Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bottom-up in vitro-metoder til analyse af den ultrastrukturelle organisation, membranomformning og krumningsfølsomhedsadfærd hos septiner

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63889
Automatic Translation
*1, *1, 1,7, 1, 1, 2, 2, 3, 4, 5, *6, *1
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

Summary

Septiner er cytoskeletale proteiner. De interagerer med lipidmembraner og kan fornemme, men også generere membrankrumning på mikronskala. Vi beskriver i denne protokol bottom-up in vitro-metoder til analyse af membrandeformationer, krumningsfølsom septinbinding og septinfilament ultrastruktur.

Abstract

Membranombygning forekommer konstant ved plasmamembranen og inden for cellulære organeller. For fuldt ud at dissekere miljøets rolle (ioniske tilstande, protein- og lipidsammensætninger, membrankrumning) og de forskellige partnere, der er forbundet med specifikke membranomformningsprocesser, foretager vi in vitro bottom-up-tilgange. I de senere år har der været stor interesse for at afsløre septinproteinernes rolle forbundet med større sygdomme. Septiner er essentielle og allestedsnærværende cytoskeletale proteiner, der interagerer med plasmamembranen. De er impliceret i celledeling, cellemotilitet, neuromorfogenese og spermiogenese, blandt andre funktioner. Det er derfor vigtigt at forstå, hvordan septiner interagerer og organiserer sig ved membraner for efterfølgende at inducere membrandeformationer, og hvordan de kan være følsomme over for specifikke membrankrumninger. Denne artikel har til formål at dechiffrere samspillet mellem ultrastrukturen af septiner på molekylært niveau og membranombygningen, der forekommer på mikronskala. Til dette formål blev spirende gær og pattedyrs septinkomplekser rekombinant udtrykt og renset. En kombination af in vitro-assays blev derefter brugt til at analysere selvmonteringen af septiner ved membranen. Understøttede lipiddobbeltlag (SLB'er), gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er), store unilamellare vesikler (LUV'er) og bølgede substrater blev brugt til at studere samspillet mellem septin selvsamling, membranomformning og membrankrumning.

Introduction

Septiner er cytoskeletale filamentdannende proteiner, der interagerer med lipidmembraner. Septiner er allestedsnærværende i eukaryoter og afgørende for mange cellulære funktioner. De er blevet identificeret som de vigtigste regulatorer for celledeling i spirende gær og pattedyr 1,2. De er involveret i membranomformningshændelser, ciliogenese3 og spermiogenese4. Inden for pattedyrceller kan septiner også interagere med actin og mikrotubuli 5,6,7 i et bindemiddel af Rho GTPases (BORG) -afhængig måde8. I forskellige væv (neuroner9, cilia3, spermatozoer10) er septiner blevet identificeret som regulatorer af diffusionsbarrierer for membranbundne komponenter11. Septiner har også vist sig at regulere membranblegning og fremspringsdannelse12. Septiner, der er multi-tasking proteiner, er impliceret i fremkomsten af forskellige udbredte sygdomme13. Deres fejlregulering er forbundet med fremkomsten af kræft14 og neurodegenerative sygdomme15.

Afhængigt af organismen samles flere septinunderenheder (to i Caenorhabditis elegans til 13 hos mennesker) for at danne komplekser, hvis organisation varierer på en vævsafhængig måde16. Den grundlæggende septinbyggesten samler to til fire underenheder, der er til stede i to kopier og selvsamlede på en stanglignende palindromisk måde. I spirende gær er septineroktomere 17,18. In situ er septiner ofte lokaliseret på steder med mikrometerkrumning; de findes ved opdelingsforsnævringssteder, ved bunden af cilia og dendritter og ved ring af spermatozoer19,20. Ved membranen synes septinernes rolle at være dobbelt: de er impliceret i omformning af lipiddobbeltlaget og opretholdelse af membranintegritet21. Derfor er det afgørende at undersøge de biofysiske egenskaber af septinfilamentdannende proteiner og / eller underenheder ved membranen for at forstå deres rolle. For at dissekere septiners specifikke egenskaber i et velkontrolleret miljø er bottom-up in vitro-tilgange hensigtsmæssige. Indtil videre har kun få grupper beskrevet de biofysiske egenskaber af septiner in vitro 20,22,23. Sammenlignet med andre cytoskeletale filamenter forbliver den nuværende viden om septiners opførsel in vitro derfor begrænset.

Denne protokol beskriver, hvordan organiseringen af septinfilamenter, membranomformning og krumningsfølsomhed kan analyseres19. Til dette formål er der anvendt en kombination af optiske og elektronmikroskopimetoder (fluorescensmikroskopi, kryo-elektronmikroskopi [cryo-EM] og scanningselektronmikroskopi [SEM]). Membranomformningen af mikrometerstore gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er) visualiseres ved hjælp af fluorescensoptisk mikroskopi. Analysen af arrangementet og ultrastrukturen af septinfilamenter bundet til lipidvesikler udføres ved anvendelse af cryo-EM. Analyse af septinkrumningsfølsomhed udføres ved hjælp af SEM ved at studere opførelsen af septinfilamenter bundet til fastunderstøttede lipiddobbeltlag deponeret på bølgede substrater af variable krumninger, hvilket muliggør analyse af krumningsfølsomhed for både positive og negative krumninger. Sammenlignet med tidligere analyse20,24 foreslår vi her at bruge en kombination af metoder til grundigt at analysere, hvordan septiner kan samle sig selv, synergistisk deformere membran og være krumningsfølsomme. Denne protokol menes at være nyttig og tilpasningsdygtig til ethvert trådformet protein, der viser en affinitet for membraner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bestemmelse af membranomformning ved hjælp af gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er)

BEMÆRK: I dette afsnit genereres GUV'er for at efterligne de membrandeformationer, der muligvis induceres af septiner i en cellulær sammenhæng. Faktisk findes septiner i celler ofte på steder med mikrometerkrumninger. GUV'er har størrelser fra et par til snesevis af mikrometer og kan deformeres. De er således egnede til at analysere eventuelle septininducerede deformationer i mikrometerskala. Fluorescerende lipider samt fluorescerende mærkede septiner (ved hjælp af grønt fluorescerende protein [GFP]) bruges til at følge adfærden af både lipider og proteiner via fluorescensmikroskopi.

  1. Fremstilling af buffere og opløsninger
    1. Guv-vækstbufferen (50 mM NaCl, 50 mM saccharose og 10 mM Tris [pH = 7,8]) og observationsbufferen (75 mM NaCl og 10 mM Tris [pH = 7,8]) forberedes.
    2. Mål (ved hjælp af et kommercielt osmometer) og juster osmolariteten af observations- og vækstbuffere (170 mOsmol· L-1, i teorien) ved at tilføje små mængder NaCl, indtil deres respektive osmolariteter er ens. Bufferne filtreres ved hjælp af et filter på 0,2 μm. Vækstbufferen aliquot, og den opbevares ved -20 °C til videre brug. Observationsbufferen opbevares ved 4 °C.
      BEMÆRK: Forskellen i osmolaritet mellem begge buffere bør ikke overstige 5%.
    3. Der fremstilles en 5 mg·ml-1 β-kaseinopløsning i observationsbufferen. Sørg for fuldstændig opløsning (efter flere timer ved 4 °C under magnetisk omrøring). Opløsningen filtreres med et 0,2 μm filter, aliquot, og opbevares ved -20 °C.
  2. Lipidblandingerne fremstilles ved en total lipidkoncentration på 3 mg·ml-1 i chloroform. Brug en sammensætning (mol%) af 56,8% Æg L-α-phosphatidylcholin (EggPC), 15% kolesterol, 10% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE), 10% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin (DOPS), 8% hjerne L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI(4,5)P2) og 0,2% Bodipy-TR-Ceramid for at forbedre protein-lipidinteraktionerne og favorisere inkorporeringen af PI(4,5)P225.
    BEMÆRK: Håndter chloroform under en røghætte ved hjælp af nitrilhandsker og sikkerhedsbriller. Afpipettere chloroformopløsninger med glassprøjter, og undgå plast, da chloroform opløser plast. Før og efter brug skylles sprøjterne ved pipettering af chloroform 5x-10x. Brug separate sprøjter til at pipettere specifikke fluorescerende lipider for at forhindre krydskontaminering. Lipider kan opbevares i chloroform ved -20 °C i et ravfarvet hætteglas med teflon. Hætteglassene skal fyldes med argon inden lukning og forsegles med parafilm for at forhindre lipidoxidation.
  3. Elektrodannelse af GUV'er ved hjælp af en platintrådopsætning
    BEMÆRK: Figur 1 viser skemaet for de eksperimentelle trin og et billede af kammeret.
    1. Rengør kammeret og platintrådene grundigt som følger for at fjerne eventuelle lipidrester.
    2. Dyk ledningerne og kammeret i acetone og soniker i 10 min. Tør dem forsigtigt af med et papirserviet ved hjælp af acetone.
    3. Saml kammeret ved at indsætte ledningerne, spring igen i acetone og sonikere i 10 minutter. Tør igen med acetone, og sørg for, at ledningerne er helt rengjort. Dyk kammeret i ethanol, sonikat i 10 minutter, og tør med ethanol.
    4. Til sidst skal du kaste kammeret i deioniseret vand, sonikere i 10 minutter og tørre med en strøm af nitrogen eller luft.
      BEMÆRK: Teflonkammeret (figur 1B) blev specialfremstillet i det interne værksted. Den rummer tre rum, der kan forsegles på begge sider ved hjælp af glasdæksler. Platintråde kan indsættes i kammeret gennem huller med en diameter på 1,3 mm.
    5. Efter rengøring af kammeret deponeres 3-4 dråber pr. rum (hver dråbe er ca. 0,1 μL)) af 3 mg · ml-1 lipidblandingen på hver platintråd. Drej ledningerne med 180 ° og aflejr 3-4 lipiddråber pr. Rum på den modsatte side af hver platintråd. Sørg for, at dråberne ikke kommer i kontakt med hinanden. Ca. 5 μL af lipidblandingen kræves pr. Hele kammeret.
    6. Anbring vækstkammeret i et vakuumkammer i 30 minutter for at fjerne spor af chloroform.
      BEMÆRK: Dybt vakuum (0,1 mbar) er bedst. Når de tørres, er lipider sårbare over for oxidation og bør derfor ikke efterlades i luften i mere end et par minutter.
    7. Aflejr højvakuumfedt i bunden af kammeret (den side, der er tættest på ledningerne) langs periferien af de tre rum ved hjælp af en sprøjte, og tryk en ren (22 mm x 40 mm) dækslip mod fedtet for at sikre perfekt tætning. Forsegl begge ekstremiteter af kammeret (dvs. ved ledningernes indgangs- / udgangssteder) ved hjælp af tætningspasta (voksplader). På samme måde påføres vakuumfedt på den anden side af kammeret.
    8. Fyld rummene med vækstbuffer (~1 ml pr. kammer) med en pipette. Rør ikke opløsningen for hurtigt eller stærkt for at forhindre løsrivelse af lipidfilmen fra ledningerne. Forsegl toppen af kammeret hermetisk ved hjælp af en 22 mm x 40 mm dækslip ved at trykke den mod fedtet. For at undgå dannelse af luftbobler skal du forsigtigt trykke på glasdækslet fra midten til kanterne.
      1. Placer kammeret i et køleskab ved 4 °C, og tilslut ledningerne til en bølgefunktionsgenerator (sinusfunktion ved 500 Hz). Indstil en effektiv spænding på 350 mV i en kortere vækstperiode (dvs. 6 h) eller 250 mV i en længere vækstperiode (dvs. 12-16 h), som allerede præsenteret og optimeret i en undersøgelse af Beber et al.25.
    9. Fjern dækslerne, tør tætningsmidlet og fedtet af, og fjern ledningerne. Vask og skrub kammeret med et papirserviet ved hjælp af vand og ethanol (≥70%) skiftevis.
      BEMÆRK: Den optimale spænding og tidsskala for GUV-vækst afhænger af mange parametre, fra buffersaltkoncentrationen til kammergeometrien (dvs. afstanden mellem ledningerne og kammerstørrelsen). Brug det samme kammer, hver gang eksperimentet gentages, for at sikre reproducerbarhed. Ledningerne er i nærheden af bunden af kammeret, så lipiderne kan afbildes ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Forestil dig lipiderne ved hvert trin (se figur 1C, D) for at sikre, at elektrodannelsesprocessen er vellykket.
  4. Septin inkubation med vesikler
    1. Saml GUV'er fra ledningerne ved hjælp af forskårne pipettespidser (~ 1 mm åbning), der bringes i nærheden af ledningerne. Pipetter derefter opløsningen langs ledningen. Denne procedure forhindrer generering af stærke lamellære strømme, der kan forstyrre GUV'erne. Efter dette trin er det ikke længere nødvendigt at skære pipettespidser. Faktisk beskadiger lamellære strømme ikke GUV'er i opløsningen.
      BEMÆRK: På grund af tilstedeværelsen af PI(4,5)P2 i lipidblandingen må ROV'er, der er opsamlet, opbevares i højst 2-3 timer før forsøget. Faktisk bliver PI (4,5) P2 opløses hurtigt, og septiner binder ikke længere til membranerne et par timer efter deres dannelse. Men når septiner er bundet til membranen, forbliver de bundet i et par dage.
    2. Septinopløsningen fortyndes udelukkende i Tris 10 mM (pH 8) for at opnå en osmolaritet svarende til vækstbufferens. fortynd om nødvendigt septinopløsningen yderligere i observationsbufferen. Tilsæt det tilsigtede volumen af indsamlede GUV'er (50-100 μL for et samlet volumen på 200 μL). Udfør inkubationen direkte i observationskammeret efter passivering med β-kasein (se nedenfor). 20-30 minutters ventetid er påkrævet for at nå ligevægt.
      BEMÆRK: Ekspression og oprensning af septinoktomere komplekser (humane eller spirende gær) er udførligt beskrevet i andre artikler17. Kort fortalt blev septiner udtrykt i Escherichia coli, renset i laboratoriet ved hjælp af affinitet, størrelsesekskludering og ionbytterkromatografitrin og opbevaret ved -80 ° C i en vandig opløsning af 50 mM Tris-HCI (pH 8), 300 mM KCl og 5 mMMgCl2 ved ~ 1 mg · ml-1 (3 μM) koncentration. En høj saltkoncentration bruges til at undgå septinaggregering. Septinkomplekser bør ikke koncentreres gennem en filtercentrifugeringsanordning, som inducerer aggregering og dermed reducerer proteinudbyttet.
  5. Billeddannelse med konfokalt og/eller roterende diskmikroskop
    1. For at forhindre GUV'erne i at klæbe til overfladen og / eller eksplodere, passiveres observationskammeret ved at inkubere det med en 5 mg · ml-1 β-kaseinopløsning i 30 minutter.
    2. Opløsningen af β-kasein fjernes, og septin-GUV-opløsningen (trin 1.4.2) overføres til observationskammeret ved hjælp af en pipette. Lad GUV'erne sedimentere til bunden af kammeret i 10-15 min.
      BEMÆRK: Sammensætningsafvigelsen mellem GUV'ens indre og den eksterne buffer skaber både en tæthed og et brydningsindeks mismatch. På grund af misforholdet mellem brydningsindekset er GUV'erne synlige med optisk mikroskopi af transmissionslys.
    3. Brug konfokal mikroskopi til at visualisere lipidernes fluorescerende signal for at kontrollere GUVs kvalitet og membranlamellaritetstilstand. Vurder densiteten af septiner bundet til GUV'er ved at registrere septinernes fluorescerende signal efter udførelse af en korrekt kalibrering25. Udfør Z-stack-erhvervelser med 0,4 μm rumligt interval for at analysere og visualisere 3D-deformationerne af vesikler induceret af interaktionen mellem septinerne og membranen.
      BEMÆRK: Oliesænkningsmål med 60- eller 100-doblede forstørrelser blev brugt. Standard konfokale eller roterende diskmikroskoper (Materialetabel) med pixelstørrelser på henholdsvis 250 nm og 110 nm blev anvendt. Man skal tilpasse billeddannelsesforholdene til et givet stykke udstyr. Der blev ikke tilsat specifikke anti-fotoblegemidler til opløsningen.

Figure 1
Figur 1: Elektrodannelse af GUV'er. (A) Skematisk repræsentation af elektrodannelsesprocessen ved hjælp af platintråde. (B) Billede af teflon-hjemmefremstillet enhed samlet med platintråde, der anvendes til generering af GUV'er ved elektrodannelse. Ledninger er 0,5 mm i diameter og 3 mm fra hinanden. (C) GUV'er (sfæriske objekter) observeret ved transmission optisk mikroskopi under vækstprocessen. Den uigennemsigtige zone i bunden af billedet er platintråden. (D) GUV'er (runde fluorescerende genstande) observeret med fluorescerende mikroskopi under væksten på platintråden. Skalastænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Analyse af ultrastrukturel organisering af septinfilamenter ved kryo-elektronmikroskopi

BEMÆRK: Vesikler er ikke egnede til billeddannelse med standard elektronmikroskopimetoder. Faktisk tørres prøver ved hjælp af standard negative pletmetoder. Ved dehydrering vil vesikler sandsynligvis gennemgå uspecifikke deformationer, hvilket ofte resulterer i lipidfremspring. Kryo-elektronmikroskopi er således en meget bedre strategi til at observere specifikke deformationer af vesikler. Ved hjælp af cryo-EM er prøverne indlejret i et tyndt (~ 100-200 nm) lag af forglasset is, som bevarer prøverne tæt på den oprindelige tilstand. GUV'er er imidlertid for store (flere titalls mikrometer) til at blive indlejret i tynd is og dermed afbildet ved transmissionselektronmikroskopi. Derfor genereres store unilamellare vesikler (LUV'er), hvis diametre spænder fra ~ 50-500 nm, for at bestemme, hvordan septiner kan deformere vesikler, og hvordan de arrangeres på vesikler.

  1. Generation af store unilamellare vesikler (LUV'er)
    1. Forbered 50 μg lipidblanding opløset i chloroform med en molær sammensætning af 57% EggPC, 15% kolesterol, 10% DOPE, 10% DOPS og 8% hjerne PI (4,5) P2), som er optimeret til at forbedre septininteraktion med membranen i et hætteglas.
    2. Tør opløsningen under argonstrøm for at generere en tørret lipidfilm i hætteglasset. Sæt hætteglasset under vakuum i 30 minutter for at tørre lipidet helt.
    3. Resolubilisere lipidfilmen i 50 μL vandig opløsning (50 mM Tris-HCi [pH 8]; 50 mM KCl; 2 mM MgCl2) for at opnå en endelig koncentration på 1 mg · ml-1, hvirvel i 10 s, og overfør opløsningen til et rør.
      BEMÆRK: LUV'er skal straks anvendes til inkubation med septiner. Ellers vil protein-lipid-interaktionen være svag på grund af PI (4,5) P2-opløselighed. Denne rå re-opløselighedsproces genererer en heterogen population af vesikler med diametre fra 50 nm til 500 nm. Derfor analyseres en lang række diametre og dermed krumninger samtidigt.
  2. Septinerne inkuberes med de opløselige lipider ved endelige lipid- og septinkoncentrationer på henholdsvis 0,1 mg · ml-1 (ca. 300 nM) og 20 nm i en højsaltbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2). Prøven inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
  3. Dykfrysning for at forglasse prøven
    1. Glødeudladningshullede kulstofgitter (300 mesh) på kulstofsiden i 30 s ved 5 mA ved hjælp af plasmageneratorudstyr og indsæt gitteret i en springfrysningsmaskine i et fugtigt miljø.
    2. Adsorber 4 μL af prøven (trin 2.2)på den glødende kulstofside af gitteret. Umiddelbart før prøveadsorption tilsættes 5-10 nm guldperler i opløsningen, hvis prøverne vil blive brugt til at generere vippede serier ved kryo-tomografi.
      BEMÆRK: Tætheden af guldperler skal screenes og justeres empirisk og afhænger af udbyderen. Den optimerede tæthed er 10-15 guldperler i synsfeltet.
    3. Tør prøverne tørres fra den bare side for at aspirere prøvefaldet på den modsatte side.
      BEMÆRK: Blottingtiden er typisk 4 s, og filterpapirets position og blottingkraft justeres empirisk ved at teste og screene alternative positioner af filterpapiret for at optimere iskvaliteten (tykkelsen) og materialetætheden.
    4. Overfør gitterene til et mikroskop eller opbevar dem i en flydende nitrogenbeholder.
      BEMÆRK: Brug af hullede kulstofgitter er afgørende for at imødekomme polydispersiteten i vesiklernes størrelse. Blotting af prøven fra den modsatte side favoriserer forbedret adsorption af det biologiske materiale på gitteret.
  4. Kryo-elektronmikroskopi billeddannelse
    1. Indsæt gitrene i et elektronmikroskop (EM), der er udstyret til cryo-EM-observation. Screen hele gitteret ved at generere et kort over hele prøven ved lav forstørrelse (typisk ved 120x forstørrelse) for at vælge områder, der viser bedre is (dvs. tynd og godt forglasset).
    2. Til indsamling af cryo-EM 2D-data skal du indsamle billeder med en pixelstørrelse på ca. 2 Å pr. pixel for at kontrollere kvaliteten af prøven. Sørg for, at både septinfilamenter og lipiddobbeltlaget er synlige.
    3. Til dataindsamling af kryo-elektrontomografi skal du vælge interesseområder, der viser deformerede vesikler. Sørg for, at der er nok guldperler (mindst 10) i synsfeltet.
    4. I henhold til den software, der bruges til dataindsamling af vippede serier, skal du vælge fokus- og sporingspositioner for at være langt nok fra interesseområdet. Saml vippede serier ved at variere hældningsvinklen fra -60° til +60°, og saml et billede hver 2°-3° grad.
      BEMÆRK: Den totale dosis skal være omkring eller mindre end 100 elektroner/Å2. Pixelstørrelsen varierer fra 1,3 Å til 2,1 Å, afhængigt af det mikroskop, der anvendes til dataindsamling. Ideelt set foretrækkes et vinkelsymmetrisk skema til dataindsamling som følger: 0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°. Goniometre af sideindgangsmikroskoper giver imidlertid ikke tilstrækkelig mekanisk stabilitet til at opnå disse symmetriske skemaer. Alternativt kan erhvervelsen startes ved 0 ° til 34 °, efterfulgt af en anden vinkelsekvens fra -2 ° til -60 ° og afsluttes med en endelig sekvens fra 36 ° til 60 °. Formålet er at indsamle de første billeder (med de laveste strålingsskader) i de laveste vinkler. For at visualisere ultrastrukturen af vesikler og bundne septinfilamenter kan der desuden anvendes et standard kryo-EM-mikroskop (200 kV, Lanthanum hexaborid (LaB6) filament og prøvesideindgang). Men hvis man sigter mod at forfølge yderligere billedbehandling (sub-tomogram gennemsnit, for eksempel), er det bedst at bruge sidste generations feltemissionspistol (FEG) mikroskoper udstyret med direkte detektorer. I denne protokol begrænser vi vores beskrivelse til erhvervelse af 3D-rekonstruktioner og udelader sub-tomogramgennemsnit.
  5. 3D-rekonstruktion fra kryo-tomografi og segmentering
    1. Brug IMOD-softwarepakken (Table of Materials) til billedjustering i vippede serier og 3D-rekonstruktion26,27. Inden for IMOD skal du udføre vippeseriejustering baseret på fiducials (guldperler) positionering. Derudover skal du om nødvendigt udføre bestemmelse og korrektion af kontrastoverførselsfunktion (CTF) inden for IMOD26. Endelig skal du opnå 3D-rekonstruktion med IMOD, efter hvert trin strengt.
    2. Segmenter lipid dobbeltlag og septinfilamenter manuelt ved hjælp af 3Dmod27 fra IMOD-softwarepakken til visning.

3. Analyse af septins krumningsfølsomhed ved hjælp af SEM

BEMÆRK: For at forstå, hvordan septiner kan være følsomme over for mikrometerkrumninger, er der anvendt en in vitro-tilgang til at inkubere septinfilamentkomplekser med fast understøttede lipiddobbeltlag deponeret på bølgede bølgede mønstre i mikrometerskala.

  1. Design af bølget NOA (Norland optisk klæbemiddel) replika fra bølgede polydimethylsiloxan (PDMS) mønstre
    1. Brug PDMS bølgede mønstre med 250 nm amplitude og 2 μm lateral periodicitet eller andre dimensioner til at analysere krumningerne, der er egnede til proteinet af interesse.
      BEMÆRK: PDMS bølgede mønstre er designet og genereret som beskrevet i Nania et al.28,29.
    2. I et renrumsmiljø skal du deponere 5 μL flydende NOA på en cirkulær glasdæksler på 1 cm i diameter og placere PDMS-skabelonen på dråben. Behandl med UV-lys (320 nm) i 5 minutter for at fotopolymerisere den flydende NOA til en tynd polymerfilm. Fjern derefter forsigtigt PDMS-skabelonen fra dækslippen med den friskpolymeriserede NOA.
      BEMÆRK: NOA er en almindelig optisk gennemsigtig lim, der er egnet til optisk mikroskopibilleddannelse. Derudover er NOA modstandsdygtig over for de kemiske fikserings- og farvningsprocesser, der udføres før SEM-billeddannelse. Både NOA 71 og NOA 81 harpikser kan anvendes med lignende resultater. Det oprindelige PDMS-mønster kunne bruges flere gange til at producere NOA-replikaer. De opnåede NOA-replikaer kan opbevares i en kasse ved stuetemperatur i flere måneder.
  2. Generering af et understøttet lipiddobbeltlag og proteininkubation
    1. Behandl NOA-filmene ved hjælp af en luftplasmarenser i 5 minutter for at gøre overfladen hydrofil.
    2. Forbered en opløsning af små unilamellare vesikler (SUV'er) med en molær sammensætning af 57% EggPC, 15% kolesterol, 10% DOPE, 10% DOPS og 8% hjerne PI (4,5) P2 ved en total lipidkoncentration på 1 mg · ml-1. SUV'erne forberedes ved at genoplive en tørret lipidfilm i observationsbufferen som beskrevet i trin 2.1.3. Soniker forsigtigt opløsningen ved hjælp af en badsoniskator i 5-10 minutter, indtil opløsningen er gennemsigtig.
      BEMÆRK: Opløsningen af SUV'er kan opbevares frosset i flere uger ved -20 °C.
    3. Indsæt dækslerne, der understøtter NOA-mønstrene i brøndene i cellekulturbokse. 100 μL 1 mg·ml-1 SUV-opløsning anbringes på de frisk glødende NOA-mønstre (trin 3.2.1) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Dette trin inducerer fusion af SUV'er med overfladen af NOA-mønsteret for at generere et understøttet lipiddobbeltlag.
    4. Skyl gliderne grundigt 6x med septinbufferen (50 mM Tris-HCi [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) for at fjerne uoversluttede SUV' er. Efter hver skylning må prøven aldrig tørre helt.
    5. Den oktomere septinbestandsopløsning fortyndes i septinhøjsaltbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2) ved hjælp af septinbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) til slutkoncentrationer fra 10 nM til 100 nM og volumener på 1 ml. Inkuber proteinopløsningen på diasene i ~ 1 time ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Volumenet er stort nok, så fordampning ikke er et problem.
  3. Prøveforberedelse til SEM-analyse
    BEMÆRK: Forskellige protokoller er blevet udviklet i elektronmikroskopi til analyse af proteinstrukturer og deres samling. Den nuværende protokol bevarer organisationen af septinfilamenter ved hjælp af en fikseringsprotokol afledt af Svitkina et al.30 det er let at implementere. Desuden optimerer denne protokol SEM-observationer i høj opløsning.
    1. Fremstilling af reagenser og stamopløsninger
      BEMÆRK: Denne protokol kræver flere reagenser og opløsninger, der kan fremstilles på forhånd eller lige før inkubation. Følg de medfølgende instruktioner for at undgå artefakter eller mangel på kemisk reaktivitet.
      1. Natriumcacodylat 0,2 M stamopløsning: For at fremstille denne dobbeltstyrkeopløsning opløses 2,14 g natriumcacodylatpulver i ~ 40 ml destilleret vand under magnetisk omrøring. Efter fuldstændig opløsning justeres pH til 7,4 ved forsigtigt at tilsætte 0,1 M HCI (~ 1 ml for 50 ml opløsning) og fyldes det endelige volumen med destilleret vand. Denne opløsning kan opbevares i 24-48 timer ved 4 °C.
      2. 2% glutaraldehyd (GA) i 0,1 M natriumcacodylat (fikserende opløsning): Forbered denne opløsning lige før brug ved fortynding af meget ren EM-klasse GA med 0,2 M natriumcacodylatopløsning (se ovenfor). Brug en 25%-50% kommerciel GA-lagerløsning på grund af dens optimerede lagerkapacitet ved 4 °C. Til fremstilling af 10 ml fiksiv opløsning fortyndes 0,8 ml 25% kommerciel GA-opløsning med 4,2 ml destilleret vand og 5 ml 0,2 ml natriumcacodylat.
      3. 1% osmiumtetroxid (OsO4) i 0,1 M natriumcacodylat: Forbered denne anden fikseringsopløsning lige før brug ved fortynding af den kommercielle 4%OsO4 stamopløsning med 0,2 M natriumcacodylat (se ovenfor). For 4 mlOsO4 fiksiv opløsning fortyndes 1 ml 4% kommercielOsO4-opløsning med 1 ml destilleret vand og 2 ml 0,2 ml natriumcacodylat.
        BEMÆRK: Brug kommerciel 4% OsO4 lageropløsning i spaltelige glaspærer på grund af deres opbevarings- og håndteringsegenskaber. Bemærk, at OsO4 er meget reaktiv. Sørg for, at farven er lidt gul og ikke mørk.
      4. 1% garvesyre (TA) i vand: Forbered denne opløsning lige før brug. TA-opløsningen fremstilles for at opnå en slutkoncentration på 1% TA i destilleret vand ved stuetemperatur. Opløs 10 mg i 1 ml destilleret vand og hvirvel i et par minutter. TA-opløsning kan ikke opbevares og skal filtreres med et 0,2 μm filter før brug.
      5. 1% uranylacetat (UA) opløsning i vand Forbered UA-opløsning for at opnå en slutkoncentration på 1% UA i destilleret vand. Opløs 10 mg i 1 ml destilleret vand og hvirvel i mindst 30 minutter til 1 time ved hvirvel eller omrystning ved stuetemperatur. Denne opløsning kan opbevares i 1 måned ved 4 °C, men kan let udfældes og skal derfor filtreres med et 0,2 μm filter før brug.
      6. Graduerede serier af ethanolopløsninger Forbered 50%, 70%, 95% og 100% ethanolopløsninger i vand. Forbered det sidste bad fra nyåbnede flasker med 100% ethanol eller fra 100% ethanol, der har været dehydreret i mindst 24 timer med molekylære sigter (nominel porediameter = 4 Å) for at fjerne alle spor af vand, der kan forstyrre tørring og belægning, fra prøverne. Pas på ikke at ryste denne opløsning, da det kan forårsage resuspension af silikatpartikler.
        BEMÆRK: Vær forsigtig, når du håndterer de kemiske reagenser, der anvendes i denne protokol. Glutaraldehyd, osmiumtetroxid, natriumcacodylat og uranylacetat er alle meget giftige, uranylacetat er også radioaktivt. Al manipulation af reagenserne og deres affald skal ske ved hjælp af individuelle (handsker, laboratoriefrakker, sikkerhedsbriller) og kollektiv beskyttelse (stinkhætter og plexiglasskærme) i henhold til de laboratoriespecifikke procedurer.
    2. Prøvefiksering
      1. Prøverne (dvs. NOA-dias med smeltede understøttede lipiddobbeltlag og inkuberet protein) vaskes med PBS. Udskift PBS med GA-fikseringsopløsningen, der er forvarmlet ved 37 °C, og lad reaktionen fortsætte i 15 minutter. Prøverne kan derefter opbevares ved 4 °C.
      2. Fixopløsningen fjernes, og de faste prøver vaskes 3x med 0,1 M natriumcacodylat (5 min. pr. vask) med skånsom omrystning.
      3. Prøverne inkuberes i OsO 4-fikseringsopløsningen i 10 minutter med maksimal beskyttelse mod lys for at muliggøre fiksering af membranøse strukturer og øge prøvernes elektriske ledningsevne. Fjern fikseringsopløsningen, og vask prøverne 3x i destilleret vand (5 min pr. Vask) med skånsom omrystning.
      4. De vaskede prøver inkuberes i den filtrerede TA-fikseringsopløsning i højst 10 minutter. Ta-opløsningen fjernes, og prøverne vaskes 3x i destilleret vand (5 min. pr. vask) med let omrystning.
      5. De vaskede prøver inkuberes i en friskfiltreret UA-fikseringsopløsning i 10 minutter med maksimal beskyttelse mod lys. Fjern UA-opløsningen, og prøverne vaskes 3x i destilleret vand (5 min pr. vask) med skånsom omrystning.
    3. Dehydrering af prøver og tørring af kritiske punkter
      BEMÆRK: Lufttørring er ikke tilladt for at undgå at beskadige prøver gennem uønskede overfladespændinger, når der skiftes fra væsken til gasformig tilstand. To metoder er blevet etableret i EM: den fysiske metode til at nå den superkritiske tilstand af CO2 og omgå dets kritiske punkt (31 ° C, 74 bar) eller den kemiske metode til fordampning af hexamethyldisilazan (HMDS), et tørremiddel med reduceret overfladespænding. CO2 og HMDS er dårligt blandbare med vand. Derfor skal alle spor af vand erstattes med et overgangsopløsningsmiddel (ethanol) for at undgå skader senere under tørringsprocesserne.
      1. Prøverne inkuberes i 2-3 minutter i hver ethanolopløsning, startende fra 50% til 100% (vandfrit) ethanolbad.
        BEMÆRK: Da fordampningen af ethanol mellem badene er hurtig, skal prøvehåndteringen også være hurtig for at undgå lufttørring.
      2. Overfør glasglassene inde i kritisk punkttørreren, der er fyldt med ethanol, og følg producentens anvisninger.
        BEMÆRK: I denne protokol blev der anvendt et automatisk apparat, men ethvert system kan bruges. Protokollerne kan variere for hvert apparat, men skal optimeres til fuldstændigt at fjerne ethanol (25 bade i denne protokol) og reducere hastighederne for de forskellige opløsningsmiddeludvekslinger (CO2 -indgange og ethanol / CO2 -udgange) og den endelige trykaflastning (næsten 1 time i denne protokol).
      3. Ved afslutningen af tørringen af kritisk punkt opbevares prøverne straks i en ekssikkator indtil montering og belægning. Da tørrede prøver er meget hygroskopiske, skal du belægge dem (se nedenfor) så hurtigt som muligt.
        BEMÆRK: Alternativt kan HMDS tilbyde en billigere og hurtigere metode. Selvom HDMS aldrig er blevet testet på vores prøver, gav denne tilgang gode resultater til observation af proteiner på indersiden af cellulære membraner31,32.
    4. Prøve montering og belægning.
      BEMÆRK: Da biologiske prøver har dårlige elektriske ledningsevneegenskaber, skal de overtrækkes med en ledende metalfilm før SEM-observation. Plasma-magnetron forstøvning anvendes således.
      1. Fastgør dækslen til stubbe, der vil blive brugt til fremtidige SEM-observationer. Brug sølvmaling på grund af dens forbedrede elektriske ledningsevne sammenlignet med kulstofskiver. Tilsæt en strimmel sølvmaling til dækslippens overside, og sørg for, at forbindelsen med stubben er tilfredsstillende. Undgå maling agglomerater.
        BEMÆRK: Sølvmalingsstrimlen skal være tynd for at undgå kontakt mellem prøven og SEM'ens objektive linse, når der arbejdes ved høje opløsninger (dvs. lav arbejdsafstand).
      2. Vent på, at opløsningsmidlet fordamper fuldstændigt.
        BEMÆRK: Varigheden af dette trin kan variere afhængigt af mængden og tykkelsen af sølvmalingsaflejringen. Dette trin kan forkortes ved hjælp af en klokkekrukke eller coateren og et primært vakuum i 10-30 min.
      3. Brug et apparat udstyret med et plasmamagnetronforstøvningshoved og et roterende planetarisk stadium, og følg standardprotokoller leveret af producenten. Her blev apparatet evakueret til 2, 5 x 10-5 mbar, renset 1x med argon af høj kvalitet og derefter justeret til 8, 0 x 10-3 mbar.
      4. Udfør forstøvning (120 mA i 60 s) for at fjerne oxidlaget på overfladen. Derefter deponeres 1,5 nm wolfram (90 mA, arbejdsafstand = 50 mm) ved hjælp af en filmtykkelsesmonitor.
        BEMÆRK: Coateren skal rengøres perfekt for at sikre reproducerbarheden af filmfordampningen. Belægningen skal stoppes, når den målrettede tykkelse er nået. Den endelige filmtykkelse beregnes og korrigeres bagefter. Film på ca. 1,5 nm har i gennemsnit en efterkorrektion på 0,7 nm ved hjælp af vores apparat. Da disse korrektionsværdier er tæt på målet, udføres en række belægninger for at vurdere og derefter trække denne korrektion fra målværdien.
      5. Opbevar prøverne under vakuum for at beskytte dem mod den omgivende luft indtil og under alle SEM-analyser.
        BEMÆRK: Arten af det metal, der bruges til forstøvning, betyder noget. Pt, på trods af at det er et almindeligt materiale, resulterer i en belægning af dårlig kvalitet med en Pt-filmtykkelse tilpasset septinfilamenter (1,5 nm). Ved høje opløsninger mangler en 1,5 nm Pt-film kohæsivitet; størrelsen af Pt-klyngerne og septinfilamenterne bliver derved ens, hvilket fører til fejlfortolkninger under filamentsegmenteringsprocessen33 (se figur 2A, indsat). Wolfram er et godt alternativ til Pt, fordi det viser en mindre kornstørrelse, næppe synlig ved SEM med høj opløsning (se figur 2B, indsat). Ikke desto mindre oxideres ren wolfram let, hvilket fører til artefakter med stærk opladningseffekt under SEM-observation, hvis proceduren beskrevet i trin 3.3.4. følges ikke nøje.
  4. Få billederne ved hjælp af et feltemissionssem SEM (FESEM) mikroskop.
    BEMÆRK: SEM-teknologier er for nylig blevet opgraderet for at forbedre opløsningen, og teknologierne afhænger af producenten (f.eks. Elektronoptik, stråledeceleration, magnetisk linse). Denne forstærkning i opløsning (tilgængelig hos flere producenter), især ved en lav accelererende spænding (nær nanometeret ved 1 kV), er nødvendig for at løse nanometriske strukturer svarende til septinnetværk.
    1. Opnå billeddannelse i høj opløsning gennem detektion af primære sekundære elektroner (SE1) med "in-lens" -detektoren ved hjælp af følgende indstillinger.
    2. Indstil accelerationsspændingen til 3 kV. Strålestrømmen fastgøres med blænden på 20 μm (for Zeiss Gemini I-søjler eller svarende til 34 pA) eller med blænden på 15 μm (for Zeiss Gemini I-søjler eller svarende til 18,5 pA), hvis det er nødvendigt at undertrykke ladeeffekter.
    3. Til observationer skal du bruge opløsninger fra 21,25 nm/pixel til 1,224 nm/pixel, og til dataanalyse skal du bruge en opløsning på ~5,58 nm/pixel (20.000x forstørrelse i henhold til Polaroid 545-referencen).
    4. Indstil arbejdsafstanden mellem 1 mm og 2 mm for observation i høj opløsning og omkring 3 mm, hvis der kræves en øget dybdeskarphed. Juster scanningshastigheden og linjeintegrationen kontinuerligt for at sikre et konstant signal/støj-forhold med en anskaffelsestid på omkring 30-45 s pr. billede.

Figure 2
Figur 2: Effekt af materialet deponeret på septinfilamenter på bølgede PDMS-mønstre. SEM af septinfilamenter belagt ved forstøvning med enten (A) 1,5 nm platin, der udviser det "tørre revnede jord" -mønster, der er typisk for manglende kohæsivitet mellem klyngerne af platinkerner, eller (B) 1,5 nm wolfram dækket med et glat og sammenhængende lag. Skala bar = 200 nm. Hvide firkantede felter repræsenterer de forstørrede visninger nederst til højre. De sfæriske kugler er små lipidvesikler, der interagerer med septinerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GUVs deformationer
Typiske konfokale fluorescensbilleder af GUV'er omformet efter inkubation med septiner vises i figur 3 under forhold, hvor septiner polymeriserer. Bare GUV'er (figur 3A) var perfekt sfæriske. Ved inkubation med mere end 50 nM spirende gærseptinfilamenter syntes vesiklerne deformerede. Op til en koncentration på 100 nM spirende gærseptinoktomerer syntes vesiklerne facetterede, og deformationerne forblev statiske og svingede således ikke (figur 3B). Over 200 nM spirende gærseptiner, hvor membranen var mættet med septiner, blev der observeret periodiske deformationer (figur 3C). Ved hjælp af spirende gærseptiner blev pigge visualiseret med en periodicitet varierende fra 2 μm til 6 μm og med en amplitude på ca. 1 μm. Derfor omformer septiner stærkt membraner på en bestemt måde. Disse amplituder og tilhørende krumninger af de observerede deformationer afspejler slående affiniteten af septiner til mikrometerkrumninger observeret i celler. GUV'er, der er deformerbare, er således egnede til at analysere, hvordan proteiner omformer membraner.

Figure 3
Figur 3: Septin-induceret deformation af GUV'er. (A) Ækvatorialt kontrolplan GUV'er mærket med 0,5% rhodamin PE og afbildet ved konfokal mikroskopi. Skalabjælke = 3 μm. (B) GFP-septiner (100 nM) bundet til en deformeret GUV og afbildet ved fluorescenskonfokal mikroskopi. Skalabjælke = 1 μm. (C) GFP-septiner (600 nM) bundet til en deformeret GUV og afbildet ved fluorescensspindende diskmikroskopi. Skala bar = 10 μm. GUV'erne er lavet af et molært forhold på 56,8% EggPC, 15% kolesterol, 10% DOPE, 10% DOPS, 8% hjerne PI (4,5) P2 og 0,2% Bodipy-TR-Ceramid. Observationsbufferen omfatter 75 mM NaCl og 10 mM Tris (pH = 7,8). Klik her for at se en større version af denne figur.

Selvmontering af septinfilamenter bundet til LUV'er afbildet af cryo-EM
Sammenlignet med fluorescensmikroskopi giver cryo-EM bedre rumlig opløsning. Individuelle septinfilamenter og lipiddobbeltlag kan således skelnes entydigt i billeder. Figur 4A viser et billede af LUV'er dekoreret med spirende gærseptinfilamenter (nogle af dem er fremhævet med blåt) ved 50 nM. Parallelle sæt filamenter, ca. 10 nm fra hinanden, blev observeret på LUV'erne. Dette typiske billede er en 2D-projektion. For at dechiffrere enhver 3D-deformation og for at vide, om septinfilamenter direkte interagerer med membranen, blev kryo-elektrontomografi udført (figur 4B og figur 4C). Figur 4B viser et udsnit i en 3D-rekonstruktion, mens figur 4C viser en segmentering af det samme område, der fremhæver membranen i gul og septinfilamenterne i blåt. Som det ses på sidevisningen, forblev septinfilamenter i det væsentlige lige bundet til liposomet, og vesiklen blev betydeligt fladt sammenlignet med de nøgne sfæriske vesikler.

Figure 4
Figur 4: Selvmontering af septinfilamenter bundet til LUV'er. (A) Cryo-EM-billede af septinfilamenter bundet til en vesikel. Nogle af filamenterne er fremhævet med blåt for synlighed. De mørke prikker er guldfiducialer, der normalt bruges til at justere data til tomografi. Skala bar = 100 nm. (B) og (C) 3D-rekonstruktion opnået fra en vippet serie. Lipiderne er fremhævet med gult, mens septinerne er segmenteret i blåt. Vægtstænger = 200 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Krumningsafhængigt arrangement af septinfilamenter visualiseret af SEM
Septiner lokaliseres i celler på steder, der viser mikrometerkrumninger (f.eks. Ved celledelingsfuren, bunden af cilia osv.). Derudover viser in vitro-undersøgelser , at septiner, som set ovenfor, kan omforme membraner, så de til sidst viser mikrometerkrumninger. For at analysere septiners krumningsfølsomhed for både positive (konvekse) og negative (konkave) krumninger blev septiner inkuberet med et understøttet lipiddobbeltlag smeltet sammen med de bølgede mønstre beskrevet ovenfor. Resultatet fremgår af figur 5. Figur 5A rekapitulerer de forskellige trin, der kræves for at opnå prøverne. Figur 5B viser et bølget mønster ved lav forstørrelse, hvor periodiciteten af negative og positive krumninger er tydeligt synlig. To på hinanden følgende bølger er angivet med orange faste linjer. Defekter omtrent ortogonale til bølgerne er angivet med hvide pile. Figur 5C og figur 5D viser den ultrastrukturelle organisering af septinfilamenter ved højere forstørrelse. Septinerne samledes i sæt parallelle filamenter, hvis orientering afhang af krumningen (se filamenter fremhævet med blåt). Faktisk var septinfilamenterne ikke orienteret tilfældigt. I stedet kan septiner bøjes, når de interagerer med negative (konkave) krumninger for at følge den pålagte krumning. Omvendt forblev septinfilamenterne på positive krumninger lige, ubøjet og justeret langs de konvekse bølger. Derfor kan septiner interagere med både positive og negative krumninger, men vedtage specifikke organisationer på givne krumninger. Denne metode forekommer således særlig relevant for at fremhæve krumningsfølsomheden af binding og selvmontering af trådformede proteiner.

Figure 5
Figur 5: Krumningsafhængigt arrangement af septinfilamenter. (A) Skematisk repræsentation af de trin, der kræves for at opnå de "bølgede" prøver, der er beregnet til at analysere septinkrumningsfølsomhed gennem SEM. (B) SEM-billede med lav forstørrelse af et bølget mønster med bundne septinfilamenter, der ikke løses ved denne opløsning. To på hinanden følgende bølger er fremhævet med orange. Ortogonale defekter er angivet med hvide pile. Skalabjælke = 10 μm. (C) SEM-billede ved 10.000x forstørrelse, hvor septinfilamenter er synlige. Skalalinje = 1 μm. (D) SEM-billede ved 20.000x forstørrelse. Nogle af filamenterne er fremhævet med blåt for synlighed. Skala bar = 200 nm. De sfæriske objekter, der er til stede i billederne, er små vesikler, der interagerer med septinerne og substratet. Septinkoncentrationen blev sat til 200 nM i B-D. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som nævnt ovenfor er der anvendt en lipidblanding, der forbedrer PI (4,5) P 2-inkorporering i lipiddobbeltlaget og letter dermed septin-membraninteraktioner. Faktisk har vi vist andetsteds25, at spirende gærseptiner interagerer med vesikler på en PI (4,5) P2-specifik måde. Denne lipidsammensætning blev justeret empirisk fra screening af flere sammensætninger og anvendes nu i vid udstrækning af forfatterne. PI(4,5)P2 lipider skal håndteres omhyggeligt. Stamopløsninger skal alikvoteres i små mængder, således at et specifikt hætteglas ikke åbnes mere end to gange til pipettering. Desuden bør lipidalquoter opbevares under argon for at forhindre lipidoxidation. Endelig, når lipidblandingerne er oplukket i en vandig opløsning, skal blandingen anvendes straks og kan ikke opbevares til yderligere forsøg. Især efter GUV-rekonstitution eller understøttet lipid dobbeltlagsfusion reduceres interaktionen mellem septiner og lipider kraftigt efter 2 timer.

Nogle af resultaterne opnået med oktomere spirende gærseptinkomplekser (omslutter Cdc10, Cdc11, Cdc12 og Cdc3) er blevet præsenteret her; De eksperimentelle procedurer, der følges for at analysere opførelsen af septinkomplekser fra andre arter, bør dog være identiske.

For at generere GUV'er foretrækker vi elektrodannelsesmetoden ved hjælp af platintråde frem for elektrodannelse på ITO-plader eller PVA-hævelse. Som demonstreret tidligere25 producerer denne metode reproducerbart unilamellare GUV'er af god kvalitet uden fejl.

De bølgede underlag kan designes med en bred vifte af krumninger. Efter screening af forskellige designs er mønstre med en periodicitet på 2 μm og en amplitude på 250 nm, som genererer krumninger fra -3,5 μm-1 til 3,5 μm-1 (± 0,5 um-1), blevet anvendt konsekvent. Ved hjælp af mønstre med en kort periodicitet og højere amplitude var lipiddobbeltlaget ikke pænt i overensstemmelse med overfladen. I tilfælde af højere krumning ville dobbeltlaget ofte blive suspenderet mellem to konvekse bølger i stedet for at være fuldt understøttet på NOA-substratet. Med lavere amplituder og større periodicitet organiserede septiner med tilfældige nematiske orienteringer, hvilket indikerer, at mønstrene var for flade. Desuden har brug af bølgede mønstre i stedet for cylindriske rør20 eller kugler20 den fordel, at både positive og negative krumninger kan testes samtidigt. I fremtiden vil det være relevant at undersøge filamenternes opførsel på gaussiske "sadellignende" krumninger for at efterligne krumningen af mere realistiske cellulære sammenhænge.

I opløsning inducerede blanding af LUV'er med septiner dannelsen af septin-lipidaggregater selv ved lave koncentrationer af proteiner og lipider. Prøverne var således heterogene, og det er klogt at kigge efter tyndere isdomæner, hvor der findes mindre og mere definerede septin-vesikelobjekter. Dette er især afgørende, når man vælger interesseområder, hvor kryo-tomografi skal udføres. Ofte, selv ved lave forstørrelser, er vesikler, der viser fremspring af stærke deformationer sammenlignet med sfæriske vesikler, mere tilbøjelige til at have en høj densitet af septinfilamenter bundet. Denne protokol fokuserer på at opnå en beskrivelse af den globale ultrastruktur af filamenter på biomimetiske membraner. I øjeblikket er højere opløsninger tilgængelige. Opløsningsbegrænsningen skyldes det begrænsede antal visninger, der er tilgængelige ved billedbehandling. Dette ligger dog uden for denne protokols anvendelsesområde.

Vi har gennem denne protokol vist, at en kombination af komplementære metoder er afgørende for at forstå og dissekere, hvordan det specifikke arrangement af cytoskeletale septinfilamenter kan sanse og omforme membraner på en krumningsafhængig måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Patricia Bassereau og Daniel Lévy for deres nyttige råd og diskussioner. Dette arbejde modtog støtte fra ANR (Agence Nationale de la Recherche) til finansiering af projektet "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 og projektet "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin er finansieret af Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" og Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa blev støttet af Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink blev støttet af Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) gennem »BaSyC-Building a Synthetic Cell«. Gravitationstilskud (024.003.019). Vi takker Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) og Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Vi takker Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, medlem af den franske nationale forskningsinfrastruktur France-BioImaging (ANR10-INBS-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids 840035
Bath sonicator Elma Elmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramide invitrogen, Thermo Fischer scientific 11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol Sigma Aldrich
Confocal microscope nikon spinning disk or confocal
Critical point dryer Leica microsystems CPD300
Deionized water generator MilliQ F1CA38083B MilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051
Field Emission Gun SEM (FESEM) Carl Zeiss Gemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution Thermo Fischer scientific 50-262-19
High vacuum grease, Dow corning VWR
IMOD software https://bio3d.colorado.edu/imod/ software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids Eloise 01883-F
Lipids Avanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046
Metal evaporator Leica microsystems EM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 Norland Products NOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4% delta microscopies 19170
Osmometer Löser 15 M
Plasma cleaner Alcatel pascal 2005 SD
Plasma generator Electron Microscopy Science
Plunge freezing equipment leica microsystems EMGP
Transmission electron microscope Thermofischer Tecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetate Electron Microscopy Science 22451 this product is not available for purchase any longer
Wax plates, Vitrex VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -H., Kuo, Y. -C., Chiang, H. -S., Kuo, P. -L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, Pt 1 79-89 (1998).

Tags

Biologi udgave 186
Bottom-up <em>in vitro-metoder</em> til analyse af den ultrastrukturelle organisation, membranomformning og krumningsfølsomhedsadfærd hos septiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chauvin, B., Nakazawa, K., Beber,… More

Chauvin, B., Nakazawa, K., Beber, A., Di Cicco, A., Hajj, B., Iv, F., Mavrakis, M., Koenderink, G. H., Cabral, J. T., Trichet, M., Mangenot, S., Bertin, A. Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins. J. Vis. Exp. (186), e63889, doi:10.3791/63889 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter