Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bottom-Up In Vitro-metoder for å analysere den ultrastrukturelle organisasjonen, membranomformingen og krumningsfølsomhetsoppførselen til septiner

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63889
Automatic Translation
*1, *1, 1,7, 1, 1, 2, 2, 3, 4, 5, *6, *1
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

Summary

Septiner er cytoskeletale proteiner. De samhandler med lipidmembraner og kan fornemme, men også generere membrankrumning på mikronskalaen. Vi beskriver i denne protokollen bottom-up in vitro metoder for analyse av membrandeformasjoner, krumningsfølsom septinbinding og septinfilament ultrastruktur.

Abstract

Membranremodellering skjer konstant ved plasmamembranen og i cellulære organeller. For å fullstendig dissekere miljøets rolle (ioniske forhold, protein- og lipidsammensetninger, membrankrumning) og de forskjellige partnerne knyttet til spesifikke membranomformingsprosesser, foretar vi in vitro bottom-up-tilnærminger. I de senere år har det vært stor interesse for å avsløre rollen som septinproteiner assosiert med store sykdommer. Septiner er essensielle og allestedsnærværende cytoskeletale proteiner som interagerer med plasmamembranen. De er involvert i celledeling, cellemotilitet, nevromorfogenese og spermiogenese, blant andre funksjoner. Det er derfor viktig å forstå hvordan septiner interagerer og organiserer seg ved membraner for senere å indusere membrandeformasjoner og hvordan de kan være følsomme for spesifikke membrankrumninger. Denne artikkelen tar sikte på å dechiffrere samspillet mellom ultrastrukturen til septiner på molekylært nivå og membranremodellering som forekommer på mikronskala. Til dette formål ble spirende gjær og pattedyr septinkomplekser rekombinant uttrykt og renset. En kombinasjon av in vitro-analyser ble deretter brukt til å analysere selvmontering av septiner ved membranen. Støttede lipid dobbeltlag (SLBer), gigantiske unilamellære vesikler (GUV), store unilamellære vesikler (LUV) og bølgete substrater ble brukt til å studere samspillet mellom septin selvmontering, membranomforming og membrankrumning.

Introduction

Septiner er cytoskeletale filamentdannende proteiner som interagerer med lipidmembraner. Septiner er allestedsnærværende i eukaryoter og essensielle for mange cellulære funksjoner. De har blitt identifisert som de viktigste regulatorene for celledeling i spirende gjær og pattedyr 1,2. De er involvert i membranomformingshendelser, ciliogenese3 og spermiogenese4. I pattedyrceller kan septiner også interagere med aktin og mikrotubuli 5,6,7 i et bindemiddel av Rho GTPases (BORG)-avhengig måte 8. I forskjellige vev (nevroner9, cilia3, spermatozoa10) har septiner blitt identifisert som regulatorer av diffusjonsbarrierer for membranbundne komponenter11. Septiner har også vist seg å regulere membran blebbing og fremspring dannelse12. Septiner, som er multi-tasking proteiner, er involvert i fremveksten av ulike utbredte sykdommer13. Deres feilregulering er forbundet med fremveksten av kreft14 og neurodegenerative sykdommer15.

Avhengig av organismen samles flere septin-underenheter (to i Caenorhabditis elegans til 13 hos mennesker) for å danne komplekser hvis organisasjon varierer på en vevavhengig måte16. Den grunnleggende septinbyggeblokken samler to til fire underenheter, til stede i to eksemplarer og selvmontert på en stanglignende palindromisk måte. I spirende gjær er septiner oktamere17,18. In situ er septiner ofte lokalisert på steder med mikrometerkrumning; De finnes på divisjonsinnsnevringssteder, ved foten av cilia og dendritter, og ved ringrommet til spermatozoa19,20. Ved membranen synes rollen som septiner å være dobbel: de er involvert i å omforme lipid dobbeltlaget og i å opprettholde membranintegritet21. Derfor er det avgjørende å undersøke de biofysiske egenskapene til septinfilamentdannende proteiner og / eller underenheter ved membranen for å forstå deres rolle. For å dissekere spesifikke egenskaper til septiner i et godt kontrollert miljø, er bottom-up in vitro tilnærminger hensiktsmessige. Så langt har bare noen få grupper beskrevet de biofysiske egenskapene til septiner in vitro20,22,23. Derfor, sammenlignet med andre cytoskeletale filamenter, er den nåværende kunnskapen om oppførselen til septiner in vitro fortsatt begrenset.

Denne protokollen beskriver hvordan organisering av septinfilamenter, membranomforming og krumningsfølsomhet kan analyseres19. Til dette formål har en kombinasjon av optiske og elektronmikroskopiske metoder (fluorescensmikroskopi, kryo-elektronmikroskopi [cryo-EM] og skanningelektronmikroskopi [SEM]) blitt brukt. Membranomformingen av mikrometerstore gigantiske unilamellære vesikler (GUV) visualiseres ved hjelp av fluorescens optisk mikroskopi. Analysen av arrangementet og ultrastrukturen av septinfilamenter bundet til lipidvesikler utføres ved bruk av kryo-EM. Analyse av septinkrumningsfølsomhet utføres ved bruk av SEM, ved å studere oppførselen til septinfilamenter bundet til solidstøttet lipid dobbeltlag avsatt på bølgete substrater av variable krumninger, noe som muliggjør analyse av krumningsfølsomhet for både positive og negative krumninger. Sammenlignet med tidligere analyse20,24, foreslår vi her å bruke en kombinasjon av metoder for å grundig analysere hvordan septiner kan selvmontere, synergistisk deformere membran og være krumningsfølsom. Denne protokollen antas å være nyttig og tilpasningsdyktig til ethvert filamentøst protein som viser en affinitet for membraner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bestemmelse av membranomforming ved hjelp av gigantiske unilamellære vesikler (GUV)

MERK: I denne delen genereres GUV for å etterligne membrandeformasjonene som muligens induseres av septiner i en cellulær sammenheng. Faktisk, i celler, er septiner ofte funnet på steder med mikrometer krumninger. GUV har størrelser fra noen få til titalls mikrometer og kan deformeres. De er derfor hensiktsmessige for å analysere eventuelle septininduserte deformasjoner i mikrometerskala. Fluorescerende lipider, samt fluorescerende merkede septiner (ved bruk av grønt fluorescerende protein [GFP]), brukes til å følge oppførselen til både lipider og proteiner via fluorescensmikroskopi.

  1. Fremstilling av buffere og løsninger
    1. Forbered GUV-vekstbufferen (50 mM NaCl, 50 mM sukrose og 10 mM Tris [pH = 7,8]) og observasjonsbufferen (75 mM NaCl og 10 mM Tris [pH = 7,8]).
    2. Måle (ved hjelp av et kommersielt osmometer) og justere osmolariteten til observasjons- og vekstbufferne (170 mOsmol · L-1, i teorien) ved å tilsette små mengder NaCl til deres respektive osmolariteter er like. Filtrer bufferne med et 0,2 μm filter. Aliquot vekstbufferen og lagre den ved -20 °C for videre bruk. Oppbevar observasjonsbufferen ved 4 °C.
      MERK: Forskjellen i osmolaritet mellom begge buffere bør ikke overstige 5%.
    3. Klargjør en 5 mg·ml-1 β-kaseinløsning i observasjonsbufferen. Sørg for fullstendig oppløsning (etter flere timer ved 4 °C med magnetisk omrøring). Filtrer løsningen med et 0,2 μm filter, aliquot, og oppbevar ved -20 °C.
  2. Klargjør lipidblandingene ved en total lipidkonsentrasjon på 3 mg·ml-1 i kloroform. Bruk en sammensetning (mol%) av 56,8% Egg L-α-fosfatidylkolin (EggPC), 15% kolesterol, 10% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin (DOPE), 10% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serin (DOPS), 8% hjerne L-α-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PI(4,5)P 2), og 0,2% Bodipy-TR-Ceramide for å forbedre protein-lipid-interaksjonene og favorisere inkorporering av PI(4,5)P225.
    MERK: Håndter kloroform under en avtrekksvifte med nitrilhansker og vernebriller. Pipette kloroformløsninger med glasssprøyter og unngå plast da kloroform løser opp plast. Før og etter bruk, skyll sprøytene ved pipettering av kloroform 5x-10x. Bruk separate sprøyter til pipettespesifikke fluorescerende lipider for å forhindre krysskontaminering. Lipider kan oppbevares i kloroform ved -20 °C i et ravfarget hetteglass dekket med teflon. Hetteglassene må fylles med argon før lukking og forsegles med parafilm for å forhindre lipidoksidasjon.
  3. Elektrodannelse av GUV-er ved hjelp av et platinatrådoppsett
    MERK: Figur 1 viser skjemaet for eksperimentelle trinn og et bilde av kammeret.
    1. Rengjør kammeret og platinatrådene grundig som følger for å fjerne eventuelle lipidrester.
    2. Dypp ledningene og kammeret i aceton og sonikat i 10 minutter. Tørk dem forsiktig med et papirlommetørkle med aceton.
    3. Monter kammeret ved å sette inn ledningene, stupe igjen i aceton og sonikere i 10 minutter. Tørk en gang til med aceton, og sørg for at ledningene er fullstendig rengjort. Dypp kammeret i etanol, sonikat i 10 minutter, og tørk med etanol.
    4. Til slutt, stup kammeret i avionisert vann, sonikat i 10 minutter og tørk med en strøm av nitrogen eller luft.
      MERK: Teflonkammeret (figur 1B) ble skreddersydd i det interne verkstedet. Den har plass til tre rom som kan forsegles på begge sider ved hjelp av glassdeksler. Platinatråder kan settes inn i kammeret gjennom hull med en diameter på 1,3 mm.
    5. Etter rengjøring av kammeret avsettes 3-4 dråper per rom (hver dråpe er ca. 0,1 μL)) av lipidblandingen på 3 mg · ml-1 på hver platinatråd. Vri ledningene med 180 ° og sett inn 3-4 lipiddråper per rom på motsatt side av hver platinatråd. Sørg for at dråpene ikke kommer i kontakt med hverandre. Omtrent 5 μL av lipidblandingen kreves per hele kammer.
    6. Plasser vekstkammeret i et vakuumkammer i 30 minutter for å fjerne spor av kloroform.
      MERK: Dyp vakuum (0,1 mbar) er best. Når de tørkes, er lipider sårbare for oksidasjon og bør derfor ikke stå i luft i mer enn noen få minutter.
    7. Sett høyvakuumfett i bunnen av kammeret (siden nærmest ledningene) langs periferien av de tre rommene ved hjelp av en sprøyte og trykk en ren (22 mm x 40 mm) deksel mot fettet for å sikre perfekt tetning. Forsegl begge ekstremiteter av kammeret (dvs. ved inngangs- / utgangsstedene til ledningene) ved hjelp av tetningspasta (voksplater). På samme måte påfør vakuumfett på den andre siden av kammeret.
    8. Fyll rommene med vekstbuffer (~1 ml per kammer) ved hjelp av en pipette. Ikke rør løsningen for raskt eller sterkt for å forhindre at lipidfilmen løsner fra ledningene. Forsegl toppen av kammeret hermetisk med en 22 mm x 40 mm deksel ved å trykke den mot fettet. For å unngå dannelse av luftbobler, trykk forsiktig på glassdekselet fra midten til kantene.
      1. Plasser kammeret i et 4 °C kjøleskap og koble ledningene til en bølgefunksjonsgenerator (sinusfunksjon ved 500 Hz). Sett en effektiv spenning på 350 mV for en kortere vekstperiode (dvs. 6 timer) eller 250 mV for en lengre vekstperiode (dvs. 12-16 timer), som allerede presentert og optimalisert i en studie av Beber et al.25.
    9. Fjern dekslene, tørk av tetningsmassen og fettet, og fjern ledningene. Vask og skrubb kammeret med et papirlommetørkle med vann og etanol (≥70%) vekselvis.
      MERK: Den optimale spennings- og tidsskalaen for GUV-vekst avhenger av mange parametere, fra buffersaltkonsentrasjonen til kammergeometrien (dvs. avstanden mellom ledningene og kammerstørrelsen). Bruk samme kammer hver gang eksperimentet gjentas for å sikre reproduserbarhet. Ledningene er i nærheten av bunnen av kammeret, slik at lipidene kan avbildes ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. Avbilde lipidene på hvert trinn (se figur 1C, D) for å sikre at elektrodannelsesprosessen er vellykket.
  4. Septin inkubasjon med vesiklene
    1. Samle GUVs fra ledningene ved hjelp av forhåndskuttede pipettespisser (~ 1 mm åpning) som bringes i nærheten av ledningene. Pipetter deretter løsningen langs hele ledningen. Denne prosedyren forhindrer generering av sterke lamellære strømmer som kan forstyrre GUV-ene. Etter dette trinnet er det ikke lenger nødvendig å kutte pipettespisser. Lamellære strømmer skader faktisk ikke GUV i løsningen.
      MERK: På grunn av tilstedeværelsen av PI (4,5) P 2 i lipidblandingen, må GUV som er oppsamlet lagres i ikke mer enn2-3 timer før forsøket. Faktisk blir PI (4,5) P2 løst raskt og septiner binder seg ikke lenger til membranene noen timer etter dannelsen. Men når septiner er bundet til membranen, forblir de bundet i noen dager.
    2. Fortynn septinlagerløsningen i Tris 10 mM (pH 8) utelukkende for å oppnå en osmolaritet lik vekstbufferens; Fortynn om nødvendig septinoppløsningen ytterligere i observasjonsbufferen. Legg til det tiltenkte volumet av innsamlede GUV-er (50-100 μL for et totalt volum på 200 μL). Utfør inkubasjonen direkte i observasjonskammeret etter passivering med β-kasein (se nedenfor). 20-30 min ventetid er nødvendig for å nå likevekt.
      MERK: Uttrykket og rensingen av septin oktameriske komplekser (menneskelige eller spirende gjær) er omfattende beskrevet i andre artikler17. Kort fortalt ble septiner uttrykt i Escherichia coli, renset i laboratoriet ved hjelp av affinitet, størrelseseksklusjon og ionebyttekromatografitrinn, og lagret ved -80 °C i en vandig oppløsning på 50 mM Tris-HCl (pH 8), 300 mM KCl og 5 mM MgCl2 ved ~1 mg·mL-1 (3 μM) konsentrasjon. En høy saltkonsentrasjon brukes til å unngå septinaggregering. Septinkomplekser bør ikke konsentreres gjennom en filtersentrifugeringsanordning, noe som induserer aggregering og dermed reduserer proteinutbyttet.
  5. Avbildning med konfokalt og/eller roterende diskmikroskop
    1. For å forhindre at GUV-ene fester seg til overflaten og/eller eksploderer, passiverer du observasjonskammeret ved å inkubere det med en 5 mg·mL-1 β-kaseinoppløsning i 30 minutter.
    2. Fjern β-kaseinoppløsningen og overfør septin-GUV-løsningen (trinn 1.4.2.) til observasjonskammeret ved hjelp av en pipette. La GUVs sediment til bunnen av kammeret i 10-15 minutter.
      MERK: Sammensetningsavviket mellom det indre av GUV og den eksterne bufferen skaper både en tetthet og brytningsindeks mismatch. På grunn av brytningsindeksens mismatch er GUV-ene synlige med optisk mikroskopi for overføringslys.
    3. Ved hjelp av konfokal mikroskopi, visualiser det fluorescerende signalet til lipidene for å kontrollere GUVs kvalitet og membranlamelltilstand. Vurder tettheten av septiner bundet til GUV ved å registrere septinenes fluorescerende signal etter å ha utført en riktig kalibrering25. Utfør Z-stack-oppkjøp ved 0,4 μm romlig intervall for å analysere og visualisere 3D-deformasjonene av vesiklene indusert av samspillet mellom septinene og membranen.
      MERK: Olje nedsenking mål med 60- eller 100-fold forstørrelser ble brukt. Standard konfokale eller spinnende diskmikroskoper (materialtabell) med pikselstørrelser på henholdsvis 250 nm og 110 nm ble brukt. Man må tilpasse bildeforholdene til et gitt utstyr. Ingen spesifikke anti-fotoblekemidler ble tilsatt løsningen.

Figure 1
Figur 1: Elektrodannelse av GUV . (A) Skjematisk fremstilling av elektrodannelsesprosessen ved bruk av platinatråder. (B) Bilde av Teflon hjemmelaget enhet montert med platinaledninger som brukes til å generere GUVs ved elektro-formasjon. Ledninger er 0,5 mm i diameter og 3 mm fra hverandre. (C) GUVs (sfæriske objekter) observert ved overføring optisk mikroskopi under vekstprosessen. Den ugjennomsiktige sonen nederst i bildet er platinatråden. (D) GUVs (runde fluorescerende objekter) observert med fluorescerende mikroskopi under veksten på platinatråden. Skala barer = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Analyse av ultrastrukturell organisering av septinfilamenter ved kryo-elektronmikroskopi

MERK: Vesikler er ikke egnet for avbildning med standard elektronmikroskopimetoder. Faktisk tørkes prøver ved hjelp av standard negative flekkmetoder. Ved dehydrering vil vesikler sannsynligvis gjennomgå uspesifikke deformasjoner, noe som ofte resulterer i lipidfremspring. Kryo-elektronmikroskopi er dermed en mye bedre strategi for å observere spesifikke deformasjoner av vesikler. Ved hjelp av cryo-EM er prøvene innebygd i et tynt (~ 100-200 nm) lag med vitrifisert is, som bevarer prøvene nær den opprinnelige tilstanden. GUV er imidlertid for store (flere titalls mikrometer) til å være innebygd i tynn is og dermed avbildet ved transmisjonselektronmikroskopi. Derfor genereres store unilamellære vesikler (LUV), hvis diametre varierer fra ~ 50-500 nm, for å bestemme hvordan septiner kan deformere vesikler og hvordan de ordner på vesikler.

  1. Generering av store unilamellære vesikler (LUV)
    1. Forbered 50 μg lipidblanding oppløst i kloroform med en molar sammensetning på 57% EggPC, 15% kolesterol, 10% DOPE, 10% DOPS og 8% hjerne PI (4,5) P2), som er optimalisert for å forbedre septininteraksjonen med membranen i et glassflaske.
    2. Tørk oppløsningen under argonstrømmen for å generere en tørket lipidfilm i hetteglasset. Sett hetteglasset under vakuum i 30 minutter for å tørke lipidet helt.
    3. Resolubiliser lipidfilmen i 50 μL vandig oppløsning (50 mM Tris-HCl [pH 8]; 50 mM KCl; 2 mM MgCl2) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 mg · ml-1, virvel i 10 s, og overfør løsningen til et rør.
      MERK: LUV må brukes med en gang for inkubering med septiner. Ellers vil protein-lipid-interaksjonen være svak på grunn av PI (4,5) P2-oppløseliggjøring. Denne rå re-solubiliseringsprosessen genererer en heterogen populasjon av vesikler med diametre fra 50 nm til 500 nm. Derfor analyseres en hel rekke diametre og dermed krumninger samtidig.
  2. Inkuber septinene med de oppløselige lipidene ved endelige lipid- og septinkonsentrasjoner på henholdsvis 0,1 mg· ml-1 (ca. 300 nM) og 20 nM i en høysaltbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2). Inkuber prøven i 1 time ved romtemperatur.
  3. Stup-frysing for å vitrifisere prøven
    1. Glødeutladning hullete karbongitter (300 mesh) på karbonsiden i 30 s ved 5 mA ved hjelp av plasmageneratorutstyr og sett rutenettet inn i en stupefrysemaskin i et fuktig miljø.
    2. Adsorber 4 μL av prøven (trinn 2.2.) på den glødutladede karbonsiden av rutenettet. Umiddelbart før prøveadsorpsjon, tilsett 5-10 nm gullperler i løsningen, dersom prøvene vil bli brukt til å generere vippede serier ved kryotomografi.
      MERK: Tettheten av gullperler må screenes og justeres empirisk og avhenger av leverandøren. Den optimaliserte tettheten er 10-15 gullperler i synsfeltet.
    3. Tørk prøvene fra den nakne siden for å aspirere prøvedråpen på motsatt side.
      MERK: Blottingstiden er vanligvis 4 s, og plasseringen av filterpapiret og blottingkraften justeres empirisk ved å teste og screene alternative posisjoner av filterpapiret for å optimalisere iskvaliteten (tykkelsen) og materialtettheten.
    4. Overfør rutenettene til et mikroskop eller lagre dem i en flytende nitrogenbeholder.
      MERK: Bruk av hullete karbongitter er viktig for å imøtekomme polydispersiteten i størrelsen på vesiklene. Blotting av prøven fra motsatt side favoriserer forbedret adsorpsjon av det biologiske materialet på rutenettet.
  4. Kryo-elektronmikroskopi avbildning
    1. Sett ristene inn i et elektronmikroskop (EM) utstyrt for cryo-EM-observasjon. Screen hele rutenettet ved å generere et kart over hele prøven ved lav forstørrelse (vanligvis ved 120x forstørrelse) for å velge områder som viser bedre is (dvs. tynn og godt vitrified).
    2. For cryo-EM 2D-datainnsamling, samle bilder med en pikselstørrelse på omtrent 2 Å per piksel for å sjekke kvaliteten på prøven. Sørg for at både septinfilamenter og lipid-dobbeltlag er synlige.
    3. For innsamling av kryo-elektrontomografi, velg interesseområder som viser deformerte vesikler. Sørg for at nok gullperler (minst 10) er til stede i synsfeltet.
    4. I henhold til programvaren som brukes til datainnsamling med skråstilte serier, velger du fokus- og sporingsposisjoner for å være langt nok fra interesseområdet. Samle skråstilte serier ved å variere hellingsvinkelen fra -60° til +60°, og samle et bilde hver 2°-3° grader.
      MERK: Den totale dosen skal være ca, eller mindre enn, 100 elektroner/Å2. Pikselstørrelsen varierer fra 1,3 Å til 2,1 Å, avhengig av mikroskopet som brukes til datainnsamling. Ideelt sett foretrekkes et vinkelsymmetrisk skjema for datainnsamling som følger: 0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°. Imidlertid gir goniometre av sideinngangsmikroskoper ikke nok mekanisk stabilitet til å oppnå de symmetriske ordningene. Alternativt kan innsamlingen startes ved 0° til 34°, etterfulgt av en andre vinkelsekvens fra -2° til -60°, og avsluttes med en sluttsekvens fra 36° til 60°. Hensikten er å samle de første bildene (med de laveste strålingsskadene) i de laveste vinklene. Videre, for å visualisere ultrastrukturen av vesikler og bundne septinfilamenter, kan et standard kryo-EM-mikroskop brukes (200 kV, Lantanheksaborid (LaB6) filament og prøvesideinngang). Men hvis man tar sikte på å forfølge videre bildebehandling (sub-tomogram gjennomsnitt, for eksempel), er det best å bruke siste generasjons feltutslippspistol (FEG) mikroskoper utstyrt med direkte detektorer. I denne protokollen begrenser vi vår beskrivelse til anskaffelse av 3D-rekonstruksjoner og utelater gjennomsnitt av sub-tomogram.
  5. 3D-rekonstruksjon fra kryotomografi og segmentering
    1. Bruk IMOD-programvarepakken (Table of Materials) for skråstilt seriebildejustering og 3D-rekonstruksjon26,27. Innenfor IMOD, utfør tiltseriejustering basert på posisjonering av fiducials (gullperler). I tillegg, om nødvendig, utføre kontrastoverføringsfunksjon (CTF) bestemmelse og korreksjon innen IMOD26. Til slutt, oppnå 3D-rekonstruksjon med IMOD, og følg hvert trinn nøye.
    2. Segmenter lipid-dobbeltlagene og septinfilamenter manuelt ved hjelp av 3Dmod27 fra IMOD-programvarepakken, for visning.

3. Analyse av krumningsfølsomhet av septin ved bruk av SEM

MERK: For å forstå hvordan septiner kan være følsomme for mikrometerkurvaturer, har en in vitro-tilnærming blitt brukt til å inkubere septinfilamentkomplekser med solidstøttede lipid dobbeltlag avsatt på mikrometerskala bølgete bølgemønstre.

  1. Design bølgete NOA (Norland optisk lim) kopi fra bølgete polydimetylsiloksan (PDMS) mønstre
    1. Bruk PDMS bølgede mønstre av 250 nm amplitude og 2 μm lateral periodicitet eller andre dimensjoner for å analysere krumningene som passer for proteinet av interesse.
      MERK: PDMS bølgede mønstre er utformet og generert som beskrevet i Nania et al.28,29.
    2. I et renromsmiljø legger du 5 μL flytende NOA på et sirkulært glassdeksel på 1 cm i diameter og plasserer PDMS-malen på dråpen. Behandle med UV-lys (320 nm) i 5 minutter for å fotopolymerisere flytende NOA til en tynn polymerfilm. Deretter skreller du forsiktig av PDMS-malen fra dekselet med den nypolymeriserte NOA.
      MERK: NOA er et vanlig optisk gjennomsiktig lim som er egnet for optisk mikroskopiavbildning. I tillegg er NOA motstandsdyktig mot kjemiske fikserings- og fargeprosesser utført før SEM-avbildning. Både NOA 71 og NOA 81 harpikser kan brukes med lignende utfall. Det opprinnelige PDMS-mønsteret kunne brukes flere ganger til å produsere NOA-kopier. De oppnådde NOA-replikaene kan oppbevares i en boks ved romtemperatur i flere måneder.
  2. Generering av et støttet lipid dobbeltlag og proteininkubasjon
    1. Behandle NOA-filmene med en luftplasmarenser i 5 minutter for å gjøre overflaten hydrofil.
    2. Forbered en løsning av små unilamellære vesikler (SUVer) med en molar sammensetning på 57% EggPC, 15% kolesterol, 10% DOPE, 10% DOPS og 8% hjerne PI (4,5) P2 ved en total lipidkonsentrasjon på 1 mg · ml-1. Forbered SUV-ene ved å resuspendere en tørket lipidfilm i observasjonsbufferen, som beskrevet i trinn 2.1.3. Soniker forsiktig løsningen ved hjelp av en badsonikator i 5-10 minutter til løsningen er gjennomsiktig.
      MERK: SUV-løsningen kan oppbevares frosset i flere uker ved -20 °C.
    3. Sett inn dekslene som støtter NOA-mønstrene i brønnene i cellekulturbokser. Sett inn 100 μL 1 mg·mL-1 SUV-løsning på de nyglødende NOA-mønstrene (trinn 3.2.1.) og rug i 30 minutter ved romtemperatur. Dette trinnet induserer fusjonen av SUVer med overflaten av NOA-mønsteret for å generere et støttet lipid-dobbeltlag.
    4. Skyll lysbildene grundig 6x med septinbufferen (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) for å fjerne usmeltet SUV. Etter hver skylling, la aldri prøven tørke helt.
    5. Fortynn den oktameriske septinstamløsningen i septin høysaltbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl 2) ved bruk av septinbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) til endelige konsentrasjoner fra 10 nM til 100 nM, og volumer på 1 ml. Inkuber proteinoppløsningen på lysbildene i ~ 1 time ved romtemperatur.
      MERK: Volumet er stort nok til at fordampning ikke er et problem.
  3. Prøvepreparering for SEM-analyse
    MERK: Ulike protokoller er utviklet i elektronmikroskopi for å analysere proteinstrukturer og deres montering. Den nåværende protokollen bevarer organiseringen av septinfilamenter, ved hjelp av en fikseringsprotokoll avledet fra Svitkina et al.30 Det er enkelt å implementere. Dessuten optimaliserer denne protokollen høyoppløselige SEM-observasjoner.
    1. Fremstilling av reagenser og stamløsninger
      MERK: Denne protokollen krever flere reagenser og løsninger som kan utarbeides på forhånd eller like før inkubasjon. Følg instruksjonene for å unngå gjenstander eller mangel på kjemisk reaktivitet.
      1. Natriumkakodylat 0,2 M stamløsning: For å klargjøre denne dobbeltstyrkeløsningen, oppløs 2,14 g natriumkakodylatpulver i ~ 40 ml destillert vann under magnetisk omrøring. Etter fullstendig oppløsning, juster pH til 7,4 ved forsiktig å tilsette 0,1 M HCl (~1 ml for 50 ml oppløsning) og lag det endelige volumet med destillert vann. Denne oppløsningen kan oppbevares i 24-48 timer ved 4 °C.
      2. 2% glutaraldehyd (GA) i 0,1 M natriumkakodilat (fiksativ oppløsning): Klargjør denne oppløsningen rett før bruk ved å fortynne svært ren EM-klasse GA med 0,2 M natriumkakodylatoppløsning (se ovenfor). Bruk en kommersiell GA-lagerløsning på 25–50 % på grunn av den optimaliserte lagringskapasiteten ved 4 °C. For fremstilling av 10 ml fikseringsmiddel, fortynn 0,8 ml 25% kommersiell GA-løsning med 4,2 ml destillert vann og 5 ml 0,2 M natriumkakodylat.
      3. 1 % osmiumtetroksid (OsO 4) i 0,1 M natriumkakodylat: Tilbered denne andre fikseringsløsningen rett før bruk ved å fortynne den kommersielle 4 % OsO4-stamløsningen med 0,2 M natriumkakodilat (se ovenfor). For 4 ml OsO 4 fikseringsløsning, fortynn 1 ml 4% kommersiell OsO4-løsning med 1 ml destillert vann og 2 ml 0,2 M natriumkakodylat.
        MERK: Bruk kommersiell 4% OsO4 lagerløsning i spaltbare glasspærer på grunn av deres lagrings- og håndteringsegenskaper. Merk at OsO4 er svært reaktiv. Pass på at fargen er litt gul og ikke mørk.
      4. 1% garvesyre (TA) i vann: Klargjør denne løsningen rett før bruk. Klargjør TA-oppløsningen for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1% TA i destillert vann ved romtemperatur. Løs opp 10 mg i 1 ml destillert vann og virvel i noen minutter. TA-oppløsningen kan ikke oppbevares og må filtreres med et 0,2 μm filter før bruk.
      5. 1% uranylacetat (UA) løsning i vann Forbered UA-løsning for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1% UA i destillert vann. Oppløs 10 mg i 1 ml destillert vann og virvel i minst 30 minutter til 1 time ved vortexing eller risting ved romtemperatur. Denne oppløsningen kan oppbevares i 1 måned ved 4 °C, men kan lett utfelles og må derfor filtreres med et 0,2 μm filter før bruk.
      6. Gradert serie etanolløsninger Forbered 50%, 70%, 95% og 100% etanolløsninger i vann. Forbered det endelige badet fra nyåpnede flasker med 100% etanol eller fra 100% etanol som har blitt dehydrert i minst 24 timer med molekylsikter (nominell porediameter = 4 Å) for å fjerne fra prøver alle spor av vann som kan forstyrre tørking og belegg. Vær forsiktig så du ikke rister denne oppløsningen, da det kan føre til resuspendering av silikatpartikler.
        MERK: Vær forsiktig når du håndterer de kjemiske reagensene som brukes i denne protokollen. Glutaraldehyd, osmiumtetroksid, natriumkakodilat og uranylacetat er alle svært giftige, uranylacetat er også radioaktivt. All manipulering av reagensene og deres avfall må gjøres ved hjelp av individuelle (hansker, laboratoriefrakker, vernebriller) og kollektiv beskyttelse (avtrekkshetter og plexiglassskjold), i henhold til laboratoriespesifikke prosedyrer.
    2. Eksempel på fiksering
      1. Vask prøvene (dvs. NOA-lysbilder med smeltet støttet lipid dobbeltlag og inkubert protein) med PBS. Erstatt PBS med GA-fikseringsløsningen forvarmet ved 37 °C og la reaksjonen fortsette i 15 minutter. Prøvene kan deretter lagres ved 4 °C.
      2. Fjern fikseringsvæsken og vask de faste prøvene 3x med 0,1 M natriumkakodilat (5 min per vask) med forsiktig risting.
      3. Inkuber prøvene i OsO 4-fikseringsløsningen i 10 minutter med maksimal beskyttelse mot lys for å tillate fiksering av membranøse strukturer og øke prøvenes elektriske ledningsevne. Fjern fikseringsløsningen og vask prøvene 3x i destillert vann (5 min per vask) med forsiktig risting.
      4. Inkuber de vaskede prøvene i den filtrerte TA-fikseringsløsningen i maksimalt 10 minutter. Fjern TA-løsningen og vask prøvene 3x i destillert vann (5 min per vask) med skånsom risting.
      5. Inkuber de vaskede prøvene i en nyfiltrert UA-fikseringsløsning i 10 minutter med maksimal beskyttelse mot lys. Fjern UA-løsningen og vask prøvene 3x i destillert vann (5 min per vask) med skånsom risting.
    3. Dehydrering av prøver og tørking av kritiske punkter
      MERK: Lufttørking er ikke tillatt for å unngå skadelige prøver gjennom uønskede overflatespenninger ved overgang fra væske til gassform. To metoder er etablert i EM: den fysiske metoden for å nå den superkritiske tilstanden til CO2 og omgå det kritiske punktet (31 ° C, 74 bar), eller den kjemiske metoden for fordampning av heksametyldisilazan (HMDS), et tørkemiddel med redusert overflatespenning. CO2 og HMDS er dårlig blandbare med vann. Derfor må alle spor av vann erstattes med et overgangsløsningsmiddel (etanol) for å unngå skade senere under tørkeprosessene.
      1. Inkuber prøvene i 2-3 minutter i hver etanolløsning, fra 50% til 100% (vannfritt) etanolbad.
        MERK: Siden fordampningen av etanol mellom badene er rask, må prøvehåndteringen også være rask for å unngå lufttørking.
      2. Overfør glassglassene inne i tørketrommelen som er forhåndsfylt med etanol, og følg produsentens instruksjoner.
        MERK: I denne protokollen ble det brukt et automatisk apparat, men ethvert system kan brukes. Protokoller kan variere for hvert apparat, men må optimaliseres for å fjerne etanol helt (25 bad i denne protokollen) og redusere hastighetene for de forskjellige løsningsmiddelutvekslingene (CO 2-innløp og etanol / CO2-uttak) og den endelige trykkavlastningen (nesten 1 time i denne protokollen).
      3. På slutten av tørkingen av det kritiske punktet, oppbevar prøvene umiddelbart i en tørkemiddel til montering og belegg. Siden tørkeprøver er svært hygroskopiske, belegg dem (se nedenfor) så snart som mulig.
        MERK: Alternativt kan HMDS tilby en billigere og raskere metode. Selv om HDMS aldri har blitt testet på våre prøver, ga denne tilnærmingen gode resultater for observasjon av proteiner på innsiden av cellemembraner31,32.
    4. Prøvemontering og belegg.
      MERK: Siden biologiske prøver har dårlige elektriske ledningsevneegenskaper, må de belegges med en ledende metallfilm før SEM-observasjon. Plasma-magnetron sputtering brukes dermed.
      1. Fest dekselet til stubber som skal brukes til fremtidige SEM-observasjoner. Bruk sølvmaling på grunn av forbedret elektrisk ledningsevne, sammenlignet med karbonskiver. Legg en stripe sølvmaling på forsiden av dekselet og sørg for at forbindelsen med stubben er tilfredsstillende. Unngå malingsagglomerater.
        MERK: Sølvmalingslisten må være tynn for å unngå kontakt mellom prøven og objektivlinsen til SEM når du arbeider med høye oppløsninger (dvs. lav arbeidsavstand).
      2. Vent til oppløsningsvæsken fordamper helt.
        MERK: Varigheten av dette trinnet kan variere avhengig av mengden og tykkelsen på sølvmalingsavleiringen. Dette trinnet kan forkortes ved å bruke en klokkekrukke eller belegget og et primærvakuum i 10-30 minutter.
      3. Bruk et apparat utstyrt med et plasmamagnetron sputtering hode og et roterende planetarisk stadium, og følg standardprotokoller levert av produsenten. Her ble apparatet evakuert til 2,5 x 10-5 mbar, renset 1x med argon av høy kvalitet, og deretter justert til 8,0 x 10-3 mbar.
      4. Utfør pre-sputtering (120 mA i 60 s) for å fjerne oksidlaget på overflaten. Deretter deponerer du 1,5 nm wolfram (90 mA, arbeidsavstand = 50 mm) ved hjelp av en filmtykkelsesmonitor.
        MERK: Belegget må rengjøres perfekt for å sikre reproduserbarheten av filmfordampningen. Belegget må stoppes når den målrettede tykkelsen er nådd. Den endelige filmtykkelsen beregnes og korrigeres etterpå. Filmer på ca. 1,5 nm har i gjennomsnitt en etterkorreksjon på 0,7 nm ved hjelp av apparatet vårt. Siden disse korreksjonsverdiene er nær målet, utføres en serie belegg for å vurdere og deretter trekke denne korreksjonen fra målverdien.
      5. Oppbevar prøvene under vakuum for å beskytte dem mot omgivelsesluften til og gjennom alle SEM-analysene.
        MERK: Arten av metallet som brukes til sputtering saker. Pt, til tross for at det er et vanlig materiale, resulterer i et belegg av dårlig kvalitet med en Pt-filmtykkelse tilpasset septinfilamenter (1,5 nm). Ved høye oppløsninger mangler en 1,5 nm Pt-film sammenheng; størrelsen på Pt-klyngene og septinfilamentene blir dermed like, noe som fører til feiltolkninger under filamentsegmenteringsprosessen33 (se figur 2A, innfelt). Wolfram er et godt alternativ til Pt fordi det viser en mindre kornstørrelse, knapt synlig ved høyoppløselig SEM (se figur 2B, innfelt). Ikke desto mindre blir ren wolfram lett oksidert, noe som fører til sterke ladningseffektartefakter under SEM-observasjon hvis prosedyren er beskrevet i trinn 3.3.4. følges ikke strengt.
  4. Skaff bildene ved hjelp av et feltemisjon SEM (FESEM) mikroskop.
    MERK: SEM-teknologier har nylig blitt oppgradert for å forbedre oppløsningen, og teknologiene er avhengige av produsenten (f.eks. Elektronoptikk, strålebremsing, magnetisk linse). Denne gevinsten i oppløsning (tilgjengelig hos flere produsenter), spesielt ved lav akselererende spenning (nær nanometeret ved 1 kV), er nødvendig for å løse nanometriske strukturer som ligner septin-nettverk.
    1. Oppnå høyoppløselig avbildning gjennom deteksjon av primære sekundære elektroner (SE1) med "in-lens" detektoren ved hjelp av følgende innstillinger.
    2. Sett akselerasjonsspenningen til 3 kV. Fest strålestrømmen med 20 μm blenderåpning (for Zeiss Gemini I-kolonner, eller tilsvarende 34 pA) eller med 15 μm blenderåpning (for Zeiss Gemini I-kolonner, eller tilsvarende 18,5 pA), hvis undertrykkelse av ladeeffekter er nødvendig.
    3. For observasjoner, bruk oppløsninger fra 21,25 nm / piksel til 1,224 nm / piksel, og for dataanalyse, bruk en oppløsning på ~ 5,58 nm / piksel (20 000x forstørrelse i henhold til Polaroid 545-referansen).
    4. Still inn arbeidsavstanden mellom 1 mm og 2 mm for høyoppløselig observasjon, og rundt 3 mm hvis en økt dybdeskarphet er nødvendig. Juster skannehastigheten og linjeintegrasjonen kontinuerlig for å sikre et konstant signal/støy-forhold med en anskaffelsestid på rundt 30–45 s per bilde.

Figure 2
Figur 2: Effekt av materialet avsatt på septinfilamenter på bølgete PDMS-mønstre. SEM av septinfilamenter belagt ved sputtering med enten (A) 1,5 nm platina, som viser mønsteret "tørr sprukket jord" som er typisk for mangel på kohesivitet mellom klyngene av platinakjerner, eller (B) 1,5 nm wolfram dekket med et glatt og sammenhengende lag. Skala bar = 200 nm. Hvite firkantede bokser representerer de forstørrede visningene nederst til høyre. De sfæriske globulene er små lipidvesikler som interagerer med septinene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GUVs deformasjoner
Typiske konfokale fluorescensbilder av GUV-er omformet etter å ha blitt inkubert med septiner vises i figur 3, under forhold der septiner polymeriseres. Bare GUVs (figur 3A) var perfekt sfæriske. Ved inkubasjon med mer enn 50 nM spirende gjærseptinfilamenter virket vesiklene deformerte. Opp til en konsentrasjon på 100 nM spirende gjærseptinoktamerer syntes vesiklene fasetterte, og deformasjonene forble statiske og svingte dermed ikke (figur 3B). Over 200 nM spirende gjærseptiner, der membranen var mettet med septiner, ble det observert periodiske deformasjoner (figur 3C). Ved hjelp av spirende gjærseptiner ble pigger visualisert med en periodicitet som varierte fra 2 μm til 6 μm og med en amplitude på ca. 1 μm. Derfor omformer septiner sterkt membraner på en bestemt måte. Disse amplitudene og tilhørende krumninger av de observerte deformasjonene reflekterer påfallende affiniteten til septiner for mikrometerkurvaturer observert i celler. GUV, som er deformerbare, er dermed hensiktsmessige for å analysere hvordan proteiner omformer membraner.

Figure 3
Figur 3: Septin-indusert deformasjon av GUV. (A) Ekvatorialplan av kontroll GUVs merket med 0,5% rhodamin PE og avbildet ved konfokal mikroskopi. Skala bar = 3 μm. (B) GFP-septiner (100 nM) bundet til en deformert GUV og avbildet ved fluorescens konfokal mikroskopi. Skalalinje = 1 μm. (C) GFP-septiner (600 nM) bundet til en deformert GUV og avbildet ved fluorescensspinnende diskmikroskopi. Skala bar = 10 μm. GUVs er laget av et molar forhold på 56,8% EggPC, 15% kolesterol, 10% DOPE, 10% DOPS, 8% hjerne PI (4,5) P 2 og0,2% Bodipy-TR-Ceramide. Observasjonsbufferen inkluderer 75 mM NaCl og 10 mM Tris (pH = 7,8). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Selvmontering av septinfilamenter bundet til LUV-er avbildet av cryo-EM
Sammenlignet med fluorescensmikroskopi gir cryo-EM bedre romlig oppløsning. Individuelle septinfilamenter og lipid-dobbeltlag kan dermed skjelnes entydig i bilder. Figur 4A viser et bilde av LUV-er dekorert med spirende gjærseptinfilamenter (noen av dem er uthevet i blått) ved 50 nM. Parallelle sett med filamenter, ca. 10 nm fra hverandre, ble observert på LUV-ene. Dette typiske bildet er en 2D-projeksjon. Derfor, for å dechiffrere enhver 3D-deformasjon og å vite om septinfilamenter direkte interagerer med membranen, ble kryo-elektrontomografi utført (figur 4B og figur 4C). Figur 4B viser et stykke i en 3D-rekonstruksjon, mens figur 4C presenterer en segmentering av det samme området som fremhever membranen i gult og septinfilamenter i blått. Som sett på sidevisningen forble septinfilamenter i hovedsak rett bundet til liposomet, og vesiklet ble betydelig flatt sammenlignet med de nakne sfæriske vesiklene.

Figure 4
Figur 4: Selvmontering av septinfilamenter bundet til LUV-er. (A) Cryo-EM-bilde av septinfilamenter bundet til en vesikkel. Noen av filamentene er uthevet i blått for synlighet. De mørke prikkene er gullfiducialer som vanligvis brukes til å justere data for tomografi. Skala bar = 100 nm. (B) og (C) 3D-rekonstruksjon oppnådd fra en vippet serie. Lipidene er uthevet i gult, mens septinene er segmentert i blått. Skala barer = 200 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Krumningsavhengig arrangement av septinfilamenter visualisert av SEM
Septiner lokaliseres i celler på steder som viser mikrometerkurvaturer (f.eks. Ved celledelingsfuren, basen av cilia, etc.). I tillegg viser in vitro-studier at septiner, som vist ovenfor, kan omforme membraner slik at de til slutt viser mikrometerkrumninger. For å analysere krumningsfølsomheten til septiner for både positive (konvekse) og negative (konkave) krumninger, ble septiner inkubert med et støttet lipid dobbeltlag smeltet sammen med de bølgete mønstrene beskrevet ovenfor. Utfallet er vist i figur 5. Figur 5A rekapitulerer de forskjellige trinnene som kreves for å oppnå prøvene. Figur 5B viser et bølget mønster ved lav forstørrelse, der periodisiteten av negative og positive krumninger er godt synlig. To påfølgende bølger er indikert med oransje heltrukne linjer. Defekter omtrent ortogonale til bølgene er indikert med hvite piler. Figur 5C og figur 5D viser den ultrastrukturelle organiseringen av septinfilamenter ved høyere forstørrelse. Septinene samlet seg i sett med parallelle filamenter, hvis orientering var avhengig av krumningen (se filamenter uthevet i blått). Faktisk var septinfilamentene ikke orientert tilfeldig. I stedet kan septiner bøye seg når de interagerer med negative (konkave) krumninger for å følge den pålagte krumningen. Omvendt, på positive krumninger, forble septinfilamentene rette, ubøyde og justert langs de konvekse bølgene. Derfor kan septiner samhandle med både positive og negative krumninger, men vedta spesifikke organisasjoner på gitte krumninger. Denne metodikken synes derfor spesielt relevant for å synliggjøre krumningssensitiviteten ved binding og selvmontering av filamentøse proteiner.

Figure 5
Figur 5: Krumningsavhengig arrangement av septinfilamenter. (A) Skjematisk fremstilling av trinnene som kreves for å oppnå de "bølgete" prøvene som er ment å analysere septinkurvaturfølsomhet gjennom SEM. (B) Lav forstørrelse SEM-bilde av et bølget mønster med bundne septinfilamenter som ikke løses ved denne oppløsningen. To påfølgende bølger er uthevet i oransje. Ortogonale defekter er indikert med hvite piler. Skalalinje = 10 μm. (C) SEM-bilde ved 10 000x forstørrelse der septinfilamenter er synlige. Skalalinje = 1 μm. (D) SEM-bilde ved 20 000x forstørrelse. Noen av filamentene er uthevet i blått for synlighet. Skala bar = 200 nm. De sfæriske objektene som er tilstede i bildene er små vesikler som interagerer med septinene og substratet. Septinkonsentrasjonen ble satt til 200 nM i B-D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som nevnt ovenfor har en lipidblanding blitt brukt som forbedrer PI (4,5) P 2-inkorporering i lipid-dobbeltlaget og dermed letter septinmembraninteraksjoner. Faktisk har vi vist andre steder25 at spirende gjærseptiner samhandler med vesikler på en PI (4,5) P2-spesifikk måte. Denne lipidsammensetningen ble justert empirisk fra screening av flere komposisjoner og er nå mye brukt av forfatterne. PI (4,5) P2 lipider må håndteres nøye. Stamløsninger må aliquoteres i små volumer slik at et bestemt hetteglass ikke åpnes mer enn to ganger for pipettering. Dessuten bør lipid aliquots lagres under argon for å forhindre lipidoksydasjon. Til slutt, når lipidblandingene er oppløst i en vandig løsning, må blandingen brukes samtidig og kan ikke lagres for videre eksperimenter. Spesielt, etter GUV-rekonstituering eller støttet lipid dobbeltlagsfusjon, ble samspillet mellom septiner og lipider sterkt redusert etter 2 timer.

Noen av resultatene oppnådd med oktameriske spirende gjærseptinkomplekser (omsluttende Cdc10, Cdc11, Cdc12 og Cdc3) har blitt presentert her; Imidlertid bør de eksperimentelle prosedyrene som følges for å analysere oppførselen til septinkomplekser fra andre arter, være identiske.

For å generere GUV-er foretrekker vi elektroformasjonsmetoden ved bruk av platinatråder fremfor elektrodannelse på ITO-plater eller PVA-hevelse. Som demonstrert tidligere25, produserer denne metoden reproduserbart unilamellar GUV av god kvalitet uten feil.

De bølgete underlagene kan utformes med et bredt spekter av krumninger. Etter screening av ulike design har mønstre med en periodicitet på 2 μm og en amplitude på 250 nm, som genererer krumninger fra -3,5 μm-1 til 3,5 μm-1 (± 0,5 um-1), blitt konsekvent brukt. Ved å bruke mønstre med kort periodicitet og høyere amplitude, passet lipid-dobbeltlagene ikke pent til overflaten. Ofte, i tilfelle av høyere krumning, vil dobbeltlaget bli suspendert mellom to konvekse bølger i stedet for å bli fullt støttet på NOA-substratet. Med lavere amplituder og større periodicitet organiserte septiner med tilfeldige nematisk-lignende orienteringer, noe som indikerer at mønstrene var for flate. Dessuten har bruk av bølgete mønstre i stedet for sylindriske rør 20 eller kuler20 fordelen at både positive og negative krumninger kan testes samtidig. I fremtiden vil det være relevant å undersøke oppførselen til filamenter på gaussiske "sadellignende" krumninger for å etterligne krumningen av mer realistiske cellulære sammenhenger.

I oppløsning induserte blanding av LUV med septiner genereringen av septin-lipidaggregater selv ved lave konsentrasjoner av proteiner og lipider. Prøvene var altså heterogene, og det er lurt å lete etter tynnere isdomener der det finnes mindre og mer definerte septin-vesikkelobjekter. Dette er spesielt viktig når du velger områder av interesse hvor kryotomografi skal utføres. Ofte, selv ved lave forstørrelser, er vesikler som viser fremspring av sterke deformasjoner, sammenlignet med sfæriske vesikler, mer sannsynlig å ha en høy tetthet av septinfilamenter bundet. Denne protokollen fokuserer på å få en beskrivelse av den globale ultrastrukturen til filamenter på biomimetiske membraner. For øyeblikket er høyere oppløsninger tilgjengelige. Oppløsningsbegrensningen skyldes det begrensede antallet visninger som er tilgjengelige ved bildebehandling. Dette forblir imidlertid utenfor omfanget av denne protokollen.

Vi har vist gjennom denne protokollen at en kombinasjon av komplementære metoder er avgjørende for å forstå og dissekere hvordan det spesifikke arrangementet av cytoskeletale septinfilamenter kan fornemme og omforme membraner på en krumningsavhengig måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Patricia Bassereau og Daniel Lévy for nyttige råd og diskusjoner. Dette arbeidet dro nytte av støtte fra ANR (Agence Nationale de la Recherche) for finansiering av prosjektet "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, og prosjektet "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin er finansiert av Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" og Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa ble støttet av Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink ble støttet av Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) gjennom 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'. Gravitasjonsstipend (024.003.019). Vi takker Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) og Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Vi takker Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, medlem av den franske nasjonale forskningsinfrastrukturen France-BioImaging (ANR10-INBS-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids 840035
Bath sonicator Elma Elmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramide invitrogen, Thermo Fischer scientific 11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol Sigma Aldrich
Confocal microscope nikon spinning disk or confocal
Critical point dryer Leica microsystems CPD300
Deionized water generator MilliQ F1CA38083B MilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051
Field Emission Gun SEM (FESEM) Carl Zeiss Gemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution Thermo Fischer scientific 50-262-19
High vacuum grease, Dow corning VWR
IMOD software https://bio3d.colorado.edu/imod/ software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids Eloise 01883-F
Lipids Avanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046
Metal evaporator Leica microsystems EM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 Norland Products NOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4% delta microscopies 19170
Osmometer Löser 15 M
Plasma cleaner Alcatel pascal 2005 SD
Plasma generator Electron Microscopy Science
Plunge freezing equipment leica microsystems EMGP
Transmission electron microscope Thermofischer Tecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetate Electron Microscopy Science 22451 this product is not available for purchase any longer
Wax plates, Vitrex VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -H., Kuo, Y. -C., Chiang, H. -S., Kuo, P. -L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, Pt 1 79-89 (1998).

Tags

Biologi utgave 186
Bottom-Up <em>In Vitro-metoder</em> for å analysere den ultrastrukturelle organisasjonen, membranomformingen og krumningsfølsomhetsoppførselen til septiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chauvin, B., Nakazawa, K., Beber,… More

Chauvin, B., Nakazawa, K., Beber, A., Di Cicco, A., Hajj, B., Iv, F., Mavrakis, M., Koenderink, G. H., Cabral, J. T., Trichet, M., Mangenot, S., Bertin, A. Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins. J. Vis. Exp. (186), e63889, doi:10.3791/63889 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter