Summary
Septinas são proteínas citoesqueléticos. Eles interagem com membranas lipídicas e podem sentir, mas também gerar curvatura de membrana na escala de míces. Descrevemos neste protocolo metodologias in vitro para analisar deformações de membrana, ligação de septina sensível à curvatura e ultraestrutura de filamento de septina.
Abstract
A remodelagem da membrana ocorre constantemente na membrana plasmática e dentro de organelas celulares. Para dissecar totalmente o papel do ambiente (condições iônicas, composições proteicas e lipídicas, curvatura de membrana) e os diferentes parceiros associados a processos específicos de remodelação de membrana, realizamos abordagens in vitro de baixo para cima. Nos últimos anos, tem havido grande interesse em revelar o papel das proteínas septinas associadas às principais doenças. As septinas são proteínas citoesqueléticas essenciais e onipresentes que interagem com a membrana plasmática. Eles estão implicados na divisão celular, motilidade celular, neurofogênese e espermaogênese, entre outras funções. É, portanto, importante entender como os septins interagem e se organizam nas membranas para induzir posteriormente deformações de membranas e como elas podem ser sensíveis a curvaturas de membrana específicas. Este artigo tem como objetivo decifrar a interação entre a ultraestruturagem de septinas a nível molecular e a remodelação da membrana que ocorre em escala de mícticos. Para isso, os complexos de leveduras e septinas de mamíferos foram recombinantemente expressos e purificados. Uma combinação de ensaios in vitro foi então usada para analisar a auto-montagem de septinas na membrana. Bicamadas lipídicas suportadas (SLBs), vesículas unilamellar gigantes (GUVs), vesículas unilamellar grandes (LUVs) e substratos ondulados foram usados para estudar a interação entre automontagem de septina, remodelação da membrana e curvatura da membrana.
Introduction
As septinas são proteínas citoesqueletal que formam filamentos que interagem com membranas lipídicas. Os septinos são onipresentes em eucariotes e essenciais para inúmeras funções celulares. Eles foram identificados como os principais reguladores da divisão celular em leveduras e mamíferos 1,2. Eles estão envolvidos em eventos de remodelação de membrana, ciliogênese3 e espermaiogênese4. Dentro das células mamíferas, os septinos também podem interagir com actina e microtúbulos 5,6,7 em uma pasta de Rho GTPases (BORG) de forma dependente8. Em vários tecidos (neurônios9, cilia3, espermatozoides10), os septinos foram identificados como reguladores de barreiras de difusão para componentes ligados à membrana11. As septinas também foram demonstradas para regular a saliência da membrana e a formação de saliência12. Os septinos, sendo proteínas multitarefas, estão implicados no surgimento de várias doenças prevalentes13. Sua desregulação está associada ao surgimento de cânceres14 e doenças neurodegenerativas15.
Dependendo do organismo, várias subunidades de septina (duas em Caenorhabditis elegans a 13 em humanos) se reúnem para formar complexos cuja organização varia de forma dependente de tecidos16. O bloco básico de construção de septin reúne de duas a quatro subunidades, presentes em duas cópias e auto-montados de forma palindômica semelhante a uma vara. Na levedura brotante, os septins são octamericos 17,18. In situ, os septins são frequentemente localizados em locais com curvatura de micrômetros; eles são encontrados em locais de constrição de divisão, na base de cílios e dendritos, e no anulo de espermatozoides19,20. Na membrana, o papel dos septinos parece ser duplo: eles estão implicados na remodelação do bicamadorão lipídial e na manutenção da integridade da membrana21. Assim, investigar as propriedades biofísicas das proteínas formadoras de filamentos de septina e/ou subunidades na membrana é crucial para entender seu papel. Para dissecar propriedades específicas de septinas em um ambiente bem controlado, abordagens in vitro de baixo para cima são apropriadas. Até agora, apenas alguns grupos descreveram as propriedades biofísicas dos septinos in vitro 20,22,23. Assim, em comparação com outros filamentos citoesqueléticos, o conhecimento atual sobre o comportamento dos septinos in vitro permanece limitado.
Este protocolo descreve como a organização de filamentos de septina, remodelagem de membrana e sensibilidade à curvatura pode ser analisada19. Para isso, foi utilizada uma combinação de métodos de microscopia óptica e eletrônica (microscopia de fluorescência, microscopia crio-elétron [crio-EM], e microscopia eletrônica de varredura [SEM]). A remodelagem da membrana de vesículas unilamellar gigantes do tamanho de micrômetros (GUVs) é visualizada usando microscopia óptica de fluorescência. A análise do arranjo e ultraestrutura de filamentos de septina ligados a vesículas lipídicas é realizada utilizando-se crio-EM. A análise da sensibilidade à curvatura de septina é realizada utilizando-se o SEM, estudando o comportamento de filamentos de septina vinculados a bicamadas lipídicas de suporte sólido depositadas em substratos ondulados de curvaturas variáveis, o que permite a análise da sensibilidade da curvatura para curvaturas positivas e negativas. Em comparação com a análise anterior20,24, aqui, propomos usar uma combinação de métodos para analisar minuciosamente como os septins podem se auto-montar, sinérgicamente deformar a membrana e ser sensíveis à curvatura. Acredita-se que este protocolo seja útil e adaptável a qualquer proteína filamentosa que mostre afinidade com membranas.
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Protocol
1. Determinação da remodelagem da membrana usando vesículas unilamellar gigantes (GUVs)
NOTA: Nesta seção, os GUVs são gerados para imitar as deformações de membrana possivelmente induzidas por septinas em um contexto celular. De fato, nas células, os septinos são frequentemente encontrados em locais com curvaturas de micrômetros. Os GUVs têm tamanhos que variam de alguns a dezenas de micrômetros e podem ser deformados. Assim, são apropriados para avaliar quaisquer deformações induzidas por septina em escala de micrômetros. Lipídios fluorescentes, bem como septinas fluorescentes rotuladas (usando Proteína Fluorescente Verde [GFP]), são usados para seguir o comportamento de lipídios e proteínas através de microscopia de fluorescência.
- Preparação de buffers e soluções
- Prepare o tampão de crescimento GUV (50 mM NaCl, 50 mM de sacarose e 10 mM Tris [pH = 7,8]) e o tampão de observação (75 mM NaCl e 10 mM Tris [pH = 7,8]).
- Meça (usando um osmômetro comercial) e ajuste a osmolaridade dos buffers de observação e crescimento (170 mOsmol· L-1, em teoria) adicionando pequenas quantidades de NaCl até que suas respectivas osmolaridades sejam iguais. Filtre os buffers usando um filtro de 0,2 μm. Aliquot o buffer de crescimento e armazene-o a -20 °C para uso posterior. Armazene o tampão de observação a 4 °C.
NOTA: A diferença na osmolaridade entre os dois buffers não deve exceder 5%. - Prepare uma solução de 5 mg·mL-1 β-caseína no buffer de observação. Certifique-se de dissolução completa (após várias horas a 4 °C com agitação magnética). Filtre a solução com um filtro de 0,2 μm, alíquota e armazenamento a -20 °C.
- Prepare as misturas lipídicas em uma concentração lipídica total de 3 mg·mL-1 em clorofórmio. Use uma composição (mol%) de 56,8% Ovo L-α-fosfatidylcholina (EggPC), 15% colesterol, 10% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamina (DOPE), 10% 1,2-dioleoyl-sn-glyo-3-3-3-3-3-fosfo-L-serina (DOPS), 8% cérebro L-α-fosfattidylinositol-4,5-bisfosfato (PI(4,5)P2), e 0,2% Bodipy-TR-Ceramide para melhorar as interações proteína-lipídica e favorecer a incorporação de PI(4,5)P2 25.
NOTA: Manuseie o clorofórmio sob um capô de fumaça usando luvas de nitrito e óculos de segurança. Soluções de clorofórmio pipeta com seringas de vidro e evitar plástico à medida que o clorofórmio dissolve o plástico. Antes e depois do uso, enxágue as seringas tubondo clorofórmio 5x-10x. Use seringas separadas para pipetizar lipídios fluorescentes específicos para evitar contaminação cruzada. Lipídios podem ser armazenados em clorofórmio a -20 °C em um frasco de vidro âmbar tampado com Teflon. Os frascos devem ser preenchidos com argônio antes de fechar e selados com parafilme para evitar qualquer oxidação lipídica. - Eletro-formação de GUVs usando uma configuração de fios de platina
NOTA: A Figura 1 apresenta o esquema das etapas experimentais e uma imagem da câmara.- Limpe bem a câmara e os fios de platina da seguinte forma para remover quaisquer resíduos lipídulos.
- Mergulhe os fios e a câmara em acetona e sonicato por 10 minutos. Limpe-os cuidadosamente com um tecido de papel usando acetona.
- Monte a câmara inserindo os fios, mergulhe novamente em acetona e sonicato por 10 minutos. Limpe mais uma vez com acetona, certificando-se de que os fios estejam totalmente limpos. Mergulhe a câmara em etanol, sonicate por 10 minutos, e limpe com etanol.
- Finalmente, mergulhe a câmara em água deionizada, sonicato por 10 minutos, e seque com um fluxo de nitrogênio ou ar.
NOTA: A câmara de Teflon (Figura 1B) foi feita sob medida na oficina interna. Acomoda três compartimentos que podem ser selados em ambos os lados usando tampas de vidro. Os fios de platina podem ser inseridos na câmara através de furos de 1,3 mm de diâmetro. - Após a limpeza da câmara, deposite 3-4 gotas por compartimento (cada gota é de cerca de 0,1 μL)) da mistura lipídica de 3 mg·mL-1 em cada fio de platina. Gire os fios em 180° e deposite 3-4 gotículas lipídicas por compartimento no lado oposto de cada fio de platina. Certifique-se de que as gotas não entrem em contato entre si. Cerca de 5 μL da mistura lipídica é necessário por câmara inteira.
- Coloque a câmara de crescimento em uma câmara de vácuo por 30 minutos para remover qualquer traço de clorofórmio.
NOTA: O vácuo profundo (0,1 mbar) é o melhor. Quando secos, os lipídios são vulneráveis à oxidação e, portanto, não devem ser deixados no ar por mais de alguns minutos. - Deposite graxa de alto vácuo na parte inferior da câmara (o lado mais próximo dos fios) ao longo da periferia dos três compartimentos usando uma seringa e pressione uma tampa limpa (22 mm x 40 mm) contra a graxa para garantir a vedação perfeita. Sele ambas as extremidades da câmara (ou seja, nos locais de entrada/saída dos fios) utilizando pasta de vedação (placas de cera). Da mesma forma, aplique graxa de vácuo do outro lado da câmara.
- Encha os compartimentos com tampão de crescimento (~1 mL por câmara) usando uma pipeta. Não mexa a solução muito rapidamente ou fortemente para evitar qualquer descolamento da filmagem lipídica dos fios. Sele a parte superior da câmara hermeticamente usando uma tampa de 22 mm x 40 mm pressionando-a contra a graxa. Para evitar a formação de bolhas de ar, pressione suavemente a tampa de vidro do centro para as bordas.
- Coloque a câmara em uma geladeira de 4 °C e conecte os fios a um gerador de função de onda (função seno a 500 Hz). Estabeleça uma tensão efetiva de 350 mV para um período de crescimento mais curto (ou seja, 6h) ou 250 mV para um período de crescimento mais longo (ou seja, 12-16 h), conforme já apresentado e otimizado em estudo de Beber et al.25.
- Remova as tampas, limpe o selado e unte e remova os fios. Lave e esfregue a câmara com um tecido de papel usando água e etanol (≥70%) alternadamente.
NOTA: A tensão ideal e a escala de tempo para o crescimento do GUV dependem de muitos parâmetros, desde a concentração de sal tampão até a geometria da câmara (ou seja, a distância entre os fios e o tamanho da câmara). Use a mesma câmara toda vez que o experimento for repetido para garantir a reprodutibilidade. Os fios estão próximos com a parte inferior da câmara para que os lipídios possam ser imagens usando microscopia fluorescente. Imagem dos lipídios em cada etapa (ver Figura 1C,D) para garantir que o processo de eletro-formação seja bem sucedido.
- Incubação de septina com as vesículas
- Coletar GUVs dos fios usando pontas de pipeta pré-cortadas (abertura~1 mm) que são trazidas nas proximidades dos fios. Então, pipeta a solução o tempo todo o fio. Este procedimento impede a geração de fortes fluxos lamelares que poderiam interromper os GUVs. Após esta etapa, não é mais necessário cortar dicas de pipeta. De fato, os fluxos lamelares não danificam os GUVs na solução.
NOTA: Devido à presença de PI(4,5)P2 na mistura lipídica, os GUVs que foram coletados devem ser armazenados por no máximo 2-3 h antes do experimento. De fato, pi(4,5)P2 é solubilizado rapidamente e septinos não se ligam mais às membranas poucas horas após sua formação. No entanto, uma vez que os septinos estão ligados à membrana, eles permanecem ligados por alguns dias. - Diluir a solução de estoque de septinas em Tris 10 mM (pH 8) exclusivamente para atingir uma osmolaridade igual à do buffer de crescimento; se necessário, diluir ainda mais a solução de septina no tampão de observação. Adicione o volume pretendido de GUVs coletados (50-100 μL para um volume total de 200 μL). Realize a incubação diretamente na câmara de observação após a passivação com β-caseína (veja abaixo). É necessário tempo de espera de 20-30 minutos para alcançar o equilíbrio.
NOTA: A expressão e purificação dos complexos octaméricos septina (leveduras humanas ou brotantes) são extensivamente descritas em outros artigos17. Resumidamente, os septinos foram expressos em Escherichia coli, purificado em laboratório usando medidas de afinidade, exclusão de tamanho e cromatografia de troca de íons, e armazenado a -80 °C em uma solução aquosa de 50 mM Tris-HCl (pH 8), 300 mM KCl e 5 mM MgCl2 a ~1 mg·mL-1 (3 μM) de concentração. Uma alta concentração de sal é usada para evitar a agregação de septina. Os complexos de septina não devem ser concentrados através de um dispositivo de centrifugação de filtro, que induz a agregação e, portanto, reduz o rendimento da proteína.
- Coletar GUVs dos fios usando pontas de pipeta pré-cortadas (abertura~1 mm) que são trazidas nas proximidades dos fios. Então, pipeta a solução o tempo todo o fio. Este procedimento impede a geração de fortes fluxos lamelares que poderiam interromper os GUVs. Após esta etapa, não é mais necessário cortar dicas de pipeta. De fato, os fluxos lamelares não danificam os GUVs na solução.
- Imagem com microscópio de disco confocal e/ou giratório
- Para evitar que os GUVs grudem na superfície e/ou explodam, passee a câmara de observação incubando-a com uma solução de 5 mg·mL-1 β-casein por 30 minutos.
- Remova a solução de β-caseína e transfira a solução septin-GUV (Passo 1.4.2.) para a câmara de observação usando uma pipeta. Deixe os guvs sedimentares para o fundo da câmara por 10-15 min.
NOTA: A discrepância de composição entre o interior do GUV e o buffer externo cria uma incompatibilidade de densidade e índice refrativo. Devido à incompatibilidade do índice de refração, os GUVs são visíveis com microscopia óptica de luz de transmissão. - Utilizando microscopia confocal, visualize o sinal fluorescente dos lipídios para verificar se há o estado de qualidade e lamelaridade da membrana dos GUVs. Avalie a densidade de septinas vinculadas aos GUVs registrando o sinal fluorescente dos septinos após a realização de uma calibragem adequada25. Realize aquisições de pilha Z a intervalo espacial de 0,4 μm para analisar e visualizar as deformações 3D das vesículas induzidas pela interação entre os septinos e a membrana.
NOTA: Foram utilizados objetivos de imersão de óleo com ampliações de 60 ou 100 vezes. Foram utilizados microscópios de disco confocal padrão ou giratório (Tabela de Materiais) com tamanhos de pixels de 250 nm e 110 nm, respectivamente. Deve-se adaptar as condições de imagem a um determinado equipamento. Nenhum agente anti-branqueamento anti-foto específico foi adicionado à solução.
Figura 1: Eletro-formação de GUVs. (A) Representação esquemática do processo de eletro-formação utilizando fios de platina. (B) Imagem do dispositivo caseiro Teflon montado com fios de platina usados para gerar GUVs por eletro-formação. Os fios têm 0,5 mm de diâmetro e 3 mm de distância. (C) GUVs (objetos esféricos) observados por microscopia óptica de transmissão durante o processo de crescimento. A zona opaca na parte inferior da imagem é o fio de platina. (D) GUVs (objetos fluorescentes redondos) observados com microscopia fluorescente durante o crescimento do fio de platina. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Análise da organização ultraestrutural de filamentos de septina por microscopia crio-elétron
NOTA: As vesículas não são adequadas para imagens com métodos padrão de microscopia eletrônica. De fato, as amostras são secas usando métodos de manchas negativas padrão. Após a desidratação, é provável que as vesículas sejam submetidas a deformações inespecíficas, resultando frequentemente em saliências lipídicas. A microscopia crio-elétron é, portanto, uma estratégia muito melhor para observar deformações específicas de vesículas. Usando crio-EM, as amostras são incorporadas dentro de uma fina camada de gelo vitrificado (~100-200 nm), que preserva as amostras próximas ao estado nativo. Os GUVs são, no entanto, muito grandes (várias dezenas de micrômetros) para serem incorporados dentro de gelo fino e, portanto, imagens por microscopia eletrônica de transmissão. Assim, grandes vesículas unilamellar (LUVs), cujos diâmetros variam de ~50-500 nm, são gerados para determinar como os septins podem deformar vesículas e como elas se organizam em vesículas.
- Geração de grandes vesículas unilamellar (LUVs)
- Prepare 50 μg de mistura lipídica solubilizada em clorofórmio com uma composição molar de 57% EggPC, 15% colesterol, 10% DOPE, 10% DOPS e 8% pi cerebral(4,5)P2), que é otimizado para melhorar a interação septina com a membrana em um frasco de vidro.
- Seque a solução sob fluxo de argônio para gerar um filme lipídio seco no frasco. Coloque o frasco sob vácuo por 30 minutos para secar completamente o lipídio.
- Resolubilize o filme lipídeco em 50 μL de solução aquosa (50 mM Tris-HCl [pH 8]; 50 mM KCl; 2 mM MgCl2) para obter uma concentração final de 1 mg·mL-1, vórtice para 10 s, e transferir a solução para um tubo.
NOTA: Os LUVs devem ser usados imediatamente para incubação com septinas. Caso contrário, a interação proteína-lipídica será fraca por causa da solubilização PI(4,5)P2. Este processo de ressubilização bruta gera uma população heterogênea de vesículas com diâmetros que variam de 50 nm a 500 nm. Assim, toda uma gama de diâmetros e, portanto, curvaturas são simultaneamente avaliadas.
- Incubar os septinas com os lipídios solubilizados nas concentrações lipídicas e septinas finais de 0,1 mg·mL-1 (cerca de 300 nM) e 20 nM, respectivamente, em um tampão de alto sal (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2). Incubar a amostra por 1h à temperatura ambiente.
- Mergulho congelante para vitrifar a amostra
- Redes de carbono furado de descarga de brilho (300 malhas) no lado carbono para 30 s a 5 mA usando equipamento de gerador de plasma e inserir a grade dentro de uma máquina de congelamento de mergulho em um ambiente úmido.
- Adsorb 4 μL da amostra (Passo 2.2.) no lado de carbono descarregado com brilho da rede. Imediatamente antes da adsorção da amostra, adicione contas de ouro de 5-10 nm na solução, caso as amostras sejam usadas para gerar séries inclinadas por crio-tomografia.
NOTA: A densidade das contas de ouro deve ser rastreada e ajustada empiricamente e depende do provedor. A densidade otimizada é de 10 a 15 contas de ouro no campo de visão. - Enxugue as amostras do lado nu para aspirar a gota da amostra no lado oposto.
NOTA: O tempo de mancha é tipicamente 4 s, e a posição do papel filtro e da força de mancha são ajustadas empiricamente por meio de testes e triagem de posições alternativas do papel filtro para otimizar a qualidade do gelo (espessura) e a densidade do material. - Transfira as grades para um microscópio ou armazene-as em um recipiente de nitrogênio líquido.
NOTA: O uso de redes de carbono furados é essencial para acomodar a polidispersidade no tamanho das vesículas. A mancha da amostra do lado oposto favorece a adsorção aprimorada do material biológico na rede.
- Imagem de microscopia crio-elétron
- Insira as grades em um microscópio eletrônico (EM) equipado para observação crio-EM. Trie toda a grade gerando um mapa de toda a amostra em baixa ampliação (tipicamente em ampliação de 120x) para selecionar áreas que exibem melhor gelo (ou seja, fino e bem vitrificado).
- Para a coleta de dados crio-EM 2D, colete imagens com um tamanho de pixel de cerca de 2 Å por pixel para verificar a qualidade da amostra. Certifique-se de que tanto os filamentos de septina quanto o bicamado lipíduo são visíveis.
- Para coleta de dados de tomografia crio-elétron, selecione áreas de interesse exibindo vesículas deformadas. Certifique-se de que contas de ouro suficientes (pelo menos 10) estão presentes no campo de visão.
- De acordo com o software usado para coleta de dados de séries inclinadas, selecione o foco e as posições de rastreamento para estar longe o suficiente da área de interesse. Colete séries inclinadas variando o ângulo de inclinação de -60° a +60°, coletando uma imagem a cada 2°-3° graus.
NOTA: A dose total deve ser de cerca de, ou menos, 100 elétrons/Å2. O tamanho do pixel varia de 1,3 Å a 2,1 Å, dependendo do microscópio usado para coleta de dados. Idealmente, um esquema simétrico angular para coleta de dados é preferido da seguinte forma: 0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°. No entanto, os goniômetros dos microscópios de entrada lateral não fornecem estabilidade mecânica suficiente para alcançar esses esquemas simétricos. Alternativamente, a aquisição pode ser iniciada em 0° a 34°, seguida por uma segunda sequência angular de -2° a -60°, e terminou por uma sequência final de 36° a 60°. O objetivo é coletar as primeiras imagens (com os menores danos à radiação) nos ângulos mais baixos. Além disso, para visualizar a ultraestrutura de vesículas e filamentos de septina encadernados, um microscópio crio-EM padrão pode ser usado (200 kV, filamento de hexaboride lanthanum (LaB6) e entrada lateral da amostra). No entanto, se se pretende buscar mais processamento de imagem (média de sub-tomograma, por exemplo), é melhor usar microscópios de última geração de arma de emissão de campo (FEG) equipados com detectores diretos. Neste protocolo, restringimos nossa descrição à aquisição de reconstruções 3D e deixamos de fora a média do sub-tomograma.
- Reconstrução 3D da crio-tomografia e segmentação
- Use o pacote de software IMOD (Tabela de Materiais) para alinhamento de imagem de série inclinada e reconstrução 3D26,27. Dentro do IMOD, realize o alinhamento da série de inclinação com base no posicionamento fiduciário (contas de ouro). Além disso, se necessário, realize a determinação e correção da função de transferência de contraste (CTF) dentro do IMOD26. Finalmente, realize a reconstrução 3D com IMOD, seguindo cada passo rigorosamente.
- Segmente manualmente as bicamadas lipídicas e filamentos de septina usando 3Dmod27 do conjunto de software IMOD, para exibição.
3. Análise da sensibilidade da curvatura do septin utilizando SEM
NOTA: Para entender como os septins podem ser sensíveis às curvaturas de micrômetros, uma abordagem in vitro tem sido usada para incubar complexos de filamento de septina com bicamadas lipídicas de suporte sólido depositadas em padrões ondulados ondulados em escala de micrômetros.
- Projetando réplica ondulada de NOA (adesivo óptico norland) a partir de padrões ondulados de polidimetiletilaxano (PDMS)
- Use padrões ondulados PDMS de amplitude de 250 nm e periodicidade lateral de 2 μm ou outras dimensões para avaliar as curvaturas adequadas para a proteína de interesse.
NOTA: Os padrões ondulados do PDMS são projetados e gerados conforme descrito em Nánia et al.28,29. - Em um ambiente de limpeza, deposite 5 μL de NOA líquido em uma tampa circular de vidro de 1 cm de diâmetro e coloque o modelo PDMS na gota. Trate com luz UV (320 nm) por 5 min para foto-polimerizar o líquido NOA em uma fina película de polímero. Em seguida, retire suavemente o modelo PDMS do deslizamento de tampas com o NOA recém-polimerizado.
NOTA: NOA é uma cola opticamente transparente comum adequada para imagens de microscopia óptica. Além disso, o NOA é resistente aos processos de fixação química e coloração realizados antes da imagem SEM. Ambas as resinas NOA 71 e NOA 81 podem ser usadas com resultados semelhantes. O padrão PDMS inicial poderia ser usado várias vezes para produzir réplicas NOA. As réplicas NOA obtidas podem ser mantidas em uma caixa à temperatura ambiente por meses.
- Use padrões ondulados PDMS de amplitude de 250 nm e periodicidade lateral de 2 μm ou outras dimensões para avaliar as curvaturas adequadas para a proteína de interesse.
- Geração de bicamada lipídica apoiada e incubação de proteínas
- Trate os filmes NOA usando um limpador de plasma de ar por 5 minutos para tornar a superfície hidrofílica.
- Prepare uma solução de pequenas vesículas unilamellar (SUVs) com uma composição molar de 57% EggPC, 15% de colesterol, 10% DOPE, 10% DOPS e 8% pi cerebral (4,5)P2 em uma concentração lipídica total de 1 mg·mL-1. Prepare os SUVs reutilizando uma película lipídica seca no tampão de observação, conforme descrito na Etapa 2.1.3. Sonicar suavemente a solução usando um sônico de banho por 5-10 min até que a solução seja transparente.
NOTA: A solução de SUVs pode ser armazenada congelada por várias semanas a -20 °C. - Insira as tampas que suportam os padrões NOA dentro dos poços das caixas de cultura celular. Deposite 100 μL de solução de 1 mg·mL-1 SUV nos padrões NOA recém-lançados por brilho (Passo 3.2.1.) e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Esta etapa induz a fusão de SUVs com a superfície do padrão NOA para gerar uma bicamada lipídica suportada.
- Enxágüe as lâminas completamente 6x com o tampão de septina (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) para remover o SUV não-afusado. Depois de cada lavagem, nunca deixe a amostra completamente seca.
- Diluir a solução de estoque de septina octameric em tampão de sal alto septin (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2) usando tampão de septina (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) para concentrações finais que variam de 10 nM a 100 nM, e volumes de 1 mL. Incubar a solução proteica nos slides por ~1 h em temperatura ambiente.
NOTA: O volume é grande o suficiente para que a evaporação não seja um problema.
- Preparação da amostra para análise de SEM
NOTA: Vários protocolos foram desenvolvidos em microscopia eletrônica para analisar estruturas proteicas e sua montagem. O protocolo atual preserva a organização de filamentos de septino, utilizando um protocolo de fixação derivado de Svitkina et al.30 que é fácil de implementar. Além disso, este protocolo otimiza observações sem de alta resolução.- Preparação de reagentes e soluções de estoque
NOTA: Este protocolo requer vários reagentes e soluções que podem ser preparados com antecedência ou apenas antes da incubação. Siga as instruções fornecidas para evitar quaisquer artefatos ou falta de reatividade química.- Solução de estoque de cacodilato de sódio 0,2 M: Para preparar esta solução de dupla resistência, dissolva 2,14 g de pó de cacodilato de sódio em ~ 40 mL de água destilada sob agitação magnética. Após a dissolução completa, ajuste o pH para 7,4 adicionando suavemente 0,1 M HCl (~1 mL para 50 mL de solução) e compor o volume final com água destilada. Esta solução pode ser armazenada por 24-48 h a 4°C.
- 2% glutaraldeído (GA) em 0,1 M de cacodilato de sódio (solução fixativa): Prepare esta solução logo antes do uso diluindo a altamente pura SOLUÇÃO EM grau GA com solução de cacodilato de sódio de 0,2 M (ver acima). Use uma solução comercial de estoque GA de 25%-50% devido à sua capacidade de armazenamento otimizada a 4 °C. Para a preparação de 10 mL de solução fixa, diluir 0,8 mL de solução GA comercial de 25% com 4,2 mL de água destilada e 5 mL de cacodilato de sódio de 0,2 M.
- 1% de tetroxida de ósmio (OsO4) em 0,1 M de cacodilato de sódio: Prepare esta segunda solução fixativa logo antes do uso diluindo a solução comercial de estoque OsO4 com cacodilato de sódio de 0,2 M (ver acima). Para 4 mL de solução fixativa OsO4 , diluir 1 mL de solução Comercial OsO4 com 1 mL de água destilada e 2 mL de cacodilato de sódio de 0,2 M.
NOTA: Use a solução comercial de estoque OsO4 em lâmpadas de vidro cleavable devido às suas propriedades de armazenamento e manuseio. Note que o OsO4 é altamente reativo. Certifique-se de que sua cor é ligeiramente amarela e não escura. - 1% de ácido tânico (TA) na água: Prepare esta solução logo antes do uso. Prepare a solução TA para obter uma concentração final de 1% de TA em água destilada à temperatura ambiente. Dissolva 10 mg em 1 mL de água destilada e vórtice por alguns minutos. A solução TA não pode ser armazenada e deve ser filtrada com um filtro de 0,2 μm antes de ser usada.
- Solução de acetato de uranyl (UA) de 1% na água Prepare a solução UA para obter uma concentração final de 1% de UA em água destilada. Dissolva 10 mgs em 1 mL de água destilada e vórtice por pelo menos 30 min a 1 h por vórtice ou agitação à temperatura ambiente. Esta solução pode ser armazenada por 1 mês a 4 °C, mas pode facilmente precipitar e deve, portanto, ser filtrada com um filtro de 0,2 μm antes de usar.
- Série classificada de soluções de etanol Prepare 50%, 70%, 95% e 100% soluções de etanol na água. Prepare o banho final de garrafas recém-abertas de 100% etanol ou de 100% de etanol que foi desidratado por pelo menos 24 h com peneiras moleculares (diâmetro nominal do poro = 4 Å) para remover das amostras todos os vestígios de água que possam interferir na secagem e revestimento. Tenha cuidado para não sacudir esta solução, pois ela pode causar resuspensão de partículas de silicato.
NOTA: Tenha cuidado ao manusear os reagentes químicos utilizados neste protocolo. Glutaraldeído, tetroxida de ósmio, cacodilato de sódio e acetato de urânyl são todos altamente tóxicos, acetato de urânyl sendo radioativo também. Toda a manipulação dos reagentes e seus resíduos deve ser feita utilizando-se individual (luvas, jalecos, óculos de segurança) e proteção coletiva (capuzes de fumaça e escudos de plexiglass), de acordo com os procedimentos específicos do laboratório.
- Fixação da amostra
- Lave as amostras (ou seja, slides NOA com bicamadas lipídicas fundidas e proteína incubada) com PBS. Substitua o PBS pela solução fixativa GA pré-armada a 37 °C e deixe a reação prosseguir por 15 min. As amostras podem então ser armazenadas a 4 °C.
- Remova a solução fixa e lave as amostras fixas 3x com cacodilato de sódio de 0,1 M (5 min por lavagem) com agitação suave.
- Incubar as amostras na solução fixativa OsO4 por 10 minutos com máxima proteção contra luz para permitir a fixação de estruturas membranous e aumentar a condutividade elétrica das amostras. Remova a solução fixa e lave as amostras 3x em água destilada (5 minutos por lavagem) com agitação suave.
- Incubar as amostras lavadas na solução fixativa TA filtrada por um máximo de 10 minutos. Remova a solução TA e lave as amostras 3x em água destilada (5 minutos por lavagem) com agitação suave.
- Incubar as amostras lavadas em uma solução fixativa UA recém-filtrada por 10 minutos com máxima proteção contra luz. Remova a solução UA e lave as amostras 3x em água destilada (5 minutos por lavagem) com agitação suave.
- Desidratação da amostra e secagem de pontos críticos
NOTA: A secagem de ar não é permitida para evitar amostras prejudiciais através de tensões superficiais indesejadas ao mudar do líquido para o estado gasoso. Dois métodos foram estabelecidos em EM: o método físico de atingir o estado supercrítico do CO2 e contornar seu ponto crítico (31 °C, 74 bar), ou o método químico de evaporação de hexametileuta (HMDS), um agente de secagem com tensão superficial reduzida. CO2 e HMDS são mal miscíveis com água. Consequentemente, todos os vestígios de água devem ser substituídos por um solvente transitório (etanol) para evitar qualquer dano posteriormente durante os processos de secagem.- Incubar as amostras por 2-3 min em cada solução de etanol, a partir de 50% a 100% (anidro) banho de etanol.
NOTA: Como a evaporação do etanol entre os banhos é rápida, o manuseio da amostra também deve ser rápido para evitar qualquer secagem de ar. - Transfira as lâminas de vidro dentro do secador de ponto crítico pré-preenchido com etanol e siga as instruções do fabricante.
NOTA: Neste protocolo, foi utilizado um aparelho automático, mas qualquer sistema pode ser usado. Os protocolos podem diferir para cada aparelho, mas devem ser otimizados para remover completamente o etanol (25 banhos neste protocolo) e reduzir as velocidades para as diferentes trocas de solventes (entradas de CO2 e saídas de etanol/CO2 ) e a despressurização final (quase 1h neste protocolo). - No final da secagem do ponto crítico, armazene amostras imediatamente em um dessecanteto até a montagem e o revestimento. Como as amostras secas são altamente higroscópicas, cubra-as (veja abaixo) o mais rápido possível.
NOTA: Alternativamente, o HMDS pode oferecer um método mais barato e mais rápido. Embora o HDMS nunca tenha sido testado em nossas amostras, essa abordagem produziu bons resultados para a observação de proteínas na face interna das membranas celulares31,32.
- Incubar as amostras por 2-3 min em cada solução de etanol, a partir de 50% a 100% (anidro) banho de etanol.
- Montagem e revestimento de amostras.
NOTA: Uma vez que as amostras biológicas apresentam propriedades de condutividade elétrica precárias, elas precisam ser revestidas com uma película metálica condutiva antes da observação sem. A espirttering de plasma-magnetron é assim usada.- Anexar o deslizamento de tampas aos stubs que serão usados para futuras observações SEM. Use tinta prateada devido à sua condutividade elétrica melhorada, em comparação com discos de carbono. Adicione uma tira de tinta prateada na face superior da tampa e certifique-se de que a conexão com o stub é satisfatória. Evite qualquer aglomerado de tinta.
NOTA: A tira de tinta prateada deve ser fina para evitar qualquer contato entre a amostra e a lente objetiva do MEI ao trabalhar em altas resoluções (ou seja, baixa distância de trabalho). - Espere o solvente evaporar completamente.
NOTA: A duração desta etapa pode variar dependendo da quantidade e da espessura do depósito de tinta prateada. Esta etapa pode ser encurtada usando um pote de sino ou o revestimento e um vácuo primário por 10-30 min. - Use um aparelho equipado com uma cabeça de sputtering plasma-magnetron e um estágio rotativo-planetário, e siga os protocolos padrão fornecidos pelo fabricante. Aqui, o aparelho foi evacuado para 2,5 x 10-5 mbar, purgado 1x com argônio de alta qualidade, e depois ajustado para 8,0 x 10-3 mbar.
- Realize a pré-sputtering (120 mA para 60 s) para remover a camada de óxido na superfície. Em seguida, deposite 1,5 nm de tungstênio (90 mA, distância de trabalho = 50 mm) com o auxílio de um monitor de espessura de filme.
NOTA: O revestimento deve ser perfeitamente limpo para garantir a reprodutibilidade da evaporação do filme. O revestimento deve ser interrompido assim que a espessura alvo tiver sido atingida. A espessura final do filme é calculada e corrigida depois. Filmes de cerca de 1,5 nm têm, em média, uma pós-correção de 0,7 nm usando nosso aparelho. Como esses valores de correção estão próximos ao alvo, uma série de revestimentos são realizados para avaliar e, em seguida, subtrair essa correção do valor-alvo. - Armazene as amostras sob vácuo para protegê-las do ar ambiente até todas as análises sem..
NOTA: A natureza do metal usado para sputtering assuntos. O PT, apesar de ser um material comum, resulta em um revestimento de má qualidade com uma espessura de película Pt adaptada a filamentos de septina (1,5 nm). Em altas resoluções, um filme pt de 1,5 nm carece de cohesividade; o tamanho dos clusters Pt e os filamentos de septina tornam-se assim semelhantes, levando a interpretações erradas durante o processo de segmentaçãode filamentos 33 (ver Figura 2A, inset). Tungstênio é uma boa alternativa ao Pt porque exibe um tamanho menor de grãos, quase visível em SEM de alta resolução (ver Figura 2B, inset). No entanto, o tungstênio puro é facilmente oxidado, levando a artefatos de efeito de carregamento fortes durante a observação sem se o procedimento detalhado na Etapa 3.3.4. não é estritamente seguido.
- Anexar o deslizamento de tampas aos stubs que serão usados para futuras observações SEM. Use tinta prateada devido à sua condutividade elétrica melhorada, em comparação com discos de carbono. Adicione uma tira de tinta prateada na face superior da tampa e certifique-se de que a conexão com o stub é satisfatória. Evite qualquer aglomerado de tinta.
- Preparação de reagentes e soluções de estoque
- Adquira as imagens usando um microscópio SEM de emissão de campo (FESEM).
NOTA: As tecnologias SEM foram recentemente atualizadas para melhorar a resolução, e as tecnologias dependem do fabricante (por exemplo, óptica eletrônica, desaceleração de feixe, lente magnética). Este ganho de resolução (acessível com vários fabricantes), especialmente em uma baixa tensão acelerada (perto do nanômetro a 1 kV), é necessário para resolver estruturas nanométricas semelhantes às redes de septina.- Obtenha imagens de alta resolução através da detecção de elétrons secundários primários (SE1) com o detector "in-lens" usando as seguintes configurações.
- Defina a tensão acelerada para 3 kV. Fixar a corrente de feixe com a abertura de 20 μm (para colunas Zeiss Gemini I, ou equivalente a 34 pA) ou com a abertura de 15 μm (para colunas Zeiss Gemini I, ou equivalente a 18,5 pA), se for necessária a supressão dos efeitos de carregamento.
- Para observações, use resoluções que variam de 21,25 nm/pixel a 1.224 nm/pixel, e para análise de dados, use uma resolução de ~5,58 nm/pixel (ampliação de 20.000x de acordo com a referência Polaroid 545).
- Defina a distância de trabalho entre 1 mm e 2 mm para observação de alta resolução e em torno de 3 mm se for necessária uma profundidade de campo aumentada. Ajuste a velocidade de varredura e a integração da linha continuamente para garantir uma relação sinal-ruído constante com um tempo de aquisição de cerca de 30-45 s por imagem.
Figura 2: Efeito do material depositado em filamentos de septina em padrões PDMS ondulados. SEM de filamentos de septina revestidos por sputtering com (A) 1,5 nm de platina, exibindo o padrão "solo rachado árido" típico de uma falta de coesividade entre os aglomerados de núcleos de platina, ou (B) 1,5 nm de tungstênio coberto com uma camada lisa e coesa. Barra de escala = 200 nm. As caixas quadradas brancas representam as vistas ampliadas no lado inferior direito. Os glóbulos esféricos são pequenas vesículas lipídicas interagindo com os septinos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Deformações de GUVs
Imagens típicas de fluorescência confocal de GUVs remodeladas após serem incubadas com septinas são exibidas na Figura 3, em condições onde os septins polimerizam. GuVs nus (Figura 3A) eram perfeitamente esféricos. Após a incubação com mais de 50 nM de filamentos de levedura, as vesículas pareciam deformadas. Até uma concentração de octamers de levedura de 100 nM, as vesículas apareceram facetted, e as deformações permaneceram estáticas e, portanto, não flutuaram (Figura 3B). Acima de 200 nM de sêmínias de levedura brotante, com a membrana sendo saturada com septinas, foram observadas deformações periódicas (Figura 3C). Utilizando septinas de levedura, os picos foram visualizados com periodicidade variando de 2 μm a 6 μm e com uma amplitude de cerca de 1 μm. Assim, os septins remodelam fortemente as membranas de forma específica. Essas amplitudes e curvaturas associadas das deformações observadas refletem notavelmente a afinidade dos septinos para curvaturas de micrômetros observadas nas células. Os GUVs, sendo deformáveis, são, portanto, apropriados para avaliar como as proteínas remodelam as membranas.
Figura 3: Deformação induzida por septina de GUVs. (A) Plano equatorial de controle GUVs rotulado com 0,5% de rhodamina PE e imageado por microscopia confocal. Barra de escala = 3 μm. (B) GFP-septins (100 nM) vinculada a um GUV deformado e imageada por microscopia confocal de fluorescência. Barra de escala = 1 μm. (C) GFP-septins (600 nM) vinculado a um GUV deformado e imageado por microscopia de disco giratório de fluorescência. Barra de escala = 10 μm. Os GUVs são feitos de uma razão molar de 56,8% EggPC, 15% colesterol, 10% DOPE, 10% DOPS, 8% pi cerebral (4,5)P2 e 0,2% Bodipy-TR-Ceramide. O tampão de observação inclui 75 mM NaCl e 10 mM Tris (pH = 7,8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Auto-montagem de filamentos de septina ligados aos LUVs imagens por crio-EM
Em comparação com a microscopia de fluorescência, a crio-EM fornece melhor resolução espacial. Filamentos de septina individuais e bicamadas lipídicas podem, portanto, ser discernidos inequivocamente em imagens. A Figura 4A exibe uma imagem de LUVs decoradas com filamentos de septino de levedura (alguns deles sendo destacados em azul) a 50 nM. Conjuntos paralelos de filamentos, com cerca de 10 nm de distância, foram observados nos LUVs. Esta imagem típica é uma projeção 2D. Assim, para decifrar qualquer deformação 3D e saber se filamentos de septina interagem diretamente com a membrana, foi realizada a tomografia crio-elétron (Figura 4B e Figura 4C). A Figura 4B exibe uma fatia em uma reconstrução 3D, enquanto a Figura 4C apresenta uma segmentação da mesma área destacando a membrana em amarelo e os filamentos de septina em azul. Como visto na visão lateral, os filamentos de septina permaneceram essencialmente retos ao lipossomo e a vesícula foi consideravelmente achatada em comparação com as vesículas esféricas nuas.
Figura 4: Auto-montagem de filamentos de septin vinculados aos LUVs. (A) Imagem cryo-EM de filamentos de septina vinculados a uma vesícula. Alguns dos filamentos são destacados em azul para visibilidade. Os pontos escuros são fiduciais de ouro geralmente usados para alinhar dados para tomografia. Barra de escala = 100 nm. (B) e (C) reconstrução 3D obtida a partir de uma série inclinada. Os lipídios são destacados em amarelo, enquanto os septinos são segmentados em azul. Barras de escala = 200 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arranjo dependente de curvatura de filamentos de septina visualizados pela SEM
Os septinos localizam-se em células em locais que exibem curvaturas de micrômetros (por exemplo, na divisão celular, na base de cílios, etc.). Além disso, estudos in vitro mostram que os septinos, como visto acima, podem remodelar as membranas para que eventualmente exibam curvaturas de micrômetros. Para avaliar a sensibilidade de curvatura dos septinos tanto para curvaturas positivas (convexas) quanto negativas (côncavas), os septins foram incubados com uma bicamada lipídica apoiada fundida com os padrões ondulados descritos acima. O resultado é exibido na Figura 5. A Figura 5A recapitula as diferentes etapas necessárias para a obtenção das amostras. A Figura 5B apresenta um padrão ondulado em baixa ampliação, onde a periodicidade das curvaturas negativas e positivas é claramente visível. Duas ondas sucessivas são indicadas por linhas sólidas laranjas. Defeitos aproximadamente ortogonais às ondas são indicados por setas brancas. Figura 5C e Figura 5D exibem a organização ultraestrutural de filamentos de septina em ampliação mais elevada. Os septins reunidos em conjuntos de filamentos paralelos, cuja orientação dependia da curvatura (ver filamentos destacados em azul). De fato, os filamentos de septina não foram orientados aleatoriamente. Em vez disso, os septins podem dobrar ao interagir com curvaturas negativas (côncavas) para seguir a curvatura imposta. Por outro lado, em curvaturas positivas, os filamentos de septina permaneceram retos, inatados e alinhados ao longo das ondas convexas. Assim, os septins podem interagir com curvaturas positivas e negativas, mas adotar organizações específicas em determinadas curvaturas. Essa metodologia parece, portanto, particularmente relevante para destacar a curvatura-sensibilidade da vinculação e automontagem de proteínas filamentosas.
Figura 5: Arranjo dependente da curvatura dos filamentos de septina. (A) Representação esquemática das etapas necessárias para a obtenção das amostras "onduladas" destinadas a analisar a sensibilidade da curvatura septina através da SEM. (B) Baixa ampliação SEM imagem de um padrão ondulado com filamentos de septina amarrados que não são resolvidos nesta resolução. Duas ondas consecutivas são destacadas em laranja. Defeitos ortogonais são indicados por setas brancas. Barra de escala = imagem SEM de 10 μm. (C) a 10.000x de ampliação onde os filamentos de septina são visíveis. Barra de escala = 1 μm. (D) IMAGEM SEM a 20.000x de ampliação. Alguns dos filamentos são destacados em azul para visibilidade. Barra de escala = 200 nm. Os objetos esféricos presentes nas imagens são pequenas vesículas interagindo com os septinos e substratos. A concentração de septina foi definida em 200 nM em B-D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Como dito acima, tem sido utilizada uma mistura lipídica que melhora a incorporação de PI(4,5)P2 dentro da bicamadas lipídica e facilita assim as interações septina-membrana. De fato, mostramos em outros lugares25 que os septinos de levedura brotante interagem com vesículas de forma específica de PI(4,5)P2. Esta composição lipídica foi ajustada empiricamente a partir da triagem de múltiplas composições e agora é amplamente utilizada pelos autores. Pi(4,5)P2 lipídios devem ser manuseados cuidadosamente. As soluções de estoque devem ser alitadas em pequenos volumes para que um frasco específico não seja aberto mais do que duas vezes para a pipetação. Além disso, as alíquotas lipídicas devem ser armazenadas sob argônio para evitar a oxidação lipídica. Finalmente, uma vez que as misturas lipídicas são solubilizadas em uma solução aquosa, a mistura deve ser usada de uma só vez e não pode ser armazenada para outros experimentos. Notavelmente, após a reconstituição do GUV ou a fusão de bicamadas lipídicas, a interação entre septinas e lipídios diminuiu consideravelmente após 2h.
Alguns dos resultados obtidos com os complexos de leveduras octameric (englobando Cdc10, Cdc11, Cdc12 e Cdc3) foram apresentados aqui; no entanto, os procedimentos experimentais seguidos para analisar o comportamento dos complexos de septina de outras espécies devem ser idênticos.
Para gerar GUVs, preferimos o método de eletro-formação usando fios de platina em vez de eletro-formação em placas ITO ou inchaço PVA. Como demonstrado anteriormente25, este método produz de forma reprodutivelmente GUVs unilamellar de boa qualidade sem defeitos.
Os substratos ondulados podem ser projetados com uma ampla gama de curvaturas. Após a triagem de vários desenhos, foram utilizados padrões com periodicidade de 2 μm e amplitude de 250 nm, que geram curvaturas que variam de -3,5 μm-1 a 3,5 μm-1 (± 0,5 um-1), têm sido consistentemente utilizados. Utilizando padrões com uma periodicidade curta e maior amplitude, as bicamadas lipídicas não se conformavam muito com a superfície. Muitas vezes, no caso de maior curvatura, o bicamado seria suspenso entre duas ondas convexas em vez de ser totalmente suportado no substrato NOA. Com menor amplitude e maior periodicidade, os septins se organizaram com orientações nemáticas aleatórias, indicando que os padrões eram muito planos. Além disso, o uso de padrões ondulados em vez de tubos cilíndricos20 ou esferas20 tem o benefício de que curvaturas positivas e negativas podem ser testadas simultaneamente. No futuro, examinar o comportamento dos filamentos nas curvaturas "semelhantes à sela" gaussianas seria relevante para imitar a curvatura de contextos celulares mais realistas.
Em solução, a mistura de LUVs com septinas induziu a geração de agregados septino-lipídicos mesmo em baixas concentrações de proteínas e lipídios. As amostras foram, portanto, heterogêneas, e é sábio procurar por domínios de gelo mais finos onde objetos septin-vesículas menores e mais definidos são encontrados. Isso é particularmente crucial na escolha de áreas de interesse onde a crio-tomografia será realizada. Muitas vezes, mesmo em baixas ampliações, vesículas exibindo saliências de deformações fortes, em comparação com vesículas esféricas, são mais propensas a ter uma alta densidade de filamentos de septina ligados. Este protocolo se concentra na obtenção de uma descrição da ultraestrutura global de filamentos em membranas biomiméticas. Atualmente, resoluções mais altas são alcançáveis. A limitação de resolução resulta do número limitado de visualizações disponíveis por imagem. No entanto, isso permanece além do escopo deste protocolo.
Mostramos através deste protocolo que uma combinação de métodos complementares é essencial para entender e dissecar como o arranjo específico de filamentos de septina citoesqueletal pode sentir e remodelar as membranas de forma dependente da curvatura.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos a Patricia Bassereau e Daniel Lévy por seus conselhos e discussões úteis. Este trabalho foi beneficiado com o apoio da ANR (Agence Nationale de la Recherche) para financiar o projeto "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, e o projeto "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-011. B. Chauvin é financiado pela Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" e Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa foi apoiado pela Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink foi apoiado pelo Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) através do 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'. Bolsa de gravitação (024.003.019). Agradecemos à Escala Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) e à Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Agradecemos ao Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, membro da Infraestrutura Nacional de Pesquisa Francesa França-BioImaging (ANR10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
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