOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4% delta microscopies 19170
Osmometer Löser 15 M
Plasma cleaner Alcatel pascal 2005 SD
Plasma generator Electron Microscopy Science
Plunge freezing equipment leica microsystems EMGP
Transmission electron microscope Thermofischer Tecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetate Electron Microscopy Science 22451 this product is not available for purchase any longer
Wax plates, Vitrex VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -H., Kuo, Y. -C., Chiang, H. -S., Kuo, P. -L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, Pt 1 79-89 (1998).

Tags

ביולוגיה גיליון 186
מלמטה למעלה בשיטות <em>במבחנה</em> כדי לבחון את הארגון האולטרה-סטרוקטורלי, עיצוב מחדש של הממברנה והתנהגות הרגישות לעקמומיות של מחיצות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chauvin, B., Nakazawa, K., Beber,… More

Chauvin, B., Nakazawa, K., Beber, A., Di Cicco, A., Hajj, B., Iv, F., Mavrakis, M., Koenderink, G. H., Cabral, J. T., Trichet, M., Mangenot, S., Bertin, A. Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins. J. Vis. Exp. (186), e63889, doi:10.3791/63889 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter