Summary
Septine sind Zytoskelettproteine. Sie interagieren mit Lipidmembranen und können Membrankrümmungen im Mikrometerbereich wahrnehmen, aber auch erzeugen. Wir beschreiben in diesem Protokoll Bottom-up-In-vitro-Methoden zur Analyse von Membranverformungen, krümmungsempfindlicher Septinbindung und Septinfilament-Ultrastruktur.
Abstract
Der Membranumbau findet ständig an der Plasmamembran und in zellulären Organellen statt. Um die Rolle der Umwelt (ionische Bedingungen, Protein- und Lipidzusammensetzungen, Membrankrümmung) und die verschiedenen Partner, die mit spezifischen Membranumformungsprozessen verbunden sind, vollständig zu analysieren, verfolgen wir In-vitro-Bottom-up-Ansätze. In den letzten Jahren gab es ein großes Interesse daran, die Rolle von Septinproteinen im Zusammenhang mit schweren Krankheiten aufzudecken. Septine sind essentielle und allgegenwärtige Zytoskelettproteine, die mit der Plasmamembran interagieren. Sie sind unter anderem an der Zellteilung, Zellmotilität, Neuromorphogenese und Spermiogenese beteiligt. Es ist daher wichtig zu verstehen, wie Septine an Membranen interagieren und sich organisieren, um anschließend Membranverformungen zu induzieren und wie sie empfindlich auf bestimmte Membrankrümmungen reagieren können. Dieser Artikel zielt darauf ab, das Zusammenspiel zwischen der Ultrastruktur von Septinen auf molekularer Ebene und dem Membranumbau im Mikrometerbereich zu entschlüsseln. Zu diesem Zweck wurden knospende Hefe und Säugetierseptinkomplexe rekombinant exprimiert und gereinigt. Eine Kombination von In-vitro-Assays wurde dann verwendet, um die Selbstorganisation von Septinen an der Membran zu analysieren. Unterstützte Lipiddoppelschichten (SLBs), riesige unilamellare Vesikel (GUVs), große unilamellare Vesikel (LUVs) und wellige Substrate wurden verwendet, um das Zusammenspiel zwischen Septin-Selbstorganisation, Membranumformung und Membrankrümmung zu untersuchen.
Introduction
Septine sind filamentbildende Proteine des Zytoskeletts, die mit Lipidmembranen interagieren. Septine sind in Eukaryoten allgegenwärtig und essentiell für zahlreiche zelluläre Funktionen. Sie wurden als die Hauptregulatoren der Zellteilung in knospender Hefe und Säugetieren identifiziert 1,2. Sie sind an Membranumformungsereignissen, Ziliogenese3 und Spermiogenese4 beteiligt. Innerhalb von Säugetierzellen können Septine auch mit Aktin und Mikrotubuli 5,6,7 in einem Bindemittel von Rho GTPasen (BORG)-abhängiger Weise interagieren 8. In verschiedenen Geweben (Neuronen9, Zilien3, Spermatozoen10) wurden Septine als Regulatoren von Diffusionsbarrieren für membrangebundene Komponentenidentifiziert 11. Es wurde auch gezeigt, dass Septine das Membranblasen und die Protrusionsbildung regulieren12. Septine sind als Multitasking-Proteine an der Entstehung verschiedener prävalenter Krankheiten beteiligt13. Ihre Fehlregulation ist mit dem Auftreten von Krebserkrankungen14 und neurodegenerativen Erkrankungen15 verbunden.
Je nach Organismus fügen sich mehrere Septin-Untereinheiten (zwei bei Caenorhabditis elegans bis 13 beim Menschen) zu Komplexen zusammen, deren Organisation gewebeabhängig variiert16. Der grundlegende Septin-Baustein besteht aus zwei bis vier Untereinheiten, die in zwei Kopien vorliegen und in einer stabartigen palindromischen Weise selbst zusammengesetzt sind. In knospender Hefe sind Septine oktamer17,18. In situ werden Septine oft an Stellen mit Mikrometerkrümmung lokalisiert; Man findet sie an Teilungsverengungsstellen, an der Basis von Zilien und Dendriten und am Ringring der Spermatozoen19,20. An der Membran scheint die Rolle der Septine dual zu sein: Sie sind an der Umformung der Lipiddoppelschicht und an der Aufrechterhaltung der Membranintegrität beteiligt21. Daher ist die Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften von Septinfilament-bildenden Proteinen und/oder Untereinheiten an der Membran entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle. Um spezifische Eigenschaften von Septinen in einer gut kontrollierten Umgebung zu analysieren, sind Bottom-up-In-vitro-Ansätze geeignet. Bisher haben nur wenige Gruppen die biophysikalischen Eigenschaften von Septinen in vitro20,22,23 beschrieben. Im Vergleich zu anderen Filamenten des Zytoskeletts bleibt das derzeitige Wissen über das Verhalten von Septinen in vitro daher begrenzt.
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Organisation von Septinfilamenten, die Membranumformung und die Krümmungsempfindlichkeit analysiert werden können19. Zu diesem Zweck wurde eine Kombination aus optischen und elektronenmikroskopischen Methoden (Fluoreszenzmikroskopie, Kryo-Elektronenmikroskopie [Kryo-EM] und Rasterelektronenmikroskopie [REM]) verwendet. Die Membranumformung von mikrometergroßen riesigen unilamellaren Vesikeln (GUVs) wird mittels Fluoreszenz-Lichtmikroskopie sichtbar gemacht. Die Analyse der Anordnung und Ultrastruktur von Septinfilamenten, die an Lipidvesikel gebunden sind, erfolgt mittels Kryo-EM. Die Analyse der Septinkrümmungsempfindlichkeit wird mit REM durchgeführt, indem das Verhalten von Septinfilamenten untersucht wird, die an feststoffgestützte Lipiddoppelschichten gebunden sind, die auf welligen Substraten mit variablen Krümmungen abgeschieden sind, was die Analyse der Krümmungsempfindlichkeit sowohl für positive als auch für negative Krümmungen ermöglicht. Im Vergleich zur vorherigen Analyse20,24 schlagen wir hier vor, eine Kombination von Methoden zu verwenden, um gründlich zu analysieren, wie Septine sich selbst organisieren, synergistisch die Membran verformen und krümmungsempfindlich sein können. Es wird angenommen, dass dieses Protokoll nützlich und anpassungsfähig an jedes filamentöse Protein ist, das eine Affinität für Membranen aufweist.
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Protocol
1. Bestimmung der Membranumformung mittels riesiger unilamellärer Vesikel (GUVs)
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden GUVs erzeugt, um die Membranverformungen nachzuahmen, die möglicherweise durch Septine in einem zellulären Kontext induziert werden. Tatsächlich werden Septine in Zellen häufig an Stellen mit Mikrometerkrümmungen gefunden. GUVs haben Größen von wenigen bis zu zehn Mikrometern und können verformt werden. Sie sind daher geeignet, septinininduzierte Verformungen im Mikrometerbereich zu untersuchen. Fluoreszierende Lipide sowie fluoreszenzmarkierte Septine (unter Verwendung von Green Fluorescent Protein [GFP]) werden verwendet, um das Verhalten von Lipiden und Proteinen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu verfolgen.
- Vorbereitung von Puffern und Lösungen
- Bereiten Sie den GUV-Wachstumspuffer (50 mM NaCl, 50 mM Saccharose und 10 mM Tris [pH = 7,8]) und den Beobachtungspuffer (75 mM NaCl und 10 mM Tris [pH = 7,8]) vor.
- Messung (mit einem handelsüblichen Osmometer) und Einstellung der Osmolarität der Beobachtungs- und Wachstumspuffer (170 mOsmol· L-1, theoretisch) durch Zugabe kleiner Mengen NaCl, bis ihre jeweiligen Osmolaritäten gleich sind. Filtern Sie die Puffer mit einem 0,2-μm-Filter. Aliquot den Wachstumspuffer und lagern Sie ihn bei -20 °C für die weitere Verwendung. Lagern Sie den Beobachtungspuffer bei 4 °C.
HINWEIS: Der Unterschied in der Osmolarität zwischen beiden Puffern sollte 5% nicht überschreiten. - Eine 5 mg·ml-1 β-Kaseinlösung wird im Beobachtungspuffer hergestellt. Für eine vollständige Auflösung sorgen (nach einigen Stunden bei 4 °C unter Magnetrühren). Die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter aliquot filtrieren und bei -20 °C lagern.
- Die Lipidgemische werden bei einer Gesamtlipidkonzentration von 3 mg·ml-1 in Chloroform hergestellt. Verwenden Sie eine Zusammensetzung (mol%) von 56,8% Ei L-α-Phosphatidylcholin (EggPC), 15% Cholesterin, 10% 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE), 10% 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin (DOPS), 8% Gehirn L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI(4,5)P 2) und0,2% Bodipy-TR-Ceramid, um die Protein-Lipid-Wechselwirkungen zu verstärken und den Einbau von PI(4,5)P2 25 zu begünstigen.
HINWEIS: Behandeln Sie Chloroform unter einem Abzug mit Nitrilhandschuhen und Schutzbrille. Pipetten Sie Chloroformlösungen mit Glasspritzen und vermeiden Sie Kunststoff, da Chloroform Kunststoff auflöst. Spülen Sie die Spritzen vor und nach dem Gebrauch aus, indem Sie Chloroform 5x-10x pipettieren. Verwenden Sie separate Spritzen, um spezifische fluoreszierende Lipide zu pipettieren, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Lipide können in Chloroform bei -20 °C in einem mit Teflon verschlossenen Braunglasfläschchen gelagert werden. Die Durchstechflaschen müssen vor dem Verschließen mit Argon gefüllt und mit Parafilm verschlossen werden, um eine Lipidoxidation zu verhindern. - Elektroformung von GUVs mit einem Platindrahtaufbau
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt das Schema der Versuchsschritte und ein Bild der Kammer.- Reinigen Sie die Kammer und die Platindrähte gründlich wie folgt, um eventuelle Lipidrückstände zu entfernen.
- Tauchen Sie die Drähte und die Kammer in Aceton und beschallen Sie für 10 min. Wischen Sie sie vorsichtig mit einem Papiertaschentuch mit Aceton ab.
- Montieren Sie die Kammer durch Einführen der Drähte, tauchen Sie erneut in Aceton und beschallen Sie sie für 10 Minuten. Wischen Sie noch einmal mit Aceton ab und stellen Sie sicher, dass die Drähte vollständig gereinigt sind. Tauchen Sie die Kammer in Ethanol, beschallen Sie sie für 10 Minuten und wischen Sie sie mit Ethanol ab.
- Zum Schluss tauchen Sie die Kammer in entionisiertes Wasser, beschallen Sie sie für 10 Minuten und trocknen Sie sie mit einem Strom von Stickstoff oder Luft.
HINWEIS: Die Teflonkammer (Abbildung 1B) wurde in der hauseigenen Werkstatt maßgefertigt. Es beherbergt drei Fächer, die beidseitig mit Glasdeckgläsern verschlossen werden können. Platindrähte können durch Löcher mit einem Durchmesser von 1,3 mm in die Kammer eingeführt werden. - Nach der Reinigung der Kammer 3-4 Tropfen pro Kompartiment (jeder Tropfen ist etwa 0,1 μL)) der 3 mg·mL-1 Lipidmischung auf jeden Platindraht geben. Drehen Sie die Drähte um 180° und legen Sie 3-4 Lipidtröpfchen pro Fach auf der gegenüberliegenden Seite jedes Platindrahtes ab. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen nicht miteinander in Kontakt kommen. Pro Ganzkammer werden etwa 5 μL der Lipidmischung benötigt.
- Stellen Sie die Wachstumskammer für 30 Minuten in eine Vakuumkammer, um Spuren von Chloroform zu entfernen.
HINWEIS: Tiefvakuum (0,1 mbar) ist am besten. Im getrockneten Zustand sind Lipide anfällig für Oxidation und sollten daher nicht länger als einige Minuten an der Luft belassen werden. - Legen Sie Hochvakuumfett am Boden der Kammer (der den Drähten am nächsten gelegenen Seite) entlang des Randes der drei Fächer mit einer Spritze ab und drücken Sie ein sauberes (22 mm x 40 mm) Deckglas gegen das Fett, um eine perfekte Abdichtung zu gewährleisten. Versiegeln Sie beide Enden der Kammer (d. h. an den Ein-/Austrittsstellen der Drähte) mit Dichtungspaste (Wachsplatten). Tragen Sie in ähnlicher Weise Vakuumfett auf der anderen Seite der Kammer auf.
- Füllen Sie die Fächer mit Wachstumspuffer (~ 1 ml pro Kammer) mit einer Pipette. Rühren Sie die Lösung nicht zu schnell oder stark, um ein Ablösen des Lipidfilms von den Drähten zu verhindern. Verschließen Sie die Oberseite der Kammer hermetisch mit einem 22 mm x 40 mm großen Deckglas, indem Sie es gegen das Fett drücken. Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, drücken Sie das Glasdeckglas vorsichtig von der Mitte bis zu den Rändern.
- Stellen Sie die Kammer in einen 4 °C heißen Kühlschrank und schließen Sie die Drähte an einen Wellenfunktionsgenerator (Sinusfunktion bei 500 Hz) an. Stellen Sie eine effektive Spannung von 350 mV für eine kürzere Wachstumsperiode (d.h. 6 h) oder 250 mV für eine längere Wachstumsperiode (d.h. 12-16 h) ein, wie bereits in einer Studie von Beber et al.25 vorgestellt und optimiert.
- Entfernen Sie die Deckgläser, wischen Sie das Dichtmittel und Fett ab und entfernen Sie die Drähte. Waschen und schrubben Sie die Kammer abwechselnd mit einem Papiertuch mit Wasser und Ethanol (≥70%).
HINWEIS: Die optimale Spannungs- und Zeitskala für das GUV-Wachstum hängt von vielen Parametern ab, von der Puffersalzkonzentration bis zur Kammergeometrie (d. H. Der Abstand zwischen den Drähten und die Kammergröße). Verwenden Sie bei jeder Wiederholung des Experiments dieselbe Kammer, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Die Drähte befinden sich in der Nähe des Kammerbodens, so dass die Lipide mit Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden können. Stellen Sie die Lipide bei jedem Schritt dar (siehe Abbildung 1C,D), um sicherzustellen, dass der Elektrobildungsprozess erfolgreich ist.
- Septininkubation mit den Vesikeln
- Sammeln Sie GUVs von den Drähten mit vorgeschnittenen Pipettenspitzen (~ 1 mm Öffnung), die in die Nähe der Drähte gebracht werden. Dann pipetten Sie die Lösung entlang des gesamten Drahtes. Dieses Verfahren verhindert die Erzeugung starker lamellärer Strömungen, die die GUVs stören könnten. Nach diesem Schritt ist das Schneiden von Pipettenspitzen nicht mehr erforderlich. Tatsächlich schädigen lamellare Strömungen GUVs in der Lösung nicht.
HINWEIS: Aufgrund des Vorhandenseins von PI(4,5)P2in der Lipidmischung müssen gesammelte GUVs vor dem Experiment nicht länger als 2-3 h gelagert werden. Tatsächlich wird PI(4,5)P2 schnell löslich und Septine binden einige Stunden nach ihrer Bildung nicht mehr an die Membranen. Sobald Septine jedoch an die Membran gebunden sind, bleiben sie für einige Tage gebunden. - Die Septin-Stammlösung wird ausschließlich in Tris 10 mM (pH 8) verdünnt, um eine Osmolarität zu erreichen, die der des Wachstumspuffers entspricht. Falls erforderlich, verdünnen Sie die Septinlösung weiter im Beobachtungspuffer. Fügen Sie das vorgesehene Volumen der gesammelten GUVs hinzu (50-100 μL für ein Gesamtvolumen von 200 μL). Führen Sie die Inkubation direkt in der Beobachtungskammer nach der Passivierung mit β-Casein durch (siehe unten). 20-30 min Wartezeit ist erforderlich, um das Gleichgewicht zu erreichen.
ANMERKUNG: Die Expression und Reinigung von septin-oktameren Komplexen (menschliche oder knospende Hefen) werden in anderen Artikelnausführlich beschrieben 17. Kurz gesagt, Septine wurden in Escherichia coli exprimiert, im Labor unter Verwendung von Affinitäts-, Größenausschluss- und Ionenaustauschchromatographieschritten gereinigt und bei -80 °C in einer wässrigen Lösung von 50 mM Tris-HCl (pH 8), 300 mM KCl und 5 mM MgCl2 bei ~ 1 mg·mL-1 (3 μM) Konzentration gelagert. Eine hohe Salzkonzentration wird verwendet, um eine Septinaggregation zu vermeiden. Septinkomplexe sollten nicht durch eine Filterzentrifugationsvorrichtung konzentriert werden, die eine Aggregation induziert und somit die Proteinausbeute reduziert.
- Sammeln Sie GUVs von den Drähten mit vorgeschnittenen Pipettenspitzen (~ 1 mm Öffnung), die in die Nähe der Drähte gebracht werden. Dann pipetten Sie die Lösung entlang des gesamten Drahtes. Dieses Verfahren verhindert die Erzeugung starker lamellärer Strömungen, die die GUVs stören könnten. Nach diesem Schritt ist das Schneiden von Pipettenspitzen nicht mehr erforderlich. Tatsächlich schädigen lamellare Strömungen GUVs in der Lösung nicht.
- Bildgebung mit konfokalem und/oder rotierendem Scheibenmikroskop
- Um zu verhindern, dass die GUVs an der Oberfläche haften und/oder explodieren, passivieren Sie die Beobachtungskammer, indem Sie sie 30 min lang mit einer 5 mg·ml-1 β-Kaseinlösung inkubieren.
- Die β-Kaseinlösung wird entfernt und die Septin-GUV-Lösung (Schritt 1.4.2.) mit einer Pipette in die Beobachtungskammer überführt. Lassen Sie die GUVs für 10-15 min auf den Boden der Kammer sedimentieren.
HINWEIS: Die Abweichung bei der Zusammensetzung zwischen dem Inneren des GUV und dem externen Puffer führt zu einer Dichte- und Brechungsindex-Fehlanpassung. Aufgrund der Brechungsindexfehlanpassung sind die GUVs mit Transmissionslichtmikroskopie sichtbar. - Visualisieren Sie mit konfokaler Mikroskopie das Fluoreszenzsignal der Lipide, um die Qualität der GUVs und den Lamellaritätszustand der Membran zu überprüfen. Beurteilen Sie die Dichte von Septinen, die an GUVs gebunden sind, indem das Fluoreszenzsignal der Septine nach einer ordnungsgemäßen Kalibrierung aufgezeichnetwird 25. Führen Sie Z-Stack-Erfassungen in einem räumlichen Intervall von 0,4 μm durch, um die 3D-Verformungen der Vesikel zu analysieren und zu visualisieren, die durch die Wechselwirkung zwischen den Septinen und der Membran induziert werden.
HINWEIS: Es wurden Ölimmersionsobjektive mit 60- oder 100-facher Vergrößerung verwendet. Es wurden Standard-Konfokal- oder Spinning-Disk-Mikroskope (Table of Materials) mit Pixelgrößen von 250 nm bzw. 110 nm verwendet. Man muss die Bildgebungsbedingungen an ein bestimmtes Gerät anpassen. Der Lösung wurden keine spezifischen Anti-Photo-Bleichmittel zugesetzt.
Abbildung 1: Elektrobildung von GUVs . (A) Schematische Darstellung des Elektrobildungsprozesses mit Platindrähten. (B) Bild des selbstgebauten Teflongeräts, das mit Platindrähten bestückt ist, die zur Erzeugung von GUVs durch Elektrobildung verwendet werden. Die Drähte haben einen Durchmesser von 0,5 mm und einen Abstand von 3 mm. (C) GUVs (sphärische Objekte), die durch transmissionsoptische Mikroskopie während des Wachstumsprozesses beobachtet werden. Die undurchsichtige Zone am unteren Bildrand ist der Platindraht. (D) GUVs (runde fluoreszierende Objekte), die mit Fluoreszenzmikroskopie während des Wachstums auf dem Platindraht beobachtet wurden. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
2. Analyse der ultrastrukturellen Organisation von Septinfilamenten mittels Kryo-Elektronenmikroskopie
HINWEIS: Vesikel sind nicht für die Bildgebung mit Standard-Elektronenmikroskopie-Methoden geeignet. Tatsächlich werden die Proben mit Standard-Negativfärbemethoden getrocknet. Bei Dehydratation erleiden Vesikel wahrscheinlich unspezifische Verformungen, die häufig zu Lipidvorsprüngen führen. Die Kryo-Elektronenmikroskopie ist daher eine viel bessere Strategie, um spezifische Verformungen von Vesikeln zu beobachten. Bei Verwendung von Kryo-EM werden die Proben in eine dünne (~100-200 nm) Schicht aus verglastem Eis eingebettet, wodurch die Proben nahe dem ursprünglichen Zustand erhalten bleiben. GUVs sind jedoch zu groß (mehrere zehn Mikrometer), um in dünnes Eis eingebettet und somit durch Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet zu werden. Daher werden große unilamellare Vesikel (LUVs) erzeugt, deren Durchmesser von ~50-500 nm reichen, um zu bestimmen, wie Septine Vesikel verformen können und wie sie sich auf Vesikeln anordnen.
- Erzeugung großer unilamellärer Vesikel (LUVs)
- Bereiten Sie 50 μg Lipidmischung in Chloroform mit einer molaren Zusammensetzung von 57% EggPC, 15% Cholesterin, 10% DOPE, 10% DOPS und 8% Gehirn PI(4,5)P2) her, die optimiert ist, um die Septin-Interaktion mit der Membran in einer Glasdurchstechflasche zu verbessern.
- Trocknen Sie die Lösung unter Argonfluss, um einen getrockneten Lipidfilm in der Durchstechflasche zu erzeugen. Stellen Sie die Durchstechflasche 30 Minuten lang unter Vakuum, um das Lipid vollständig zu trocknen.
- Der Lipidfilm wird in 50 μL wässriger Lösung (50 mM Tris-HCl [pH 8]; 50 mM KCl; 2 mMMgCl2) resolubilisiert, um eine Endkonzentration von 1 mg·mL-1, Wirbel für 10 s zu erhalten, und die Lösung in ein Röhrchen überführt.
HINWEIS: LUVs müssen sofort für die Inkubation mit Septinen verwendet werden. Andernfalls ist die Protein-Lipid-Interaktion aufgrund der PI(4,5)P2-Solubilisierung schwach. Dieser rohe Re-Solubilisierungsprozess erzeugt eine heterogene Population von Vesikeln mit Durchmessern von 50 nm bis 500 nm. Daher werden eine ganze Reihe von Durchmessern und damit Krümmungen gleichzeitig untersucht.
- Die Septine werden mit den solubilisierten Lipiden bei Endlipid- und Septinkonzentrationen von 0,1 mg·mL-1 (ca. 300 nM) bzw. 20 nM in einem salzreichen Puffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2) inkubiert. Die Probe 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Tauchgefrieren zur Vitrifizierung der Probe
- Glimmentladung löchrige Kohlenstoffgitter (300 mesh) auf der Kohlenstoffseite für 30 s bei 5 mA mit Plasmageneratorausrüstung und setzen Sie das Gitter in eine Tauchgefriermaschine in einer feuchten Umgebung ein.
- Adsorbieren Sie 4 μL der Probe (Schritt 2.2.) auf der glühenden Kohlenstoffseite des Gitters. Unmittelbar vor der Probenadsorption 5-10 nm Goldperlen in die Lösung geben, falls die Proben verwendet werden, um geneigte Serien durch Kryotomographie zu erzeugen.
HINWEIS: Die Dichte von Goldperlen muss gescreent und empirisch angepasst werden und ist abhängig vom Anbieter. Die optimierte Dichte beträgt 10-15 Goldperlen im Sichtfeld. - Tupfen Sie die Proben von der nackten Seite ab, um den Probentropfen auf der gegenüberliegenden Seite abzusaugen.
HINWEIS: Die Löschzeit beträgt typischerweise 4 s, und die Position des Filterpapiers und die Löschkraft werden empirisch angepasst, indem alternative Positionen des Filterpapiers getestet und gesiebt werden, um die Eisqualität (Dicke) und die Materialdichte zu optimieren. - Übertragen Sie die Gitter in ein Mikroskop oder lagern Sie sie in einem Flüssigstickstoffbehälter.
HINWEIS: Die Verwendung löchriger Kohlenstoffgitter ist unerlässlich, um die Polydispersität in der Größe der Vesikel zu berücksichtigen. Das Ablöschen der Probe von der gegenüberliegenden Seite begünstigt eine verbesserte Adsorption des biologischen Materials auf dem Gitter.
- Kryo-Elektronenmikroskopische Bildgebung
- Führen Sie die Gitter in ein Elektronenmikroskop (EM) ein, das für die Kryo-EM-Beobachtung ausgestattet ist. Screenen Sie das gesamte Raster, indem Sie eine Karte der gesamten Probe bei geringer Vergrößerung (normalerweise bei 120-facher Vergrößerung) erstellen, um Bereiche auszuwählen, die besseres Eis aufweisen (d. H. Dünn und gut verglast).
- Für die Kryo-EM-2D-Datenerfassung sammeln Sie Bilder mit einer Pixelgröße von etwa 2 Å pro Pixel, um die Qualität der Probe zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Septinfilamente als auch die Lipiddoppelschicht sichtbar sind.
- Wählen Sie für die Kryo-Elektronentomographie-Datenerfassung Interessengebiete mit deformierten Vesikeln aus. Stellen Sie sicher, dass genügend Goldperlen (mindestens 10) im Sichtfeld vorhanden sind.
- Je nach Software, die für die Datenerfassung von geneigten Serien verwendet wird, wählen Sie Fokus- und Tracking-Positionen, um weit genug vom interessierenden Bereich entfernt zu sein. Sammeln Sie geneigte Serien, indem Sie den Neigungswinkel von -60° bis +60° variieren und alle 2°-3° Grad ein Bild aufnehmen.
HINWEIS: Die Gesamtdosis sollte etwa oder weniger als 100 Elektronen/Å2 betragen. Die Pixelgröße variiert von 1,3 Å bis 2,1 Å, abhängig vom Mikroskop, das für die Datenerfassung verwendet wird. Idealerweise wird ein winkelsymmetrisches Schema für die Datenerhebung wie folgt bevorzugt: 0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°. Goniometer von Seiteneintrittsmikroskopen bieten jedoch nicht genügend mechanische Stabilität, um diese symmetrischen Schemata zu erreichen. Alternativ kann die Erfassung bei 0° bis 34° gestartet werden, gefolgt von einer zweiten Winkelsequenz von -2° bis -60° und einer abschließenden Sequenz von 36° bis 60°. Der Zweck besteht darin, die ersten Bilder (mit den geringsten Strahlungsschäden) in den niedrigsten Winkeln zu sammeln. Darüber hinaus kann zur Visualisierung der Ultrastruktur von Vesikeln und gebundenen Septinfilamenten ein Standard-Kryo-EM-Mikroskop verwendet werden (200 kV, Lanthanhexaborid (LaB6) -Filament und Probenseiteneintritt). Wenn man jedoch eine weitere Bildverarbeitung (z. B. Sub-Tomogramm-Mittelwertbildung) anstrebt, ist es am besten, FEG-Mikroskope der neuesten Generation zu verwenden, die mit direkten Detektoren ausgestattet sind. In diesem Protokoll beschränken wir unsere Beschreibung auf die Erfassung von 3D-Rekonstruktionen und lassen die Sub-Tomogramm-Mittelwertbildung weg.
- 3D-Rekonstruktion aus Kryotomographie und Segmentierung
- Verwenden Sie die IMOD-Softwaresuite (Table of Materials) für die geneigte Serienbildausrichtung und 3D-Rekonstruktion26,27. Führen Sie innerhalb von IMOD eine Ausrichtung der Neigungsreihe basierend auf der Positionierung von Treuhandblättern (Goldperlen) durch. Darüber hinaus können Sie bei Bedarf die Bestimmung und Korrektur der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) innerhalb von IMOD26 durchführen. Erreichen Sie schließlich eine 3D-Rekonstruktion mit IMOD, indem Sie jeden Schritt rigoros befolgen.
- Segmentieren Sie die Lipiddoppelschichten und Septinfilamente manuell mit 3Dmod27 aus der IMOD-Softwaresuite zur Anzeige.
3. Analyse der Krümmungsempfindlichkeit von Septin mittels REM
HINWEIS: Um zu verstehen, wie Septine empfindlich auf Mikrometerkrümmungen reagieren können, wurde ein In-vitro-Ansatz verwendet, um Septinfilamentkomplexe mit feststoffgestützten Lipiddoppelschichten zu inkubieren, die auf wellenförmigen Wellenmustern im Mikrometerbereich abgeschieden sind.
- Entwicklung einer wellenförmigen NOA-Replik (Norland Optical Adhesive) aus welligen Polydimethylsiloxan-Mustern (PDMS)
- Verwenden Sie PDMS-Wellenmuster mit einer Amplitude von 250 nm und einer lateralen Periodizität von 2 μm oder anderen Dimensionen, um die Krümmungen zu bestimmen, die für das interessierende Protein geeignet sind.
HINWEIS: PDMS-Wellenmuster werden wie in Nania et al.28,29 beschrieben entworfen und erzeugt. - In einer Reinraumumgebung 5 μL flüssiges NOA auf ein kreisförmiges Glasdeckglas von 1 cm Durchmesser geben und die PDMS-Schablone auf den Tropfen legen. Mit UV-Licht (320 nm) 5 min behandeln, um die flüssige NOA zu einem dünnen Polymerfilm zu photopolymerisieren. Anschließend die PDMS-Schablone vorsichtig vom Deckglas mit dem frisch polymerisierten NOA abziehen.
HINWEIS: NOA ist ein gängiger optisch transparenter Klebstoff, der für die optische Mikroskopie-Bildgebung geeignet ist. Darüber hinaus ist NOA beständig gegen die chemischen Fixierungs- und Färbeprozesse, die vor der REM-Bildgebung durchgeführt werden. Sowohl NOA 71 als auch NOA 81 Harze können mit ähnlichen Ergebnissen verwendet werden. Das ursprüngliche PDMS-Muster konnte mehrmals verwendet werden, um NOA-Replikate zu erstellen. Die erhaltenen NOA-Repliken können monatelang bei Raumtemperatur in einer Box aufbewahrt werden.
- Verwenden Sie PDMS-Wellenmuster mit einer Amplitude von 250 nm und einer lateralen Periodizität von 2 μm oder anderen Dimensionen, um die Krümmungen zu bestimmen, die für das interessierende Protein geeignet sind.
- Erzeugung einer unterstützten Lipiddoppelschicht und Proteininkubation
- Behandeln Sie die NOA-Folien mit einem Luftplasmareiniger für 5 Minuten, um die Oberfläche hydrophil zu machen.
- Bereiten Sie eine Lösung aus kleinen unilamellären Vesikeln (SUVs) mit einer molaren Zusammensetzung von 57% EggPC, 15% Cholesterin, 10% DOPE, 10% DOPS und 8% Gehirn PI(4,5)P2 bei einer Gesamtlipidkonzentration von 1 mg·ml-1 vor. Bereiten Sie die SUVs vor, indem Sie einen getrockneten Lipidfilm im Beobachtungspuffer resuspendieren, wie in Schritt 2.1.3 beschrieben. Beschallen Sie die Lösung vorsichtig mit einem Badsonikator für 5-10 Minuten, bis die Lösung transparent ist.
HINWEIS: Die Lösung von SUVs kann mehrere Wochen tiefgefroren bei -20 °C gelagert werden. - Legen Sie die Deckgläser, die die NOA-Muster tragen, in die Vertiefungen der Zellkulturboxen ein. 100 μL 1 mg·ml-1 SUV-Lösung auf die frisch glühenden NOA-Muster geben (Schritt 3.2.1.) und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Dieser Schritt induziert die Verschmelzung von SUVs mit der Oberfläche des NOA-Musters, um eine unterstützte Lipiddoppelschicht zu erzeugen.
- Spülen Sie die Objektträger 6x gründlich mit dem Septinpuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) aus, um den nicht verschmolzenen SUV zu entfernen. Lassen Sie die Probe nach jeder Spülung niemals vollständig trocknen.
- Die oktamere Septin-Stammlösung in Septin-Hochsalzpuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl 2) wird unter Verwendung von Septinpuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) auf Endkonzentrationen im Bereich von 10 nM bis 100 nM und Volumina von 1 ml verdünnt. Inkubieren Sie die Proteinlösung auf den Objektträgern für ~1 h bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Das Volumen ist groß genug, so dass die Verdunstung kein Problem darstellt.
- Probenvorbereitung für die REM-Analyse
HINWEIS: In der Elektronenmikroskopie wurden verschiedene Protokolle entwickelt, um Proteinstrukturen und deren Aufbau zu analysieren. Das aktuelle Protokoll bewahrt die Organisation von Septinfilamenten unter Verwendung eines Fixierungsprotokolls, das von Svitkina et al. abgeleitet ist.30 Das ist einfach umzusetzen. Außerdem optimiert dieses Protokoll hochauflösende REM-Beobachtungen.- Herstellung von Reagenzien und Stammlösungen
HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert mehrere Reagenzien und Lösungen, die im Voraus oder kurz vor der Inkubation hergestellt werden können. Befolgen Sie die bereitgestellten Anweisungen, um Artefakte oder mangelnde chemische Reaktivität zu vermeiden.- Natriumcacodylat 0,2 M Stammlösung: Um diese doppelt starke Lösung herzustellen, lösen Sie 2,14 g Natriumcacodylatpulver in ~ 40 mL destilliertem Wasser unter Magnetrühren. Nach vollständiger Auflösung stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie vorsichtig 0,1 M HCl (~ 1 ml für 50 ml Lösung) hinzufügen und das endgültige Volumen mit destilliertem Wasser auffüllen. Diese Lösung kann für 24-48 h bei 4°C gelagert werden.
- 2% Glutaraldehyd (GA) in 0,1 M Natriumcacodylat (Fixierlösung): Bereiten Sie diese Lösung direkt vor Gebrauch vor, indem Sie hochreine EM-Qualität GA mit 0,2 M Natriumcacodylatlösung verdünnen (siehe oben). Verwenden Sie eine kommerzielle GA-Lagerlösung mit 25 % bis 50 % aufgrund ihrer optimierten Speicherkapazität bei 4 °C. Zur Herstellung von 10 ml Fixierlösung werden 0,8 ml 25% handelsübliche GA-Lösung mit 4,2 ml destilliertem Wasser und 5 ml 0,2 ml Natriumcacodylat verdünnt.
- 1% Osmiumtetroxid (OsO4) in 0,1 M Natriumcacodylat: Diese zweite Fixierlösung wird unmittelbar vor Gebrauch hergestellt, indem Sie die handelsübliche 4%igeOsO4-Stammlösung mit 0,2 M Natriumcacodylat verdünnen (siehe oben). Für 4 ml OsO4-Fixierlösung wird 1 ml 4%ige handelsüblicheOsO4-Lösung mit 1 ml destilliertem Wasser und 2 ml 0,2 ml Natriumcacodylat verdünnt.
HINWEIS: Verwenden Sie handelsübliche 4% OsO4-Stammlösung in spaltbaren Glaskolben aufgrund ihrer Lager- und Handhabungseigenschaften. Beachten Sie, dass OsO4 sehr reaktiv ist. Stellen Sie sicher, dass seine Farbe leicht gelb und nicht dunkel ist. - 1% Gerbsäure (TA) in Wasser: Bereiten Sie diese Lösung direkt vor Gebrauch vor. Die TA-Lösung wird so hergestellt, dass eine Endkonzentration von 1% TA in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur erhalten wird. Lösen Sie 10 mg in 1 ml destilliertem Wasser auf und wirbeln Sie für einige Minuten. TA-Lösung kann nicht gelagert werden und muss vor Gebrauch mit einem 0,2-μm-Filter filtriert werden.
- 1% Uranylacetat (UA) Lösung in Wasser Bereiten Sie die UA-Lösung vor, um eine Endkonzentration von 1% UA in destilliertem Wasser zu erhalten. 10 mg in 1 ml destilliertem Wasser und Wirbel für mindestens 30 min bis 1 h durch Wirbeln oder Schütteln bei Raumtemperatur auflösen. Diese Lösung kann 1 Monat bei 4 °C gelagert werden, kann aber leicht ausfallen und muss daher vor Gebrauch mit einem 0,2 μm Filter filtriert werden.
- Sortierte Serie von Ethanollösungen Bereiten Sie 50%, 70%, 95% und 100% Ethanollösungen in Wasser vor. Bereiten Sie das Abschlussbad aus neu geöffneten Flaschen mit 100% Ethanol oder aus 100% Ethanol, das mindestens 24 h lang dehydriert wurde, mit Molekularsieben (nominaler Porendurchmesser = 4 Å) vor, um alle Wasserspuren aus den Proben zu entfernen, die das Trocknen und die Beschichtung beeinträchtigen könnten. Achten Sie darauf, diese Lösung nicht zu schütteln, da dies zu einer Resuspension von Silikatpartikeln führen kann.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit den in diesem Protokoll verwendeten chemischen Reagenzien. Glutaraldehyd, Osmiumtetroxid, Natriumcacodylat und Uranylacetat sind alle hochgiftig, Uranylacetat ist ebenfalls radioaktiv. Alle Manipulationen der Reagenzien und ihrer Abfälle müssen mit individuellem (Handschuhe, Laborkittel, Schutzbrille) und kollektivem Schutz (Abzüge und Plexiglasschirme) gemäß den laborspezifischen Verfahren erfolgen.
- Probenfixierung
- Waschen Sie die Proben (d. h. NOA-Objektträger mit fusionierten Lipiddoppelschichten und inkubiertem Protein) mit PBS. PBS wird durch die bei 37 °C vorgewärmte GA-Fixierlösung ersetzt und 15 min lang reagiert. Die Proben können dann bei 4 °C gelagert werden.
- Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die fixierten Proben 3x mit 0,1 M Natriumcacodylat (5 min pro Waschgang) unter leichtem Schütteln.
- Inkubieren Sie die Proben in der OsO4 Fixierlösung für 10 min mit maximalem Lichtschutz, um die Fixierung von Membranstrukturen zu ermöglichen und die elektrische Leitfähigkeit der Proben zu erhöhen. Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Proben 3x in destilliertem Wasser (5 min pro Waschgang) unter leichtem Schütteln.
- Inkubieren Sie die gewaschenen Proben in der gefilterten TA-Fixierlösung für maximal 10 min. Entfernen Sie die TA-Lösung und waschen Sie die Proben 3x in destilliertem Wasser (5 min pro Waschgang) unter leichtem Schütteln.
- Inkubieren Sie die gewaschenen Proben in einer frisch filtrierten UA-Fixierlösung für 10 min mit maximalem Lichtschutz. Entfernen Sie die UA-Lösung und waschen Sie die Proben 3x in destilliertem Wasser (5 min pro Waschgang) unter leichtem Schütteln.
- Probentrocknung und Trocknung kritischer Punkte
HINWEIS: Eine Lufttrocknung ist nicht zulässig, um eine Beschädigung der Proben durch unerwünschte Oberflächenspannungen beim Wechsel vom flüssigen in den gasförmigen Zustand zu vermeiden. In EM haben sich zwei Methoden etabliert: die physikalische Methode, den überkritischen Zustand von CO2 zu erreichen und seinen kritischen Punkt (31 °C, 74 bar) zu umgehen, oder die chemische Methode zur Verdampfung von Hexamethyldisilazan (HMDS), einem Trocknungsmittel mit reduzierter Oberflächenspannung. CO2 und HMDS sind schlecht mit Wasser mischbar. Folglich müssen alle Wasserspuren durch ein Übergangslösungsmittel (Ethanol) ersetzt werden, um spätere Schäden während des Trocknungsprozesses zu vermeiden.- Inkubieren Sie die Proben für 2-3 min in jeder Ethanollösung, beginnend mit 50% bis 100% (wasserfreiem) Ethanolbad.
HINWEIS: Da die Verdampfung von Ethanol zwischen den Bädern schnell ist, muss auch die Probenhandhabung schnell sein, um eine Lufttrocknung zu vermeiden. - Legen Sie die Glasobjektträger in den mit Ethanol vorgefüllten kritischen Punkttrockner und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurde ein automatisches Gerät verwendet, aber jedes System kann verwendet werden. Die Protokolle können für jedes Gerät unterschiedlich sein, müssen jedoch optimiert werden, um Ethanol vollständig zu entfernen (25 Bäder in diesem Protokoll) und die Geschwindigkeiten für den verschiedenen Lösungsmittelaustausch (CO 2 Einlässe und Ethanol / CO2 Ausgänge) und die endgültige Druckentlastung (fast 1 h in diesem Protokoll) zu reduzieren. - Am Ende des kritischen Punktes Trocknung lagern Sie die Proben sofort in einem Exsikkator, bis sie montiert und beschichtet sind. Da getrocknete Proben sehr hygroskopisch sind, beschichten Sie sie (siehe unten) so schnell wie möglich.
HINWEIS: Alternativ kann HMDS eine billigere und schnellere Methode anbieten. Obwohl HDMS noch nie an unseren Proben getestet wurde, lieferte dieser Ansatz gute Ergebnisse für die Beobachtung von Proteinen an der Innenseite von Zellmembranen31,32.
- Inkubieren Sie die Proben für 2-3 min in jeder Ethanollösung, beginnend mit 50% bis 100% (wasserfreiem) Ethanolbad.
- Probenmontage und Beschichtung.
HINWEIS: Da biologische Proben schlechte elektrische Leitfähigkeitseigenschaften aufweisen, müssen sie vor der REM-Beobachtung mit einem leitfähigen Metallfilm beschichtet werden. Daher kommt das Plasma-Magnetron-Sputtern zum Einsatz.- Befestigen Sie das Deckglas an Stubs, die für zukünftige SEM-Beobachtungen verwendet werden. Verwenden Sie Silberfarbe wegen ihrer verbesserten elektrischen Leitfähigkeit im Vergleich zu Kohlenstoffscheiben. Fügen Sie einen Silberstreifen auf die Oberseite des Deckglases und stellen Sie sicher, dass die Verbindung mit dem Stummel zufriedenstellend ist. Vermeiden Sie Farbagglomerate.
HINWEIS: Der silberne Farbstreifen muss dünn sein, um jeglichen Kontakt zwischen der Probe und der Objektivlinse des REM zu vermeiden, wenn mit hoher Auflösung (d. h. geringer Arbeitsabstand) gearbeitet wird. - Warten Sie, bis das Lösungsmittel vollständig verdampft ist.
HINWEIS: Die Dauer dieses Schritts kann je nach Menge und Dicke der Silberlackablagerung variieren. Dieser Schritt kann durch die Verwendung eines Glockenglases oder des Beschichters und eines Primärvakuums für 10-30 min verkürzt werden. - Verwenden Sie ein Gerät, das mit einem Plasma-Magnetron-Sputterkopf und einem rotierend-planetaren Tisch ausgestattet ist, und befolgen Sie die vom Hersteller bereitgestellten Standardprotokolle. Hier wurde die Apparatur auf 2,5 x 10-5 mbar evakuiert, 1x mit hochwertigem Argon gespült und anschließend auf 8,0 x 10-3 mbar eingestellt.
- Führen Sie ein Vorsputtern durch (120 mA für 60 s), um die Oxidschicht an der Oberfläche zu entfernen. Anschließend werden 1,5 nm Wolfram (90 mA, Arbeitsabstand = 50 mm) mit Hilfe eines Schichtdickenmonitors abgeschieden.
HINWEIS: Der Beschichter muss perfekt gereinigt werden, um die Reproduzierbarkeit der Filmverdampfung zu gewährleisten. Die Beschichtung muss gestoppt werden, sobald die angestrebte Dicke erreicht ist. Die endgültige Schichtdicke wird berechnet und anschließend korrigiert. Filme von etwa 1,5 nm haben mit unserer Apparatur durchschnittlich eine Nachkorrektur von 0,7 nm. Da diese Korrekturwerte nahe am Ziel liegen, wird eine Reihe von Beschichtungen durchgeführt, um diese Korrektur zu bewerten und dann vom Zielwert abzuziehen. - Lagern Sie die Proben unter Vakuum, um sie vor der Umgebungsluft zu schützen, bis und während aller REM-Analysen.
HINWEIS: Die Art des Metalls, das zum Sputtern verwendet wird. Obwohl Pt ein gängiges Material ist, führt es zu einer minderwertigen Beschichtung mit einer Pt-Schichtdicke, die an Septinfilamente (1,5 nm) angepasst ist. Bei hohen Auflösungen fehlt einem 1,5-nm-Pt-Film die Kohäsivität; Die Größe der Pt-Cluster und der Septinfilamente wird dadurch ähnlich, was zu Fehlinterpretationen während des Filamentsegmentierungsprozesses33 führt (siehe Abbildung 2A, Einschub). Wolfram ist eine gute Alternative zu Pt, da es eine kleinere Korngröße aufweist, die bei hochauflösendem REM kaum sichtbar ist (siehe Abbildung 2B, Einschub). Dennoch wird reines Wolfram leicht oxidiert, was zu starken Ladeeffektartefakten während der REM-Beobachtung führt, wenn das in Schritt 3.3.4 beschriebene Verfahren beschrieben wird. wird nicht strikt befolgt.
- Befestigen Sie das Deckglas an Stubs, die für zukünftige SEM-Beobachtungen verwendet werden. Verwenden Sie Silberfarbe wegen ihrer verbesserten elektrischen Leitfähigkeit im Vergleich zu Kohlenstoffscheiben. Fügen Sie einen Silberstreifen auf die Oberseite des Deckglases und stellen Sie sicher, dass die Verbindung mit dem Stummel zufriedenstellend ist. Vermeiden Sie Farbagglomerate.
- Herstellung von Reagenzien und Stammlösungen
- Nehmen Sie die Bilder mit einem Feldemissions-REM-Mikroskop (FESEM) auf.
HINWEIS: REM-Technologien wurden kürzlich aktualisiert, um die Auflösung zu verbessern, und die Technologien hängen vom Hersteller ab (z. B. Elektronenoptik, Strahlverzögerung, magnetische Linse). Dieser Auflösungsgewinn (bei mehreren Herstellern zugänglich), insbesondere bei einer niedrigen Beschleunigungsspannung (nahe dem Nanometer bei 1 kV), ist notwendig, um nanometrische Strukturen ähnlich wie Septinnetzwerke aufzulösen.- Erzielen Sie eine hochauflösende Bildgebung durch die Detektion von primären Sekundärelektronen (SE1) mit dem "In-Lens"-Detektor mit den folgenden Einstellungen.
- Stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 3 kV ein. Fixieren Sie den Strahlstrom mit der 20 μm Apertur (für Zeiss Gemini I Säulen oder entspricht 34 pA) oder mit der 15 μm Apertur (für Zeiss Gemini I Säulen oder äquivalent 18,5 pA), wenn die Unterdrückung von Ladeeffekten erforderlich ist.
- Verwenden Sie für Beobachtungen Auflösungen von 21,25 nm/Pixel bis 1,224 nm/Pixel und für die Datenanalyse eine Auflösung von ~5,58 nm/Pixel (20.000-fache Vergrößerung gemäß Polaroid 545-Referenz).
- Stellen Sie den Arbeitsabstand zwischen 1 mm und 2 mm für hochauflösende Beobachtungen und etwa 3 mm ein, wenn eine erhöhte Schärfentiefe erforderlich ist. Passen Sie die Scangeschwindigkeit und die Zeilenintegration kontinuierlich an, um ein konstantes Signal-Rausch-Verhältnis mit einer Aufnahmezeit von ca. 30-45 s pro Bild zu gewährleisten.
Abbildung 2: Wirkung des auf Septinfilamenten abgeschiedenen Materials auf wellige PDMS-Muster. REM von Septinfilamenten, die durch Sputtern entweder mit (A) 1,5 nm Platin beschichtet sind und das Muster des "trockenen rissigen Bodens" aufweisen, das typisch für einen Mangel an Kohäsivität zwischen den Clustern von Platinkernen ist, oder (B) 1,5 nm Wolfram, das mit einer glatten und kohäsiven Schicht bedeckt ist. Maßstabsbalken = 200 nm. Weiße quadratische Kästchen stellen die vergrößerten Ansichten unten rechts dar. Die kugelförmigen Kügelchen sind kleine Lipidvesikeln, die mit den Septinen interagieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Representative Results
GUVs-Verformungen
Typische konfokale Fluoreszenzbilder von GUVs, die nach der Inkubation mit Septinen umgeformt wurden, sind in Abbildung 3 unter Bedingungen dargestellt, unter denen Septine polymerisieren. Blanke GUVs (Abbildung 3A) waren perfekt kugelförmig. Bei der Inkubation mit mehr als 50 nM knospenden Hefeseptinfilamenten erschienen die Vesikel deformiert. Bis zu einer Konzentration von 100 nM knospenden Hefeseptin-Oktameren erschienen die Vesikel facettiert, und die Verformungen blieben statisch und schwankten daher nicht (Abbildung 3B). Oberhalb von 200 nM knospenden Hefeseptinen, bei denen die Membran mit Septinen gesättigt war, wurden periodische Verformungen beobachtet (Abbildung 3C). Mit knospenden Hefeseptinen wurden Spikes mit einer Periodizität von 2 μm bis 6 μm und einer Amplitude von etwa 1 μm visualisiert. Daher formen Septine Membranen auf spezifische Weise stark um. Diese Amplituden und die damit verbundenen Krümmungen der beobachteten Deformationen spiegeln auffallend die Affinität von Septinen zu Mikrometerkrümmungen wider, die in Zellen beobachtet werden. GUVs, die verformbar sind, eignen sich daher, um zu untersuchen, wie Proteine Membranen umformen.
Abbildung 3: Septin-induzierte Verformung von GUVs. (A) Äquatoriale Ebene der Kontroll-GUVs, markiert mit 0,5% Rhodamin-PE und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Maßstabsbalken = 3 μm. (B) GFP-Septine (100 nM), die an ein deformiertes GUV gebunden und durch Fluoreszenz-Konfokalmikroskopie abgebildet werden. Maßstabsbalken = 1 μm. (C) GFP-Septine (600 nM) gebunden an ein deformiertes GUV und abgebildet durch Fluoreszenz-Spinning-Disk-Mikroskopie. Maßstabsbalken = 10 μm. Die GUVs bestehen aus einem molaren Verhältnis von 56,8% EggPC, 15% Cholesterin, 10% DOPE, 10% DOPS, 8% brain PI(4,5)P 2 und0,2% Bodipy-TR-Ceramid. Der Beobachtungspuffer umfasst 75 mM NaCl und 10 mM Tris (pH = 7,8). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Selbstorganisation von Septinfilamenten, die an LUVs gebunden sind, abgebildet durch Kryo-EM
Im Vergleich zur Fluoreszenzmikroskopie bietet die Kryo-EM eine bessere räumliche Auflösung. Einzelne Septinfilamente und Lipiddoppelschichten können so eindeutig in Bildern erkannt werden. Abbildung 4A zeigt ein Bild von LUVs, die mit knospenden Hefeseptinfilamenten (einige davon blau hervorgehoben) bei 50 nM dekoriert sind. Parallele Filamentsätze, etwa 10 nm voneinander entfernt, wurden auf den LUVs beobachtet. Dieses typische Bild ist eine 2D-Projektion. Um eine beliebige 3D-Verformung zu entschlüsseln und zu wissen, ob Septinfilamente direkt mit der Membran interagieren, wurde daher eine Kryo-Elektronentomographie durchgeführt (Abbildung 4B und Abbildung 4C). Abbildung 4B zeigt eine Scheibe in einer 3D-Rekonstruktion, während Abbildung 4C eine Segmentierung desselben Bereichs zeigt, die die Membran in Gelb und die Septinfilamente in Blau hervorhebt. Wie auf der Seitenansicht zu sehen, blieben die Septinfilamente im Wesentlichen gerade an das Liposom gebunden und das Vesikel war im Vergleich zu den nackten kugelförmigen Vesikeln erheblich abgeflacht.
Abbildung 4: Selbstorganisation von an LUVs gebundenen Septinfilamenten. (A) Kryo-EM-Aufnahme von Septinfilamenten, die an ein Vesikel gebunden sind. Einige der Filamente sind aus Gründen der Sichtbarkeit blau hervorgehoben. Die dunklen Punkte sind goldene Treuhänder, die normalerweise verwendet werden, um Daten für die Tomographie auszurichten. Maßstabsbalken = 100 nm. (B) und (C) 3D-Rekonstruktion aus einer geneigten Reihe. Die Lipide sind gelb hervorgehoben, während die Septine blau segmentiert sind. Maßstabsbalken = 200 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Krümmungsabhängige Anordnung von Septinfilamenten durch REM sichtbar
Septine lokalisieren sich in Zellen an Stellen mit Mikrometerkrümmungen (z. B. an der Zellteilungsfurche, der Basis von Zilien usw.). Darüber hinaus zeigen In-vitro-Studien, dass Septine, wie oben gezeigt, Membranen so umformen können, dass sie schließlich Mikrometerkrümmungen aufweisen. Um die Krümmungsempfindlichkeit von Septinen sowohl für positive (konvexe) als auch für negative (konkave) Krümmungen zu bestimmen, wurden Septine mit einer unterstützten Lipiddoppelschicht inkubiert, die mit den oben beschriebenen Wellenmustern verschmolzen ist. Das Ergebnis ist in Abbildung 5 dargestellt. Abbildung 5A gibt einen Überblick über die verschiedenen Schritte, die erforderlich sind, um die Proben zu erhalten. Abbildung 5B zeigt ein Wellenmuster bei geringer Vergrößerung, wobei die Periodizität von negativen und positiven Krümmungen deutlich sichtbar ist. Zwei aufeinanderfolgende Wellen werden durch orangefarbene durchgezogene Linien angezeigt. Defekte, die ungefähr orthogonal zu den Wellen sind, werden durch weiße Pfeile angezeigt. Abbildung 5C und Abbildung 5D zeigen die ultrastrukturelle Organisation von Septinfilamenten bei höherer Vergrößerung. Die Septine fügten sich zu Sätzen paralleler Filamente zusammen, deren Orientierung von der Krümmung abhing (siehe blau hervorgehobene Filamente). Tatsächlich waren die Septinfilamente nicht zufällig ausgerichtet. Stattdessen können sich Septine biegen, wenn sie mit negativen (konkaven) Krümmungen interagieren, um der auferlegten Krümmung zu folgen. Umgekehrt blieben die Septinfilamente bei positiven Krümmungen gerade, ungebogen und entlang der konvexen Wellen ausgerichtet. Daher können Septine sowohl mit positiven als auch mit negativen Krümmungen interagieren, aber spezifische Organisationen auf gegebenen Krümmungen annehmen. Diese Methodik erscheint daher besonders relevant, um die Krümmungsempfindlichkeit der Bindung und Selbstorganisation filamentöser Proteine hervorzuheben.
Abbildung 5: Krümmungsabhängige Anordnung von Septinfilamenten. (A) Schematische Darstellung der Schritte, die erforderlich sind, um die "wellenförmigen" Proben zu erhalten, die zur Analyse der Septinkrümmungsempfindlichkeit durch REM bestimmt sind. (B) REM-Bild mit geringer Vergrößerung eines Wellenmusters mit gebundenen Septinfilamenten, die bei dieser Auflösung nicht aufgelöst werden. Zwei aufeinanderfolgende Wellen sind orange hervorgehoben. Orthogonale Defekte werden durch weiße Pfeile angezeigt. Maßstabsbalken = 10 μm. (C) REM-Bild bei 10.000-facher Vergrößerung, wo Septinfilamente sichtbar sind. Maßstabsbalken = 1 μm. (D) REM-Bild bei 20.000-facher Vergrößerung. Einige der Filamente sind aus Gründen der Sichtbarkeit blau hervorgehoben. Maßstabsbalken = 200 nm. Die sphärischen Objekte, die in den Bildern vorhanden sind, sind kleine Vesikel, die mit den Septinen und dem Substrat interagieren. Die Septinkonzentration wurde auf 200 nM in B-D festgelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Wie oben erwähnt, wurde eine Lipidmischung verwendet, die den Einbau von PI(4,5)P2 in die Lipiddoppelschicht verstärkt und somit Septin-Membran-Wechselwirkungen erleichtert. Tatsächlich haben wir an anderer Stelle25 gezeigt, dass knospende Hefeseptine mit Vesikeln in einer PI(4,5)P2-spezifischen Weise interagieren. Diese Lipidzusammensetzung wurde empirisch aus dem Screening mehrerer Zusammensetzungen angepasst und wird heute von den Autoren häufig verwendet. PI(4,5)P2-Lipide müssen vorsichtig behandelt werden. Stammlösungen müssen in kleinen Mengen aliquotiert werden, damit eine bestimmte Durchstechflasche nicht mehr als zweimal zum Pipettieren geöffnet wird. Außerdem sollten Lipidaliquots unter Argon gelagert werden, um eine Lipidoxidation zu verhindern. Sobald die Lipidmischungen in einer wässrigen Lösung gelöst sind, muss die Mischung sofort verwendet werden und kann nicht für weitere Experimente gelagert werden. Bemerkenswerterweise reduzierte sich nach GUV-Rekonstitution oder unterstützter Lipiddoppelschichtfusion die Wechselwirkung zwischen Septinen und Lipiden nach 2 h stark.
Einige der Ergebnisse, die mit oktameren knospenden Hefeseptinkomplexen (umschließend Cdc10, Cdc11, Cdc12 und Cdc3) erzielt wurden, wurden hier vorgestellt; Die experimentellen Verfahren zur Analyse des Verhaltens von Septinkomplexen anderer Spezies sollten jedoch identisch sein.
Um GUVs zu erzeugen, bevorzugen wir die Elektrobildungsmethode mit Platindrähten gegenüber der Elektrobildung auf ITO-Platten oder PVA-Quellung. Wie bereits25 gezeigt, erzeugt dieses Verfahren reproduzierbar unilamellare GUVs von guter Qualität ohne Mängel.
Die welligen Substrate können mit einer Vielzahl von Krümmungen gestaltet werden. Nach dem Screening verschiedener Designs wurden konsequent Muster mit einer Periodizität von 2 μm und einer Amplitude von 250 nm verwendet, die Krümmungen von -3,5 μm-1 bis 3,5 μm-1 (± 0,5 um-1) erzeugen. Bei Verwendung von Mustern mit kurzer Periodizität und höherer Amplitude passten sich die Lipiddoppelschichten nicht gut an die Oberfläche an. Bei einer höheren Krümmung wird die Doppelschicht häufig zwischen zwei konvexen Wellen aufgehängt, anstatt vollständig auf dem NOA-Substrat gestützt zu werden. Mit niedrigeren Amplituden und größerer Periodizität organisierten sich Septine mit zufälligen nematikartigen Orientierungen, was darauf hindeutet, dass die Muster zu flach waren. Außerdem hat die Verwendung von Wellenmustern anstelle von zylindrischen Rohren 20 oder Kugeln20 den Vorteil, dass sowohl positive als auch negative Krümmungen gleichzeitig getestet werden können. In Zukunft wäre die Untersuchung des Verhaltens von Filamenten auf Gaußschen "sattelartigen" Krümmungen relevant, um die Krümmung realistischerer zellulärer Kontexte nachzuahmen.
In Lösung induzierte das Mischen von LUVs mit Septinen die Bildung von Septin-Lipid-Aggregaten selbst bei niedrigen Konzentrationen von Proteinen und Lipiden. Die Proben waren daher heterogen, und es ist ratsam, nach dünneren Eisdomänen zu suchen, in denen kleinere und definiertere Septin-Vesikel-Objekte gefunden werden. Dies ist besonders wichtig bei der Auswahl von Interessengebieten, in denen eine Kryotomographie durchgeführt wird. Oft, selbst bei geringen Vergrößerungen, weisen Vesikel mit Vorsprüngen starker Verformungen im Vergleich zu sphärischen Vesikeln eher eine hohe Dichte an gebundenen Septinfilamenten auf. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Beschreibung der globalen Ultrastruktur von Filamenten auf biomimetischen Membranen. Derzeit sind höhere Auflösungen erreichbar. Die Auflösungsbeschränkung ergibt sich aus der begrenzten Anzahl von Ansichten, die durch die Bildgebung verfügbar sind. Dies geht jedoch über den Rahmen dieses Protokolls hinaus.
Wir haben durch dieses Protokoll gezeigt, dass eine Kombination komplementärer Methoden unerlässlich ist, um zu verstehen und zu analysieren, wie die spezifische Anordnung von Zytoskelettseptinfilamenten Membranen krümmungsabhängig wahrnehmen und umformen kann.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Patricia Bassereau und Daniel Lévy für ihre nützlichen Ratschläge und Gespräche. Diese Arbeit profitierte von der Unterstützung der ANR (Agence Nationale de la Recherche) für die Finanzierung der Projekte "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, und des Projekts "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin wird von der Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" und der Fondation pour lea Recherche Médicale finanziert. K. Nakazawa wurde von der Sorbonne Université (AAP Emergence) unterstützt. G.H. Koenderink wurde von der Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) durch die "BaSyC-Building a Synthetic Cell" unterstützt. Gravitationszuschuss (024.003.019). Wir danken der Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) und Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Wir danken dem Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, Mitglied der französischen nationalen Forschungsinfrastruktur France-BioImaging (ANR10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
References
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