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Biology

नीचे-ऊपर कृत्रिम परिवेशीय तरीके अल्ट्रास्ट्रक्चरल संगठन, झिल्ली रीशेपिंग, और सेप्टिन के वक्रता संवेदनशीलता व्यवहार परख करने के लिए

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63889
Automatic Translation
*1, *1, 1,7, 1, 1, 2, 2, 3, 4, 5, *6, *1
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

Summary

सेप्टिन साइटोस्केलेटल प्रोटीन हैं। वे लिपिड झिल्ली के साथ बातचीत करते हैं और समझ सकते हैं लेकिन माइक्रोन पैमाने पर झिल्ली वक्रता भी उत्पन्न कर सकते हैं। हम झिल्ली विकृतियों, वक्रता-संवेदनशील सेप्टिन बाइंडिंग और सेप्टिन फिलामेंट अल्ट्रास्ट्रक्चर का विश्लेषण करने के लिए इन विट्रो पद्धतियों में इस प्रोटोकॉल में नीचे-ऊपर का वर्णन करते हैं।

Abstract

झिल्ली रीमॉडेलिंग प्लाज्मा झिल्ली पर और सेलुलर ऑर्गेनेल के भीतर लगातार होती है। पर्यावरण (आयनिक स्थितियों, प्रोटीन और लिपिड रचनाओं, झिल्ली वक्रता) और विशिष्ट झिल्ली रीशेपिंग प्रक्रियाओं से जुड़े विभिन्न भागीदारों की भूमिका को पूरी तरह से विच्छेदित करने के लिए, हम इन विट्रो बॉटम-अप दृष्टिकोण करते हैं। हाल के वर्षों में, प्रमुख बीमारियों से जुड़े सेप्टिन प्रोटीन की भूमिका का खुलासा करने में गहरी रुचि रही है। सेप्टिन आवश्यक और सर्वव्यापी साइटोस्केलेटल प्रोटीन हैं जो प्लाज्मा झिल्ली के साथ बातचीत करते हैं। वे अन्य कार्यों के बीच कोशिका विभाजन, कोशिका गतिशीलता, न्यूरो-मॉर्फोजेनेसिस और शुक्राणुजनन में फंस गए हैं। इसलिए, यह समझना महत्वपूर्ण है कि सेप्टिन झिल्ली पर कैसे बातचीत करते हैं और बाद में झिल्ली विकृतियों को प्रेरित करते हैं और वे विशिष्ट झिल्ली वक्रता के प्रति संवेदनशील कैसे हो सकते हैं। इस लेख का उद्देश्य आणविक स्तर पर सेप्टिन की अल्ट्रा-संरचना और माइक्रोन पैमाने पर होने वाली झिल्ली रीमॉडेलिंग के बीच परस्पर क्रिया को समझना है। इसके लिए, नवोदित खमीर, और स्तनधारी सेप्टिन परिसरों को पुनः संयोजक रूप से व्यक्त और शुद्ध किया गया था। इन विट्रो परखों का एक संयोजन तब झिल्ली पर सेप्टिन की आत्म-असेंबली का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया था। समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी), विशाल यूनिलामेलर पुटिकाएं (जीयूवी), बड़े यूनिलामेलर पुटिकाएं (एलयूवी), और लहराती सब्सट्रेट का उपयोग सेप्टिन स्व-असेंबली, झिल्ली रीशेपिंग और झिल्ली वक्रता के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए किया गया था।

Introduction

सेप्टिन साइटोस्केलेटल फिलामेंट बनाने वाले प्रोटीन हैं जो लिपिड झिल्ली के साथ बातचीत करते हैं। सेप्टिन यूकेरियोट्स में सर्वव्यापी हैं और कई सेलुलर कार्यों के लिए आवश्यक हैं। उन्हें नवोदित खमीर और स्तनधारियों 1,2 में कोशिका विभाजन के मुख्य नियामकों के रूप में पहचाना गया है। वे झिल्ली रीशेपिंग घटनाओं, सिलियोजेनेसिस3 और शुक्राणुजनन4 में शामिल हैं। स्तनधारी कोशिकाओं के भीतर, सेप्टिन आरएचओ जीटीपीस (बीओआरजी) -निर्भर तरीके से एक बांधने की मशीन में एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं 5,6,7 के साथ भी बातचीत कर सकते हैं। विभिन्न ऊतकों (न्यूरॉन्स9, सिलिया3, शुक्राणुजोज़ा10) में, सेप्टिन को झिल्ली-बाध्य घटकों11 के लिए प्रसार बाधाओं के नियामकों के रूप में पहचाना गया है। सेप्टिन को झिल्ली ब्लीबिंग और फलाव गठन को विनियमित करने के लिए भी दिखाया गया है12. सेप्टिन, मल्टी-टास्किंग प्रोटीन होने के नाते, विभिन्न प्रचलित बीमारियों के उद्भव में फंस गए हैं13. उनका मिसरेगुलेशन कैंसर14 और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के उद्भव से जुड़ा हुआ है15.

जीव के आधार पर, कई सेप्टिन सबयूनिट्स (मनुष्यों में 13 केनोरहाब्डिटिस एलिगेंस में दो) कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए इकट्ठा होते हैं जिनका संगठन ऊतक-निर्भर फैशन16 में भिन्न होता है। मूल सेप्टिन बिल्डिंग ब्लॉक दो से चार सबयूनिट्स को इकट्ठा करता है, जो दो प्रतियों में मौजूद होते हैं और रॉड जैसे पैलिंड्रोमिक तरीके से स्व-इकट्ठे होते हैं। नवोदित खमीर में, सेप्टिन ऑक्टामेरिक17,18 होते हैं। सीटू में, सेप्टिन को अक्सर माइक्रोमीटर वक्रता वाली साइटों पर स्थानीयकृत किया जाता है; वे विभाजन कसना स्थलों पर, सिलिया और डेंड्राइट्स के आधार पर, और शुक्राणुजोज़ा19,20 के वार्षिकी पर पाए जाते हैं। झिल्ली पर, सेप्टिन की भूमिका दोहरी प्रतीत होती है: वे लिपिड बाइलेयर को फिर से आकार देने और झिल्ली अखंडता को बनाए रखने में फंस गए हैं21. इसलिए, झिल्ली पर सेप्टिन फिलामेंट बनाने वाले प्रोटीन और / या सबयूनिट्स के बायोफिजिकल गुणों की जांच करना उनकी भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। एक अच्छी तरह से नियंत्रित वातावरण में सेप्टिन के विशिष्ट गुणों को विच्छेदित करने के लिए, इन विट्रो दृष्टिकोण में नीचे-ऊपर उपयुक्त हैं। अब तक, केवल कुछ समूहों ने इन विट्रो20,22,23 में सेप्टिन के बायोफिजिकल गुणों का वर्णन किया है। इसलिए, अन्य साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स की तुलना में, इन विट्रो में सेप्टिन के व्यवहार पर वर्तमान ज्ञान सीमित रहता है।

यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि सेप्टिन फिलामेंट्स, झिल्ली रीशेपिंग और वक्रता संवेदनशीलता के संगठन का विश्लेषण कैसे किया जा सकता है19. इसके लिए, ऑप्टिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधियों (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी [क्रायो-ईएम], और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी [एसईएम]) के संयोजन का उपयोग किया गया है। माइक्रोमीटर के आकार के विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) की झिल्ली को प्रतिदीप्ति ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना की जाती है। लिपिड पुटिकाओं से बंधे सेप्टिन फिलामेंट्स की व्यवस्था और अल्ट्रास्ट्रक्चर का विश्लेषण क्रायो-ईएम का उपयोग करके किया जाता है। सेप्टिन वक्रता संवेदनशीलता का विश्लेषण एसईएम का उपयोग करके किया जाता है, चर वक्रता के लहराती सब्सट्रेट पर जमा ठोस समर्थित लिपिड बाइलेयर से बंधे सेप्टिन फिलामेंट्स के व्यवहार का अध्ययन करके, जो सकारात्मक और नकारात्मक वक्रता दोनों के लिए वक्रता संवेदनशीलता के विश्लेषण को सक्षम बनाता है। पिछले विश्लेषण20,24 की तुलना में, यहां, हम अच्छी तरह से विश्लेषण करने के लिए तरीकों के संयोजन का उपयोग करने का प्रस्ताव करते हैं कि सेप्टिन कैसे आत्म-इकट्ठा हो सकते हैं, सहक्रियात्मक रूप से झिल्ली को विकृत कर सकते हैं, और वक्रता-संवेदनशील हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल को झिल्ली के लिए एक आत्मीयता प्रदर्शित करता है कि किसी भी फिलामेंटस प्रोटीन के लिए उपयोगी और अनुकूलनीय माना जाता है।

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Protocol

1. विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) का उपयोग करके झिल्ली को फिर से आकार देने का निर्धारण

नोट: इस खंड में, जीयूवी संभवतः सेलुलर संदर्भ में सेप्टिन द्वारा प्रेरित झिल्ली विकृतियों की नकल करने के लिए उत्पन्न होते हैं। दरअसल, कोशिकाओं में, सेप्टिन अक्सर माइक्रोमीटर वक्रता वाले स्थलों पर पाए जाते हैं। जीयूवी में कुछ से दसियों माइक्रोमीटर तक के आकार होते हैं और विकृत हो सकते हैं। इस प्रकार वे किसी भी माइक्रोमीटर-स्केल सेप्टिन-प्रेरित विकृतियों को परखने के लिए उपयुक्त हैं। फ्लोरोसेंट लिपिड, साथ ही फ्लोरोसेंटली लेबल वाले सेप्टिन (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन [जीएफपी] का उपयोग करके), प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से लिपिड और प्रोटीन दोनों के व्यवहार का पालन करने के लिए उपयोग किया जाता है।

  1. बफ़र्स और समाधान की तैयारी
    1. जीयूवी विकास बफर (50 एमएम एनएसीएल, 50 एमएम सुक्रोज, और 10 एमएम ट्रिस [पीएच = 7.8]) और अवलोकन बफर (75 एमएम एनएसीएल और 10 एमएम ट्रिस [पीएच = 7.8]) तैयार करें।
    2. मापें (एक वाणिज्यिक ऑस्मोमीटर का उपयोग करके) और अवलोकन और विकास बफर की परासरणता को समायोजित करें (170 एमओएमओएमओएल · एल -1, सिद्धांत रूप में) एनएसीएल की थोड़ी मात्रा को जोड़कर जब तक कि उनके संबंधित ऑस्मोलरिटी बराबर न हों। एक 0.2 μm फिल्टर का उपयोग कर बफ़र्स फ़िल्टर करें। विकास बफर को विभाज्य करें और इसे आगे के उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अवलोकन बफर स्टोर करें।
      नोट: दोनों बफ़र्स के बीच परासरणता में अंतर 5% से अधिक नहीं होना चाहिए।
    3. अवलोकन बफर में 5 मिलीग्राम एमएल -1 β-कैसिइन समाधान तैयार करें। पूर्ण विघटन सुनिश्चित करें (चुंबकीय सरगर्मी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर कई घंटों के बाद)। समाधान को 0.2 μm फ़िल्टर, विभाज्य के साथ फ़िल्टर करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. क्लोरोफॉर्म में 3 मिलीग्राम एमएल -1 की कुल लिपिड एकाग्रता पर लिपिड मिश्रण तैयार करें। 56.8% अंडे एल-α-फॉस्फेटिडिलकोलाइन (एगपीसी), 15% कोलेस्ट्रॉल, 10% 1,2-डायोलियोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोथेनॉलमाइन (डीओपीई), 10% 1,2-डायोलॉयल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फो-एल-सेरीन (डीओपीएस), 8% मस्तिष्क एल-α-फॉस्फेटिडिलिनो की संरचना (मोल%) का उपयोग करें
    नोट: नाइट्राइल दस्ताने और सुरक्षा चश्मा का उपयोग करके एक धूआं हुड के तहत क्लोरोफॉर्म को संभालें। कांच सिरिंज के साथ पिपेट क्लोरोफॉर्म समाधान और प्लास्टिक से बचें क्योंकि क्लोरोफॉर्म प्लास्टिक को भंग कर देता है। उपयोग से पहले और बाद में, क्लोरोफॉर्म 5x-10x पाइपिंग द्वारा सिरिंज कुल्ला। क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए विंदुक विशिष्ट फ्लोरोसेंट लिपिड के लिए अलग-अलग सिरिंज का उपयोग करें। लिपिड को टेफ्लॉन के साथ कैप किए गए एम्बर ग्लास शीशी में -20 डिग्री सेल्सियस पर क्लोरोफॉर्म में संग्रहीत किया जा सकता है। शीशियों को बंद करने से पहले आर्गन से भरा जाना चाहिए और किसी भी लिपिड ऑक्सीकरण को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ सील किया जाना चाहिए।
  3. प्लैटिनम तारों सेटअप का उपयोग करके जीयूवी का इलेक्ट्रो-गठन
    नोट: चित्रा 1 प्रयोगात्मक चरणों की योजना और कक्ष की एक तस्वीर प्रस्तुत करता है।
    1. किसी भी लिपिड अवशेषों को हटाने के लिए चैंबर और प्लैटिनम तारों को अच्छी तरह से साफ करें।
    2. तारों और कक्ष को एसीटोन में डुबोएं और 10 मिनट के लिए सोनीकेट करें। एसीटोन का उपयोग करके उन्हें एक पेपर ऊतक के साथ सावधानी से पोंछें।
    3. तारों को सम्मिलित करके कक्ष को इकट्ठा करें, एसीटोन में फिर से डुबकी लगाएं, और 10 मिनट के लिए सोनीकेट करें। एसीटोन के साथ एक बार फिर पोंछें, सुनिश्चित करें कि तार पूरी तरह से साफ हो गए हैं। इथेनॉल में कक्ष डुबकी, 10 मिनट के लिए सोनीकेट, और इथेनॉल के साथ पोंछ।
    4. अंत में, कक्ष को विआयनीकृत पानी में डुबोएं, 10 मिनट के लिए सोनीकेट करें, और नाइट्रोजन या हवा की धारा के साथ सूखें।
      नोट: टेफ्लॉन चैंबर (चित्रा 1 बी) इन-हाउस कार्यशाला में कस्टम-निर्मित था। यह तीन डिब्बों को समायोजित करता है जिन्हें ग्लास कवरलिप्स का उपयोग करके दोनों तरफ सील किया जा सकता है। प्लैटिनम तारों को 1.3 मिमी व्यास छेद के माध्यम से कक्ष में डाला जा सकता है।
    5. कक्ष की सफाई के बाद, प्रत्येक प्लैटिनम तार पर 3 मिलीग्राम एमएल -1 लिपिड मिश्रण के प्रति डिब्बे में 3-4 बूंदें जमा करें (प्रत्येक बूंद लगभग 0.1 μL है)।) तारों को 180 ° तक घुमाएं और प्रत्येक प्लैटिनम तार के विपरीत तरफ प्रति डिब्बे 3-4 लिपिड बूंदों को जमा करें। सुनिश्चित करें कि बूंदें एक दूसरे से संपर्क न करें। लिपिड मिश्रण के बारे में 5 μL पूरे कक्ष प्रति की आवश्यकता है।
    6. क्लोरोफॉर्म के किसी भी निशान को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम चैंबर में विकास कक्ष रखें।
      नोट: गहरी वैक्यूम (0.1 एमबार) सबसे अच्छा है। जब सूख जाता है, तो लिपिड ऑक्सीकरण के लिए कमजोर होते हैं और इसलिए, कुछ मिनटों से अधिक समय तक हवा में नहीं छोड़ा जाना चाहिए।
    7. एक सिरिंज का उपयोग करके तीन डिब्बों की परिधि के साथ कक्ष (तारों के निकटतम पक्ष) के तल पर उच्च-वैक्यूम ग्रीस जमा करें और सही सीलिंग सुनिश्चित करने के लिए ग्रीस के खिलाफ एक साफ (22 मिमी x 40 मिमी) कवरस्लिप दबाएं। सीलिंग पेस्ट (मोम प्लेटों) का उपयोग करके कक्ष के दोनों छोरों (यानी, तारों के प्रवेश / निकास स्थलों पर) को सील करें। इसी तरह, चैंबर के दूसरी तरफ वैक्यूम ग्रीस लागू करें।
    8. एक पिपेट का उपयोग कर विकास बफर (~ 1 एमएल प्रति कक्ष) के साथ डिब्बों भरें। तारों से लिपिड फिल्म की किसी भी टुकड़ी को रोकने के लिए समाधान को बहुत तेजी से या दृढ़ता से हलचल न करें। तेल के खिलाफ दबाकर 22 मिमी x 40 मिमी कवरस्लिप का उपयोग करके कक्ष के शीर्ष को सील करें। हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए, धीरे से ग्लास कवरस्लिप को केंद्र से किनारों तक दबाएं।
      1. कक्ष को 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में रखें और तारों को एक लहर फ़ंक्शन जनरेटर (500 हर्ट्ज पर साइन फ़ंक्शन) से कनेक्ट करें। एक छोटी वृद्धि अवधि (यानी, 6 घंटे) या लंबी वृद्धि अवधि (यानी, 12-16 घंटे) के लिए 250 एमवी का एक प्रभावी वोल्टेज सेट करें, जैसा कि पहले से ही प्रस्तुत किया गया है और बेबर एट अल 25 द्वारा एक अध्ययन में अनुकूलित किया गया है।
    9. कवरलिप्स निकालें, सीलेंट और ग्रीस को पोंछें, और तारों को हटा दें। बारी-बारी से पानी और इथेनॉल (≥70%) का उपयोग करके एक पेपर ऊतक के साथ कक्ष को धोएं और साफ़ करें।
      नोट: जीयूवी विकास के लिए इष्टतम वोल्टेज और समय पैमाने कई मापदंडों पर निर्भर करते हैं, बफर नमक एकाग्रता से कक्ष ज्यामिति (यानी, तारों और कक्ष आकार के बीच की दूरी)। प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग दोहराया जाता है हर बार एक ही कक्ष का उपयोग करें। तार कक्ष के नीचे निकटता में हैं ताकि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लिपिड को चित्रित किया जा सके। इलेक्ट्रो-गठन प्रक्रिया सफल है यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक चरण में लिपिड की छवि ( चित्रा 1 सी, डी देखें)।
  4. पुटिकाओं के साथ सेप्टिन इनक्यूबेशन
    1. तारों के करीब लाया जाता है कि पूर्व कट विंदुक युक्तियाँ (~ 1 मिमी खोलने) का उपयोग कर तारों से जीयूवी ले लीजिए। फिर, तार के साथ समाधान पिपेट करें। यह प्रक्रिया मजबूत लैमेलर प्रवाह की पीढ़ी को रोकती है जो जीयूवी को बाधित कर सकती है। इस चरण के बाद, विंदुक युक्तियों को काटने की अब आवश्यकता नहीं है। दरअसल, लैमेलर प्रवाह समाधान में जीयूवी को नुकसान नहीं पहुंचाता है।
      नोट: लिपिड मिश्रण में पीआई (4,5) पी2 की उपस्थिति के कारण, एकत्र किए गए जीयूवी को प्रयोग से पहले 2-3 घंटे से अधिक समय तक संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए। दरअसल, पीआई (4,5) पी2 तेजी से घुलनशील हो जाता है और सेप्टिन अब उनके गठन के कुछ घंटों बाद झिल्ली से नहीं बंधते हैं। हालांकि, एक बार सेप्टिन झिल्ली से बंधे होने के बाद, वे कुछ दिनों के लिए बाध्य रहते हैं।
    2. ट्रिस 10 एमएम (पीएच 8) में सेप्टिन स्टॉक समाधान को पतला करें ताकि विशेष रूप से विकास बफर के बराबर परासरण तक पहुंचा जा सके; यदि आवश्यक हो, तो अवलोकन बफर में सेप्टिन समाधान को और पतला करें। एकत्रित जीयूवी की इच्छित मात्रा जोड़ें (200 μL की कुल मात्रा के लिए 50-100 μL)। β-कैसिइन (नीचे देखें) के साथ निष्क्रिय होने के बाद सीधे अवलोकन कक्ष में इनक्यूबेशन करें। संतुलन तक पहुंचने के लिए 20-30 मिनट प्रतीक्षा समय की आवश्यकता होती है।
      नोट: सेप्टिन ऑक्टामेरिक कॉम्प्लेक्स (मानव या नवोदित खमीर) की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण को अन्यलेखों 17 में बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है। संक्षेप में, सेप्टिन को एस्चेरिचिया कोलाई में व्यक्त किया गया था, आत्मीयता, आकार-बहिष्करण और आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी चरणों का उपयोग करके प्रयोगशाला में शुद्ध किया गया था, और 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8), 300 एमएम केसीएल, और ~ 1 मिलीग्राम एमएल -1 (3 μM) एकाग्रता पर 5 एमएम एमजीसीएल2 के जलीय घोल में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। सेप्टिन एकत्रीकरण से बचने के लिए एक उच्च नमक एकाग्रता का उपयोग किया जाता है। सेप्टिन कॉम्प्लेक्स को फिल्टर सेंट्रीफ्यूजेशन डिवाइस के माध्यम से केंद्रित नहीं किया जाना चाहिए, जो एकत्रीकरण को प्रेरित करता है और इस प्रकार प्रोटीन उपज को कम करता है।
  5. कन्फोकल और / या कताई डिस्क माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग
    1. या विस्फोट से रोकने के लिए, 30 मिनट के लिए 5 मिलीग्राम एमएल -1 β-कैसिइन समाधान के साथ इनक्यूबेट करके अवलोकन कक्ष को निष्क्रिय करें।
    2. β-कैसिइन समाधान निकालें और एक पिपेट का उपयोग करके अवलोकन कक्ष में सेप्टिन-जीयूवी समाधान (चरण 1.4.2.) स्थानांतरित करें। जीयूवी को 10-15 मिनट के लिए कक्ष के नीचे तलछट दें।
      नोट: जीयूवी और बाहरी बफर के इंटीरियर के बीच रचना विसंगति घनत्व और अपवर्तक सूचकांक बेमेल दोनों बनाती है। अपवर्तक सूचकांक बेमेल के कारण, जीयूवी ट्रांसमिशन लाइट ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ दिखाई देते हैं।
    3. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, जीयूवी की गुणवत्ता और झिल्ली लैमेलैरिटी राज्य की जांच करने के लिए लिपिड के फ्लोरोसेंट सिग्नल की कल्पना करें। एक उचित अंशांकन25 प्रदर्शन करने के बाद सेप्टिन फ्लोरोसेंट संकेत रिकॉर्डिंग द्वारा जीयूवी के लिए बाध्य सेप्टिन के घनत्व का आकलन करें। सेप्टिन और झिल्ली के बीच बातचीत से प्रेरित पुटिकाओं के 3 डी विकृतियों का विश्लेषण और कल्पना करने के लिए 0.4 μm स्थानिक अंतराल पर जेड-स्टैक अधिग्रहण करें।
      नोट: 60- या 100 गुना आवर्धन के साथ तेल विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग किया गया था। क्रमशः 250 एनएम और 110 एनएम के पिक्सेल आकार के साथ मानक कॉन्फोकल या कताई डिस्क माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका) का उपयोग किया गया था। किसी को उपकरण के दिए गए टुकड़े के लिए इमेजिंग स्थितियों को अनुकूलित करना चाहिए। समाधान में कोई विशिष्ट एंटी-फोटो विरंजन एजेंट नहीं जोड़ा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: जीयूवी का इलेक्ट्रो-गठन (ए) प्लैटिनम तारों का उपयोग करके इलेक्ट्रो-गठन प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) इलेक्ट्रो-गठन द्वारा जीयूवी उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लैटिनम तारों के साथ इकट्ठे टेफ्लॉन होम-मेड डिवाइस की तस्वीर। तार व्यास में 0.5 मिमी और 3 मिमी अलग हैं। (सी) विकास प्रक्रिया के दौरान ट्रांसमिशन ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे गए जीयूवी (गोलाकार वस्तुएं)। छवि के निचले भाग में अपारदर्शी क्षेत्र प्लैटिनम तार है। (डी) प्लैटिनम तार पर वृद्धि के दौरान फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ मनाया गया जीयूवी (गोल फ्लोरोसेंट ऑब्जेक्ट्स)। स्केल सलाखों = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सेप्टिन फिलामेंट्स के अल्ट्रास्ट्रक्चरल संगठन का विश्लेषण

नोट: पुटिकाएं मानक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधियों के साथ इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं। दरअसल, मानक नकारात्मक दाग विधियों का उपयोग करके नमूने सुखाए जाते हैं। निर्जलीकरण पर, पुटिकाओं को अविशिष्ट विकृतियों से गुजरने की संभावना होती है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर लिपिड प्रोट्रूशियंस होते हैं। क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इस प्रकार पुटिकाओं की विशिष्ट विकृतियों का निरीक्षण करने के लिए एक बेहतर रणनीति है। क्रायो-ईएम का उपयोग करते हुए, नमूने विट्रीफाइड बर्फ की एक पतली (~ 100-200 एनएम) परत के भीतर एम्बेडेड होते हैं, जो मूल राज्य के करीब नमूनों को संरक्षित करता है। हालांकि, जीयूवी पतली बर्फ के भीतर एम्बेडेड होने के लिए बहुत बड़े (कई दसियों माइक्रोमीटर) हैं और इस प्रकार ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किए गए हैं। इसलिए, बड़े यूनिलामेलर पुटिकाएं (एलयूवी), जिनका व्यास ~ 50-500 एनएम से होता है, यह निर्धारित करने के लिए उत्पन्न होते हैं कि सेप्टिन पुटिकाओं को कैसे विकृत कर सकते हैं और वे पुटिकाओं पर कैसे व्यवस्थित करते हैं।

  1. बड़े यूनिलेमेलर पुटिकाओं (एलयूवी) की पीढ़ी
    1. 57% एगपीसी, 15% कोलेस्ट्रॉल, 10% डोप, 10% डीओपीएस, और 8% मस्तिष्क पीआई (4,5) पी2) की दाढ़ संरचना के साथ क्लोरोफॉर्म में घुलनशील लिपिड मिश्रण के 50 μg तैयार करें, जिसे कांच की शीशी में झिल्ली के साथ सेप्टिन इंटरैक्शन को बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया गया है।
    2. शीशी में एक सूखे लिपिड फिल्म उत्पन्न करने के लिए आर्गन प्रवाह के तहत समाधान सूखी। लिपिड को पूरी तरह से सूखने के लिए 30 मिनट के लिए वैक्यूम के तहत शीशी रखो।
    3. 1 मिलीग्राम एमएल -1 की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जलीय घोल (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल [पीएच 8]; 50 एमएम केसीएल; 2 एमएम एमजीसीएल2) के 50 μL में लिपिड फिल्म को फिर से घुलनशील करें, 10 एस के लिए भंवर, और समाधान को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: सेप्टिन के साथ इनक्यूबेशन के लिए एलयूवी का उपयोग एक बार में किया जाना चाहिए। अन्यथा, पीआई (4,5) पी 2 घुलनशीलता के कारण प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन कमजोर होगा। यह क्रूड री-घुलनशीलता प्रक्रिया 50 एनएम से 500 एनएम तक के व्यास के साथ पुटिकाओं की एक विषम आबादी उत्पन्न करती है। इसलिए, व्यास की एक पूरी श्रृंखला और इस प्रकार वक्रता एक साथ परख की जाती है।
  2. उच्च नमक बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल [पीएच 8], 300 एमएम केसीएल, 2 एमएमएमजीसीएल 2) में क्रमशः 0.1 मिलीग्राम एमएल -1 (लगभग 300 एनएम) और 20 एनएम की अंतिम लिपिड और सेप्टिन सांद्रता पर घुलनशील लिपिड के साथ सेप्टिन सेते हैं। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए नमूना सेते हैं।
  3. नमूना विट्रीफाई करने के लिए डुबकी-ठंड
    1. प्लाज्मा जनरेटर उपकरण का उपयोग करके 5 एमए पर 30 एस के लिए कार्बन पक्ष पर चमक-निर्वहन छेद कार्बन ग्रिड (300 जाल) और आर्द्र वातावरण में डुबकी ठंड मशीन के अंदर ग्रिड डालें।
    2. ग्रिड के चमक-डिस्चार्ज कार्बन पक्ष पर नमूने के 4 μL (चरण 2.2.) को अवशोषित करें। नमूना सोखना से ठीक पहले, समाधान में 5-10 एनएम सोने के मोती जोड़ें, मामले में नमूने क्रायो-टोमोग्राफी द्वारा झुकी हुई श्रृंखला उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
      नोट: सोने के मोतियों के घनत्व की जांच की जानी चाहिए और अनुभवजन्य रूप से समायोजित किया जाना चाहिए और प्रदाता पर निर्भर करता है। अनुकूलित घनत्व देखने के क्षेत्र में 10-15 सोने के मोती है।
    3. धब्बा विपरीत तरफ नमूना ड्रॉप आकांक्षा करने के लिए नंगे पक्ष से नमूनों सूखी।
      नोट: सोख्ता समय आमतौर पर 4 एस है, और फिल्टर पेपर और सोख्ता बल की स्थिति बर्फ की गुणवत्ता (मोटाई) और सामग्री घनत्व को अनुकूलित करने के लिए फिल्टर पेपर के वैकल्पिक पदों का परीक्षण और स्क्रीनिंग करके अनुभवजन्य रूप से समायोजित की जाती है।
    4. ग्रिड को माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करें या उन्हें तरल नाइट्रोजन कंटेनर में स्टोर करें।
      नोट: पुटिकाओं के आकार में पॉलीडिस्पर्सिटी को समायोजित करने के लिए होली कार्बन ग्रिड का उपयोग करना आवश्यक है। विपरीत पक्ष से नमूने को सोख्ता ग्रिड पर जैविक सामग्री के बढ़े हुए सोखना का पक्षधर है।
  4. क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग
    1. क्रायो-ईएम अवलोकन के लिए सुसज्जित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) में ग्रिड डालें। बेहतर बर्फ (यानी, पतली और अच्छी तरह से विट्रीफाइड) प्रदर्शित करने वाले क्षेत्रों का चयन करने के लिए कम आवर्धन (आमतौर पर 120x आवर्धन पर) पर पूरे नमूने का नक्शा बनाकर पूरे ग्रिड को स्क्रीन करें।
    2. क्रायो-ईएम 2 डी डेटा संग्रह के लिए, नमूने की गुणवत्ता की जांच करने के लिए लगभग 2 ए प्रति पिक्सेल के पिक्सेल आकार पर छवियां एकत्र करें। सुनिश्चित करें कि सेप्टिन फिलामेंट्स और लिपिड बाइलेयर दोनों दिखाई दे रहे हैं।
    3. क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी डेटा संग्रह के लिए, विकृत पुटिकाओं को प्रदर्शित करने वाले ब्याज के क्षेत्रों का चयन करें। सुनिश्चित करें कि पर्याप्त सोने के मोती (कम से कम 10) देखने के क्षेत्र में मौजूद हैं।
    4. झुकी हुई श्रृंखला डेटा संग्रह के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर के अनुसार, ब्याज के क्षेत्र से काफी दूर होने के लिए फोकस और ट्रैकिंग पदों का चयन करें। -60 ° से +60 ° तक झुकाव कोण को बदलकर झुका हुआ श्रृंखला इकट्ठा करें, हर 2 ° -3 ° डिग्री में एक छवि एकत्र करें।
      नोट: कुल खुराक के बारे में होना चाहिए, या उससे कम, 100 इलेक्ट्रॉनों / डेटा संग्रह के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप के आधार पर पिक्सेल का आकार 1.3 ए से 2.1 ए तक भिन्न होता है। आदर्श रूप से, डेटा संग्रह के लिए एक कोणीय सममित योजना को निम्नानुसार पसंद किया जाता है: 0 °, -3 °, +3 °, -6 °, +6 °, -9 °, +9 ° [...] -60 °, +60 °। हालांकि, साइड-एंट्री माइक्रोस्कोप के गोनियोमीटर उन सममित योजनाओं को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त यांत्रिक स्थिरता प्रदान नहीं करते हैं। वैकल्पिक रूप से, अधिग्रहण को 0 ° से 34 ° पर शुरू किया जा सकता है, इसके बाद -2 ° से -60 ° तक दूसरा कोणीय अनुक्रम होता है, और 36 ° से 60 ° तक अंतिम अनुक्रम द्वारा समाप्त होता है। इसका उद्देश्य सबसे कम कोणों पर पहली छवियों (सबसे कम विकिरण क्षति के साथ) एकत्र करना है। इसके अलावा, पुटिकाओं और बाध्य सेप्टिन फिलामेंट्स की अल्ट्रास्ट्रक्चर की कल्पना करने के लिए, एक मानक क्रायो-ईएम माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है (200 केवी, लैंथेनम हेक्साबोराइड (एलएबी 6) फिलामेंट, और नमूना पक्ष प्रविष्टि)। हालांकि, यदि कोई आगे की छवि प्रसंस्करण (उदाहरण के लिए उप-टोमोग्राम औसत) को आगे बढ़ाने का लक्ष्य रखता है, तो प्रत्यक्ष डिटेक्टरों से लैस अंतिम पीढ़ी के क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक (एफईजी) माइक्रोस्कोप का उपयोग करना सबसे अच्छा है। इस प्रोटोकॉल में, हम 3 डी पुनर्निर्माण के अधिग्रहण के लिए हमारे विवरण को प्रतिबंधित करते हैं और उप-टोमोग्राम औसत छोड़ देते हैं।
  5. क्रायो-टोमोग्राफी और विभाजन से 3 डी पुनर्निर्माण
    1. झुका श्रृंखला छवि संरेखण और 3 डी पुनर्निर्माण26,27 के लिए आईएमओडी सॉफ्टवेयर सूट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें। आईएमओडी के भीतर, फिड्यूशियल (सोने के मोती) स्थिति के आधार पर झुकाव श्रृंखला संरेखण करें। इसके अलावा, यदि आवश्यक हो, तो आईएमओडी26 के भीतर कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन (सीटीएफ) निर्धारण और सुधार करें। अंत में, प्रत्येक चरण का कड़ाई से पालन करते हुए, आईएमओडी के साथ 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करें।
    2. डिस्प्ले के लिए आईएमओडी सॉफ्टवेयर सूट से 3 डीएमओडी27 का उपयोग करके मैन्युअल रूप से लिपिड बाइलेयर और सेप्टिन फिलामेंट्स को सेगमेंट करें।

3. एसईएम का उपयोग करके सेप्टिन की वक्रता संवेदनशीलता का विश्लेषण

नोट: यह समझने के लिए कि सेप्टिन माइक्रोमीटर वक्रता के प्रति संवेदनशील कैसे हो सकते हैं, माइक्रोमीटर-स्केल लहराती लहरदार पैटर्न पर जमा ठोस समर्थित लिपिड बाइलेयर के साथ सेप्टिन फिलामेंट कॉम्प्लेक्स को इनक्यूबेट करने के लिए एक इन विट्रो दृष्टिकोण का उपयोग किया गया है।

  1. लहराती पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) पैटर्न से लहराती एनओए (नॉरलैंड ऑप्टिकल चिपकने वाला) प्रतिकृति डिजाइन करना
    1. ब्याज के प्रोटीन के लिए उपयुक्त वक्रता परख करने के लिए 250 एनएम आयाम और 2 μm पार्श्व आवधिकता या अन्य आयामों के पीडीएमएस अनियंत्रित पैटर्न का उपयोग करें।
      नोट: पीडीएमएस अनडौलेटेड पैटर्न नानिया एट अल 28,29 में वर्णित के रूप में डिजाइन और उत्पन्न होते हैं।
    2. एक क्लीनरूम वातावरण में, व्यास में 1 सेमी के एक गोलाकार ग्लास कवरस्लिप पर तरल एनओए के 5 μL जमा करें और पीडीएमएस टेम्पलेट को ड्रॉप पर रखें। एक पतली बहुलक फिल्म में तरल एनओए को फोटो-पॉलीमराइज़ करने के लिए 5 मिनट के लिए यूवी प्रकाश (320 एनएम) के साथ इलाज करें। फिर, ताजा बहुलकीकृत एनओए के साथ कवरस्लिप से पीडीएमएस टेम्पलेट को धीरे से छील लें।
      नोट: एनओए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए उपयुक्त एक आम ऑप्टिकली पारदर्शी गोंद है। इसके अलावा, एनओए एसईएम इमेजिंग से पहले किए गए रासायनिक निर्धारण और धुंधला प्रक्रियाओं के लिए प्रतिरोधी है। एनओए 71 और एनओए 81 रेजिन दोनों का उपयोग समान परिणामों के साथ किया जा सकता है। प्रारंभिक पीडीएमएस पैटर्न का उपयोग एनओए प्रतिकृतियों का उत्पादन करने के लिए कई बार किया जा सकता है। प्राप्त एनओए प्रतिकृतियों को महीनों तक कमरे के तापमान पर एक बॉक्स में रखा जा सकता है।
  2. एक समर्थित लिपिड बाइलेयर और प्रोटीन इनक्यूबेशन की पीढ़ी
    1. सतह हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए 5 मिनट के लिए एक वायु प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग करके एनओए फिल्मों का इलाज करें।
    2. 57% एगपीसी, 15% कोलेस्ट्रॉल, 10% डोप, 10% डीओपीएस, और 8% मस्तिष्क पीआई (4,5) पी2 की दाढ़ संरचना के साथ छोटे यूनिलामेलर पुटिकाओं (एसयूवी) का समाधान 1 मिलीग्रामएमएल -1 की कुल लिपिड एकाग्रता पर तैयार करें। अवलोकन बफर में एक सूखे लिपिड फिल्म को फिर से निलंबित करके एसयूवी तैयार करें, जैसा कि चरण 2.1.3 में वर्णित है। समाधान पारदर्शी होने तक 5-10 मिनट के लिए स्नान सोनिकेटर का उपयोग करके धीरे-धीरे समाधान को सोनीकेट करें।
      नोट: एसयूवी का समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर कई हफ्तों के लिए जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. सेल संस्कृति बक्से के कुओं के भीतर एनओए पैटर्न का समर्थन कवरलिप्स डालें। ताजा चमक-डिस्चार्ज एनओए पैटर्न (चरण 3.2.1.) पर 1 मिलीग्राम ·एमएल -1 एसयूवी समाधान के 100 μL जमा करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। यह कदम एक समर्थित लिपिड बाइलेयर उत्पन्न करने के लिए एनओए पैटर्न की सतह के साथ एसयूवी के संलयन को प्रेरित करता है।
    4. अनफ्यूज्ड एसयूवी को हटाने के लिए सेप्टिन बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल [पीएच 8], 50 एमएम केसीएल, 2 एमएम एमजीसीएल 2) के साथस्लाइड्स को अच्छी तरह से 6 एक्स कुल्लाएं। प्रत्येक कुल्ला के बाद, नमूना पूरी तरह से सूखने कभी न दें।
    5. सेप्टिन बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल [पीएच 8], 300 एमएम केसीएल, 2 एमएम एमजीसीएल 2) का उपयोग करके सेप्टिन उच्च नमक बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 2 एमएम एमजीसीएल2) में ऑक्टामेरिक सेप्टिन स्टॉक समाधान को पतला करें। कमरे के तापमान पर ~ 1 घंटे के लिए स्लाइड पर प्रोटीन समाधान सेते हैं।
      नोट: वॉल्यूम काफी बड़ा है ताकि वाष्पीकरण कोई समस्या न हो।
  3. एसईएम विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी
    नोट: प्रोटीन संरचनाओं और उनकी विधानसभा का विश्लेषण करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में विभिन्न प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल स्विटकिना एट अल से प्राप्त निर्धारण प्रोटोकॉल का उपयोग करके, सेप्टिन फिलामेंट्स के संगठन को संरक्षित करता है।30 जिसे लागू करना आसान है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल उच्च-रिज़ॉल्यूशन एसईएम टिप्पणियों का अनुकूलन करता है।
    1. अभिकर्मकों और स्टॉक समाधान की तैयारी
      नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए कई अभिकर्मकों और समाधानों की आवश्यकता होती है जिन्हें पहले से या इनक्यूबेशन से ठीक पहले तैयार किया जा सकता है। किसी भी कलाकृतियों या रासायनिक प्रतिक्रियाशीलता की कमी से बचने के लिए दिए गए निर्देशों का पालन करें।
      1. सोडियम कैकोडाइलेट 0.2 एम स्टॉक समाधान: इस डबल-ताकत समाधान को तैयार करने के लिए, चुंबकीय सरगर्मी के तहत ~ 40 मिलीलीटर आसुत जल में 2.14 ग्राम सोडियम कैकोडाइलेट पाउडर भंग करें। पूर्ण विघटन के बाद, धीरे-धीरे 0.1 एम एचसीएल (समाधान के 50 एमएल के लिए ~ 1 एमएल) जोड़कर पीएच को 7.4 में समायोजित करें और आसुत जल के साथ अंतिम मात्रा बनाएं। इस समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर 24-48 घंटे के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
      2. 0.1 एम सोडियम कोकोडाइलेट (फिक्सेटिव समाधान) में 2% ग्लूटाराल्डिहाइड (जीए): 0.2 एम सोडियम कोकोडिलेट समाधान (ऊपर देखें) के साथ अत्यधिक शुद्ध ईएम ग्रेड जीए को पतला करके उपयोग करने से ठीक पहले इस समाधान को तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अपनी अनुकूलित भंडारण क्षमता के कारण 25% -50% वाणिज्यिक जीए स्टॉक समाधान का उपयोग करें। फिक्सेटिव समाधान के 10 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, आसुत जल के 4.2 मिलीलीटर और 0.2 एम सोडियम कोकोडिलेट के 5 एमएल के साथ 25% वाणिज्यिक जीए समाधान के 0.8 एमएल पतला करें।
      3. 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट में 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड (ओएसओ4): 0.2 एम सोडियम कैकोडाइलेट (ऊपर देखें) के साथ वाणिज्यिक 4% ओएसओ4 स्टॉक समाधान को पतला करके उपयोग करने से ठीक पहले इस दूसरे फिक्सेटिव समाधान को तैयार करें। ओएसओ 4 फिक्सेटिव समाधान के4 मिलीलीटर के लिए, आसुत जल के 1 एमएल और 0.2 एम सोडियम कैकोडाइलेट के 2 एमएल के साथ 4% वाणिज्यिक ओएसओ4 समाधान के 1 एमएल को पतला करें।
        नोट: उनके भंडारण और हैंडलिंग गुणों के कारण क्लीवेबल ग्लास बल्बों में वाणिज्यिक 4% ओएसओ4 स्टॉक समाधान का उपयोग करें। ध्यान दें कि ओएसओ4 अत्यधिक प्रतिक्रियाशील है। इस बात का ध्यान रखें कि इसका रंग थोड़ा पीला हो और गहरा न हो।
      4. पानी में 1% टैनिक एसिड (टीए): उपयोग करने से ठीक पहले इस घोल को तैयार करें। कमरे के तापमान पर आसुत जल में 1% टीए की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए टीए समाधान तैयार करें। आसुत जल और भंवर के 1 मिलीलीटर में कुछ मिनट के लिए 10 मिलीग्राम भंग करें। टीए समाधान संग्रहीत नहीं किया जा सकता है और उपयोग करने से पहले 0.2 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर किया जाना चाहिए।
      5. पानी में 1% यूरेनियल एसीटेट (यूए) समाधान आसुत जल में 1% यूए की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए यूए समाधान तैयार करें। कमरे के तापमान पर भंवर या मिलाते हुए कम से कम 30 मिनट से 1 घंटे के लिए आसुत जल और भंवर के 1 मिलीलीटर में 10 मिलीग्राम भंग करें। यह समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है लेकिन आसानी से अवक्षेपित हो सकता है और इसलिए, उपयोग से पहले 0.2 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर किया जाना चाहिए।
      6. इथेनॉल समाधान की वर्गीकृत श्रृंखला पानी में 50%, 70%, 95%, और 100% इथेनॉल समाधान तैयार करें। 100% इथेनॉल की नई खुली बोतलों से या 100% इथेनॉल से अंतिम स्नान तैयार करें जो आणविक छलनी (नाममात्र छिद्र व्यास = 4 ए) के साथ कम से कम 24 घंटे के लिए निर्जलित हो गया है ताकि नमूनों से पानी के सभी निशान को हटाया जा सके जो सुखाने और कोटिंग में हस्तक्षेप कर सकते हैं। इस समाधान को हिलाने के लिए सावधान रहें क्योंकि यह सिलिकेट कणों के पुन: निलंबन का कारण बन सकता है।
        नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले रासायनिक अभिकर्मकों को संभालते समय सावधान रहें। ग्लूटाराल्डिहाइड, ऑस्मियम टेट्रोक्साइड, सोडियम कैकोडाइलेट और यूरेनियल एसीटेट सभी अत्यधिक विषाक्त हैं, यूरेनियल एसीटेट भी रेडियोधर्मी हैं। प्रयोगशाला-विशिष्ट प्रक्रियाओं के अनुसार अभिकर्मकों और उनके कचरे के सभी हेरफेर को व्यक्तिगत (दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मा) और सामूहिक सुरक्षा (धूआं हुड और प्लेक्सीग्लास ढाल) का उपयोग करके किया जाना चाहिए।
    2. नमूना निर्धारण
      1. पीबीएस के साथ नमूने (यानी, फ्यूज्ड समर्थित लिपिड बाइलेयर और इनक्यूबेटेड प्रोटीन के साथ एनओए स्लाइड) धो लें। जीए फिक्सेटिव समाधान के साथ पीबीएस को 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से तैयार करें और प्रतिक्रिया को 15 मिनट के लिए आगे बढ़ने दें। नमूने तो 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      2. फिक्सेटिव समाधान निकालें और कोमल मिलाते हुए के साथ 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट (धोने के प्रति 5 मिनट) के साथ निश्चित नमूने 3x धो लें।
      3. झिल्लीदार संरचनाओं के निर्धारण की अनुमति देने और नमूनों की विद्युत चालकता में वृद्धि करने के लिए प्रकाश से अधिकतम सुरक्षा के साथ 10 मिनट के लिए ओएसओ4 फिक्सेटिव समाधान में नमूनों सेते हैं। फिक्सेटिव समाधान निकालें और कोमल मिलाते हुए के साथ आसुत पानी (धोने के प्रति 5 मिनट) में नमूने 3x धो लें।
      4. 10 मिनट की एक अधिकतम के लिए फ़िल्टर्ड टीए फिक्सेटिव समाधान में धोया नमूने सेते हैं। टीए समाधान निकालें और कोमल मिलाते हुए के साथ आसुत पानी (धोने के प्रति 5 मिनट) में नमूने 3x धो लें।
      5. प्रकाश से अधिकतम सुरक्षा के साथ 10 मिनट के लिए एक ताजा फ़िल्टर्ड यूए फिक्सेटिव समाधान में धोया नमूने सेते हैं। यूए समाधान निकालें और कोमल मिलाते हुए के साथ आसुत पानी (धोने के प्रति 5 मिनट) में नमूने 3x धो लें।
    3. नमूना निर्जलीकरण और महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने
      नोट: तरल से गैसीय अवस्था में बदलते समय अवांछित सतह तनाव के माध्यम से हानिकारक नमूनों से बचने के लिए वायु-सुखाने की अनुमति नहीं है। ईएम में दो विधियां स्थापित की गई हैं: सीओ2 की सुपरक्रिटिकल स्थिति तक पहुंचने और इसके महत्वपूर्ण बिंदु (31 डिग्री सेल्सियस, 74 बार) को दरकिनार करने की भौतिक विधि, या हेक्सामेथिलडिसिलाज़ेन (एचएमडीएस) को वाष्पित करने की रासायनिक विधि, कम सतह तनाव के साथ एक सुखाने वाला एजेंट। सीओ2 और एचएमडीएस पानी के साथ खराब रूप से गलत हैं। नतीजतन, सुखाने की प्रक्रियाओं के दौरान बाद में किसी भी क्षति से बचने के लिए पानी के सभी निशान को संक्रमणकालीन विलायक (इथेनॉल) के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए।
      1. प्रत्येक इथेनॉल समाधान में 2-3 मिनट के लिए नमूने सेते हैं, 50% से 100% (निर्जल) इथेनॉल स्नान से शुरू होता है।
        नोट: स्नान के बीच इथेनॉल का वाष्पीकरण तेजी से है, नमूना हैंडलिंग भी किसी भी हवा सुखाने से बचने के लिए तेज होना चाहिए।
      2. इथेनॉल के साथ पहले से भरे हुए महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर के अंदर ग्लास स्लाइड स्थानांतरित करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
        नोट: इस प्रोटोकॉल में, एक स्वचालित उपकरण का उपयोग किया गया था, लेकिन किसी भी प्रणाली का उपयोग किया जा सकता है। प्रोटोकॉल प्रत्येक उपकरण के लिए भिन्न हो सकते हैं लेकिन इथेनॉल (इस प्रोटोकॉल में 25 स्नान) को पूरी तरह से हटाने और विभिन्न विलायक एक्सचेंजों (सीओ2 इनलेट और इथेनॉल / सीओ2 आउटलेट) और अंतिम अवसाद (इस प्रोटोकॉल में लगभग 1 घंटे) के लिए गति को कम करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
      3. महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने के अंत में, बढ़ते और कोटिंग तक नमूनों को तुरंत एक डिसिकेटर में स्टोर करें। चूंकि सूखे नमूने अत्यधिक हीड्रोस्कोपिक होते हैं, इसलिए जितनी जल्दी हो सके उन्हें कोट करें (नीचे देखें)।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, एचएमडीएस एक सस्ता और तेज़ तरीका प्रदान कर सकता है। यद्यपि एचडीएमएस का हमारे नमूनों पर कभी परीक्षण नहीं किया गया है, इस दृष्टिकोण ने सेलुलर झिल्ली31,32 के आंतरिक चेहरे पर प्रोटीन के अवलोकन के लिए अच्छे परिणाम उत्पन्न किए।
    4. नमूना बढ़ते और कोटिंग।
      नोट: चूंकि जैविक नमूने खराब विद्युत चालकता गुण पेश करते हैं, इसलिए उन्हें एसईएम अवलोकन से पहले एक प्रवाहकीय धातु फिल्म के साथ लेपित करने की आवश्यकता होती है। प्लाज्मा-मैग्नेट्रॉन स्पटरिंग का उपयोग इस प्रकार किया जाता है।
      1. भविष्य के एसईएम टिप्पणियों के लिए उपयोग किए जाने वाले स्टब्स में कवरस्लिप संलग्न करें। कार्बन डिस्क की तुलना में इसकी बेहतर विद्युत चालकता के कारण सिल्वर पेंट का उपयोग करें। कवरस्लिप के ऊपरी चेहरे पर सिल्वर पेंट की एक पट्टी जोड़ें और सुनिश्चित करें कि स्टब के साथ कनेक्शन संतोषजनक है। किसी भी पेंट एग्लोमेरेट्स से बचें।
        नोट: उच्च संकल्प (यानी, कम काम दूरी) पर काम करते समय नमूना और एसईएम के उद्देश्य लेंस के बीच किसी भी संपर्क से बचने के लिए सिल्वर पेंट स्ट्रिप पतली होनी चाहिए।
      2. विलायक के पूरी तरह से वाष्पित होने की प्रतीक्षा करें।
        नोट: इस चरण की अवधि राशि और चांदी पेंट जमा की मोटाई के आधार पर भिन्न हो सकती है। इस चरण को घंटी जार या कोटर और 10-30 मिनट के लिए एक प्राथमिक वैक्यूम का उपयोग करके छोटा किया जा सकता है।
      3. प्लाज्मा-मैग्नेट्रॉन स्पटरिंग हेड और रोटरी-प्लैनेटरी स्टेज से लैस एक उपकरण का उपयोग करें, और निर्माता द्वारा प्रदान किए गए मानक प्रोटोकॉल का पालन करें। यहां, उपकरण को 2.5 x 10-5 एमबार में खाली कर दिया गया था, उच्च गुणवत्ता वाले आर्गन के साथ 1 एक्स को शुद्ध किया गया था, और फिर 8.0 x 10-3 एमबार में समायोजित किया गया था।
      4. सतह पर ऑक्साइड परत को हटाने के लिए प्री-स्पटरिंग (60 एस के लिए 120 एमए) करें। फिर, एक फिल्म मोटाई मॉनिटर की सहायता से टंगस्टन (90 एमए, काम की दूरी = 50 मिमी) के 1.5 एनएम जमा करें।
        नोट: फिल्म वाष्पीकरण की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए कोटर को पूरी तरह से साफ किया जाना चाहिए। लक्षित मोटाई तक पहुंचने के बाद कोटिंग को रोक दिया जाना चाहिए। अंतिम फिल्म मोटाई की गणना की जाती है और बाद में सही किया जाता है। लगभग 1.5 एनएम की फिल्मों में औसतन, हमारे उपकरण का उपयोग करके 0.7 एनएम का सुधार होता है। चूंकि वे सुधार मान लक्ष्य के करीब हैं, इसलिए लक्ष्य मूल्य से इस सुधार का आकलन करने और फिर घटाने के लिए कोटिंग्स की एक श्रृंखला की जाती है।
      5. वैक्यूम के तहत नमूनों को स्टोर करें ताकि उन्हें परिवेशी हवा से बचाया जा सके जब तक कि सभी एसईएम विश्लेषण न करें।
        नोट: स्पटरिंग मामलों के लिए उपयोग की जाने वाली धातु की प्रकृति। पीटी, एक सामान्य सामग्री होने के बावजूद, सेप्टिन फिलामेंट्स (1.5 एनएम) के अनुकूल पीटी फिल्म मोटाई के साथ खराब गुणवत्ता वाली कोटिंग का परिणाम है। उच्च संकल्पों पर, 1.5 एनएम पीटी फिल्म में सामंजस्य की कमी होती है; पीटी क्लस्टर और सेप्टिन फिलामेंट्स का आकार इस प्रकार समान हो जाता है, जिससे फिलामेंट विभाजन प्रक्रिया33 के दौरान गलत व्याख्या होती है ( चित्रा 2 ए, इनसेट देखें)। टंगस्टन पीटी के लिए एक अच्छा विकल्प है क्योंकि यह एक छोटे अनाज के आकार को प्रदर्शित करता है, जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन एसईएम ( चित्रा 2 बी, इनसेट देखें) पर मुश्किल से दिखाई देता है। बहरहाल, शुद्ध टंगस्टन आसानी से ऑक्सीकरण किया जाता है, जिससे एसईएम अवलोकन के दौरान मजबूत चार्जिंग प्रभाव कलाकृतियों का कारण बनता है यदि प्रक्रिया चरण 3.3.4 में विस्तृत है। कड़ाई से पालन नहीं किया जाता है।
  4. एक क्षेत्र उत्सर्जन एसईएम (एफईएसईएम) माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें।
    नोट: एसईएम प्रौद्योगिकियों को हाल ही में रिज़ॉल्यूशन में सुधार करने के लिए अपग्रेड किया गया है, और प्रौद्योगिकियां निर्माता (जैसे, इलेक्ट्रॉन प्रकाशिकी, बीम-मंदी, चुंबकीय लेंस) पर निर्भर करती हैं। रिज़ॉल्यूशन में यह लाभ (कई निर्माताओं के साथ सुलभ), विशेष रूप से कम त्वरित वोल्टेज (1 केवी पर नैनोमीटर के पास) पर, सेप्टिन नेटवर्क के समान नैनोमेट्रिक संरचनाओं को हल करने के लिए आवश्यक है।
    1. निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके "इन-लेंस" डिटेक्टर के साथ प्राथमिक माध्यमिक इलेक्ट्रॉनों (एसई 1) का पता लगाने के माध्यम से उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्राप्त करें।
    2. त्वरित वोल्टेज को 3 केवी पर सेट करें। बीम वर्तमान को 20 μm एपर्चर के साथ ठीक करें (ज़ीस मिथुन मैं कॉलम के लिए, या 34 पीए के बराबर) या 15 μm एपर्चर के साथ (ज़ीस मिथुन मैं कॉलम के लिए, या 18.5 पीए के बराबर), यदि चार्जिंग प्रभावों के दमन की आवश्यकता है।
    3. अवलोकनों के लिए, 21.25 एनएम / पिक्सेल से 1.224 एनएम / पिक्सेल तक के संकल्प का उपयोग करें, और डेटा विश्लेषण के लिए, ~ 5.58 एनएम / पिक्सेल (पोलरॉइड 545 संदर्भ के अनुसार 20,000x आवर्धन) के रिज़ॉल्यूशन का उपयोग करें।
    4. उच्च-रिज़ॉल्यूशन अवलोकन के लिए 1 मिमी और 2 मिमी के बीच काम की दूरी निर्धारित करें, और यदि क्षेत्र की बढ़ी हुई गहराई की आवश्यकता होती है तो लगभग 3 मिमी। प्रति छवि लगभग 30-45 एस के अधिग्रहण समय के साथ निरंतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात सुनिश्चित करने के लिए स्कैन गति और लाइन एकीकरण को लगातार समायोजित करें।

Figure 2
चित्रा 2: लहराती पीडीएमएस पैटर्न पर सेप्टिन फिलामेंट्स पर जमा सामग्री का प्रभाव। प्लैटिनम के या तो (ए) 1.5 एनएम के साथ स्पटरिंग द्वारा लेपित सेप्टिन फिलामेंट्स का एसईएम, प्लैटिनम नाभिक के समूहों के बीच सामंजस्य की कमी के विशिष्ट "शुष्क फटा हुआ मिट्टी" पैटर्न का प्रदर्शन करता है, या (बी) टंगस्टन का 1.5 एनएम एक चिकनी और सामंजस्यपूर्ण परत के साथ कवर किया जाता है। स्केल बार = 200 एनएम। सफेद वर्ग बक्से निचले दाईं ओर आवर्धित दृश्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। गोलाकार ग्लोब्यूल्स छोटे लिपिड पुटिकाएं हैं जो सेप्टिन के साथ बातचीत करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

जीयूवी विरूपण
सेप्टिन के साथ ऊष्मायन किए जाने के बाद जीयूवी की विशिष्ट कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति छवियों को चित्रा 3 में प्रदर्शित किया जाता है, ऐसी स्थितियों में जहां सेप्टिन पोलीमराइज़ करते हैं। नंगे जीयूवी (चित्रा 3 ए) पूरी तरह से गोलाकार थे। 50 एनएम से अधिक नवोदित खमीर सेप्टिन फिलामेंट्स के साथ इनक्यूबेशन पर, पुटिकाएं विकृत दिखाई दीं। 100 एनएम नवोदित खमीर सेप्टिन ऑक्टेमर्स की एकाग्रता तक, पुटिकाएं दिखाई दीं, और विकृतियां स्थिर रहीं और इस प्रकार उतार-चढ़ाव नहीं हुआ (चित्रा 3 बी)। 200 एनएम नवोदित खमीर सेप्टिन से ऊपर, झिल्ली सेप्टिन के साथ संतृप्त होने के साथ, आवधिक विकृतियों (चित्रा 3 सी) मनाया गया। नवोदित खमीर सेप्टिन का उपयोग करते हुए, स्पाइक्स को 2 μm से 6 μm तक की आवधिकता के साथ और लगभग 1 μm के आयाम के साथ कल्पना की गई थी। इसलिए, सेप्टिन एक विशिष्ट फैशन में झिल्ली को दृढ़ता से आकार देते हैं। देखे गए विकृतियों के ये आयाम और संबंधित वक्रताएं कोशिकाओं में देखे गए माइक्रोमीटर वक्रताओं के लिए सेप्टिन की आत्मीयता को दर्शाती हैं। जीयूवी, विकृत होने के नाते, इस प्रकार परख करने के लिए उपयुक्त हैं कि प्रोटीन झिल्ली को कैसे आकार देते हैं।

Figure 3
चित्रा 3: जीयूवी के सेप्टिन-प्रेरित विरूपण ( ए ) नियंत्रण जीयूवी के भूमध्यरेखीय विमान को 0.5% रोडामाइन पीई के साथ लेबल किया गया और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया। स्केल बार = 3 μm. (बी) जीएफपी-सेप्टिन (100 एनएम) एक विकृत जीयूवी से बंधे और प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित। स्केल बार = 1 μm. (सी) जीएफपी-सेप्टिन (600 एनएम) एक विकृत जीयूवी से बंधे और प्रतिदीप्ति कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेज किए गए। स्केल बार = 10 μm। जीयूवी 56.8% एगपीसी, 15% कोलेस्ट्रॉल, 10% डोप, 10% डीओपीएस, 8% मस्तिष्क पीआई (4,5) पी 2, और0.2% बोडिपी-टीआर-सेरामाइड के दाढ़ अनुपात से बने होते हैं। अवलोकन बफर में 75 एमएम एनएसीएल और 10 एमएम ट्रिस (पीएच = 7.8) शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

क्रायो-ईएम द्वारा इमेज किए गए एलयूवी से बंधे सेप्टिन फिलामेंट्स की स्व-असेंबली
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की तुलना में, क्रायो-ईएम बेहतर स्थानिक संकल्प प्रदान करता है। व्यक्तिगत सेप्टिन फिलामेंट्स और लिपिड बाइलेयर को इस प्रकार छवियों में स्पष्ट रूप से समझा जा सकता है। चित्रा 4 ए 50 एनएम पर नवोदित खमीर सेप्टिन फिलामेंट्स (उनमें से कुछ को नीले रंग में हाइलाइट किया जा रहा है) के साथ सजाए गए एलयूवी की एक छवि प्रदर्शित करता है। एलयूवी पर लगभग 10 एनएम अलग फिलामेंट्स के समानांतर सेट देखे गए। यह विशिष्ट छवि एक 2 डी प्रक्षेपण है। इसलिए, किसी भी 3 डी विरूपण को समझने के लिए और यह जानने के लिए कि क्या सेप्टिन फिलामेंट्स सीधे झिल्ली के साथ बातचीत करते हैं, क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी की गई थी (चित्रा 4 बी और चित्रा 4 सी)। चित्रा 4 बी एक 3 डी पुनर्निर्माण में एक टुकड़ा प्रदर्शित करता है, जबकि चित्रा 4 सी पीले रंग में झिल्ली और नीले रंग में सेप्टिन फिलामेंट्स को उजागर करने वाले एक ही क्षेत्र का विभाजन प्रस्तुत करता है। जैसा कि साइड व्यू पर देखा गया है, सेप्टिन फिलामेंट्स अनिवार्य रूप से लिपोसोम से सीधे बंधे रहे और नग्न गोलाकार पुटिकाओं की तुलना में पुटिका काफी चपटा हो गई।

Figure 4
चित्रा 4: एलयूवी से बंधे सेप्टिन फिलामेंट्स की स्व-असेंबली। (ए) एक पुटिका से बंधे सेप्टिन फिलामेंट्स की क्रायो-ईएम छवि। कुछ फिलामेंट्स को दृश्यता के लिए नीले रंग में हाइलाइट किया गया है। डार्क डॉट्स सोने के फिड्यूशियल होते हैं जिनका उपयोग आमतौर पर टोमोग्राफी के लिए डेटा को संरेखित करने के लिए किया जाता है। स्केल बार = 100 एनएम। (बी) और (सी) 3 डी पुनर्निर्माण एक झुका हुआ श्रृंखला से प्राप्त किया गया। लिपिड को पीले रंग में हाइलाइट किया जाता है, जबकि सेप्टिन नीले रंग में खंडित होते हैं। स्केल सलाखों = 200 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एसईएम द्वारा कल्पना की गई सेप्टिन फिलामेंट्स की वक्रता-निर्भर व्यवस्था
सेप्टिन माइक्रोमीटर वक्रता प्रदर्शित करने वाली साइटों पर कोशिकाओं में स्थानीयकरण करते हैं (उदाहरण के लिए, कोशिका विभाजन फरो पर, सिलिया का आधार, आदि)। इसके अलावा, इन विट्रो अध्ययनों से पता चलता है कि सेप्टिन, जैसा कि ऊपर देखा गया है, झिल्ली को फिर से आकार दे सकता है ताकि वे अंततः माइक्रोमीटर वक्रता प्रदर्शित कर सकें। सकारात्मक (उत्तल) और नकारात्मक (अवतल) वक्रता दोनों के लिए सेप्टिन की वक्रता संवेदनशीलता परख करने के लिए, सेप्टिन को ऊपर वर्णित लहरदार पैटर्न के साथ जुड़े एक समर्थित लिपिड बाइलेयर के साथ ऊष्मायन किया गया था। परिणाम चित्रा 5 में प्रदर्शित किया गया है। चित्रा 5 ए नमूने प्राप्त करने के लिए आवश्यक विभिन्न चरणों को दोहराता है। चित्रा 5 बी कम आवर्धन पर एक लहरदार पैटर्न प्रस्तुत करता है, जहां नकारात्मक और सकारात्मक वक्रता की आवधिकता स्पष्ट रूप से दिखाई देती है। नारंगी ठोस रेखाओं द्वारा दो क्रमिक तरंगों को इंगित किया जाता है। तरंगों के लगभग ऑर्थोगोनल दोष सफेद तीरों द्वारा इंगित किए जाते हैं। चित्रा 5 सी और चित्रा 5 डी उच्च आवर्धन पर सेप्टिन फिलामेंट्स के अल्ट्रास्ट्रक्चरल संगठन को प्रदर्शित करते हैं। सेप्टिन समानांतर फिलामेंट्स के सेट में इकट्ठे हुए, जिनका अभिविन्यास वक्रता पर निर्भर करता था (नीले रंग में हाइलाइट किए गए फिलामेंट्स देखें)। दरअसल, सेप्टिन फिलामेंट्स बेतरतीब ढंग से उन्मुख नहीं थे। इसके बजाय, लगाए गए वक्रता का पालन करने के लिए नकारात्मक (अवतल) वक्रताओं के साथ बातचीत करते समय सेप्टिन झुक सकते हैं। इसके विपरीत, सकारात्मक वक्रता पर, सेप्टिन फिलामेंट्स सीधे, अनियंत्रित और उत्तल तरंगों के साथ संरेखित रहे। इसलिए, सेप्टिन सकारात्मक और नकारात्मक वक्रता दोनों के साथ बातचीत कर सकते हैं लेकिन दिए गए वक्रताओं पर विशिष्ट संगठनों को अपना सकते हैं। इस प्रकार यह पद्धति फिलामेंटस प्रोटीन के बंधन और आत्म-असेंबली की वक्रता-संवेदनशीलता को उजागर करने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक प्रतीत होती है।

Figure 5
चित्रा 5: सेप्टिन फिलामेंट्स की वक्रता-निर्भर व्यवस्था( ए) एसईएम के माध्यम से सेप्टिन वक्रता संवेदनशीलता का विश्लेषण करने के लिए "लहराती" नमूनों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व( बी) बाध्य सेप्टिन फिलामेंट्स के साथ एक लहरदार पैटर्न की कम आवर्धन एसईएम छवि जो इस रिज़ॉल्यूशन पर हल नहीं होती है। नारंगी में लगातार दो तरंगों को हाइलाइट किया जाता है। ऑर्थोगोनल दोष सफेद तीरों द्वारा इंगित किए जाते हैं। स्केल बार = 10 μm. (सी) एसईएम छवि 10,000x आवर्धन पर जहां सेप्टिन फिलामेंट्स दिखाई दे रहे हैं। स्केल बार = 1 μm. (डी) 20,000x आवर्धन पर एसईएम छवि। कुछ फिलामेंट्स को दृश्यता के लिए नीले रंग में हाइलाइट किया गया है। स्केल बार = 200 एनएम। छवियों में मौजूद गोलाकार वस्तुएं सेप्टिन और सब्सट्रेट के साथ बातचीत करने वाले छोटे पुटिकाएं हैं। बी-डी में सेप्टिन एकाग्रता 200 एनएम पर सेट की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जैसा कि ऊपर कहा गया है, एक लिपिड मिश्रण का उपयोग किया गया है जो लिपिड बाइलेयर के भीतर पीआई (4,5) पी2 निगमन को बढ़ाता है और इस प्रकार सेप्टिन-झिल्ली इंटरैक्शन की सुविधा प्रदान करता है। दरअसल, हमने कहीं और25 दिखाया है कि नवोदित खमीर सेप्टिन पीआई (4,5) पी2-विशिष्ट फैशन में पुटिकाओं के साथ बातचीत करते हैं। इस लिपिड रचना को कई रचनाओं की स्क्रीनिंग से अनुभवजन्य रूप से समायोजित किया गया था और अब लेखकों द्वारा व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। पीआई (4,5) पी2 लिपिड को सावधानीपूर्वक संभाला जाना चाहिए। स्टॉक समाधानों को छोटी मात्रा में विभाज्य किया जाना चाहिए ताकि पाइपिंग के लिए एक विशिष्ट शीशी दो बार से अधिक न खोले जाएं। इसके अलावा, लिपिड ऑक्सीकरण को रोकने के लिए लिपिड विभाज्य को आर्गन के नीचे संग्रहीत किया जाना चाहिए। अंत में, एक बार लिपिड मिश्रण एक जलीय घोल में घुलनशील हो जाने के बाद, मिश्रण को एक बार में उपयोग किया जाना चाहिए और आगे के प्रयोगों के लिए संग्रहीत नहीं किया जा सकता है। विशेष रूप से, जीयूवी पुनर्गठन या समर्थित लिपिड बाइलेयर संलयन के बाद, 2 घंटे के बाद सेप्टिन और लिपिड के बीच बातचीत बहुत कम हो गई।

ऑक्टामेरिक नवोदित खमीर सेप्टिन कॉम्प्लेक्स (सीडीसी 10, सीडीसी 11, सीडीसी 12 और सीडीसी 3 को संलग्न करते हुए) के साथ प्राप्त कुछ परिणाम यहां प्रस्तुत किए गए हैं; हालांकि, अन्य प्रजातियों से सेप्टिन परिसरों के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए अपनाई जाने वाली प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं समान होनी चाहिए।

जीयूवी उत्पन्न करने के लिए, हम आईटीओ प्लेटों या पीवीए सूजन पर इलेक्ट्रो-गठन पर प्लैटिनम तारों का उपयोग करके इलेक्ट्रो-गठन विधि पसंद करते हैं। जैसा कि पहले25 से पता चला है, यह विधि बिना किसी दोष के अच्छी गुणवत्ता के यूनिलेमेलर जीयूवी का उत्पादन करती है।

लहरदार सब्सट्रेट को वक्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ डिज़ाइन किया जा सकता है। विभिन्न डिजाइनों की स्क्रीनिंग के बाद, 2 μm की आवधिकता और 250 एनएम के आयाम के साथ पैटर्न, जो -3.5 μm-1 से 3.5 μm-1 (± 0.5 उम -1) तक वक्रता उत्पन्न करते हैं, लगातार उपयोग किए गए हैं। एक छोटी आवधिकता और उच्च आयाम के साथ पैटर्न का उपयोग करते हुए, लिपिड बाइलेयर सतह के अनुरूप नहीं थे। अक्सर, उच्च वक्रता के मामले में, बिलियर को एनओए सब्सट्रेट पर पूरी तरह से समर्थित होने के बजाय दो उत्तल तरंगों के बीच निलंबित कर दिया जाएगा। कम आयाम और बड़ी आवधिकता के साथ, सेप्टिन यादृच्छिक नेमैटिक-जैसे झुकाव के साथ व्यवस्थित होते हैं, यह दर्शाता है कि पैटर्न बहुत सपाट थे। इसके अलावा, बेलनाकार ट्यूब20 या गोले 20 के बजाय लहराती पैटर्न का उपयोग करने सेलाभ होता है कि सकारात्मक और नकारात्मक वक्रता दोनों का एक साथ परीक्षण किया जा सकता है। भविष्य में, गाऊसी "काठी जैसी" वक्रताओं पर फिलामेंट्स के व्यवहार की जांच करना अधिक यथार्थवादी सेलुलर संदर्भों की वक्रता की नकल करने के लिए प्रासंगिक होगा।

समाधान में, सेप्टिन के साथ एलयूवी के मिश्रण ने प्रोटीन और लिपिड की कम सांद्रता पर भी सेप्टिन-लिपिड समुच्चय की पीढ़ी को प्रेरित किया। इस प्रकार नमूने विषम थे, और पतली बर्फ डोमेन की तलाश करना बुद्धिमानी है जहां छोटे और अधिक परिभाषित सेप्टिन-पुटिका वस्तुएं पाई जाती हैं। ब्याज के क्षेत्रों को चुनते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां क्रायो-टोमोग्राफी की जाएगी। अक्सर, कम आवर्धन पर भी, गोलाकार पुटिकाओं की तुलना में मजबूत विकृतियों के फलाव प्रदर्शित करने वाले पुटिकाओं में सेप्टिन फिलामेंट्स का उच्च घनत्व होने की अधिक संभावना होती है। यह प्रोटोकॉल बायोमिमेटिक झिल्ली पर फिलामेंट्स के वैश्विक अल्ट्रास्ट्रक्चर का विवरण प्राप्त करने पर केंद्रित है। वर्तमान में, उच्च रिज़ॉल्यूशन पहुंच योग्य हैं। रिज़ॉल्यूशन सीमा इमेजिंग द्वारा उपलब्ध दृश्यों की सीमित संख्या के परिणामस्वरूप होती है। हालांकि, यह इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे है।

हमने इस प्रोटोकॉल के माध्यम से दिखाया है कि पूरक तरीकों का एक संयोजन समझने और विच्छेदन करने के लिए आवश्यक है कि साइटोस्केलेटल सेप्टिन फिलामेंट्स की विशिष्ट व्यवस्था वक्रता-निर्भर तरीके से झिल्ली को कैसे समझ और फिर से आकार दे सकती है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम पेट्रीसिया बसेरो और डैनियल लेवी को उनकी उपयोगी सलाह और चर्चाओं के लिए धन्यवाद देते हैं। यह काम परियोजना "सेपटाइम", एएनआर -13-जेएसवी 8-0002-01, एएनआर सेप्टिमोआरएफ एएनआर-17-सीई 13-0014, और परियोजना "सेप्टस्कॉर्ट", एएनआर -20-सीई 11-0014-01 के वित्तपोषण के लिए एएनआर (एजेंस नेशनले डे ला रेचेर्चे) के समर्थन से लाभान्वित हुआ। चौविन को इकोल डॉक्टरेट "ईडी 564: फिजिक एन इले डी फ्रांस" और फोंडेशन पोर ली रेचेर्चे मेडिकेल द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। के नाकाजावा द्वारा समर्थित था सोरबोन यूनिवर्सिटी (एएपी उद्भव)। जीएच कोएंडरिंक को नेडरलैंड्स ऑर्गेनाइजेशन वूर वेटेंस्चैपेलिजक ओन्डरज़ोक (एनडब्ल्यूओ / ओसीडब्ल्यू) द्वारा 'बेसीक-बिल्डिंग ए सिंथेटिक सेल' के माध्यम से समर्थित किया गया था। गुरुत्वाकर्षण अनुदान (024.003.019)। हम लैबेक्स सेल (एन) स्केल (एएनआर -11-लैबएक्स 0038) और पेरिस साइंसेज एट लेट्रेस (एएनआर -10-आईडीईएक्स-0001-02) का धन्यवाद करते हैं। हम सेल और ऊतक इमेजिंग (पीआईसीटी-आईबीआईएसए), इंस्टीट्यूट क्यूरी, फ्रेंच नेशनल रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर फ्रांस-बायोइमेजिंग (एएनआर 10-आईएनबीएस -04) के सदस्य का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids 840035
Bath sonicator Elma Elmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramide invitrogen, Thermo Fischer scientific 11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol Sigma Aldrich
Confocal microscope nikon spinning disk or confocal
Critical point dryer Leica microsystems CPD300
Deionized water generator MilliQ F1CA38083B MilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051
Field Emission Gun SEM (FESEM) Carl Zeiss Gemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution Thermo Fischer scientific 50-262-19
High vacuum grease, Dow corning VWR
IMOD software https://bio3d.colorado.edu/imod/ software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids Eloise 01883-F
Lipids Avanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046
Metal evaporator Leica microsystems EM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 Norland Products NOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4% delta microscopies 19170
Osmometer Löser 15 M
Plasma cleaner Alcatel pascal 2005 SD
Plasma generator Electron Microscopy Science
Plunge freezing equipment leica microsystems EMGP
Transmission electron microscope Thermofischer Tecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetate Electron Microscopy Science 22451 this product is not available for purchase any longer
Wax plates, Vitrex VWR

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References

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जीव विज्ञान अंक 186
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