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Biology

Métodos in vitro ascendentes para evaluar la organización ultraestructural, la remodelación de la membrana y el comportamiento de sensibilidad a la curvatura de las septinas

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63889
Automatic Translation
*1, *1, 1,7, 1, 1, 2, 2, 3, 4, 5, *6, *1
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

Summary

Las septinas son proteínas citoesqueléticas. Interactúan con las membranas lipídicas y pueden sentir, pero también generar curvatura de la membrana a escala de micras. Describimos en este protocolo metodologías in vitro ascendentes para analizar deformaciones de membrana, unión de septina sensible a la curvatura y ultraestructura de filamentos de septina.

Abstract

La remodelación de la membrana ocurre constantemente en la membrana plasmática y dentro de los orgánulos celulares. Para diseccionar completamente el papel del medio ambiente (condiciones iónicas, composiciones de proteínas y lípidos, curvatura de membrana) y los diferentes socios asociados con procesos específicos de remodelación de membranas, emprendemos enfoques ascendentes in vitro . En los últimos años, ha habido un gran interés en revelar el papel de las proteínas septina asociadas con las principales enfermedades. Las septinas son proteínas citoesqueléticas esenciales y ubicuas que interactúan con la membrana plasmática. Están implicados en la división celular, la motilidad celular, la neuromorfogénesis y la espermiogénesis, entre otras funciones. Por lo tanto, es importante comprender cómo las septinas interactúan y se organizan en las membranas para inducir posteriormente deformaciones de la membrana y cómo pueden ser sensibles a curvaturas específicas de la membrana. Este artículo tiene como objetivo descifrar la interacción entre la ultraestructura de las septinas a nivel molecular y la remodelación de la membrana que se produce a escala micrométrica. Con este fin, la levadura en ciernes y los complejos de septina de mamíferos se expresaron y purificaron recombinantemente. Luego se utilizó una combinación de ensayos in vitro para analizar el autoensamblaje de septinas en la membrana. Se utilizaron bicapas lipídicas soportadas (SLB), vesículas unilamelares gigantes (GUV), vesículas unilamelares grandes (LUV) y sustratos ondulados para estudiar la interacción entre el autoensamblaje de septinas, la remodelación de la membrana y la curvatura de la membrana.

Introduction

Las septinas son proteínas formadoras de filamentos citoesqueléticos que interactúan con las membranas lipídicas. Las septinas son ubicuas en los eucariotas y esenciales para numerosas funciones celulares. Han sido identificados como los principales reguladores de la división celular en levaduras y mamíferos en ciernes 1,2. Están involucrados en eventos de remodelación de membrana, ciliogénesis3 y espermiogénesis4. Dentro de las células de mamíferos, las septinas también pueden interactuar con actina y microtúbulos 5,6,7 de manera dependiente de Rho GTPasas (BORG) 8. En diversos tejidos (neuronas9, cilios3, espermatozoides10), las septinas han sido identificadas como reguladores de barreras de difusión para componentes unidos a la membrana11. También se ha demostrado que las septinas regulan el blebbing de la membrana y la formación de protrusión12. Las septinas, al ser proteínas multitarea, están implicadas en la aparición de diversas enfermedades prevalentes13. Su mala regulación está asociada con la aparición de cánceres14 y enfermedades neurodegenerativas15.

Dependiendo del organismo, varias subunidades de septina (dos en Caenorhabditis elegans a 13 en humanos) se ensamblan para formar complejos cuya organización varía de manera dependiente del tejido16. El bloque de construcción básico de septina reúne de dos a cuatro subunidades, presentes en dos copias y autoensambladas de una manera palindrómica similar a una varilla. En la levadura en ciernes, las septinas son octaméricas17,18. In situ, las septinas a menudo se localizan en sitios con curvatura micrométrica; Se encuentran en sitios de constricción de división, en la base de cilios y dendritas, y en el anillo de los espermatozoides19,20. En la membrana, el papel de las septinas parece ser dual: están implicadas en la remodelación de la bicapa lipídica y en el mantenimiento de la integridad de la membrana21. Por lo tanto, investigar las propiedades biofísicas de las proteínas formadoras de filamentos de septina y / o subunidades en la membrana es crucial para comprender su papel. Para diseccionar las propiedades específicas de las septinas en un ambiente bien controlado, los enfoques in vitro de abajo hacia arriba son apropiados. Hasta ahora, sólo unos pocos grupos han descrito las propiedades biofísicas de las septinas in vitro20,22,23. Por lo tanto, en comparación con otros filamentos citoesqueléticos, el conocimiento actual sobre el comportamiento de las septinas in vitro sigue siendo limitado.

Este protocolo describe cómo se puede analizar la organización de los filamentos de septina, la remodelación de la membrana y la sensibilidad a la curvatura19. Con este fin, se ha utilizado una combinación de métodos de microscopía óptica y electrónica (microscopía de fluorescencia, microscopía crioelectrónica [cryo-EM] y microscopía electrónica de barrido [SEM]). La remodelación de la membrana de vesículas unilamelares gigantes (GUV) de tamaño micrométrico se visualiza utilizando microscopía óptica de fluorescencia. El análisis de la disposición y ultraestructura de los filamentos de septina unidos a vesículas lipídicas se realiza mediante crio-EM. El análisis de la sensibilidad a la curvatura de septina se lleva a cabo mediante SEM, mediante el estudio del comportamiento de los filamentos de septina unidos a bicapas lipídicas sólidas depositadas sobre sustratos ondulados de curvaturas variables, lo que permite el análisis de la sensibilidad a la curvatura tanto para curvaturas positivas como negativas. En comparación con el análisis anterior20,24, aquí proponemos utilizar una combinación de métodos para analizar a fondo cómo las septinas pueden autoensamblarse, deformar sinérgicamente la membrana y ser sensibles a la curvatura. Se cree que este protocolo es útil y adaptable a cualquier proteína filamentosa que muestre una afinidad por las membranas.

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Protocol

1. Determinación de la remodelación de la membrana utilizando vesículas unilamelares gigantes (GUV)

NOTA: En esta sección, los GUV se generan para imitar las deformaciones de la membrana posiblemente inducidas por las septinas en un contexto celular. De hecho, en las células, las septinas se encuentran con frecuencia en sitios con curvaturas micrométricas. Los GUV tienen tamaños que van desde unos pocos hasta decenas de micrómetros y pueden deformarse. Por lo tanto, son apropiados para evaluar cualquier deformación inducida por septina a escala micrométrica. Los lípidos fluorescentes, así como las septinas marcadas con fluorescencia (utilizando proteína fluorescente verde [GFP]), se utilizan para seguir el comportamiento de los lípidos y las proteínas a través de la microscopía de fluorescencia.

  1. Preparación de tampones y soluciones
    1. Preparar el tampón de crecimiento GUV (50 mM de NaCl, 50 mM de sacarosa y 10 mM de Tris [pH = 7,8]) y el tampón de observación (75 mM de NaCl y 10 mM de Tris [pH = 7,8]).
    2. Medir (utilizando un osmómetro comercial) y ajustar la osmolaridad de los tampones de observación y crecimiento (170 mOsmol· L-1, en teoría) añadiendo pequeñas cantidades de NaCl hasta que sus respectivas osmolaridades sean iguales. Filtre los búferes con un filtro de 0,2 μm. Alícuota el tampón de crecimiento y almacénelo a -20 °C para su posterior utilización. Conservar el tampón de observación a 4 °C.
      NOTA: La diferencia de osmolaridad entre ambos tampones no debe exceder el 5%.
    3. Preparar una solución de 5 mg·mL-1 β-caseína en el tampón de observación. Asegurar la disolución completa (después de varias horas a 4 °C con agitación magnética). Filtrar la solución con un filtro de 0,2 μm, alícuota y conservar a -20 °C.
  2. Preparar las mezclas lipídicas a una concentración lipídica total de 3 mg·mL-1 en cloroformo. Utilizar una composición (mol%) de 56,8% de L-α-fosfatidilcolina de huevo (EggPC), 15% de colesterol, 10% de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 10% de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS), 8% de L-α-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato cerebral (PI(4,5)P 2), y0,2% de Bodipy-TR-Ceramida para potenciar las interacciones proteína-lípido y favorecer la incorporación de PI(4,5)P25.
    NOTA: Manipule el cloroformo debajo de una campana extractora con guantes de nitrilo y gafas de seguridad. Pipetear las soluciones de cloroformo con jeringas de vidrio y evitar el plástico, ya que el cloroformo disuelve el plástico. Antes y después de su uso, enjuague las jeringas pipeteando cloroformo 5x-10x. Use jeringas separadas para pipetear lípidos fluorescentes específicos para evitar la contaminación cruzada. Los lípidos pueden almacenarse en cloroformo a -20 °C en un vial de vidrio ámbar tapado con teflón. Los viales deben llenarse con argón antes de cerrarse y sellarse con parafilm para evitar cualquier oxidación lipídica.
  3. Electroformación de GUVs usando una configuración de alambres de platino
    NOTA: La Figura 1 presenta el esquema de los pasos experimentales y una imagen de la cámara.
    1. Limpie la cámara y los cables de platino a fondo de la siguiente manera para eliminar cualquier residuo de lípidos.
    2. Sumerja los cables y la cámara en acetona y sonicate durante 10 min. Límpielos cuidadosamente con un pañuelo de papel con acetona.
    3. Ensamble la cámara insertando los cables, sumérjala nuevamente en acetona y sonicar durante 10 minutos. Limpie una vez más con acetona, asegurándose de que los cables estén completamente limpios. Sumerja la cámara en etanol, sonicar durante 10 minutos y limpiar con etanol.
    4. Finalmente, sumerja la cámara en agua desionizada, sanice durante 10 minutos y seque con una corriente de nitrógeno o aire.
      NOTA: La cámara de teflón (Figura 1B) fue hecha a medida en el taller interno. Tiene capacidad para tres compartimentos que se pueden sellar en ambos lados con cubreobjetos de vidrio. Los alambres de platino se pueden insertar en la cámara a través de orificios de 1,3 mm de diámetro.
    5. Después de limpiar la cámara, deposite 3-4 gotas por compartimento (cada gota es de aproximadamente 0,1 μL)) de la mezcla lipídica de 3 mg·mL-1 en cada alambre de platino. Gire los cables 180° y deposite 3-4 gotas de lípidos por compartimento en el lado opuesto de cada alambre de platino. Asegúrese de que las gotas no entren en contacto entre sí. Se requieren aproximadamente 5 μL de la mezcla lipídica por cámara completa.
    6. Coloque la cámara de crecimiento en una cámara de vacío durante 30 minutos para eliminar cualquier rastro de cloroformo.
      NOTA: El vacío profundo (0,1 mbar) es el mejor. Cuando se secan, los lípidos son vulnerables a la oxidación y, por lo tanto, no deben dejarse en el aire durante más de unos pocos minutos.
    7. Deposite la grasa de alto vacío en la parte inferior de la cámara (el lado más cercano a los cables) a lo largo de la periferia de los tres compartimentos con una jeringa y presione un cubreobjetos limpio (22 mm x 40 mm) contra la grasa para garantizar un sellado perfecto. Selle ambos extremos de la cámara (es decir, en los sitios de entrada / salida de los cables) usando pasta de sellado (placas de cera). Del mismo modo, aplique grasa de vacío en el otro lado de la cámara.
    8. Llene los compartimentos con tampón de crecimiento (~1 ml por cámara) con una pipeta. No agite la solución demasiado rápido o fuertemente para evitar cualquier desprendimiento de la película lipídica de los cables. Selle herméticamente la parte superior de la cámara con un cubreobjetos de 22 mm x 40 mm presionándolo contra la grasa. Para evitar la formación de burbujas de aire, presione suavemente el cubreobjetos de vidrio desde el centro hasta los bordes.
      1. Coloque la cámara en un refrigerador a 4 °C y conecte los cables a un generador de función de onda (función sinusoidal a 500 Hz). Establecer una tensión efectiva de 350 mV para un período de crecimiento más corto (es decir, 6 h) o 250 mV para un período de crecimiento más largo (es decir, 12-16 h), como ya se presentó y optimizó en un estudio de Beber et al.25.
    9. Retire los cubreobjetos, limpie el sellador y la grasa, y retire los cables. Lave y frote la cámara con un pañuelo de papel usando agua y etanol (≥70%) alternativamente.
      NOTA: El voltaje óptimo y la escala de tiempo para el crecimiento de GUV dependen de muchos parámetros, desde la concentración de sales tampón hasta la geometría de la cámara (es decir, la distancia entre los cables y el tamaño de la cámara). Utilice la misma cámara cada vez que se repita el experimento para garantizar la reproducibilidad. Los cables están cerca de la parte inferior de la cámara para que los lípidos puedan ser fotografiados usando microscopía fluorescente. Imagen de los lípidos en cada paso (ver Figura 1C, D) para asegurarse de que el proceso de electroformación sea exitoso.
  4. Incubación de septina con las vesículas
    1. Recoja los GUV de los cables utilizando puntas de pipeta precortadas (abertura de ~ 1 mm) que se acercan a los cables. Luego, pipetea la solución a lo largo del cable. Este procedimiento evita la generación de fuertes flujos laminares que podrían interrumpir los GUV. Después de este paso, ya no es necesario cortar puntas de pipeta. De hecho, los flujos laminares no dañan los GUV en la solución.
      NOTA: Debido a la presencia de PI(4,5)P 2 en la mezcla lipídica, los GUV que se han recolectado deben almacenarse durante no más de2-3 h antes del experimento. De hecho, PI(4,5)P2 se solubiliza rápidamente y las septinas ya no se unen a las membranas unas horas después de su formación. Sin embargo, una vez que las septinas se unen a la membrana, permanecen unidas durante unos días.
    2. Diluir la solución madre de septinas en Tris 10 mM (pH 8) exclusivamente para alcanzar una osmolaridad igual a la del tampón de crecimiento; Si es necesario, diluya la solución de septina aún más en el tampón de observación. Agregue el volumen previsto de GUV recolectados (50-100 μL para un volumen total de 200 μL). Realice la incubación directamente en la cámara de observación después de la pasivación con β-caseína (ver más abajo). Se requiere un tiempo de espera de 20-30 minutos para alcanzar el equilibrio.
      NOTA: La expresión y purificación de los complejos octaméricos de septina (levaduras humanas o en ciernes) se describen ampliamente en otros artículos17. Brevemente, las septinas se expresaron en Escherichia coli, se purificaron en el laboratorio utilizando pasos de cromatografía de afinidad, exclusión de tamaño e intercambio iónico, y se almacenaron a -80 °C en una solución acuosa de 50 mM de Tris-HCl (pH 8), 300 mM KCl y 5 mM MgCl2 a ~1 mg·mL-1 (3 μM) de concentración. Se utiliza una alta concentración de sal para evitar la agregación de septina. Los complejos de septina no deben concentrarse a través de un dispositivo de centrifugación de filtro, que induce la agregación y, por lo tanto, reduce el rendimiento de proteínas.
  5. Imágenes con microscopio de disco confocal y/o giratorio
    1. Para evitar que los GUV se peguen a la superficie y/o exploten, pasivar la cámara de observación incubándola con una solución de 5 mg·mL-1 β-caseína durante 30 min.
    2. Extraer la solución de β-caseína y transferir la solución de septina-GUV (paso 1.4.2.) a la cámara de observación con una pipeta. Deje que los GUV sedimenten hasta el fondo de la cámara durante 10-15 minutos.
      NOTA: La discrepancia de composición entre el interior del GUV y el tampón externo crea un desajuste entre la densidad y el índice de refracción. Debido al desajuste del índice de refracción, los GUV son visibles con microscopía óptica de luz de transmisión.
    3. Usando microscopía confocal, visualice la señal fluorescente de los lípidos para verificar la calidad de los GUV y el estado de laminaridad de la membrana. Evaluar la densidad de septinas unidas a GUVs registrando la señal fluorescente de las septinas después de realizar una calibración adecuada25. Realizar adquisiciones de Z-stack a intervalos espaciales de 0,4 μm para analizar y visualizar las deformaciones 3D de las vesículas inducidas por la interacción entre las septinas y la membrana.
      NOTA: Se utilizaron objetivos de inmersión en aceite con aumentos de 60 o 100 veces. Se utilizaron microscopios estándar de disco confocal o giratorio (Tabla de materiales) con tamaños de píxel de 250 nm y 110 nm, respectivamente. Uno debe adaptar las condiciones de imagen a una pieza dada del equipo. No se agregaron agentes antiblanqueadores fotográficos específicos a la solución.

Figure 1
Figura 1: Electroformación de GUVs . (A) Representación esquemática del proceso de electroformación utilizando alambres de platino. (B) Imagen del dispositivo casero de teflón ensamblado con alambres de platino utilizados para generar GUVs por electroformación. Los cables tienen 0,5 mm de diámetro y 3 mm de separación. (C) GUVs (objetos esféricos) observados por microscopía óptica de transmisión durante el proceso de crecimiento. La zona opaca en la parte inferior de la imagen es el alambre de platino. (D) GUVs (objetos fluorescentes redondos) observados con microscopía fluorescente durante el crecimiento en el alambre de platino. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Análisis de la organización ultraestructural de filamentos de septina mediante microscopía crioelectrónica

NOTA: Las vesículas no son adecuadas para obtener imágenes con métodos estándar de microscopía electrónica. De hecho, las muestras se secan utilizando métodos estándar de tinción negativa. Tras la deshidratación, es probable que las vesículas sufran deformaciones inespecíficas, lo que con frecuencia resulta en protuberancias lipídicas. La criomicroscopía electrónica es, por lo tanto, una estrategia mucho mejor para observar deformaciones específicas de vesículas. Usando cryo-EM, las muestras se incrustan dentro de una capa delgada (~ 100-200 nm) de hielo vitrificado, que conserva las muestras cerca del estado nativo. Sin embargo, los GUV son demasiado grandes (varias decenas de micrómetros) para ser incrustados dentro de hielo delgado y, por lo tanto, fotografiados por microscopía electrónica de transmisión. Por lo tanto, se generan grandes vesículas unilamelares (LUV), cuyos diámetros oscilan entre ~ 50-500 nm, para determinar cómo las septinas pueden deformar las vesículas y cómo se organizan en las vesículas.

  1. Generación de vesículas unilamelares grandes (LUVs)
    1. Prepare 50 μg de mezcla lipídica solubilizada en cloroformo con una composición molar de 57% EggPC, 15% colesterol, 10% DOPE, 10% DOPS y 8% cerebro PI(4,5)P2), que está optimizado para mejorar la interacción de la septina con la membrana en un vial de vidrio.
    2. Seque la solución bajo flujo de argón para generar una película lipídica seca en el vial. Ponga el vial al vacío durante 30 minutos para secar completamente el lípido.
    3. Resolubilizar la película lipídica en 50 μL de solución acuosa (50 mM Tris-HCl [pH 8]; 50 mM KCl; 2 mM MgCl2) para obtener una concentración final de 1 mg·mL-1, vórtice durante 10 s, y transferir la solución a un tubo.
      NOTA: Los LUV deben usarse de inmediato para la incubación con septinas. De lo contrario, la interacción proteína-lípido será débil debido a la solubilización de PI(4,5)P2. Este crudo proceso de resolubilización genera una población heterogénea de vesículas con diámetros que van desde 50 nm a 500 nm. Por lo tanto, se ensaya simultáneamente toda una gama de diámetros y, por lo tanto, curvaturas.
  2. Incubar las septinas con los lípidos solubilizados a concentraciones finales de lípidos y septinas de 0,1 mg·mL-1 (aproximadamente 300 nM) y 20 nM, respectivamente, en un tampón con alto contenido de sal (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2). Incubar la muestra durante 1 h a temperatura ambiente.
  3. Congelación por inmersión para vitrificar la muestra
    1. Rejillas de carbono de descarga incandescente (malla 300) en el lado del carbono durante 30 s a 5 mA utilizando un equipo generador de plasma e inserte la rejilla dentro de una máquina de congelación por inmersión en un ambiente húmedo.
    2. Adsorber 4 μL de la muestra (Paso 2.2.) en el lado de carbono descargado de brillo de la rejilla. Inmediatamente antes de la adsorción de la muestra, agregue perlas de oro de 5-10 nm a la solución, en caso de que las muestras se utilicen para generar series inclinadas mediante criotomografía.
      NOTA: La densidad de las cuentas de oro debe ser examinada y ajustada empíricamente y depende del proveedor. La densidad optimizada es de 10-15 cuentas de oro en el campo de visión.
    3. Seque las muestras del lado desnudo para aspirar la gota de muestra en el lado opuesto.
      NOTA: El tiempo de secado suele ser de 4 s, y la posición del papel de filtro y la fuerza de secado se ajustan empíricamente probando y seleccionando posiciones alternativas del papel de filtro para optimizar la calidad del hielo (espesor) y la densidad del material.
    4. Transfiera las rejillas a un microscopio o almacénelas en un recipiente de nitrógeno líquido.
      NOTA: El uso de rejillas de carbono agujereadas es esencial para acomodar la polidispersidad en el tamaño de las vesículas. Borrar la muestra desde el lado opuesto favorece una mayor adsorción del material biológico en la rejilla.
  4. Imágenes de criomicroscopía electrónica
    1. Inserte las rejillas en un microscopio electrónico (EM) equipado para la observación crio-EM. Filtre toda la cuadrícula generando un mapa de toda la muestra con un aumento bajo (generalmente con un aumento de 120x) para seleccionar áreas que muestren mejor hielo (es decir, delgadas y bien vitrificadas).
    2. Para la recopilación de datos 2D crio-EM, recopile imágenes con un tamaño de píxel de aproximadamente 2 Å por píxel para verificar la calidad de la muestra. Asegúrese de que tanto los filamentos de septina como la bicapa lipídica sean visibles.
    3. Para la recopilación de datos de criotomografía electrónica, seleccione áreas de interés que muestren vesículas deformadas. Asegúrese de que haya suficientes cuentas de oro (al menos 10) en el campo de visión.
    4. De acuerdo con el software utilizado para la recopilación de datos de series inclinadas, seleccione las posiciones de enfoque y seguimiento para estar lo suficientemente lejos del área de interés. Recopile series inclinadas variando el ángulo de inclinación de -60° a +60°, recopilando una imagen cada 2°-3° grados.
      NOTA: La dosis total debe ser de aproximadamente o menos de 100 electrones/Å2. El tamaño del píxel varía de 1,3 Å a 2,1 Å, dependiendo del microscopio utilizado para la recopilación de datos. Idealmente, se prefiere un esquema angular simétrico para la recopilación de datos de la siguiente manera: 0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°. Sin embargo, los goniómetros de los microscopios de entrada lateral no proporcionan suficiente estabilidad mecánica para lograr esos esquemas simétricos. Alternativamente, la adquisición puede iniciarse de 0° a 34°, seguida de una segunda secuencia angular de -2° a -60°, y terminar con una secuencia final de 36° a 60°. El propósito es recopilar las primeras imágenes (con los daños de radiación más bajos) en los ángulos más bajos. Además, para visualizar la ultraestructura de vesículas y filamentos de septina unidos, se puede utilizar un microscopio crio-EM estándar (200 kV, filamento de hexaboruro de lantano (LaB6) y entrada lateral de la muestra). Sin embargo, si uno apunta a un mayor procesamiento de imágenes (promedio de sub-tomograma, por ejemplo), es mejor usar microscopios de pistola de emisión de campo (FEG) de última generación equipados con detectores directos. En este protocolo, restringimos nuestra descripción a la adquisición de reconstrucciones 3D y dejamos fuera el promedio de sub-tomograma.
  5. Reconstrucción 3D a partir de criotomografía y segmentación
    1. Utilice el paquete de software IMOD (Table of Materials) para la alineación de imágenes en serie inclinadas y la reconstrucción3D 26,27. Dentro de IMOD, realice la alineación de la serie de inclinación basada en el posicionamiento de los fiduciales (cuentas de oro). Además, si es necesario, realice la determinación y corrección de la función de transferencia de contraste (CTF) dentro de IMOD26. Finalmente, lograr la reconstrucción 3D con IMOD, siguiendo cada paso rigurosamente.
    2. Segmente manualmente las bicapas lipídicas y los filamentos de septina utilizando 3Dmod27 del paquete de software IMOD, para su visualización.

3. Análisis de la sensibilidad a la curvatura de la septina mediante SEM

NOTA: Para comprender cómo las septinas pueden ser sensibles a las curvaturas micrométricas, se ha utilizado un enfoque in vitro para incubar complejos de filamentos de septina con bicapas lipídicas sólidas depositadas en patrones ondulados ondulados a escala micrométrica.

  1. Diseño de réplicas onduladas de NOA (adhesivo óptico Norland) a partir de patrones ondulados de polidimetilsiloxano (PDMS)
    1. Utilice patrones ondulados PDMS de 250 nm de amplitud y 2 μm de periodicidad lateral u otras dimensiones para evaluar las curvaturas adecuadas para la proteína de interés.
      NOTA: Los patrones ondulados PDMS se diseñan y generan como se describe en Nania et al.28,29.
    2. En un entorno de sala limpia, deposite 5 μL de NOA líquido en un cubreobjetos de vidrio circular de 1 cm de diámetro y coloque la plantilla PDMS en la gota. Tratar con luz UV (320 nm) durante 5 min para fotopolimerizar el NOA líquido en una película delgada de polímero. Luego, retire suavemente la plantilla PDMS del cubreobjetos con el NOA recién polimerizado.
      NOA es un pegamento ópticamente transparente común adecuado para imágenes de microscopía óptica. Además, el NOA es resistente a los procesos de fijación y tinción química realizados antes de la obtención de imágenes SEM. Tanto las resinas NOA 71 como NOA 81 se pueden usar con resultados similares. El patrón PDMS inicial podría usarse varias veces para producir réplicas de NOA. Las réplicas de NOA obtenidas se pueden mantener en una caja a temperatura ambiente durante meses.
  2. Generación de una bicapa lipídica soportada e incubación proteica
    1. Trate las películas de NOA con un limpiador de plasma de aire durante 5 minutos para hacer que la superficie sea hidrófila.
    2. Preparar una solución de pequeñas vesículas unilamelares (SUV) con una composición molar de 57% EggPC, 15% colesterol, 10% DOPE, 10% DOPS y 8% cerebro PI(4,5)P2 a una concentración total de lípidos de 1 mg·mL-1. Prepare los SUV resuspendiendo una película lipídica seca en el tampón de observación, como se describe en el Paso 2.1.3. Sonicar suavemente la solución con un sonicador de baño durante 5-10 minutos hasta que la solución sea transparente.
      NOTA: La solución de los SUV se puede almacenar congelada durante varias semanas a -20 ° C.
    3. Inserte los cubreobjetos que soportan los patrones de NOA dentro de los pocillos de las cajas de cultivo celular. Depositar 100 μL de solución SUV de 1 mg·mL-1 sobre los patrones de NOA recién descargados (Paso 3.2.1.) e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Este paso induce la fusión de los SUV con la superficie del patrón NOA para generar una bicapa lipídica soportada.
    4. Enjuague bien los portaobjetos 6 veces con el tampón de septina (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) para retirar el SUV sin fundir. Después de cada enjuague, nunca deje que la muestra se seque completamente.
    5. Diluir la solución madre de septina octomérica en tampón de septina con alto contenido de sal (50 mM de Tris-HCl [pH 8], 300 mM de KCl, 2 mM de MgCl 2) utilizando tampón de septina (50 mM de Tris-HCl [pH 8], 50 mM de KCl, 2 mM de MgCl2) hasta concentraciones finales que oscilen entre 10 nM y 100 nM, y volúmenes de 1 ml. Incubar la solución de proteína en los portaobjetos durante ~1 h a temperatura ambiente.
      NOTA: El volumen es lo suficientemente grande como para que la evaporación no sea un problema.
  3. Preparación de muestras para análisis SEM
    NOTA: Se han desarrollado varios protocolos en microscopía electrónica para analizar las estructuras de las proteínas y su ensamblaje. El protocolo actual preserva la organización de los filamentos de septina, utilizando un protocolo de fijación derivado de Svitkina et al.30 Eso es fácil de implementar. Además, este protocolo optimiza las observaciones SEM de alta resolución.
    1. Preparación de reactivos y soluciones madre
      NOTA: Este protocolo requiere varios reactivos y soluciones que se pueden preparar de antemano o justo antes de la incubación. Siga las instrucciones proporcionadas para evitar cualquier artefacto o falta de reactividad química.
      1. Solución madre de cacodilato de sodio 0.2 M: Para preparar esta solución de doble fuerza, disuelva 2.14 g de polvo de cacodilato de sodio en ~ 40 ml de agua destilada bajo agitación magnética. Después de la disolución completa, ajuste el pH a 7.4 agregando suavemente 0.1 M HCl (~ 1 ml por 50 ml de solución) y enrasar el volumen final con agua destilada. Esta solución se puede almacenar durante 24-48 h a 4°C.
      2. Glutaraldehído (GA) al 2% en cacodilato de sodio 0,1 M (solución fijadora): Prepare esta solución justo antes de usarla diluyendo GA de grado EM altamente puro con solución de cacodilato de sodio 0,2 M (ver arriba). Utilice una solución de stock GA comercial del 25% al 50% debido a su capacidad de almacenamiento optimizada a 4 °C. Para preparar 10 ml de solución fijadora, diluir 0,8 ml de solución comercial de GA al 25% con 4,2 ml de agua destilada y 5 ml de cacodilato de sodio 0,2 M.
      3. Tetróxido de osmio (OsO4) al 1% en cacodilato de sodio 0,1 M: Prepare esta segunda solución fijadora justo antes de usarla diluyendo lasolución madre comercial de OsO4 al 4% con cacodilato de sodio 0,2 M (ver arriba). Para 4 ml de solución fijadora de OsO 4, diluir 1 ml de solución comercial de OsO 4 al4% con 1 ml de agua destilada y 2 ml de cacodilato de sodio 0,2 M.
        NOTA: Utilice una solución estándar comercial de OsO 4 al4 % en bombillas de vidrio escindibles debido a sus propiedades de almacenamiento y manipulación. Tenga en cuenta que OsO4 es altamente reactivo. Asegúrese de que su color sea ligeramente amarillo y no oscuro.
      4. 1% de ácido tánico (AT) en agua: Prepare esta solución justo antes de usar. Preparar la solución de TA para obtener una concentración final de 1% de TA en agua destilada a temperatura ambiente. Disuelva 10 mg en 1 ml de agua destilada y vortex durante unos minutos. La solución de TA no se puede almacenar y debe filtrarse con un filtro de 0,2 μm antes de su uso.
      5. Solución de acetato de uranilo (UA) al 1% en agua Prepare la solución de UA para obtener una concentración final de 1% de UA en agua destilada. Disuelva 10 mg en 1 ml de agua destilada y vórtice durante al menos 30 min a 1 h mediante vórtice o agitación a temperatura ambiente. Esta solución puede almacenarse durante 1 mes a 4 °C, pero puede precipitar fácilmente y, por lo tanto, debe filtrarse con un filtro de 0,2 μm antes de su uso.
      6. Serie graduada de soluciones de etanol Prepare soluciones de etanol al 50%, 70%, 95% y 100% en agua. Preparar el baño final a partir de botellas recién abiertas de etanol al 100% o de etanol 100% que haya sido deshidratado durante al menos 24 h con tamices moleculares (diámetro nominal de poro = 4 Å) para eliminar de las muestras todos los restos de agua que puedan interferir con el secado y el recubrimiento. Tenga cuidado de no agitar esta solución, ya que podría causar la resuspensión de partículas de silicato.
        NOTA: Tenga cuidado al manipular los reactivos químicos utilizados en este protocolo. El glutaraldehído, el tetróxido de osmio, el cacodilato de sodio y el acetato de uranilo son altamente tóxicos, el acetato de uranilo también es radiactivo. Toda la manipulación de los reactivos y sus residuos debe realizarse con protección individual (guantes, batas de laboratorio, gafas de seguridad) y colectiva (campanas extractoras y escudos de plexiglás), de acuerdo con los procedimientos específicos del laboratorio.
    2. Fijación de muestras
      1. Lave las muestras (es decir, portaobjetos NOA con bicapas lipídicas soportadas fusionadas y proteína incubada) con PBS. Sustituir PBS por la solución fijadora de GA precalentada a 37 °C y dejar que la reacción proceda durante 15 min. Las muestras pueden almacenarse a 4 °C.
      2. Retirar la solución fijadora y lavar las muestras fijadas 3 veces con cacodilato sódico 0,1 M (5 min por lavado) agitando suavemente.
      3. Incubar las muestras en la solución fijadora OsO4 durante 10 min con la máxima protección contra la luz para permitir la fijación de estructuras membranosas y aumentar la conductividad eléctrica de las muestras. Retire la solución fijadora y lave las muestras 3 veces en agua destilada (5 minutos por lavado) agitando suavemente.
      4. Incubar las muestras lavadas en la solución fijadora de TA filtrada durante un máximo de 10 min. Retire la solución de TA y lave las muestras 3 veces en agua destilada (5 minutos por lavado) agitando suavemente.
      5. Incubar las muestras lavadas en una solución fijadora de UA recién filtrada durante 10 min con la máxima protección contra la luz. Retire la solución de AU y lave las muestras 3 veces en agua destilada (5 min por lavado) con agitación suave.
    3. Deshidratación de muestras y secado de puntos críticos
      NOTA: El secado al aire no está permitido para evitar dañar las muestras a través de tensiones superficiales no deseadas al cambiar del estado líquido al gaseoso. Se han establecido dos métodos en EM: el método físico de alcanzar el estado supercrítico deCO2 y evitar su punto crítico (31 °C, 74 bar), o el método químico de evaporación de hexametildisilazano (HMDS), un agente de secado con tensión superficial reducida. ElCO2 y el HMDS son poco miscibles con agua. En consecuencia, todas las trazas de agua deben sustituirse por un disolvente de transición (etanol) para evitar cualquier daño posterior durante los procesos de secado.
      1. Incubar las muestras durante 2-3 minutos en cada solución de etanol, comenzando desde un baño de etanol al 50% a 100% (anhidro).
        NOTA: Como la evaporación del etanol entre baños es rápida, el manejo de la muestra también debe ser rápido para evitar el secado al aire.
      2. Transfiera los portaobjetos de vidrio dentro del secador de punto crítico precargado con etanol y siga las instrucciones del fabricante.
        NOTA: En este protocolo, se utilizó un aparato automático, pero se puede utilizar cualquier sistema. Los protocolos pueden diferir para cada aparato, pero deben optimizarse para eliminar completamente el etanol (25 baños en este protocolo) y reducir las velocidades para los diferentes intercambios de disolventes (entradas de CO 2 y salidas de etanol / CO2) y la despresurización final (casi 1 h en este protocolo).
      3. Al final del punto crítico de secado, almacene las muestras inmediatamente en un desecador hasta que las monte y recubra. Como las muestras secas son altamente higroscópicas, cúbralas (ver más abajo) lo antes posible.
        NOTA: Alternativamente, HMDS puede ofrecer un método más barato y rápido. Aunque HDMS nunca ha sido probado en nuestras muestras, este enfoque produjo buenos resultados para la observación de proteínas en la cara interna de las membranas celulares31,32.
    4. Montaje y recubrimiento de muestras.
      NOTA: Dado que las muestras biológicas presentan propiedades de conductividad eléctrica deficientes, deben recubrirse con una película metálica conductora antes de la observación SEM. Por lo tanto, se utiliza la pulverización catódica de plasma-magnetrón.
      1. Fije el cubreobjetos a los talones que se utilizarán para futuras observaciones SEM. Use pintura plateada debido a su conductividad eléctrica mejorada, en comparación con los discos de carbono. Agregue una tira de pintura plateada a la cara superior del cubreobjetos y asegúrese de que la conexión con el talón sea satisfactoria. Evite cualquier aglomerado de pintura.
        NOTA: La tira de pintura plateada debe ser delgada para evitar cualquier contacto entre la muestra y la lente objetiva del SEM cuando se trabaja a altas resoluciones (es decir, baja distancia de trabajo).
      2. Espere a que el disolvente se evapore por completo.
        NOTA: La duración de este paso puede variar dependiendo de la cantidad y el grosor del depósito de pintura plateada. Este paso se puede acortar usando un frasco de campana o el recubridor y un vacío primario durante 10-30 minutos.
      3. Utilice un aparato equipado con un cabezal pulverizador de plasma-magnetrón y una etapa rotativa-planetaria, y siga los protocolos estándar proporcionados por el fabricante. Aquí, el aparato se evacuó a 2.5 x 10-5 mbar, se purgó 1x con argón de alta calidad y luego se ajustó a 8.0 x 10-3 mbar.
      4. Realice la pulverización catódica previa (120 mA durante 60 s) para eliminar la capa de óxido en la superficie. Luego, deposite 1.5 nm de tungsteno (90 mA, distancia de trabajo = 50 mm) con la ayuda de un monitor de espesor de película.
        NOTA: El recubridor debe limpiarse perfectamente para garantizar la reproducibilidad de la evaporación de la película. El recubrimiento debe detenerse una vez que se haya alcanzado el espesor objetivo. El espesor final de la película se calcula y se corrige después. Las películas de aproximadamente 1.5 nm tienen, en promedio, una post-corrección de 0.7 nm usando nuestro aparato. Como esos valores de corrección están cerca del objetivo, se realizan una serie de recubrimientos para evaluar y luego restar esta corrección del valor objetivo.
      5. Almacene las muestras al vacío para protegerlas del aire ambiente hasta y durante todos los análisis SEM.
        NOTA: La naturaleza del metal utilizado para pulverizar la pulverización catódica. El Pt, a pesar de ser un material común, da como resultado un recubrimiento de mala calidad con un espesor de película de Pt adaptado a filamentos de septina (1,5 nm). A altas resoluciones, una película de 1,5 nm Pt carece de cohesión; el tamaño de los grupos de Pt y los filamentos de septina se vuelven similares, lo que lleva a interpretaciones erróneas durante el proceso de segmentación del filamento33 (ver Figura 2A, recuadro). El tungsteno es una buena alternativa al Pt porque muestra un tamaño de grano más pequeño, apenas visible en SEM de alta resolución (ver Figura 2B, recuadro). No obstante, el tungsteno puro se oxida fácilmente, lo que lleva a fuertes artefactos de efecto de carga durante la observación SEM si el procedimiento detallado en el Paso 3.3.4. no se sigue estrictamente.
  4. Adquiera las imágenes utilizando un microscopio SEM de emisión de campo (FESEM).
    NOTA: Las tecnologías SEM se han actualizado recientemente para mejorar la resolución, y las tecnologías dependen del fabricante (por ejemplo, óptica electrónica, desaceleración del haz, lente magnética). Esta ganancia en resolución (accesible con varios fabricantes), especialmente a un voltaje de aceleración bajo (cerca del nanómetro a 1 kV), es necesaria para resolver estructuras nanométricas similares a las redes de septinas.
    1. Logre imágenes de alta resolución a través de la detección de electrones secundarios primarios (SE1) con el detector "en lente" utilizando los siguientes ajustes.
    2. Ajuste la tensión de aceleración a 3 kV. Fije la corriente del haz con la apertura de 20 μm (para columnas Zeiss Gemini I, o equivalente a 34 pA) o con la apertura de 15 μm (para columnas Zeiss Gemini I, o equivalente a 18,5 pA), si es necesaria la supresión de los efectos de carga.
    3. Para las observaciones, use resoluciones que van desde 21.25 nm / píxel a 1.224 nm / píxel, y para el análisis de datos, use una resolución de ~ 5.58 nm / píxel (aumento de 20,000x según la referencia de Polaroid 545).
    4. Establezca la distancia de trabajo entre 1 mm y 2 mm para la observación de alta resolución, y alrededor de 3 mm si se requiere una mayor profundidad de campo. Ajuste la velocidad de escaneo y la integración de la línea continuamente para garantizar una relación señal-ruido constante con un tiempo de adquisición de alrededor de 30-45 s por imagen.

Figure 2
Figura 2: Efecto del material depositado sobre filamentos de septina sobre patrones PDMS ondulados. SEM de filamentos de septina recubiertos por pulverización catódica con (A) 1,5 nm de platino, exhibiendo el patrón de "suelo agrietado árido" típico de la falta de cohesión entre los grupos de núcleos de platino, o (B) 1,5 nm de tungsteno cubierto con una capa lisa y cohesiva. Barra de escala = 200 nm. Los cuadros cuadrados blancos representan las vistas ampliadas en la parte inferior derecha. Los glóbulos esféricos son pequeñas vesículas lipídicas que interactúan con las septinas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

Deformaciones de GUVs
Las imágenes típicas de fluorescencia confocal de GUVs remodelados después de ser incubados con septinas se muestran en la Figura 3, en condiciones donde las septinas polimerizan. Los GUV desnudos (Figura 3A) eran perfectamente esféricos. Tras la incubación con más de 50 nM de filamentos de septina de levadura en ciernes, las vesículas parecían deformadas. Hasta una concentración de 100 nM de octámeros de septina de levadura en ciernes, las vesículas parecían facetadas, y las deformaciones permanecieron estáticas y, por lo tanto, no fluctuaron (Figura 3B). Por encima de 200 nM de septinas de levadura en ciernes, con la membrana saturada de septinas, se observaron deformaciones periódicas (Figura 3C). Usando septinas de levadura en ciernes, los picos se visualizaron con una periodicidad que variaba de 2 μm a 6 μm y con una amplitud de aproximadamente 1 μm. Por lo tanto, las septinas remodelan fuertemente las membranas de una manera específica. Estas amplitudes y curvaturas asociadas de las deformaciones observadas reflejan sorprendentemente la afinidad de las septinas por las curvaturas micrométricas observadas en las células. Los GUV, al ser deformables, son apropiados para evaluar cómo las proteínas remodelan las membranas.

Figure 3
Figura 3: Deformación inducida por septina de GUVs . (A) Plano ecuatorial de control GUVs marcados con 0,5% de rodamina PE e imágenes por microscopía confocal. Barra de escala = 3 μm. (B) GFP-septinas (100 nM) unidas a un GUV deformado y fotografiadas por microscopía confocal de fluorescencia. Barra de escala = 1 μm. (C) GFP-septinas (600 nM) unidas a un GUV deformado y fotografiadas por microscopía de disco giratorio de fluorescencia. Barra de escala = 10 μm. Los GUV están hechos de una proporción molar de 56.8% EggPC, 15% colesterol, 10% DOPE, 10% DOPS, 8% cerebro PI (4,5) P 2 y0.2% Bodipy-TR-Ceramida. El tampón de observación incluye 75 mM NaCl y 10 mM Tris (pH = 7,8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Autoensamblaje de filamentos de septina unidos a LUVs fotografiados por cryo-EM
En comparación con la microscopía de fluorescencia, la crio-EM proporciona una mejor resolución espacial. Por lo tanto, los filamentos de septina individuales y las bicapas lipídicas se pueden discernir sin ambigüedades en las imágenes. La Figura 4A muestra una imagen de LUVs decorados con filamentos de septina de levadura en ciernes (algunos de ellos resaltados en azul) a 50 nM. Se observaron conjuntos paralelos de filamentos, separados por unos 10 nm, en los LUV. Esta imagen típica es una proyección 2D. Por lo tanto, para descifrar cualquier deformación 3D y saber si los filamentos de septina interactúan directamente con la membrana, se realizó una tomografía crioelectrónica (Figura 4B y Figura 4C). La Figura 4B muestra un corte en una reconstrucción 3D, mientras que la Figura 4C presenta una segmentación de la misma área destacando la membrana en amarillo y los filamentos de septina en azul. Como se ve en la vista lateral, los filamentos de septina permanecieron esencialmente unidos al liposoma y la vesícula se aplanó considerablemente en comparación con las vesículas esféricas desnudas.

Figure 4
Figura 4: Autoensamblaje de filamentos de septina unidos a LUVs. (A) Imagen crio-EM de filamentos de septina unidos a una vesícula. Algunos de los filamentos están resaltados en azul para mayor visibilidad. Los puntos oscuros son fiduciarios de oro que generalmente se usan para alinear datos para la tomografía. Barra de escala = 100 nm. (B) y (C) reconstrucción 3D obtenida a partir de una serie inclinada. Los lípidos se resaltan en amarillo, mientras que las septinas se segmentan en azul. Barras de escala = 200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Disposición dependiente de la curvatura de filamentos de septina visualizados por SEM
Las septinas se localizan en células en sitios que muestran curvaturas micrométricas (por ejemplo, en el surco de división celular, la base de los cilios, etc.). Además, los estudios in vitro muestran que las septinas, como se vio anteriormente, pueden remodelar las membranas para que eventualmente muestren curvaturas micrométricas. Para evaluar la sensibilidad a la curvatura de las septinas para curvaturas positivas (convexas) y negativas (cóncavas), las septinas se incubaron con una bicapa lipídica soportada fusionada con los patrones ondulados descritos anteriormente. El resultado se muestra en la Figura 5. La figura 5A recapitula los diferentes pasos necesarios para obtener las muestras. La Figura 5B presenta un patrón ondulado a bajo aumento, donde la periodicidad de las curvaturas negativas y positivas es claramente visible. Dos ondas sucesivas están indicadas por líneas continuas naranjas. Los defectos aproximadamente ortogonales a las ondas se indican con flechas blancas. La Figura 5C y la Figura 5D muestran la organización ultraestructural de los filamentos de septina a mayor aumento. Los septinos se ensamblaban en conjuntos de filamentos paralelos, cuya orientación dependía de la curvatura (ver filamentos resaltados en azul). De hecho, los filamentos de septina no estaban orientados al azar. En cambio, las septinas pueden doblarse al interactuar con curvaturas negativas (cóncavas) para seguir la curvatura impuesta. Por el contrario, en curvaturas positivas, los filamentos de septina permanecieron rectos, no doblados y alineados a lo largo de las ondas convexas. Por lo tanto, las septinas pueden interactuar con curvaturas positivas y negativas, pero adoptan organizaciones específicas en curvaturas dadas. Por lo tanto, esta metodología parece particularmente relevante para resaltar la sensibilidad a la curvatura de la unión y el autoensamblaje de proteínas filamentosas.

Figure 5
Figura 5: Disposición dependiente de la curvatura de los filamentos de septina. (A) Representación esquemática de los pasos necesarios para obtener las muestras "onduladas" destinadas a analizar la sensibilidad a la curvatura de septina a través de SEM. (B) Imagen SEM de bajo aumento de un patrón ondulado con filamentos de septina unidos que no se resuelven a esta resolución. Dos olas consecutivas se resaltan en naranja. Los defectos ortogonales se indican con flechas blancas. Barra de escala = 10 μm. (C) Imagen SEM con un aumento de 10.000x donde los filamentos de septina son visibles. Barra de escala = 1 μm. (D) Imagen SEM con un aumento de 20.000x. Algunos de los filamentos están resaltados en azul para mayor visibilidad. Barra de escala = 200 nm. Los objetos esféricos presentes en las imágenes son pequeñas vesículas que interactúan con las septinas y el sustrato. La concentración de septina se fijó en 200 nM en B-D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Como se indicó anteriormente, se ha utilizado una mezcla lipídica que mejora la incorporación de PI(4,5)P2 dentro de la bicapa lipídica y, por lo tanto, facilita las interacciones septina-membrana. De hecho, hemos demostrado en otra parte25 que las septinas de levadura en ciernes interactúan con las vesículas de una manera específica de PI(4,5)P2. Esta composición lipídica se ajustó empíricamente a partir del cribado de múltiples composiciones y ahora es ampliamente utilizada por los autores. Los lípidos PI(4,5)P2 deben manipularse con cuidado. Las soluciones madre deben ser alicitadas en pequeños volúmenes para que un vial específico no se abra más de dos veces para el pipeteo. Además, las alícuotas lipídicas deben almacenarse bajo argón para evitar la oxidación de lípidos. Finalmente, una vez que las mezclas lipídicas se solubilizan en una solución acuosa, la mezcla debe usarse de inmediato y no se puede almacenar para experimentos adicionales. En particular, después de la reconstitución de GUV o la fusión de bicapa lipídica soportada, la interacción entre septinas y lípidos se redujo en gran medida después de 2 h.

Algunos de los resultados obtenidos con complejos de septina de levadura en ciernes octoméricos (que contienen Cdc10, Cdc11, Cdc12 y Cdc3) se han presentado aquí; Sin embargo, los procedimientos experimentales seguidos para analizar el comportamiento de los complejos de septina de otras especies deben ser idénticos.

Para generar GUVs, preferimos el método de electro-formación usando alambres de platino sobre electro-formación en placas ITO o hinchazón de PVA. Como se demostró anteriormente25, este método produce de forma reproducible GUV unilamelares de buena calidad sin defectos.

Los sustratos ondulados se pueden diseñar con una amplia gama de curvaturas. Después de examinar varios diseños, se han utilizado consistentemente patrones con una periodicidad de 2 μm y una amplitud de 250 nm, que generan curvaturas que van desde -3.5 μm-1 a 3.5 μm-1 (± 0.5 mmm-1). Usando patrones con una periodicidad corta y mayor amplitud, las bicapas lipídicas no se ajustaron bien a la superficie. A menudo, en el caso de una curvatura más alta, la bicapa estaría suspendida entre dos ondas convexas en lugar de estar completamente apoyada en el sustrato de NOA. Con amplitudes más bajas y mayor periodicidad, los septinos se organizaron con orientaciones nemáticas aleatorias, lo que indica que los patrones eran demasiado planos. Además, el uso de patrones ondulados en lugar de tubos cilíndricos 20 o esferas20 tiene la ventaja de que las curvaturas positivas y negativas se pueden probar simultáneamente. En el futuro, examinar el comportamiento de los filamentos en curvaturas gaussianas "similares a sillas de montar" sería relevante para imitar la curvatura de contextos celulares más realistas.

En solución, la mezcla de LUVs con septinas indujo la generación de agregados septina-lípidos incluso a bajas concentraciones de proteínas y lípidos. Por lo tanto, las muestras eran heterogéneas, y es aconsejable buscar dominios de hielo más delgados donde se encuentren objetos de vesículas de septina más pequeños y definidos. Esto es particularmente crucial cuando se eligen áreas de interés donde se realizará la criotomografía. A menudo, incluso a bajas ampliaciones, las vesículas que muestran protuberancias de fuertes deformaciones, en comparación con las vesículas esféricas, tienen más probabilidades de tener una alta densidad de filamentos de septina unidos. Este protocolo se centra en obtener una descripción de la ultraestructura global de filamentos sobre membranas biomiméticas. Actualmente, se pueden alcanzar resoluciones más altas. La limitación de resolución se debe al número limitado de vistas disponibles por imágenes. Sin embargo, esto queda fuera del alcance de este protocolo.

Hemos demostrado a través de este protocolo que una combinación de métodos complementarios es esencial para comprender y diseccionar cómo la disposición específica de los filamentos de septina citoesquelética puede detectar y remodelar las membranas de una manera dependiente de la curvatura.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos a Patricia Bassereau y Daniel Lévy por sus útiles consejos y discusiones. Este trabajo contó con el apoyo de la ANR (Agence Nationale de la Recherche) para financiar el proyecto "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, y el proyecto "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin está financiado por la Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" y la Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa fue apoyado por la Universidad de la Sorbona (AAP Emergence). G.H. Koenderink recibió el apoyo de la Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) a través del 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'. Beca de gravitación (024.003.019). Agradecemos a Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) y Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Agradecemos al Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, miembro de la Infraestructura Nacional de Investigación de Francia-BioImaging (ANR10-INBS-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids 840035
Bath sonicator Elma Elmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramide invitrogen, Thermo Fischer scientific 11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol Sigma Aldrich
Confocal microscope nikon spinning disk or confocal
Critical point dryer Leica microsystems CPD300
Deionized water generator MilliQ F1CA38083B MilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051
Field Emission Gun SEM (FESEM) Carl Zeiss Gemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution Thermo Fischer scientific 50-262-19
High vacuum grease, Dow corning VWR
IMOD software https://bio3d.colorado.edu/imod/ software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids Eloise 01883-F
Lipids Avanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046
Metal evaporator Leica microsystems EM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 Norland Products NOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4% delta microscopies 19170
Osmometer Löser 15 M
Plasma cleaner Alcatel pascal 2005 SD
Plasma generator Electron Microscopy Science
Plunge freezing equipment leica microsystems EMGP
Transmission electron microscope Thermofischer Tecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetate Electron Microscopy Science 22451 this product is not available for purchase any longer
Wax plates, Vitrex VWR

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References

  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -H., Kuo, Y. -C., Chiang, H. -S., Kuo, P. -L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, Pt 1 79-89 (1998).

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Biología Número 186
Métodos in <em>vitro</em> ascendentes para evaluar la organización ultraestructural, la remodelación de la membrana y el comportamiento de sensibilidad a la curvatura de las septinas
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Chauvin, B., Nakazawa, K., Beber,… More

Chauvin, B., Nakazawa, K., Beber, A., Di Cicco, A., Hajj, B., Iv, F., Mavrakis, M., Koenderink, G. H., Cabral, J. T., Trichet, M., Mangenot, S., Bertin, A. Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins. J. Vis. Exp. (186), e63889, doi:10.3791/63889 (2022).

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