Summary
Septines zijn cytoskeletale eiwitten. Ze interageren met lipidembranen en kunnen membraankromming op micronschaal waarnemen maar ook genereren. We beschrijven in dit protocol bottom-up in vitro methodologieën voor het analyseren van membraanvervormingen, krommingsgevoelige septinebinding en septinefilament ultrastructuur.
Abstract
Membraanremodellering vindt constant plaats op het plasmamembraan en in cellulaire organellen. Om de rol van de omgeving (ionische condities, eiwit- en lipidensamenstellingen, membraankromming) en de verschillende partners geassocieerd met specifieke membraanhervormingsprocessen volledig te ontleden, ondernemen we in vitro bottom-up benaderingen. In de afgelopen jaren is er grote belangstelling geweest voor het onthullen van de rol van septine-eiwitten geassocieerd met belangrijke ziekten. Septines zijn essentiële en alomtegenwoordige cytoskeletale eiwitten die interageren met het plasmamembraan. Ze zijn betrokken bij celdeling, celmotiliteit, neuromorfogenese en spermiogenese, naast andere functies. Het is daarom belangrijk om te begrijpen hoe septines interageren en organiseren op membranen om vervolgens membraanvervormingen te induceren en hoe ze gevoelig kunnen zijn voor specifieke membraankrommingen. Dit artikel heeft tot doel het samenspel te ontcijferen tussen de ultrastructuur van septines op moleculair niveau en de membraanremodellering op micronschaal. Daartoe werden ontluikende gist- en zoogdierseptinecomplexen recombinant tot expressie gebracht en gezuiverd. Een combinatie van in vitro assays werd vervolgens gebruikt om de zelfassemblage van septines aan het membraan te analyseren. Ondersteunde lipide bilayers (SLBs), gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs), grote unilamellaire blaasjes (LUVs) en golvende substraten werden gebruikt om het samenspel tussen septine zelfassemblage, membraanverandering en membraankromming te bestuderen.
Introduction
Septines zijn cytoskeletale filamentvormende eiwitten die interageren met lipidembranen. Septines zijn alomtegenwoordig in eukaryoten en essentieel voor tal van cellulaire functies. Ze zijn geïdentificeerd als de belangrijkste regulatoren van celdeling in ontluikende gist en zoogdieren 1,2. Ze zijn betrokken bij membraanhervormingsgebeurtenissen, ciliogenese3 en spermiogenese4. In zoogdiercellen kunnen septines ook interageren met actine en microtubuli 5,6,7 in een bindmiddel van Rho GTPases (BORG)-afhankelijke manier8. In verschillende weefsels (neuronen9, trilharen3, spermatozoa10) zijn septines geïdentificeerd als regulatoren van diffusiebarrières voor membraangebonden componenten11. Van septines is ook aangetoond dat ze membraanbleseming en uitsteekselvorming reguleren12. Septines, die multitaskende eiwitten zijn, zijn betrokken bij het ontstaan van verschillende veel voorkomende ziekten13. Hun misregulatie wordt geassocieerd met de opkomst van kankers14 en neurodegeneratieve ziekten15.
Afhankelijk van het organisme verzamelen verschillende septinesubeenheden (twee bij Caenorhabditis elegans tot 13 bij mensen) zich om complexen te vormen waarvan de organisatie varieert op een weefselafhankelijke manier16. De basis septinebouwsteen verzamelt twee tot vier subeenheden, aanwezig in twee kopieën en zelf geassembleerd op een staafachtige palindromische manier. In ontluikende gist zijn septines octamerisch17,18. In situ worden septines vaak gelokaliseerd op locaties met micrometerkromming; ze worden gevonden op delingsvernauwingsplaatsen, aan de basis van trilharen en dendrieten, en aan de annulus van spermatozoa19,20. Aan het membraan lijkt de rol van septines dubbel te zijn: ze zijn betrokken bij het hervormen van de lipide bilayer en bij het handhaven van de membraanintegriteit21. Daarom is het onderzoeken van de biofysische eigenschappen van septinefilamentvormende eiwitten en / of subeenheden aan het membraan cruciaal voor het begrijpen van hun rol. Om specifieke eigenschappen van septines in een goed gecontroleerde omgeving te ontleden, zijn bottom-up in vitro benaderingen geschikt. Tot nu toe hebben slechts enkele groepen de biofysische eigenschappen van septines in vitrobeschreven 20,22,23. Daarom blijft, in vergelijking met andere cytoskeletale filamenten, de huidige kennis over het gedrag van septines in vitro beperkt.
Dit protocol beschrijft hoe de organisatie van septinefilamenten, membraanhervormen en krommingsgevoeligheid kan worden geanalyseerd19. Hiervoor is een combinatie van optische en elektronenmicroscopiemethoden (fluorescentiemicroscopie, cryo-elektronenmicroscopie [cryo-EM] en scanningelektronenmicroscopie [SEM]) gebruikt. De membraanomvorming van micrometergrote gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) wordt gevisualiseerd met behulp van fluorescentie optische microscopie. De analyse van de opstelling en ultrastructuur van septinefilamenten gebonden aan lipideblaasjes wordt uitgevoerd met behulp van cryo-EM. Analyse van septinekrommingsgevoeligheid wordt uitgevoerd met behulp van SEM, door het gedrag te bestuderen van septinefilamenten gebonden aan vaste-ondersteunde lipide bilayers afgezet op golvende substraten van variabele krommingen, wat de analyse van krommingsgevoeligheid voor zowel positieve als negatieve krommingen mogelijk maakt. In vergelijking met eerdere analyse 20,24, hier, stellen we voor om een combinatie van methoden te gebruiken om grondig te analyseren hoe septines zichzelf kunnen assembleren, synergetisch het membraan kunnen vervormen en krommingsgevoelig kunnen zijn. Dit protocol wordt verondersteld nuttig te zijn en aan te passen aan elk filamenteus eiwit dat een affiniteit voor membranen vertoont.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bepaling van membraanhervormen met behulp van gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs)
OPMERKING: In deze sectie worden GUVs gegenereerd om de membraanvervormingen na te bootsen die mogelijk worden veroorzaakt door septines in een cellulaire context. Inderdaad, in cellen worden septines vaak gevonden op plaatsen met micrometerkrommingen. GUVs hebben afmetingen variërend van enkele tot tientallen micrometers en kunnen worden vervormd. Ze zijn dus geschikt om eventuele septine-geïnduceerde vervormingen op micrometerschaal te testen. Fluorescerende lipiden, evenals fluorescerend gelabelde septines (met behulp van Green Fluorescent Protein [GFP]), worden gebruikt om het gedrag van zowel lipiden als eiwitten te volgen via fluorescentiemicroscopie.
- Bereiding van buffers en oplossingen
- Bereid de GUV-groeibuffer (50 mM NaCl, 50 mM sucrose en 10 mM Tris [pH = 7,8]) en de observatiebuffer (75 mM NaCl en 10 mM Tris [pH = 7,8]).
- Meet (met behulp van een commerciële osmometer) en pas de osmolariteit van de waarnemings- en groeibuffers aan (170 mOsmol· L-1, in theorie) door kleine hoeveelheden NaCl toe te voegen totdat hun respectievelijke osmolariteiten gelijk zijn. Filter de buffers met een filter van 0,2 μm. Vul de groeibuffer aan en bewaar deze bij -20 °C voor verder gebruik. Bewaar de observatiebuffer bij 4 °C.
OPMERKING: Het verschil in osmolariteit tussen beide buffers mag niet groter zijn dan 5%. - Bereid een 5 mg·ml-1 β-caseïneoplossing in de observatiebuffer. Zorg voor volledige oplossing (na enkele uren bij 4 °C met magneetroeren). Filtreer de oplossing met een 0,2 μm filter, aliquot, en bewaar bij -20 °C.
- Bereid de lipidenmengsels bij een totale lipidenconcentratie van 3 mg·ml-1 in chloroform. Gebruik een samenstelling (mol%) van 56,8% Ei L-α-fosfatidylcholine (EggPC), 15% cholesterol, 10% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (DOPE), 10% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serine (DOPS), 8% hersenen L-α-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (PI(4,5)P2) en 0,2% Bodipy-TR-Ceramide om de eiwit-lipide interacties te verbeteren en de opname van PI(4,5)P2 25 te bevorderen.
OPMERKING: Hanteer chloroform onder een zuurkap met nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril. Pipetteer chloroform-oplossingen met glazen spuiten en vermijd plastic omdat chloroform plastic oplost. Spoel de spuiten voor en na gebruik door chloroform 5x-10x te pipetteren. Gebruik afzonderlijke spuiten om specifieke fluorescerende lipiden te pipeten om kruisbesmetting te voorkomen. Lipiden kunnen worden opgeslagen in chloroform bij -20 °C in een amberkleurige glazen injectieflacon afgedekt met teflon. De injectieflacons moeten vóór het sluiten worden gevuld met argon en worden verzegeld met parafilm om lipide-oxidatie te voorkomen. - Elektro-vorming van GUVs met behulp van een platina draden setup
OPMERKING: Figuur 1 toont het schema van de experimentele stappen en een afbeelding van de kamer.- Reinig de kamer en platinadraden grondig als volgt om eventuele lipideresten te verwijderen.
- Dompel de draden en de kamer in aceton en soniceer gedurende 10 minuten. Veeg ze voorzichtig af met een papieren zakdoekje met aceton.
- Monteer de kamer door de draden in te brengen, duik opnieuw in aceton en soniceer gedurende 10 minuten. Veeg nogmaals af met aceton en zorg ervoor dat de draden volledig zijn gereinigd. Dompel de kamer in ethanol, soniceer gedurende 10 minuten en veeg af met ethanol.
- Dompel ten slotte de kamer in gedeïoniseerd water, soniceer gedurende 10 minuten en droog met een stroom stikstof of lucht.
OPMERKING: De teflonkamer (figuur 1B) werd op maat gemaakt in de eigen werkplaats. Het biedt plaats aan drie compartimenten die aan beide zijden kunnen worden afgedicht met behulp van glazen afdekplaten. Platina draden kunnen in de kamer worden gestoken door gaten met een diameter van 1,3 mm. - Na het reinigen van de kamer, deponeer 3-4 druppels per compartiment (elke druppel is ongeveer 0,1 μL)) van het 3 mg·ml-1 lipidenmengsel op elke platinadraad. Draai de draden 180° en deponeer 3-4 lipidedruppels per compartiment aan de andere kant van elke platinadraad. Zorg ervoor dat de druppels geen contact met elkaar maken. Ongeveer 5 μL van het lipidenmengsel is nodig per hele kamer.
- Plaats de groeikamer gedurende 30 minuten in een vacuümkamer om eventuele sporen van chloroform te verwijderen.
OPMERKING: Diep vacuüm (0,1 mbar) is het beste. Wanneer gedroogd, zijn lipiden kwetsbaar voor oxidatie en mogen daarom niet langer dan een paar minuten in de lucht worden achtergelaten. - Deponeer hoogvacuümvet aan de onderkant van de kamer (de kant die zich het dichtst bij de draden bevindt) langs de rand van de drie compartimenten met behulp van een spuit en druk een schone (22 mm x 40 mm) afdeksel tegen het vet om een perfecte afdichting te garanderen. Sluit beide uiteinden van de kamer af (d.w.z. op de in- en uitgangen van de draden) met afdichtingspasta (wasplaten). Breng op dezelfde manier vacuümvet aan de andere kant van de kamer aan.
- Vul de compartimenten met groeibuffer (~1 ml per kamer) met behulp van een pipet. Roer de oplossing niet te snel of sterk om te voorkomen dat de lipidefilm loskomt van de draden. Sluit de bovenkant van de kamer hermetisch af met een afdeksel van 22 mm x 40 mm door deze tegen het vet te drukken. Om de vorming van luchtbellen te voorkomen, drukt u voorzichtig op de glazen afdekplaat van het midden naar de randen.
- Plaats de kamer in een koelkast van 4 °C en sluit de draden aan op een golffunctiegenerator (sinusfunctie bij 500 Hz). Stel een effectieve spanning in van 350 mV voor een kortere groeiperiode (d.w.z. 6 h) of 250 mV voor een langere groeiperiode (d.w.z. 12-16 h), zoals al gepresenteerd en geoptimaliseerd in een studie van Beber et al.25.
- Verwijder de coverslips, veeg het kit en vet af en verwijder de draden. Was en schrob de kamer met een papieren zakdoekje met afwisselend water en ethanol (≥70%).
OPMERKING: De optimale spanning en tijdschaal voor GUV-groei zijn afhankelijk van vele parameters, van de bufferzoutconcentratie tot de kamergeometrie (d.w.z. de afstand tussen de draden en de kamergrootte). Gebruik dezelfde kamer telkens wanneer het experiment wordt herhaald om de reproduceerbaarheid te garanderen. De draden bevinden zich in de buurt van de bodem van de kamer, zodat de lipiden kunnen worden afgebeeld met behulp van fluorescerende microscopie. Stel de lipiden bij elke stap in beeld (zie figuur 1C,D) om er zeker van te zijn dat het elektrovormingsproces succesvol is.
- Septine incubatie met de blaasjes
- Verzamel GUVs van de draden met behulp van voorgesneden pipetpunten (~ 1 mm opening) die in de buurt van de draden worden gebracht. Pipetteer vervolgens de oplossing langs de hele draad. Deze procedure voorkomt het genereren van sterke lamellaire stromen die de GUVs kunnen verstoren. Na deze stap is het snijden van pipetpunten niet langer nodig. Inderdaad, lamellaire stromen beschadigen GUVs niet in de oplossing.
OPMERKING: Vanwege de aanwezigheid van PI(4,5)P2 in het lipidenmengsel mogen guvs die zijn verzameld niet langer dan 2-3 uur vóór het experiment worden bewaard. Inderdaad, PI(4,5)P2 wordt snel opgelost en septines binden zich enkele uren na hun vorming niet meer aan de membranen. Zodra septines echter aan het membraan zijn gebonden, blijven ze een paar dagen gebonden. - Verdun de septinestamoplossing in Tris 10 mM (pH 8) uitsluitend om een osmolariteit te bereiken die gelijk is aan die van de groeibuffer; verdun indien nodig de septineoplossing verder in de observatiebuffer. Voeg het beoogde volume van verzamelde GUVs (50-100 μL toe voor een totaal volume van 200 μL). Voer de incubatie direct in de observatiekamer uit na passivering met β-caseïne (zie hieronder). 20-30 minuten wachttijd is nodig om een evenwicht te bereiken.
OPMERKING: De expressie en zuivering van septine octamere complexen (menselijke of ontluikende gisten) worden uitgebreid beschreven in andere artikelen17. In het kort werden septines uitgedrukt in Escherichia coli, gezuiverd in het laboratorium met behulp van affiniteits-, grootte-uitsluitings- en ionenwisselingschromatografiestappen, en opgeslagen bij -80 °C in een waterige oplossing van 50 mM Tris-HCl (pH 8), 300 mM KCl en 5 mM MgCl2 bij ~1 mg·ml-1 (3 μM) concentratie. Een hoge zoutconcentratie wordt gebruikt om septineaggregatie te voorkomen. Septinecomplexen mogen niet worden geconcentreerd door een filtercentrifugatieapparaat, dat aggregatie induceert en zo de eiwitopbrengst vermindert.
- Verzamel GUVs van de draden met behulp van voorgesneden pipetpunten (~ 1 mm opening) die in de buurt van de draden worden gebracht. Pipetteer vervolgens de oplossing langs de hele draad. Deze procedure voorkomt het genereren van sterke lamellaire stromen die de GUVs kunnen verstoren. Na deze stap is het snijden van pipetpunten niet langer nodig. Inderdaad, lamellaire stromen beschadigen GUVs niet in de oplossing.
- Beeldvorming met confocale en/of draaiende schijfmicroscoop
- Om te voorkomen dat de GO's aan het oppervlak blijven plakken en/of exploderen, passiveert u de observatiekamer door deze gedurende 30 minuten te incuberen met een 5 mg·ml-1 β-caseïneoplossing.
- Verwijder de β-caseïneoplossing en breng de septine-GUV-oplossing (stap 1.4.2.) met een pipet over in de observatiekamer. Laat de GUVs 10-15 minuten naar de bodem van de kamer bezinken.
OPMERKING: De samenstellingsverschillen tussen het inwendige van de GUV en de externe buffer creëren zowel een dichtheid als een refractie-index die niet overeenkomen. Door de refractieve index mismatch zijn de GUVs zichtbaar met transmissie licht optische microscopie. - Visualiseer met behulp van confocale microscopie het fluorescerende signaal van de lipiden om te controleren op de kwaliteit van de GUVs en de lamellriteit van het membraan. Beoordeel de dichtheid van septines gebonden aan GUVs door het fluorescerende signaal van de septines te registreren na het uitvoeren van een goede kalibratie25. Voer Z-stack acquisities uit met een ruimtelijk interval van 0,4 μm om de 3D-vervormingen van de blaasjes te analyseren en te visualiseren die worden veroorzaakt door de interactie tussen de septines en het membraan.
OPMERKING: Olie-onderdompelingsdoelen met 60- of 100-voudige vergrotingen werden gebruikt. Standaard confocale of draaiende schijfmicroscopen (Tabel van Materialen) met pixelgroottes van respectievelijk 250 nm en 110 nm werden gebruikt. Men moet de beeldvormingsomstandigheden aanpassen aan een bepaald apparaat. Er werden geen specifieke anti-fotobleekmiddelen aan de oplossing toegevoegd.
Figuur 1: Elektro-vorming van GUVs. (A) Schematische weergave van het elektrovormingsproces met behulp van platinadraden. (B) Foto van het zelfgemaakte teflonapparaat geassembleerd met platina draden die worden gebruikt voor het genereren van GUVs door elektrovorming. Draden hebben een diameter van 0,5 mm en een afstand van 3 mm. (C) GUVs (bolvormige objecten) waargenomen door transmissie optische microscopie tijdens het groeiproces. De ondoorzichtige zone aan de onderkant van de afbeelding is de platinadraad. (D) GUVs (ronde fluorescerende objecten) waargenomen met fluorescerende microscopie tijdens de groei op de platinadraad. Schaalstaven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Analyse van de ultrastructurele organisatie van septinefilamenten door cryo-elektronenmicroscopie
OPMERKING: Blaasjes zijn niet geschikt voor beeldvorming met standaard elektronenmicroscopiemethoden. Inderdaad, monsters worden gedroogd met behulp van standaard negatieve vlekmethoden. Bij uitdroging zullen blaasjes waarschijnlijk niet-specifieke vervormingen ondergaan, wat vaak resulteert in lipide-uitsteeksels. Cryo-elektronenmicroscopie is dus een veel betere strategie om specifieke vervormingen van blaasjes waar te nemen. Met behulp van cryo-EM worden de monsters ingebed in een dunne (~ 100-200 nm) laag verglaasd ijs, die de monsters dicht bij de oorspronkelijke staat bewaart. GUVs zijn echter te groot (enkele tientallen micrometers) om ingebed te worden in dun ijs en dus in beeld gebracht door transmissie-elektronenmicroscopie. Vandaar dat grote unilamellaire blaasjes (LUV's), waarvan de diameters variëren van ~ 50-500 nm, worden gegenereerd om te bepalen hoe septines blaasjes kunnen vervormen en hoe ze zich op blaasjes rangschikken.
- Generatie van grote unilamellaire blaasjes (LUVs)
- Bereid 50 μg lipidenmengsel opgelost in chloroform met een molaire samenstelling van 57% EggPC, 15% cholesterol, 10% DOPE, 10% DOPS en 8% hersen PI (4,5) P2), die is geoptimaliseerd om de septine-interactie met het membraan in een glazen injectieflacon te verbeteren.
- Droog de oplossing onder argonstroom om een gedroogde lipidenfilm in de injectieflacon te genereren. Zet de injectieflacon gedurende 30 minuten onder vacuüm om de lipide volledig te drogen.
- Resonbiliteer de lipidefilm in 50 μL waterige oplossing (50 mM Tris-HCl [pH 8]; 50 mM KCl; 2 mM MgCl2) om een eindconcentratie van 1 mg·ml-1, vortex gedurende 10 s te verkrijgen en breng de oplossing over in een buis.
OPMERKING: LUV's moeten onmiddellijk worden gebruikt voor incubatie met septines. Anders zal de eiwit-lipide interactie zwak zijn vanwege PI(4,5)P2-oplosbaarheid. Dit ruwe heroplosbaarheidsproces genereert een heterogene populatie blaasjes met diameters variërend van 50 nm tot 500 nm. Vandaar dat een hele reeks diameters en dus krommingen tegelijkertijd worden getest.
- Incubeer de septines met de opgeloste lipiden bij de uiteindelijke lipide- en septineconcentraties van respectievelijk 0,1 mg·ml-1 (ongeveer 300 nM) en 20 nM in een zoutrijke buffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2). Incubeer het monster gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Dompelbevriezing om het monster te verglaasen
- Gloeiende gatvormige koolstofroosters (300 mesh) aan de koolstofzijde gedurende 30 s bij 5 mA met behulp van plasmageneratorapparatuur en plaats het rooster in een dompelbevriezingsmachine in een vochtige omgeving.
- Adsorbeer 4 μL van het monster (stap 2.2.) aan de gloeiende koolstofzijde van het rooster. Voeg onmiddellijk vóór de adsorptie van het monster 5-10 nm gouden kralen toe aan de oplossing, voor het geval de monsters worden gebruikt om gekantelde series te genereren door cryotomografie.
OPMERKING: De dichtheid van gouden kralen moet worden gescreend en empirisch worden aangepast en is afhankelijk van de provider. De geoptimaliseerde dichtheid is 10-15 gouden kralen in het gezichtsveld. - Dek de monsters van de blote kant af om de monsterdruppel aan de andere kant te aspirateren.
OPMERKING: De blotting-tijd is meestal 4 s en de positie van het filterpapier en de vloeikracht worden empirisch aangepast door alternatieve posities van het filterpapier te testen en te screenen om de ijskwaliteit (dikte) en de materiaaldichtheid te optimaliseren. - Breng de roosters over in een microscoop of bewaar ze in een container met vloeibare stikstof.
OPMERKING: Het gebruik van gatachtige koolstofroosters is essentieel om de polydispersiteit in de grootte van de blaasjes op te vangen. Het vetmesten van het monster van de andere kant bevordert een verbeterde adsorptie van het biologische materiaal op het rooster.
- Cryo-elektronenmicroscopie beeldvorming
- Plaats de roosters in een elektronenmicroscoop (EM) die is uitgerust voor cryo-EM-observatie. Scherm het hele raster door een kaart van het hele monster te genereren bij lage vergroting (meestal bij 120x vergroting) om gebieden te selecteren die beter ijs weergeven (d.w.z. dun en goed verglaasd).
- Verzamel voor cryo-EM 2D-gegevensverzameling afbeeldingen met een pixelgrootte van ongeveer 2 Å per pixel om te controleren op de kwaliteit van het monster. Zorg ervoor dat zowel de septinefilamenten als de lipide bilayer zichtbaar zijn.
- Voor het verzamelen van cryo-elektronentomografiegegevens selecteert u interessegebieden die misvormde blaasjes weergeven. Zorg ervoor dat er voldoende gouden kralen (minimaal 10) in het gezichtsveld aanwezig zijn.
- Volgens de software die wordt gebruikt voor het verzamelen van gekantelde seriegegevens, selecteert u focus- en trackingposities om ver genoeg van het interessegebied te zijn. Verzamel gekantelde series door de kantelhoek te variëren van -60° tot +60°, waarbij elke 2°-3° graden een beeld wordt verzameld.
OPMERKING: De totale dosis moet ongeveer of minder dan 100 elektronen/Å2 zijn. De pixelgrootte varieert van 1,3 Å tot 2,1 Å, afhankelijk van de microscoop die wordt gebruikt voor het verzamelen van gegevens. Idealiter heeft een hoeksymmetrisch schema voor gegevensverzameling de voorkeur als volgt: 0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°. Goniometers van side-entry microscopen bieden echter niet genoeg mechanische stabiliteit om die symmetrische schema's te bereiken. Als alternatief kan de acquisitie worden gestart op 0° tot 34°, gevolgd door een tweede hoeksequentie van -2° tot -60°, en eindigend met een laatste reeks van 36° tot 60°. Het doel is om de eerste beelden (met de laagste stralingsschades) onder de laagste hoeken te verzamelen. Bovendien, om de ultrastructuur van blaasjes en gebonden septinefilamenten te visualiseren, kan een standaard cryo-EM-microscoop worden gebruikt (200 kV, Lanthaanhexaboride (LaB6) filament en sample side entry). Als men echter verdere beeldverwerking nastreeft (subtomogrammiddeling, bijvoorbeeld), is het het beste om de laatste generatie field emission gun (FEG) microscopen te gebruiken die zijn uitgerust met directe detectoren. In dit protocol beperken we onze beschrijving tot het verkrijgen van 3D-reconstructies en laten we subtomogrammiddeling weg.
- 3D-reconstructie van cryotomografie en segmentatie
- Gebruik de IMOD-softwaresuite (Materiaaltabel) voor het uitlijnen van gekantelde seriebeelden en 3D-reconstructie26,27. Voer binnen IMOD tilt series uitlijning uit op basis van fiducials (gouden kralen) positionering. Voer bovendien, indien nodig, de bepaling en correctie van de contrastoverdrachtsfunctie (CTF) uit binnen IMOD26. Tot slot, bereik 3D-reconstructie met IMOD, waarbij elke stap rigoureus wordt gevolgd.
- Segmenteer handmatig de lipide bilayers en septine filamenten met behulp van 3Dmod27 uit de IMOD-softwaresuite, voor weergave.
3. Analyse van krommingsgevoeligheid van septine met behulp van SEM
OPMERKING: Om te begrijpen hoe septines gevoelig kunnen zijn voor micrometerkrommingen, is een in vitro benadering gebruikt om septinefilamentcomplexen te incuberen met vaste ondersteunde lipide bilayers afgezet op golvende golvende patronen op micrometerschaal.
- Ontwerpen van golvende NOA (Norland optische lijm) replica van golvende polydimethylsiloxaan (PDMS) patronen
- Gebruik PDMS golvende patronen van 250 nm amplitude en 2 μm laterale periodiciteit of andere dimensies om de krommingen te testen die geschikt zijn voor het eiwit van belang.
OPMERKING: PDMS golvende patronen worden ontworpen en gegenereerd zoals beschreven in Nania et al.28,29. - Deponeer in een cleanroomomgeving 5 μL vloeibare NOA op een cirkelvormige glazen afdekplaat met een diameter van 1 cm en plaats de PDMS-sjabloon op de druppel. Behandel met UV-licht (320 nm) gedurende 5 minuten om de vloeibare NOA te fotopolymeren tot een dunne polymeerfilm. Pel vervolgens voorzichtig de PDMS-sjabloon van de coverslip met de vers gepolymeriseerde NOA.
OPMERKING: NOA is een veel voorkomende optisch transparante lijm die geschikt is voor optische microscopie beeldvorming. Bovendien is NOA bestand tegen de chemische fixatie- en kleuringsprocessen die voorafgaand aan SEM-beeldvorming worden uitgevoerd. Zowel NOA 71- als NOA 81-harsen kunnen worden gebruikt met vergelijkbare resultaten. Het initiële PDMS-patroon kan meerdere keren worden gebruikt om NOA-replica's te produceren. De verkregen NOA replica's kunnen maandenlang in een doos bij kamertemperatuur worden bewaard.
- Gebruik PDMS golvende patronen van 250 nm amplitude en 2 μm laterale periodiciteit of andere dimensies om de krommingen te testen die geschikt zijn voor het eiwit van belang.
- Generatie van een ondersteunde lipide bilayer en eiwit incubatie
- Behandel de NOA-films met een luchtplasmareiniger gedurende 5 minuten om het oppervlak hydrofiel te maken.
- Bereid een oplossing van kleine unilamellaire blaasjes (SUV's) met een molaire samenstelling van 57% EggPC, 15% cholesterol, 10% DOPE, 10% DOPS en 8% hersen PI(4,5)P2 bij een totale lipideconcentratie van 1 mg·ml-1. Bereid de SUV's voor door een gedroogde lipidenfilm in de observatiebuffer te resuspenderen, zoals beschreven in stap 2.1.3. Soniceer de oplossing voorzichtig met behulp van een badsonicator gedurende 5-10 minuten totdat de oplossing transparant is.
OPMERKING: De oplossing van SUV's kan enkele weken bevroren worden bewaard bij -20 °C. - Plaats de coverslips die de NOA-patronen ondersteunen in de putten van celkweekdozen. Deponeer 100 μL 1 mg·ml-1 SUV-oplossing op de vers gloeiende NOA-patronen (stap 3.2.1.) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Deze stap induceert de fusie van SUV's met het oppervlak van het NOA-patroon om een ondersteunde lipide bilayer te genereren.
- Spoel de glaasjes 6x grondig af met de septinebuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) om ongefundeerde SUV te verwijderen. Laat het monster na elke spoeling nooit volledig drogen.
- Verdun de octamere septinevoorraadoplossing in septine-zoutbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2) met behulp van septinebuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) tot eindconcentraties variërend van 10 nM tot 100 nM en volumes van 1 ml. Incubeer de eiwitoplossing op de dia's gedurende ~ 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Het volume is groot genoeg zodat verdamping geen probleem is.
- Monstervoorbereiding voor SEM-analyse
OPMERKING: Er zijn verschillende protocollen ontwikkeld in elektronenmicroscopie om eiwitstructuren en hun assemblage te analyseren. Het huidige protocol behoudt de organisatie van septinefilamenten, met behulp van een fixatieprotocol afgeleid van Svitkina et al.30 dat is eenvoudig te implementeren. Bovendien optimaliseert dit protocol SEM-waarnemingen met hoge resolutie.- Bereiding van reagentia en stamoplossingen
OPMERKING: Dit protocol vereist verschillende reagentia en oplossingen die van tevoren of vlak voor de incubatie kunnen worden bereid. Volg de meegeleverde instructies om artefacten of gebrek aan chemische reactiviteit te voorkomen.- Natriumcacroodylaat 0,2 M stamoplossing: Om deze oplossing met dubbele sterkte te bereiden, lost u 2,14 g natriumcacodylaatpoeder op in ~ 40 ml gedestilleerd water onder magnetisch roeren. Na volledige oplossing, pas de pH aan op 7,4 door voorzichtig 0,1 M HCl (~ 1 ml voor 50 ml oplossing) toe te voegen en het uiteindelijke volume aan te vullen met gedestilleerd water. Deze oplossing kan 24-48 uur bij 4°C worden bewaard.
- 2% glutaaraldehyde (GA) in 0,1 M natriumcacodilaat (fixatieve oplossing): Bereid deze oplossing vlak voor gebruik door zeer zuivere EM-kwaliteit GA te verdunnen met 0,2 M natriumcacodilaatoplossing (zie hierboven). Gebruik een 25%-50% commerciële GA-voorraadoplossing vanwege de geoptimaliseerde opslagcapaciteit bij 4 °C. Verdun voor het bereiden van 10 ml fixatieve oplossing 0,8 ml 25% commerciële GA-oplossing met 4,2 ml gedestilleerd water en 5 ml natriumcacactyl.
- 1% osmiumtetroxide (OsO4) in 0,1 M natriumcacodylaat: Bereid deze tweede fixatieve oplossing vlak voor gebruik door de commerciële 4% OsO 4-stamoplossing te verdunnen met 0,2 M natriumcacodylaat (zie hierboven). Verdun voor 4 ml Fixatieve oplossing OsO4 1 ml 4% commerciële OsO4-oplossing met 1 ml gedestilleerd water en 2 ml natriumcacactyl.
OPMERKING: Gebruik commerciële 4% OsO4-voorraadoplossing in splijtbare glazen lampen vanwege hun opslag- en verwerkingseigenschappen. Merk op dat OsO4 zeer reactief is. Zorg ervoor dat de kleur licht geel is en niet donker. - 1% looizuur (TA) in water: Bereid deze oplossing vlak voor gebruik. Bereid de TA-oplossing om een eindconcentratie van 1% TA in gedestilleerd water bij kamertemperatuur te verkrijgen. Los 10 mg op in 1 ml gedestilleerd water en vortex gedurende enkele minuten. TA-oplossing kan niet worden bewaard en moet voor gebruik worden gefilterd met een filter van 0,2 μm.
- 1% uranylacetaat (UA) oplossing in water Bereid UA-oplossing voor om een eindconcentratie van 1% UA in gedestilleerd water te verkrijgen. Los 10 mg op in 1 ml gedestilleerd water en vortex gedurende ten minste 30 minuten tot 1 uur door vortexen of schudden bij kamertemperatuur. Deze oplossing kan 1 maand bij 4 °C worden bewaard, maar kan gemakkelijk neerslaan en moet daarom voor gebruik worden gefilterd met een filter van 0,2 μm.
- Gesorteerde reeks ethanoloplossingen Bereid 50%, 70%, 95% en 100% ethanoloplossingen in water. Bereid het laatste bad van nieuw geopende flessen van 100% ethanol of van 100% ethanol dat gedurende ten minste 24 uur is gedehydrateerd met moleculaire zeven (nominale poriediameter = 4 Å) om alle sporen van water uit monsters te verwijderen die het drogen en coaten kunnen verstoren. Zorg ervoor dat u deze oplossing niet schudt, omdat dit resuspensie van silicaatdeeltjes kan veroorzaken.
OPMERKING: Wees voorzichtig bij het hanteren van de chemische reagentia die in dit protocol worden gebruikt. Glutaaraldehyde, osmiumtetroxide, natriumcacodylaat en uranylacetaat zijn allemaal zeer giftig, uranylacetaat is ook radioactief. Alle manipulatie van de reagentia en hun afval moet worden gedaan met behulp van individuele (handschoenen, laboratoriumjassen, veiligheidsbrillen) en collectieve bescherming (zuurkasten en plexiglas schilden), volgens de laboratoriumspecifieke procedures.
- Monsterfixatie
- Was de monsters (d.w.z. NOA-dia's met gesmolten ondersteunde lipide-bilayers en geïncubeerd eiwit) met PBS. Vervang PBS door de GA-fixatieoplossing voorgewarmd bij 37 °C en laat de reactie gedurende 15 minuten doorgaan. Monsters kunnen dan bij 4 °C worden bewaard.
- Verwijder de fixatieve oplossing en was de vaste monsters 3x met 0,1 M natriumcacodylaat (5 min per wasbeurt) met zacht schudden.
- Incubeer de monsters in de Fixatieve oplossing OsO4 gedurende 10 minuten met maximale bescherming tegen licht om de fixatie van vliezige structuren mogelijk te maken en de elektrische geleidbaarheid van de monsters te verhogen. Verwijder de fixatieve oplossing en was de monsters 3x in gedestilleerd water (5 min per wasbeurt) met zacht schudden.
- Incubeer de gewassen monsters in de gefilterde TA-fixatieve oplossing gedurende maximaal 10 minuten. Verwijder de TA-oplossing en was de monsters 3x in gedestilleerd water (5 min per wasbeurt) met zacht schudden.
- Incubeer de gewassen monsters in een vers gefilterde UA fixatieve oplossing gedurende 10 minuten met maximale bescherming tegen licht. Verwijder de UA-oplossing en was de monsters 3x in gedestilleerd water (5 min per wasbeurt) met zacht schudden.
- Uitdroging van het monster en drogen op kritieke punten
OPMERKING: Luchtdrogen is niet toegestaan om beschadiging van monsters door ongewenste oppervlaktespanningen te voorkomen bij het overschakelen van de vloeistof naar de gasvormige toestand. In EM zijn twee methoden vastgesteld: de fysische methode om de superkritische toestand van CO2 te bereiken en het kritieke punt (31 °C, 74 bar) te omzeilen, of de chemische methode voor het verdampen van hexamethyldisilazane (HMDS), een droogmiddel met verminderde oppervlaktespanning. CO2 en HMDS zijn slecht mengbaar met water. Daarom moeten alle sporen van water worden vervangen door een overgangsoplosmiddel (ethanol) om schade later tijdens de droogprocessen te voorkomen.- Incubeer de monsters gedurende 2-3 minuten in elke ethanoloplossing, beginnend bij 50% tot 100% (watervrij) ethanolbad.
OPMERKING: Aangezien de verdamping van ethanol tussen baden snel is, moet de monsterbehandeling ook snel zijn om luchtdroging te voorkomen. - Breng de glasglaasjes over in de kritische puntdroger die is voorgevuld met ethanol en volg de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: In dit protocol werd een automatisch apparaat gebruikt, maar elk systeem kan worden gebruikt. Protocollen kunnen voor elk apparaat verschillen, maar moeten worden geoptimaliseerd om ethanol volledig te verwijderen (25 baden in dit protocol) en de snelheden voor de verschillende oplosmiddeluitwisselingen (CO 2-inlaten en ethanol / CO2-uitgangen) en de uiteindelijke drukverlaging (bijna 1 uur in dit protocol) te verlagen. - Aan het einde van het drogen van het kritieke punt, bewaar monsters onmiddellijk in een exsiccator tot montage en coating. Omdat gedroogde monsters zeer hygroscopisch zijn, moet u ze (zie hieronder) zo snel mogelijk coaten.
OPMERKING: Als alternatief kan HMDS een goedkopere en snellere methode bieden. Hoewel HDMS nooit op onze monsters is getest, leverde deze aanpak goede resultaten op voor de observatie van eiwitten aan de binnenkant van cellulaire membranen31,32.
- Incubeer de monsters gedurende 2-3 minuten in elke ethanoloplossing, beginnend bij 50% tot 100% (watervrij) ethanolbad.
- Monstermontage en coating.
OPMERKING: Omdat biologische monsters slechte elektrische geleidbaarheidseigenschappen vertonen, moeten ze vóór SEM-observatie worden gecoat met een geleidende metaalfilm. Er wordt dus gebruik gemaakt van plasma-magnetron sputteren.- Bevestig de coverslip aan stompen die zullen worden gebruikt voor toekomstige SEM-waarnemingen. Gebruik zilververf vanwege de verbeterde elektrische geleidbaarheid, in vergelijking met koolstofschijven. Voeg een strook zilververf toe aan de bovenkant van de coverlip en zorg ervoor dat de verbinding met de stomp bevredigend is. Vermijd verfagglomeraten.
OPMERKING: De zilveren verfstrip moet dun zijn om contact tussen het monster en de objectieve lens van de SEM te vermijden bij het werken met hoge resoluties (d.w.z. lage werkafstand). - Wacht tot het oplosmiddel volledig is verdampt.
OPMERKING: De duur van deze stap kan variëren, afhankelijk van de hoeveelheid en de dikte van de zilververfafzetting. Deze stap kan worden verkort door een stolp of de coater en een primaire stofzuiger gedurende 10-30 minuten te gebruiken. - Gebruik een apparaat dat is uitgerust met een plasma-magnetron sputterkop en een roterend-planetaire fase en volg de standaardprotocollen van de fabrikant. Hier werd het apparaat geëvacueerd tot 2,5 x 10-5 mbar, 1x gezuiverd met hoogwaardig argon en vervolgens aangepast aan 8,0 x 10-3 mbar.
- Voer pre-sputtering uit (120 mA voor 60 s) om de oxidelaag aan het oppervlak te verwijderen. Deponeer vervolgens 1,5 nm wolfraam (90 mA, werkafstand = 50 mm) met behulp van een filmdiktemonitor.
OPMERKING: De coater moet perfect worden gereinigd om de reproduceerbaarheid van de filmverdamping te garanderen. De coating moet worden gestopt zodra de beoogde dikte is bereikt. De uiteindelijke filmdikte wordt achteraf berekend en gecorrigeerd. Films van ongeveer 1,5 nm hebben gemiddeld een nacorrectie van 0,7 nm met behulp van ons apparaat. Aangezien die correctiewaarden dicht bij het doel liggen, wordt een reeks coatings uitgevoerd om deze correctie te beoordelen en vervolgens af te trekken van de doelwaarde. - Bewaar de monsters onder vacuüm om ze te beschermen tegen de omgevingslucht tot en met alle SEM-analyses.
OPMERKING: De aard van het metaal dat wordt gebruikt voor sputteren. Pt, ondanks dat het een veel voorkomend materiaal is, resulteert in een coating van slechte kwaliteit met een Pt-filmdikte aangepast aan septinefilamenten (1,5 nm). Bij hoge resoluties mist een 1,5 nm Pt-film cohesie; de grootte van de Pt-clusters en de septinefilamenten worden daardoor vergelijkbaar, wat leidt tot verkeerde interpretaties tijdens het filamentsegmentatieproces33 (zie figuur 2A, inzet). Wolfraam is een goed alternatief voor Pt omdat het een kleinere korrelgrootte vertoont, nauwelijks zichtbaar bij SEM met hoge resolutie (zie figuur 2B, inzet). Niettemin wordt zuiver wolfraam gemakkelijk geoxideerd, wat leidt tot sterke oplaadeffectartefacten tijdens SEM-observatie als de procedure wordt beschreven in stap 3.3.4. wordt niet strikt gevolgd.
- Bevestig de coverslip aan stompen die zullen worden gebruikt voor toekomstige SEM-waarnemingen. Gebruik zilververf vanwege de verbeterde elektrische geleidbaarheid, in vergelijking met koolstofschijven. Voeg een strook zilververf toe aan de bovenkant van de coverlip en zorg ervoor dat de verbinding met de stomp bevredigend is. Vermijd verfagglomeraten.
- Bereiding van reagentia en stamoplossingen
- Verkrijg de beelden met behulp van een field-emission SEM (FESEM) microscoop.
OPMERKING: SEM-technologieën zijn onlangs geüpgraded om de resolutie te verbeteren en de technologieën zijn afhankelijk van de fabrikant (bijv. Elektronenoptiek, bundelvertraging, magnetische lens). Deze toename in resolutie (toegankelijk bij verschillende fabrikanten), vooral bij een lage versnellende spanning (in de buurt van de nanometer bij 1 kV), is nodig om nanometrische structuren op te lossen die vergelijkbaar zijn met septinenetwerken.- Bereik beeldvorming met hoge resolutie door de detectie van primaire secundaire elektronen (SE1) met de "in-lens" detector met behulp van de volgende instellingen.
- Stel de acceleratiespanning in op 3 kV. Bevestig de bundelstroom met het diafragma van 20 μm (voor Zeiss Gemini I-kolommen, of equivalent aan 34 pA) of met het diafragma van 15 μm (voor Zeiss Gemini I-kolommen, of gelijk aan 18,5 pA), als de onderdrukking van oplaadeffecten nodig is.
- Gebruik voor waarnemingen resoluties variërend van 21,25 nm/pixel tot 1,224 nm/pixel en gebruik voor gegevensanalyse een resolutie van ~5,58 nm/pixel (20.000x vergroting volgens de Polaroid 545-referentie).
- Stel de werkafstand in tussen 1 mm en 2 mm voor observatie met hoge resolutie en ongeveer 3 mm als een grotere scherptediepte vereist is. Pas de scansnelheid en lijnintegratie continu aan om een constante signaal-ruisverhouding te garanderen met een acquisitietijd van ongeveer 30-45 s per beeld.
Figuur 2: Effect van het materiaal afgezet op septine filamenten op golvende PDMS patronen. SEM van septinefilamenten bedekt door sputteren met ofwel (A) 1,5 nm platina, met het patroon van "dorre gebarsten grond" dat typerend is voor een gebrek aan cohesie tussen de clusters van platinakernen, of (B) 1,5 nm wolfraam bedekt met een gladde en samenhangende laag. Schaalbalk = 200 nm. Witte vierkante vakken vertegenwoordigen de vergrote weergaven rechtsonder. De bolvormige bolletjes zijn kleine lipideblaasjes die interageren met de septines. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GUVs vervormingen
Typische confocale fluorescentiebeelden van GUVs die opnieuw zijn gevormd nadat ze zijn geïncubeerd met septines, worden weergegeven in figuur 3, in omstandigheden waarin septines polymeriseren. Kale GUVs (figuur 3A) waren perfect bolvormig. Bij incubatie met meer dan 50 nM ontluikende gist septineslamenten leken de blaasjes vervormd. Tot een concentratie van 100 nM ontluikende gistseptine-octameren leken de blaasjes gefacetteerd en bleven de vervormingen statisch en fluctueerden dus niet (figuur 3B). Boven 200 nM ontluikende gist septines, waarbij het membraan verzadigd was met septines, werden periodieke vervormingen waargenomen (figuur 3C). Met behulp van ontluikende gistseptines werden spikes gevisualiseerd met een periodiciteit variërend van 2 μm tot 6 μm en met een amplitude van ongeveer 1 μm. Vandaar dat septines membranen op een specifieke manier sterk hervormen. Deze amplitudes en bijbehorende krommingen van de waargenomen vervormingen weerspiegelen opvallend de affiniteit van septines voor micrometerkrommingen waargenomen in cellen. GUVs, die vervormbaar zijn, zijn dus geschikt om te testen hoe eiwitten membranen hervormen.
Figuur 3: Septine-geïnduceerde vervorming van GUVs. (A) Equatoriaal controlevlak GUVs gelabeld met 0,5% rhodamine PE en in beeld gebracht door confocale microscopie. Schaalbalk = 3 μm. (B) GFP-septines (100 nM) gebonden aan een vervormde GUV en in beeld gebracht door fluorescentie confocale microscopie. Schaalbalk = 1 μm. (C) GFP-septines (600 nM) gebonden aan een vervormde GUV en in beeld gebracht door fluorescentie draaiende schijfmicroscopie. Schaalbalk = 10 μm. De GUVs zijn gemaakt van een molaire verhouding van 56,8% EggPC, 15% cholesterol, 10% DOPE, 10% DOPS, 8% brain PI(4,5)P2 en 0,2% Bodipy-TR-Ceramide. De observatiebuffer omvat 75 mM NaCl en 10 mM Tris (pH = 7,8). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zelfassemblage van septinefilamenten gebonden aan LUV's in beeld gebracht door cryo-EM
In vergelijking met fluorescentiemicroscopie biedt cryo-EM een betere ruimtelijke resolutie. Individuele septinefilamenten en lipide bilayers zijn dus ondubbelzinnig te onderscheiden in afbeeldingen. Figuur 4A toont een afbeelding van LUV's versierd met ontluikende gistseptinefilamenten (sommige zijn blauw gemarkeerd) bij 50 nM. Parallelle sets filamenten, ongeveer 10 nm uit elkaar, werden waargenomen op de LUV's. Dit typische beeld is een 2D-projectie. Om eventuele 3D-vervorming te ontcijferen en te weten of septinefilamenten rechtstreeks interageren met het membraan, werd cryo-elektronentomografie uitgevoerd (figuur 4B en figuur 4C). Figuur 4B toont een plak in een 3D-reconstructie, terwijl figuur 4C een segmentatie van hetzelfde gebied weergeeft met het membraan in geel en de septinefilamenten in blauw. Zoals te zien is op het zijaanzicht, bleven septineslamenten in wezen recht gebonden aan het liposoom en was het blaasje aanzienlijk afgeplat in vergelijking met de naakte bolvormige blaasjes.
Figuur 4: Zelfassemblage van septinefilamenten gebonden aan LUV's. (A) Cryo-EM-afbeelding van septinefilamenten gebonden aan een blaasje. Sommige filamenten zijn blauw gemarkeerd voor zichtbaarheid. De donkere stippen zijn gouden fiducialen die meestal worden gebruikt om gegevens uit te lijnen voor tomografie. Schaalbalk = 100 nm. (B) en (C) 3D-reconstructie verkregen uit een gekantelde reeks. De lipiden zijn geel gemarkeerd, terwijl de septines in blauw zijn gesegmenteerd. Schaalstaven = 200 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Krommingsafhankelijke rangschikking van septinefilamenten gevisualiseerd door SEM
Septines lokaliseren zich in cellen op plaatsen met micrometerkrommingen (bijvoorbeeld bij de celdelingsgroef, de basis van trilharen, enz.). Bovendien tonen in vitro studies aan dat septines, zoals hierboven te zien, membranen kunnen hervormen, zodat ze uiteindelijk micrometerkrommingen vertonen. Om de krommingsgevoeligheid van septines voor zowel positieve (convexe) als negatieve (concave) krommingen te testen, werden septines geïncubeerd met een ondersteunde lipide bilayer gefuseerd met de hierboven beschreven golvende patronen. De uitkomst wordt weergegeven in figuur 5. Figuur 5A vat de verschillende stappen samen die nodig zijn om de monsters te verkrijgen. Figuur 5B toont een golvend patroon bij lage vergroting, waarbij de periodiciteit van negatieve en positieve krommingen duidelijk zichtbaar is. Twee opeenvolgende golven worden aangegeven door oranje ononderbroken lijnen. Defecten die ongeveer orthogonaal zijn aan de golven worden aangegeven met witte pijlen. Figuur 5C en figuur 5D tonen de ultrastructurele organisatie van septinefilamenten bij een hogere vergroting. De septines werden samengevoegd tot sets parallelle filamenten, waarvan de oriëntatie afhankelijk was van de kromming (zie filamenten gemarkeerd in blauw). Inderdaad, de septinefilamenten waren niet willekeurig georiënteerd. In plaats daarvan kunnen septines buigen bij interactie met negatieve (concave) krommingen om de opgelegde kromming te volgen. Omgekeerd bleven de septinefilamenten bij positieve krommingen recht, ongebogen en uitgelijnd langs de bolle golven. Vandaar dat septines kunnen interageren met zowel positieve als negatieve krommingen, maar specifieke organisaties aannemen op bepaalde krommingen. Deze methodologie lijkt dus bijzonder relevant om de krommingsgevoeligheid van binding en zelfassemblage van filamenteuze eiwitten te benadrukken.
Figuur 5: Krommingsafhankelijke rangschikking van septinefilamenten. (A) Schematische weergave van de stappen die nodig zijn om de "golvende" monsters te verkrijgen die bedoeld zijn om de gevoeligheid van de septinekromming te analyseren via SEM. (B) Lage vergroting SEM-afbeelding van een golvend patroon met gebonden septinefilamenten die niet bij deze resolutie worden opgelost. Twee opeenvolgende golven zijn oranje gemarkeerd. Orthogonale defecten worden aangegeven met witte pijlen. Schaalbalk = 10 μm. (C) SEM-afbeelding bij 10.000x vergroting waarbij septinefilamenten zichtbaar zijn. Schaalbalk = 1 μm. (D) SEM-afbeelding bij vergroting van 20.000x. Sommige filamenten zijn blauw gemarkeerd voor zichtbaarheid. Schaalbalk = 200 nm. De bolvormige objecten die in de afbeeldingen aanwezig zijn, zijn kleine blaasjes die interageren met de septines en het substraat. De septineconcentratie werd vastgesteld op 200 nM in B-D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals hierboven vermeld, is een lipidenmengsel gebruikt dat de PI(4,5)P2-opname in de lipide bilaag verbetert en zo septine-membraaninteracties vergemakkelijkt. Inderdaad, we hebben elders25 aangetoond dat ontluikende gist septines interageren met blaasjes op een PI(4,5)P2-specifieke manier. Deze lipidesamenstelling werd empirisch aangepast door het screenen van meerdere samenstellingen en wordt nu veel gebruikt door de auteurs. PI(4,5)P2 lipiden moeten zorgvuldig worden behandeld. Voorraadoplossingen moeten in kleine volumes worden gealiquoteerd, zodat een specifieke injectieflacon niet meer dan twee keer wordt geopend voor pipetteren. Bovendien moeten lipide-aliquots onder argon worden opgeslagen om lipide-oxidatie te voorkomen. Ten slotte, zodra de lipidenmengsels zijn opgelost in een waterige oplossing, moet het mengsel onmiddellijk worden gebruikt en kan het niet worden opgeslagen voor verdere experimenten. Met name na GUV-reconstitutie of ondersteunde lipide bilayer fusie, verminderde de interactie tussen septines en lipiden sterk na 2 uur.
Enkele van de resultaten verkregen met octamere ontluikende gist septine complexen (die Cdc10, Cdc11, Cdc12 en Cdc3 omsluiten) zijn hier gepresenteerd; de experimentele procedures die worden gevolgd om het gedrag van septinecomplexen van andere soorten te analyseren, moeten echter identiek zijn.
Om GUVs te genereren, geven we de voorkeur aan de elektro-vormingsmethode met platinadraden boven elektrovorming op ITO-platen of PVA-zwelling. Zoals eerder aangetoond25, produceert deze methode reproduceerbaar unilamellaire GUVs van goede kwaliteit zonder defecten.
De golvende substraten kunnen worden ontworpen met een breed scala aan krommingen. Na screening van verschillende ontwerpen zijn patronen met een periodiciteit van 2 μm en een amplitude van 250 nm, die krommingen genereren variërend van -3,5 μm-1 tot 3,5 μm-1 (± 0,5 um-1), consequent gebruikt. Met behulp van patronen met een korte periodiciteit en hogere amplitude pasten de lipide bilayers zich niet mooi aan het oppervlak aan. Vaak, in het geval van een hogere kromming, zou de bilayer tussen twee bolle golven worden opgehangen in plaats van volledig te worden ondersteund op het NOA-substraat. Met lagere amplitudes en grotere periodiciteit organiseerden septines zich met willekeurige nematische oriëntaties, wat aangeeft dat de patronen te vlak waren. Bovendien heeft het gebruik van golvende patronen in plaats van cilindrische buizen20 of bollen20 het voordeel dat zowel positieve als negatieve krommingen tegelijkertijd kunnen worden getest. In de toekomst zou het onderzoeken van het gedrag van filamenten op Gaussische "zadelachtige" krommingen relevant zijn om de kromming van meer realistische cellulaire contexten na te bootsen.
In oplossing veroorzaakte het mengen van LUV's met septines de generatie van septine-lipideaggregaten, zelfs bij lage concentraties eiwitten en lipiden. De monsters waren dus heterogeen en het is verstandig om te zoeken naar dunnere ijsdomeinen waar kleinere en meer gedefinieerde septine-blaasjesobjecten worden gevonden. Dit is met name cruciaal bij het kiezen van interessegebieden waar cryotomografie zal worden uitgevoerd. Vaak, zelfs bij lage vergrotingen, hebben blaasjes met uitsteeksels van sterke vervormingen, in vergelijking met bolvormige blaasjes, meer kans op een hoge dichtheid van septinefilamenten gebonden. Dit protocol richt zich op het verkrijgen van een beschrijving van de globale ultrastructuur van filamenten op biomimetische membranen. Momenteel zijn hogere resoluties bereikbaar. De resolutiebeperking is het gevolg van het beperkte aantal weergaven dat beschikbaar is via beeldvorming. Dit blijft echter buiten het bestek van dit protocol.
We hebben door middel van dit protocol aangetoond dat een combinatie van complementaire methoden essentieel is om te begrijpen en te ontleden hoe de specifieke rangschikking van cytoskeletale septineslamenten membranen op een krommingsafhankelijke manier kan detecteren en hervormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken Patricia Bassereau en Daniel Lévy voor hun nuttige adviezen en discussies. Dit werk heeft de steun gekregen van het ANR (Agence Nationale de la Recherche) voor de financiering van het project "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 en het project "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin wordt gefinancierd door de Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" en Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa werd ondersteund door Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink werd ondersteund door de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) via de 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'. Zwaartekrachtsuitkering (024.003.019). Wij danken de Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) en Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). We bedanken de Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, lid van de Franse nationale onderzoeksinfrastructuur France-BioImaging (ANR10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
References
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
- Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
- Lin, Y. -H., Kuo, Y. -C., Chiang, H. -S., Kuo, P. -L.
- Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
- Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
- Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
- Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
- Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
- Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
- Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
- Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
- Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
- Angelis, D., Spiliotis, E. T.
- Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
- Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
- Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
- Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
- Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
- Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
- Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
- Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
- Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
- Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, Pt 1 79-89 (1998).
