Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bottom-Up In Vitro-metoder för att analysera ultrastrukturell organisation, membranomformning och krökningskänslighetsbeteende hos septiner

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63889
Automatic Translation
*1, *1, 1,7, 1, 1, 2, 2, 3, 4, 5, *6, *1
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

Summary

Septiner är cytoskelettproteiner. De interagerar med lipidmembran och kan känna av men också generera membrankrökning på mikronskalan. Vi beskriver i detta protokoll bottom-up in vitro-metoder för att analysera membrandeformationer, krökningskänslig septinbindning och septinfilamentultrastruktur.

Abstract

Membranombyggnad sker ständigt vid plasmamembranet och inom cellulära organeller. För att helt dissekera miljöns roll (joniska förhållanden, protein- och lipidkompositioner, membrankrökning) och de olika partnerna som är associerade med specifika membranomformningsprocesser, genomför vi in vitro-bottom-up-metoder. Under de senaste åren har det funnits ett stort intresse för att avslöja rollen av septinproteiner associerade med stora sjukdomar. Septiner är väsentliga och allestädes närvarande cytoskelettproteiner som interagerar med plasmamembranet. De är inblandade i celldelning, cellmotilitet, neuromorfogenes och spermiogenes, bland andra funktioner. Det är därför viktigt att förstå hur septiner interagerar och organiserar vid membran för att därefter inducera membrandeformationer och hur de kan vara känsliga för specifika membrankrökningar. Denna artikel syftar till att dechiffrera samspelet mellan ultrastrukturen hos septiner på molekylär nivå och membranombyggnaden som sker i mikronskala. För detta ändamål uttrycktes och renades spirande jäst- och däggdjursseptinkomplex rekombinant. En kombination av in vitro-analyser användes sedan för att analysera självmontering av septiner vid membranet. Stödda lipid-dubbelskikt (SLB), gigantiska unilamellära vesiklar (GUVs), stora unilamellära vesiklar (LUVs) och vågiga substrat användes för att studera samspelet mellan septin-självmontering, membranomformning och membrankrökning.

Introduction

Septiner är cytoskelettfilamentbildande proteiner som interagerar med lipidmembran. Septiner är allestädes närvarande i eukaryoter och väsentliga för många cellulära funktioner. De har identifierats som de viktigaste regulatorerna för celldelning i spirande jäst och däggdjur 1,2. De är involverade i membranomformningshändelser, ciliogenes3 och spermiogenes4. Inom däggdjursceller kan septiner också interagera med aktin och mikrotubuli 5,6,7 i ett bindemedel av Rho GTPaser (BORG)-beroende sätt 8. I olika vävnader (neuroner9, cilia3, spermatozoa10) har septiner identifierats som regulatorer för diffusionsbarriärer för membranbundna komponenter11. Septiner har också visat sig reglera membran blebbing och utsprångsbildning12. Septiner, som är multi-tasking-proteiner, är inblandade i uppkomsten av olika vanliga sjukdomar13. Deras felreglering är förknippad med uppkomsten av cancer14 och neurodegenerativa sjukdomar15.

Beroende på organismen samlas flera septinunderenheter (två i Caenorhabditis elegans till 13 hos människor) för att bilda komplex vars organisation varierar på ett vävnadsberoende sätt16. Den grundläggande septinbyggstenen samlar två till fyra underenheter, närvarande i två kopior och självmonterade på ett stavliknande palindroma sätt. I spirande jäst är septiner oktameriska17,18. På plats är septiner ofta lokaliserade på platser med mikrometerkrökning; De finns vid divisionsförträngningsställen, vid basen av flimmerhår och dendriter och vid spermatozoas annulus19,20. Vid membranet verkar septinernas roll vara dubbel: de är inblandade i att omforma lipid-dubbelskiktet och upprätthålla membranintegriteten21. Därför är det avgörande att undersöka de biofysiska egenskaperna hos septinfilamentbildande proteiner och / eller underenheter vid membranet för att förstå deras roll. För att dissekera specifika egenskaper hos septiner i en välkontrollerad miljö är bottom-up in vitro-metoder lämpliga. Hittills har endast ett fåtal grupper beskrivit de biofysiska egenskaperna hos septiner in vitro20,22,23. Därför, jämfört med andra cytoskeletala filament, är den nuvarande kunskapen om beteendet hos septiner in vitro fortfarande begränsad.

Detta protokoll beskriver hur organisationen av septinfilament, membranomformning och krökningskänslighet kan analyseras19. För detta ändamål har en kombination av optiska och elektronmikroskopimetoder (fluorescensmikroskopi, kryoelektronmikroskopi [kryo-EM] och svepelektronmikroskopi [SEM]) använts. Membranomformningen av mikrometerstora jätteunilamellära vesiklar (GUVs) visualiseras med hjälp av fluorescensoptisk mikroskopi. Analysen av arrangemanget och ultrastrukturen hos septinfilament bundna till lipidblåsor utförs med användning av kryo-EM. Analys av septinkrökningskänslighet utförs med hjälp av SEM genom att studera beteendet hos septinfilament bundna till faststödda lipid-dubbelskikt avsatta på vågiga substrat med variabla krökningar, vilket möjliggör analys av krökningskänslighet för både positiva och negativa krökningar. Jämfört med tidigare analys20,24 föreslår vi här att använda en kombination av metoder för att noggrant analysera hur septiner kan självmontera, synergistiskt deformera membran och vara krökningskänsliga. Detta protokoll tros vara användbart och anpassningsbart till alla trådformiga proteiner som visar en affinitet för membran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bestämning av membranomformning med hjälp av gigantiska unilamellära vesiklar (GUV)

OBS: I detta avsnitt genereras GUVs för att efterlikna membrandeformationerna som eventuellt induceras av septiner i ett cellulärt sammanhang. Faktum är att i celler finns septiner ofta på platser med mikrometerkrökningar. GUVs har storlekar som sträcker sig från några till tiotals mikrometer och kan deformeras. De är således lämpliga för att analysera eventuella septininducerade deformationer på mikrometerskala. Fluorescerande lipider, såväl som fluorescerande märkta septiner (med grönt fluorescerande protein [GFP]), används för att följa beteendet hos både lipider och proteiner via fluorescensmikroskopi.

  1. Beredning av buffertar och lösningar
    1. Förbered GUV-tillväxtbufferten (50 mM NaCl, 50 mM sackaros och 10 mM Tris [pH = 7,8]) och observationsbufferten (75 mM NaCl och 10 mM Tris [pH = 7,8]).
    2. Mät (med hjälp av en kommersiell osmometer) och justera osmolariteten hos observations- och tillväxtbuffertarna (170 mOsmol· L-1, i teorin) genom att tillsätta små mängder NaCl tills deras respektive osmolariteter är lika. Filtrera buffertarna med ett 0,2 μm filter. Alikvotera tillväxtbufferten och förvara den vid -20 °C för vidare användning. Förvara observationsbufferten vid 4 °C.
      OBS: Skillnaden i osmolaritet mellan båda buffertarna bör inte överstiga 5%.
    3. Bered en 5 mg·ml-1 β-kaseinlösning i observationsbufferten. Se till att upplösningen är fullständig (efter flera timmar vid 4 °C under magnetisk omrörning). Filtrera lösningen med ett 0,2 μm filter, alikvot och förvara vid -20 °C.
  2. Bered lipidblandningarna vid en total lipidkoncentration på 3 mg·ml-1 i kloroform. Använd en komposition (mol%) av 56,8% Ägg L-α-fosfatidylkolin (EggPC), 15% kolesterol, 10% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin (DOPE), 10% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serin (DOPS), 8% hjärnan L-α-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PI(4,5)P 2) och 0,2% Bodipy-TR-Ceramid för att förbättra protein-lipidinteraktionerna och gynna införlivandet av PI(4,5)P225.
    OBS: Hantera kloroform under en dragskåp med nitrilhandskar och skyddsglasögon. Pipettera kloroformlösningar med glassprutor och undvik plast eftersom kloroform löser upp plast. Skölj sprutorna före och efter användning genom att pipettera kloroform 5x-10x. Använd separata sprutor för att pipettera specifika fluorescerande lipider för att förhindra korskontaminering. Lipider kan förvaras i kloroform vid -20 °C i en bärnstensfärgad injektionsflaska av glas täckt med teflon. Injektionsflaskorna måste fyllas med argon innan de försluts och förseglas med parafilm för att förhindra lipidoxidation.
  3. Elektrobildning av GUV: er med hjälp av en platinatrådsinställning
    OBS: Figur 1 visar schemat för experimentstegen och en bild av kammaren.
    1. Rengör kammaren och platinatrådarna noggrant enligt följande för att ta bort eventuella lipidrester.
    2. Kasta ledningarna och kammaren i aceton och sonika i 10 min. Torka av dem försiktigt med en pappersvävnad med aceton.
    3. Montera kammaren genom att sätta in ledningarna, kasta igen i aceton och sonikat i 10 minuter. Torka en gång till med aceton och se till att ledningarna är helt rengjorda. Kasta kammaren i etanol, sonika i 10 min och torka av med etanol.
    4. Slutligen kasta kammaren i avjoniserat vatten, sonika i 10 minuter och torka med en ström av kväve eller luft.
      OBS: Teflonkammaren (figur 1B) specialtillverkades i den interna verkstaden. Den rymmer tre fack som kan förseglas på båda sidor med glasöverdrag. Platinatrådar kan sättas in i kammaren genom hål med en diameter på 1,3 mm.
    5. Efter rengöring av kammaren, avsätt 3-4 droppar per fack (varje droppe är ca 0,1 μL)) av 3 mg · ml-1 lipidblandningen på varje platinatråd. Vrid ledningarna med 180 ° och sätt in 3-4 lipiddroppar per fack på motsatt sida av varje platinatråd. Se till att dropparna inte kommer i kontakt med varandra. Cirka 5 μL av lipidblandningen krävs per hel kammare.
    6. Placera tillväxtkammaren i en vakuumkammare i 30 minuter för att avlägsna eventuella spår av kloroform.
      OBS: Djupvakuum (0,1 mbar) är bäst. När de torkas är lipider sårbara för oxidation och bör därför inte lämnas i luften i mer än några minuter.
    7. Sätt in högvakuumfett längst ner i kammaren (den sida som är närmast ledningarna) längs periferin av de tre facken med en spruta och tryck en ren (22 mm x 40 mm) täckglas mot fettet för att säkerställa perfekt tätning. Försegla kammarens båda ytterkanter (dvs. vid ledningarnas ingångs-/utgångsplatser) med tätningspasta (vaxplattor). På samma sätt applicera vakuumfett på andra sidan kammaren.
    8. Fyll facken med tillväxtbuffert (~ 1 ml per kammare) med en pipett. Rör inte om lösningen för snabbt eller starkt för att förhindra att lipidfilmen lossnar från ledningarna. Försegla kammarens ovansida hermetiskt med en täckskiva på 22 mm x 40 mm genom att trycka den mot fettet. För att undvika bildandet av luftbubblor, tryck försiktigt på glasskyddet från mitten till kanterna.
      1. Placera kammaren i ett kylskåp på 4 °C och anslut ledningarna till en vågfunktionsgenerator (sinusfunktion vid 500 Hz). Ställ in en effektiv spänning på 350 mV för en kortare tillväxtperiod (dvs. 6 h) eller 250 mV för en längre tillväxtperiod (dvs. 12-16 h), som redan presenterats och optimerats i en studie av Beber et al.25.
    9. Ta bort täckglasen, torka av tätningsmedlet och fettet och ta bort ledningarna. Tvätta och skrubba kammaren med en pappersvävnad med vatten och etanol (≥70%) växelvis.
      OBS: Den optimala spännings- och tidsskalan för GUV-tillväxt beror på många parametrar, från buffertsaltkoncentrationen till kammargeometrin (dvs. avståndet mellan ledningarna och kammarstorleken). Använd samma kammare varje gång experimentet upprepas för att säkerställa reproducerbarhet. Ledningarna är i närheten av kammarens botten så att lipiderna kan avbildas med hjälp av fluorescerande mikroskopi. Avbilda lipiderna vid varje steg (se figur 1C,D) för att säkerställa att elektrobildningsprocessen lyckas.
  4. Septinkubation med vesiklarna
    1. Samla GUVs från ledningarna med hjälp av förskurna pipettspetsar (~ 1 mm öppning) som förs i närheten av ledningarna. Pipettera sedan lösningen längs tråden. Denna procedur förhindrar generering av starka lamellära flöden som kan störa GUV: erna. Efter detta steg krävs inte längre skärpipettspetsar. Faktum är att lamellära flöden inte skadar GUVs i lösningen.
      OBS: På grund av närvaron av PI(4,5)P2 i lipidblandningen måste GUVs som har samlats in förvaras i högst 2-3 timmar före experimentet. Faktum är att PI(4,5)P2 solubiliseras snabbt och septiner binder inte längre till membranen några timmar efter bildandet. Men när septiner är bundna till membranet förblir de bundna i några dagar.
    2. Späd ut septinernas stamlösning i Tris 10 mM (pH 8) uteslutande för att uppnå en osmolaritet som är lika med tillväxtbuffertens. Späd vid behov septinlösningen ytterligare i observationsbufferten. Tillsätt den avsedda volymen uppsamlade GUV (50-100 μl för en total volym på 200 μl). Utför inkubationen direkt i observationskammaren efter passivering med β-kasein (se nedan). 20-30 min väntetid krävs för att nå jämvikt.
      ANMÄRKNING: Uttrycket och reningen av septinoktameriska komplex (jästsvampar från människa eller spirande jäst) beskrivs utförligt i andra artiklar17. Kortfattat uttrycktes septiner i Escherichia coli, renades i laboratoriet med hjälp av affinitets, storleksuteslutning och jonbyteskromatografisteg och lagrades vid -80 ° C i en vattenlösning av 50 mM Tris-HCl (pH 8), 300 mM KCl och 5 mM MgCl2 vid ~ 1 mg · ml-1 (3 μM) koncentration. En hög saltkoncentration används för att undvika septinaggregering. Septinkomplex bör inte koncentreras genom en filtercentrifugeringsanordning, vilket inducerar aggregering och därmed minskar proteinutbytet.
  5. Bildbehandling med konfokalt och/eller snurrande skivmikroskop
    1. För att förhindra att GUVs fastnar på ytan och/eller exploderar, passivera observationskammaren genom att inkubera den med en 5 mg·ml-1 β-kaseinlösning i 30 minuter.
    2. Ta bort β-kaseinlösningen och överför septin-GUV-lösningen (steg 1.4.2.) till observationskammaren med hjälp av en pipett. Låt GUVs sedimentera till botten av kammaren i 10-15 min.
      OBS: Sammansättningsskillnaden mellan GUV: s inre och den externa bufferten skapar både en densitets- och brytningsindexmatchning. På grund av brytningsindexmatchningen är GUV: erna synliga med optisk mikroskopi för överföringsljus.
    3. Använd konfokalmikroskopi och visualisera lipidernas fluorescerande signal för att kontrollera GUVs kvalitet och membranlamellaritetstillstånd. Bedöm densiteten hos septiner bundna till GUVs genom att registrera septinernas fluorescerande signal efter att ha utfört en korrekt kalibrering25. Utför Z-stackförvärv med 0,4 μm rumsligt intervall för att analysera och visualisera 3D-deformationerna av vesiklarna inducerade av interaktionen mellan septinerna och membranet.
      OBS: Oljesänkningsmål med 60- eller 100-faldiga förstoringar användes. Standard konfokala eller snurrande skivmikroskop (materialtabell) med pixelstorlekar på 250 nm respektive 110 nm användes. Man måste anpassa bildförhållandena till en viss utrustning. Inga specifika anti-fotoblekmedel tillsattes till lösningen.

Figure 1
Figur 1: Elektrobildning av GUVs . (A) Schematisk representation av elektrobildningsprocessen med platinatrådar. (B) Bild av teflon hemmagjord enhet monterad med platinatrådar som används för att generera GUV genom elektrobildning. Ledningarna är 0,5 mm i diameter och 3 mm från varandra. C) GUV (sfäriska föremål) observerade genom transmissionsoptisk mikroskopi under tillväxtprocessen. Den ogenomskinliga zonen längst ner på bilden är platinatråden. (D) GUV (runda fluorescerande föremål) observerade med fluorescerande mikroskopi under tillväxten på platinatråden. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Analys av ultrastrukturell organisation av septinfilament genom kryoelektronmikroskopi

OBS: Vesiklar är inte lämpliga för avbildning med standardelektronmikroskopimetoder. Faktum är att proverna torkas med hjälp av vanliga negativa fläckmetoder. Vid uttorkning kommer vesiklar sannolikt att genomgå ospecifika deformationer, vilket ofta resulterar i lipidutsprång. Kryoelektronmikroskopi är således en mycket bättre strategi för att observera specifika deformationer av vesiklar. Med hjälp av kryo-EM är proverna inbäddade i ett tunt (~ 100-200 nm) lager av förglasad is, vilket bevarar proverna nära det ursprungliga tillståndet. GUV är dock för stora (flera tiotals mikrometer) för att bäddas in i tunn is och därmed avbildas genom transmissionselektronmikroskopi. Därför genereras stora unilamellära vesiklar (LUV), vars diametrar sträcker sig från ~ 50-500 nm, för att bestämma hur septiner kan deformera vesiklar och hur de ordnar på vesiklar.

  1. Generering av stora unilamellära vesiklar (LUV)
    1. Förbered 50 μg lipidblandning solubiliserad i kloroform med en molär sammansättning av 57% EggPC, 15% kolesterol, 10% DOPE, 10% DOPS och 8% hjärnan PI (4,5) P2), som är optimerad för att förbättra septininteraktionen med membranet i en glasflaska.
    2. Torka lösningen under argonflöde för att generera en torkad lipidfilm i injektionsflaskan. Sätt injektionsflaskan under vakuum i 30 minuter för att helt torka lipiden.
    3. Resolubilize lipidfilmen i 50 μL vattenlösning (50 mM Tris-HCl [pH 8]; 50 mM KCl; 2 mM MgCl2) för att erhålla en slutlig koncentration av 1 mg · ml-1, virvel i 10 s och överför lösningen till ett rör.
      OBS: LUVs måste användas omedelbart för inkubation med septiner. Annars kommer protein-lipidinteraktionen att vara svag på grund av PI(4,5)P2-solubilisering. Denna råa återlöslighetsprocess genererar en heterogen population av vesiklar med diametrar som sträcker sig från 50 nm till 500 nm. Därför analyseras samtidigt ett stort antal diametrar och därmed krökningar.
  2. Inkubera septinerna med de solubiliserade lipiderna vid slutliga lipid- och septinkoncentrationer på 0,1 mg · ml-1 (ca 300 nM) respektive 20 nM i en högsaltbuffert (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2). Inkubera provet i 1 timme vid rumstemperatur.
  3. Doppfrysning för att förglasa provet
    1. Glödurladdningshåliga kolgaller (300 mesh) på kolsidan i 30 s vid 5 mA med plasmageneratorutrustning och sätt in gallret i en doppfrysningsmaskin i en fuktig miljö.
    2. Adsorbera 4 μl av provet (steg 2.2) på den glödande kolsidan av gallret. Omedelbart före provadsorption, tillsätt 5-10 nm guldpärlor i lösningen, om proverna kommer att användas för att generera lutande serier genom kryotomografi.
      OBS: Tätheten av guldpärlor måste screenas och justeras empiriskt och beror på leverantören. Den optimerade densiteten är 10-15 guldpärlor i synfältet.
    3. Torka proverna från den nakna sidan för att aspirera provdroppen på motsatt sida.
      OBS: Blottningstiden är vanligtvis 4 s, och filterpapperets och blottningskraftens position justeras empiriskt genom att testa och screena alternativa positioner för filterpapperet för att optimera iskvaliteten (tjockleken) och materialtätheten.
    4. Överför gallren till ett mikroskop eller förvara dem i en behållare med flytande kväve.
      OBS: Att använda håliga kolgaller är viktigt för att rymma polydispersiteten i vesiklarnas storlek. Blottning av provet från motsatt sida gynnar förbättrad adsorption av det biologiska materialet på gallret.
  4. Kryoelektronmikroskopi avbildning
    1. Sätt in gallren i ett elektronmikroskop (EM) utrustat för kryo-EM-observation. Screena hela rutnätet genom att generera en karta över hela provet med låg förstoring (vanligtvis vid 120x förstoring) för att välja områden som visar bättre is (dvs. tunn och väl förglasad).
    2. För kryo-EM 2D-datainsamling, samla in bilder med en pixelstorlek på cirka 2 Å per pixel för att kontrollera provets kvalitet. Se till att både septinfilamenten och lipid-dubbelskiktet är synliga.
    3. För insamling av kryoelektrontomografidata, välj intresseområden som visar deformerade vesiklar. Se till att tillräckligt med guldpärlor (minst 10) finns i synfältet.
    4. Enligt programvaran som används för insamling av lutande seriedata, välj fokus- och spårningspositioner för att vara tillräckligt långt från intresseområdet. Samla lutande serier genom att variera lutningsvinkeln från -60° till +60° och samla in en bild var 2°-3° grader.
      OBS: Den totala dosen bör vara ungefär eller mindre än 100 elektroner / Å2. Pixelstorleken varierar från 1,3 Å till 2,1 Å, beroende på vilket mikroskop som används för datainsamling. Helst föredras ett vinkelsymmetriskt schema för datainsamling enligt följande: 0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°. Goniometrar av sidoingångsmikroskop ger emellertid inte tillräcklig mekanisk stabilitet för att uppnå dessa symmetriska scheman. Alternativt kan förvärvet startas vid 0 ° till 34 °, följt av en andra vinkelsekvens från -2 ° till -60 ° och avslutas med en slutlig sekvens från 36 ° till 60 °. Syftet är att samla in de första bilderna (med de lägsta strålningsskadorna) i de lägsta vinklarna. För att visualisera ultrastrukturen hos vesiklar och bundna septinfilament kan dessutom ett standard kryo-EM-mikroskop användas (200 kV, Lanthanum hexaboride (LaB6) filament och provsidoinmatning). Men om man siktar på att fortsätta med bildbehandling (till exempel sub-tomogrammedelvärde) är det bäst att använda förra generationens fältemissionspistolmikroskop (FEG) utrustade med direkta detektorer. I detta protokoll begränsar vi vår beskrivning till förvärv av 3D-rekonstruktioner och utelämnar subtomogrammedelvärde.
  5. 3D-rekonstruktion från kryotomografi och segmentering
    1. Använd IMOD-programvarusviten (Table of Materials) för lutande seriebildjustering och 3D-rekonstruktion26,27. Inom IMOD, utför lutningsseriejustering baserat på fiducials (guldpärlor) positionering. Dessutom, om det behövs, utföra kontrastöverföringsfunktion (CTF) bestämning och korrigering inom IMOD26. Slutligen, uppnå 3D-rekonstruktion med IMOD, följ varje steg noggrant.
    2. Segmentera lipid-dubbelskikten och septinfilamenten manuellt med 3Dmod27 från IMOD-programvarusviten för visning.

3. Analys av krökningskänslighet hos septin med SEM

OBS: För att förstå hur septiner kan vara känsliga för mikrometerkrökningar har en in vitro-metod använts för att inkubera septinfilamentkomplex med solidstödda lipiddubbelskikt avsatta på vågiga böljande mönster i mikrometerskala.

  1. Designa vågig NOA (Norland optiskt lim) replika från vågiga polydimetylsiloxan (PDMS) mönster
    1. Använd PDMS böljande mönster med 250 nm amplitud och 2 μm lateral periodicitet eller andra dimensioner för att analysera krökningarna som är lämpliga för proteinet av intresse.
      OBS: PDMS böljande mönster är utformade och genererade enligt beskrivningen i Nania et al.28,29.
    2. I en renrumsmiljö, deponera 5 μL flytande NOA på en cirkulär glasbeläggning med en diameter på 1 cm och placera PDMS-mallen på droppen. Behandla med UV-ljus (320 nm) i 5 minuter för att fotopolymerisera vätskan NOA till en tunn polymerfilm. Skala sedan försiktigt av PDMS-mallen från täckglaset med den nypolymeriserade NOA.
      OBS: NOA är ett vanligt optiskt transparent lim som är lämpligt för optisk mikroskopiavbildning. Dessutom är NOA resistent mot de kemiska fixerings- och färgningsprocesser som utförs före SEM-avbildning. Både NOA 71- och NOA 81-hartser kan användas med liknande resultat. Det ursprungliga PDMS-mönstret kan användas flera gånger för att producera NOA-repliker. De erhållna NOA-replikerna kan förvaras i en låda vid rumstemperatur i flera månader.
  2. Generering av ett stödd lipid-dubbelskikt och proteininkubation
    1. Behandla NOA-filmerna med en luftplasmarengörare i 5 minuter för att göra ytan hydrofil.
    2. Förbered en lösning av små unilamellära vesiklar (SUV) med en molär sammansättning av 57% EggPC, 15% kolesterol, 10% DOPE, 10% DOPS och 8% hjärnans PI(4,5)P2 vid en total lipidkoncentration av 1 mg·ml-1. Bered stadsjeeparna genom att återsuspendera en torkad lipidfilm i observationsbufferten, enligt beskrivningen i steg 2.1.3. Försiktigt sonikera lösningen med en bad sonicator i 5-10 min tills lösningen är transparent.
      OBS: Lösningen av stadsjeepar kan förvaras fryst i flera veckor vid -20 °C.
    3. Sätt i täckglasen som stöder NOA-mönstren i brunnarna i cellodlingslådorna. Deponera 100 μl 1 mg·ml-1 SUV-lösning på de nyligen glödutladdade NOA-mönstren (steg 3.2.1) och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Detta steg inducerar fusion av SUV: er med ytan på NOA-mönstret för att generera ett lipid-dubbelskikt som stöds.
    4. Skölj objektglasen noggrant 6x med septinbufferten (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) för att ta bort osmält SUV. Låt aldrig provet torka helt efter varje sköljning.
    5. Späd den oktameriska septinstamlösningen i septinhög saltbuffert (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2) med septinbuffert (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) till slutliga koncentrationer från 10 nM till 100 nM och volymer på 1 ml. Inkubera proteinlösningen på glasrutschbanorna i ~ 1 h vid rumstemperatur.
      OBS: Volymen är tillräckligt stor så att avdunstning inte är ett problem.
  3. Provberedning för SEM-analys
    OBS: Olika protokoll har utvecklats inom elektronmikroskopi för att analysera proteinstrukturer och deras sammansättning. Det nuvarande protokollet bevarar organisationen av septinfilament med hjälp av ett fixeringsprotokoll härlett från Svitkina et al.30 Det är lätt att genomföra. Dessutom optimerar detta protokoll högupplösta SEM-observationer.
    1. Beredning av reagenser och stamlösningar
      OBS: Detta protokoll kräver flera reagenser och lösningar som kan beredas i förväg eller strax före inkubation. Följ instruktionerna för att undvika artefakter eller brist på kemisk reaktivitet.
      1. Natriumkakodylat 0,2 M stamlösning: För att bereda denna dubbelhållfasta lösning, lös upp 2,14 g natriumkakodylatpulver i ~ 40 ml destillerat vatten under magnetisk omrörning. Efter fullständig upplösning, justera pH-värdet till 7,4 genom att försiktigt tillsätta 0,1 M HCl (~ 1 ml för 50 ml lösning) och fyll den slutliga volymen med destillerat vatten. Denna lösning kan förvaras i 24-48 timmar vid 4°C.
      2. 2% glutaraldehyd (GA) i 0,1 M natriumkakodylat (fixeringslösning): Förbered denna lösning strax före användning genom att späda mycket ren EM-kvalitet GA med 0,2 M natriumkakodylatlösning (se ovan). Använd en kommersiell GA-lagerlösning på 25–50 % på grund av dess optimerade lagringskapacitet vid 4 °C. För beredning av 10 ml fixeringslösning, späd 0,8 ml 25% kommersiell GA-lösning med 4,2 ml destillerat vatten och 5 ml 0,2 M natriumkakodylat.
      3. 1% osmiumtetroxid (OsO4) i 0,1 M natriumkakodylat: Bered denna andra fixativa lösning strax före användning genom att späda den kommersiella 4% OsO 4-stamlösningen med 0,2 M natriumkakodylat (se ovan). För 4 ml OsO 4 fixativ lösning, späd 1 ml 4% kommersiell OsO4-lösning med 1 ml destillerat vatten och 2 ml 0,2 M natriumkakodylat.
        OBS: Använd kommersiell 4% OsO4 stamlösning i klyvbara glödlampor på grund av deras lagrings- och hanteringsegenskaper. Observera att OsO4 är mycket reaktivt. Se till att färgen är något gul och inte mörk.
      4. 1% garvsyra (TA) i vatten: Förbered denna lösning precis före användning. Bered TA-lösningen för att erhålla en slutlig koncentration av 1% TA i destillerat vatten vid rumstemperatur. Lös upp 10 mg i 1 ml destillerat vatten och virvel i några minuter. TA-lösningen kan inte förvaras och måste filtreras med ett 0,2 μm filter före användning.
      5. 1% uranylacetat (UA) lösning i vatten Förbered UA-lösning för att erhålla en slutlig koncentration av 1% UA i destillerat vatten. Lös upp 10 mg i 1 ml destillerat vatten och virvel i minst 30 min till 1 timme genom virvel eller skakning vid rumstemperatur. Denna lösning kan förvaras i 1 månad vid 4 °C men kan lätt fällas ut och måste därför filtreras med ett 0,2 μm filter före användning.
      6. Graderad serie etanollösningar Bered 50%, 70%, 95% och 100% etanollösningar i vatten. Förbered det sista badet från nyöppnade flaskor med 100% etanol eller från 100% etanol som har dehydrerats i minst 24 timmar med molekylsiktar (nominell pordiameter = 4 Å) för att ta bort alla spår av vatten som kan störa torkning och beläggning från proverna. Var försiktig så att du inte skakar denna lösning eftersom det kan orsaka återsuspension av silikatpartiklar.
        OBS: Var försiktig när du hanterar de kemiska reagenser som används i detta protokoll. Glutaraldehyd, osmiumtetroxid, natriumkakodylat och uranylacetat är alla mycket giftiga, uranylacetat är också radioaktiva. All manipulation av reagenserna och deras avfall måste göras med hjälp av individuella (handskar, labbrockar, skyddsglasögon) och kollektivt skydd (dragskåp och plexiglassköldar), enligt de laboratoriespecifika procedurerna.
    2. Exempel på fixering
      1. Tvätta proverna (dvs. NOA-objektglas med smält stödda lipid-dubbelskikt och inkuberat protein) med PBS. Byt ut PBS mot GA-fixeringslösningen förvärmd vid 37 °C och låt reaktionen fortsätta i 15 minuter. Proverna kan sedan förvaras vid 4 °C.
      2. Ta bort fixeringslösningen och tvätta de fasta proverna 3x med 0,1 M natriumkakodylat (5 min per tvätt) med försiktig skakning.
      3. Inkubera proverna i OsO 4-fixeringslösningen i 10 minuter med maximalt skydd mot ljus för att möjliggöra fixering av membranösa strukturer och öka provernas elektriska ledningsförmåga. Ta bort fixeringslösningen och tvätta proverna 3x i destillerat vatten (5 min per tvätt) med försiktig skakning.
      4. Inkubera de tvättade proverna i den filtrerade TA-fixeringslösningen i högst 10 minuter. Ta bort TA-lösningen och tvätta proverna 3x i destillerat vatten (5 min per tvätt) med försiktig skakning.
      5. Inkubera de tvättade proverna i en nyfiltrerad UA-fixativ lösning i 10 minuter med maximalt skydd mot ljus. Ta bort den obemannade luftfartygslösningen och tvätta proverna 3x i destillerat vatten (5 min per tvätt) med försiktig skakning.
    3. Dehydrering av prover och torkning av kritiska punkter
      OBS: Lufttorkning är inte tillåten för att undvika att skada prover genom oönskade ytspänningar vid byte från vätska till gasformigt tillstånd. Två metoder har fastställts i EM: den fysikaliska metoden för att nå det superkritiska tillståndet för CO2 och kringgå dess kritiska punkt (31 °C, 74 bar), eller den kemiska metoden för förångning av hexametyldisilazan (HMDS), ett torkmedel med reducerad ytspänning. CO2 och HMDS är dåligt blandbara med vatten. Följaktligen måste alla spår av vatten ersättas med ett övergångslösningsmedel (etanol) för att undvika skador senare under torkningsprocesserna.
      1. Inkubera proverna i 2-3 minuter i varje etanollösning, från 50% till 100% (vattenfritt) etanolbad.
        OBS: Eftersom avdunstningen av etanol mellan bad är snabb måste provhanteringen också vara snabb för att undvika lufttorkning.
      2. Överför glasskivorna inuti den kritiska punkttorken förfylld med etanol och följ tillverkarens instruktioner.
        OBS: I detta protokoll användes en automatisk apparat, men vilket system som helst kan användas. Protokollen kan skilja sig åt för varje apparat men måste optimeras för att helt avlägsna etanol (25 bad i detta protokoll) och minska hastigheterna för de olika lösningsmedelsutbytena (CO2-inlopp och etanol /CO2-utlopp ) och den slutliga tryckavlastningen (nästan 1 h i detta protokoll).
      3. I slutet av den kritiska punkttorkningen, förvara proverna omedelbart i en exsickator tills de monteras och beläggs. Eftersom torkade prover är mycket hygroskopiska, täck dem (se nedan) så snart som möjligt.
        OBS: Alternativt kan HMDS erbjuda en billigare och snabbare metod. Även om HDMS aldrig har testats på våra prover, gav detta tillvägagångssätt goda resultat för observation av proteiner vid insidan av cellmembran31,32.
    4. Provmontering och beläggning.
      OBS: Eftersom biologiska prover uppvisar dåliga elektriska ledningsegenskaper måste de beläggas med en ledande metallfilm före SEM-observation. Plasma-magnetronsputtring används således.
      1. Fäst täckglaset på stubbar som kommer att användas för framtida SEM-observationer. Använd silverfärg på grund av dess förbättrade elektriska ledningsförmåga jämfört med kolskivor. Lägg till en remsa silverfärg på täckbladets övre yta och se till att anslutningen till stubben är tillfredsställande. Undvik färgagglomerat.
        OBS: Silverfärgremsan måste vara tunn för att undvika kontakt mellan provet och SEM: s objektivlins när du arbetar med höga upplösningar (dvs. lågt arbetsavstånd).
      2. Vänta tills lösningsmedlet avdunstar helt.
        OBS: Varaktigheten av detta steg kan variera beroende på mängden och tjockleken på silverfärgavsättningen. Detta steg kan förkortas med hjälp av en klockburk eller beläggningen och ett primärt vakuum i 10-30 minuter.
      3. Använd en apparat utrustad med ett plasmamagnetronsputtringshuvud och ett roterande planetstadium och följ standardprotokoll från tillverkaren. Här evakuerades apparaten till 2,5 x 10-5 mbar, rensades 1x med högkvalitativt argon och justerades sedan till 8,0 x 10-3 mbar.
      4. Utför förförstoftning (120 mA i 60 s) för att avlägsna oxidskiktet vid ytan. Sätt sedan in 1,5 nm volfram (90 mA, arbetsavstånd = 50 mm) med hjälp av en filmtjockleksmonitor.
        OBS: Beläggaren måste rengöras perfekt för att säkerställa reproducerbarheten av filmindunstningen. Beläggningen måste stoppas när den riktade tjockleken har uppnåtts. Den slutliga filmtjockleken beräknas och korrigeras efteråt. Filmer på cirka 1,5 nm har i genomsnitt en efterkorrigering på 0,7 nm med hjälp av vår apparat. Eftersom dessa korrigeringsvärden ligger nära målet utförs en serie beläggningar för att bedöma och sedan subtrahera denna korrigering från målvärdet.
      5. Förvara proverna under vakuum för att skydda dem från den omgivande luften tills och genom alla SEM-analyser.
        OBS: Arten av metallen som används för förstoftningsfrågor. Pt, trots att det är ett vanligt material, resulterar i en beläggning av dålig kvalitet med en Pt-filmtjocklek anpassad till septinfilament (1,5 nm). Vid höga upplösningar saknar en 1,5 nm Pt-film sammanhållning; storleken på Pt-klustren och septinfilamenten blir därmed likartade, vilket leder till feltolkningar under filamentsegmenteringsprocessen33 (se figur 2A, infälld). Volfram är ett bra alternativ till Pt eftersom det visar en mindre kornstorlek, knappt synlig vid högupplöst SEM (se figur 2B, infälld). Icke desto mindre, ren volfram oxideras lätt, vilket leder till stark laddningseffekt artefakter under SEM observation om proceduren beskrivs i steg 3.3.4. följs inte strikt.
  4. Hämta bilderna med hjälp av ett FESEM-mikroskop (Field Emission SEM).
    SEM-teknik har nyligen uppgraderats för att förbättra upplösningen, och tekniken beror på tillverkaren (t.ex. elektronoptik, strålretardation, magnetlins). Denna förstärkning i upplösning (tillgänglig med flera tillverkare), särskilt vid låg accelererande spänning (nära nanometern vid 1 kV), är nödvändig för att lösa nanometriska strukturer som liknar septinnätverk.
    1. Uppnå högupplöst avbildning genom detektering av primära sekundära elektroner (SE1) med "in-lens" -detektorn med hjälp av följande inställningar.
    2. Ställ in accelerationsspänningen på 3 kV. Fixera strålströmmen med 20 μm bländare (för Zeiss Gemini I-kolonner, eller motsvarande 34 pA) eller med 15 μm-bländaren (för Zeiss Gemini I-kolumner, eller motsvarande 18,5 pA), om undertryckande av laddningseffekter behövs.
    3. För observationer, använd upplösningar som sträcker sig från 21,25 nm/pixel till 1,224 nm/pixel, och för dataanalys, använd en upplösning på ~5,58 nm/pixel (20 000x förstoring enligt Polaroid 545-referensen).
    4. Ställ in arbetsavståndet mellan 1 mm och 2 mm för högupplöst observation och runt 3 mm om ett ökat skärpedjup krävs. Justera skanningshastigheten och linjeintegrationen kontinuerligt för att säkerställa ett konstant signal-brusförhållande med en förvärvstid på cirka 30-45 s per bild.

Figure 2
Figur 2: Effekten av det avsatta materialet på septinfilament på vågiga PDMS-mönster. SEM av septinfilament belagda med förstoftning med antingen (A) 1,5 nm platina, som uppvisar det "torra spruckna jord" -mönstret som är typiskt för brist på sammanhållning mellan klustren av platinakärnor, eller (B) 1,5 nm volfram täckt med ett jämnt och sammanhängande skikt. Skalstreck = 200 nm. Vita fyrkantiga rutor representerar de förstorade vyerna längst ned till höger. De sfäriska kulorna är små lipidblåsor som interagerar med septinerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GUVs deformationer
Typiska konfokala fluorescensbilder av GUVs omformade efter att ha inkuberats med septiner visas i figur 3, under förhållanden där septiner polymeriseras. Nakna GUVs (figur 3A) var perfekt sfäriska. Vid inkubation med mer än 50 nM spirande jästseptinfilament uppträdde vesiklarna deformerade. Upp till en koncentration av 100 nM spirande jästseptinoktamer verkade vesiklarna fasetterade och deformationerna förblev statiska och fluktuerade således inte (figur 3B). Över 200 nM spirande jästseptiner, med membranet mättat med septiner, observerades periodiska deformationer (Figur 3C). Med hjälp av spirande jästseptiner visualiserades spikar med en periodicitet som varierade från 2 μm till 6 μm och med en amplitud av ca 1 μm. Därför omformar septiner starkt membran på ett specifikt sätt. Dessa amplituder och tillhörande krökningar av de observerade deformationerna återspeglar påfallande affiniteten hos septiner för mikrometerkrökningar observerade i celler. GUVs, som är deformerbara, är således lämpliga för att analysera hur proteiner omformar membran.

Figure 3
Figur 3: Septininducerad deformation av GUVs. (A) Ekvatorialplan för kontroll GUVs märkta med 0,5% rhodamin PE och avbildade med konfokalmikroskopi. Skalstreck = 3 μm. (B) GFP-septiner (100 nM) bundna till en deformerad GUV och avbildade med fluorescenskonfokalmikroskopi. Skalstreck = 1 μm. (C) GFP-septiner (600 nM) bundna till en deformerad GUV och avbildade med fluorescensspinnskivmikroskopi. Skalstreck = 10 μm. GUV: erna är gjorda av ett molärt förhållande på 56,8% EggPC, 15% kolesterol, 10% DOPE, 10% DOPS, 8% hjärnan PI (4,5) P 2 och0,2% Bodipy-TR-Ceramid. Observationsbufferten inkluderar 75 mM NaCl och 10 mM Tris (pH = 7,8). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Självmontering av septinfilament bundna till LUVs avbildade av cryo-EM
Jämfört med fluorescensmikroskopi ger kryo-EM bättre rumslig upplösning. Enskilda septinfilament och lipid-dubbelskikt kan således urskiljas entydigt i bilder. Figur 4A visar en bild av LUVs dekorerade med spirande jästseptinfilament (några av dem är markerade med blått) vid 50 nM. Parallella uppsättningar av filament, cirka 10 nm från varandra, observerades på LUV: erna. Denna typiska bild är en 2D-projektion. För att dechiffrera eventuell 3D-deformation och för att veta om septinfilament direkt interagerar med membranet utfördes kryoelektrontomografi (figur 4B och figur 4C). Figur 4B visar en skiva i en 3D-rekonstruktion, medan figur 4C visar en segmentering av samma område som markerar membranet i gult och septinfilamenten i blått. Som framgår av sidovyn förblev septinfilament i huvudsak raka bundna till liposomen och vesikeln var avsevärt tillplattad jämfört med de nakna sfäriska vesiklarna.

Figure 4
Figur 4: Självmontering av septinfilament bundna till LUV. (A) Cryo-EM-bild av septinfilament bundna till en vesikel. Några av filamenten är markerade med blått för synlighet. De mörka prickarna är guldfiducialer som vanligtvis används för att anpassa data för tomografi. Skalfält = 100 nm. (B) och (C) 3D-rekonstruktion erhållen från en lutad serie. Lipiderna är markerade i gult, medan septinerna är segmenterade i blått. Skalstänger = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Krökningsberoende arrangemang av septinfilament visualiserade av SEM
Septiner lokaliseras i celler på platser som visar mikrometerkrökningar (t.ex. vid celldelningsfåran, basen av cilia, etc.). Dessutom visar in vitro-studier att septiner, som ses ovan, kan omforma membran så att de så småningom visar mikrometerkrökningar. För att analysera septinernas krökningskänslighet för både positiva (konvexa) och negativa (konkava) krökningar inkuberades septiner med ett stödd lipid-dubbelskikt smält med de vågiga mönster som beskrivs ovan. Resultatet visas i figur 5. Figur 5A rekapitulerar de olika steg som krävs för att erhålla proverna. Figur 5B visar ett vågigt mönster vid låg förstoring, där periodiciteten hos negativa och positiva krökningar är tydligt synlig. Två på varandra följande vågor indikeras med orange heldragna linjer. Defekter som är ungefär ortogonala mot vågorna indikeras av vita pilar. Figur 5C och figur 5D visar den ultrastrukturella organisationen av septinfilament vid högre förstoring. Septinerna monterades i uppsättningar av parallella filament, vars orientering berodde på krökningen (se filament markerade med blått). Faktum är att septinfilamenten inte orienterades slumpmässigt. Istället kan septiner böjas när de interagerar med negativa (konkava) krökningar för att följa den införda krökningen. Omvänt, på positiva krökningar, förblev septinfilamenten raka, oböjda och inriktade längs de konvexa vågorna. Därför kan septiner interagera med både positiva och negativa krökningar men anta specifika organisationer på givna krökningar. Denna metod förefaller därför särskilt relevant för att belysa krökningskänsligheten hos bindning och självmontering av trådformiga proteiner.

Figure 5
Figur 5: Krökningsberoende arrangemang av septinfilament. (A) Schematisk representation av de steg som krävs för att erhålla de "vågiga" proverna avsedda att analysera septinkrökningskänslighet genom SEM. (B) SEM-bild med låg förstoring av ett vågigt mönster med bundna septinfilament som inte löses med denna upplösning. Två på varandra följande vågor är markerade med orange. Ortogonala defekter indikeras med vita pilar. Skalstreck = 10 μm. (C) SEM-bild vid 10 000x förstoring där septinfilament är synliga. Skalstreck = 1 μm. (D) SEM-bild vid 20 000x förstoring. Några av filamenten är markerade med blått för synlighet. Skalstreck = 200 nm. De sfäriska föremålen som finns i bilderna är små vesiklar som interagerar med septinerna och substratet. Septinkoncentrationen sattes till 200 nM i B-D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som nämnts ovan har en lipidblandning använts som förbättrar PI (4,5) P2-införlivandet i lipid-dubbelskiktet och därmed underlättar septin-membraninteraktioner. Faktum är att vi har visat någon annanstans25 att spirande jästseptiner interagerar med vesiklar på ett PI (4,5) P2-specifikt sätt. Denna lipidkomposition justerades empiriskt från screening av flera kompositioner och används nu i stor utsträckning av författarna. PI(4,5)P2-lipider måste hanteras försiktigt. Stamlösningar måste alikvoteras i små volymer så att en specifik injektionsflaska inte öppnas mer än två gånger för pipettering. Förutom, lipid alikvoter bör lagras under argon för att förhindra lipidoxidation. Slutligen, när lipidblandningarna har solubiliserats i en vattenhaltig lösning, måste blandningen användas omedelbart och kan inte lagras för ytterligare experiment. I synnerhet, efter GUV-beredning eller stödd lipid-dubbelskiktsfusion, minskade interaktionen mellan septiner och lipider kraftigt efter 2 timmar.

Några av de resultat som erhållits med oktameriska spirande jästseptinkomplex (omslutande Cdc10, Cdc11, Cdc12 och Cdc3) har presenterats här; De experimentella förfarandena som följs för att analysera beteendet hos septinkomplex från andra arter bör emellertid vara identiska.

För att generera GUV: er föredrar vi elektrobildningsmetoden med platinatrådar framför elektrobildning på ITO-plattor eller PVA-svullnad. Som visats tidigare25 producerar denna metod reproducerbart unilamellära GUVs av god kvalitet utan några defekter.

De vågiga substraten kan utformas med ett brett spektrum av krökningar. Efter screening av olika konstruktioner har mönster med en periodicitet på 2 μm och en amplitud på 250 nm, som genererar krökningar från -3,5 μm-1 till 3,5 μm-1 (± 0,5 um-1), konsekvent använts. Med hjälp av mönster med kort periodicitet och högre amplitud överensstämde lipid-dubbelskikten inte snyggt med ytan. Ofta, vid högre krökning, skulle dubbelskiktet hängas upp mellan två konvexa vågor istället för att stödjas fullt ut på NOA-substratet. Med lägre amplituder och större periodicitet organiserades septiner med slumpmässiga nematiska orienteringar, vilket indikerar att mönstren var för platta. Att använda vågiga mönster istället för cylindriska rör 20 ellersfärer 20 har dessutom fördelen att både positiva och negativa krökningar kan testas samtidigt. I framtiden skulle det vara relevant att undersöka filamentens beteende på gaussiska "sadelliknande" krökningar för att efterlikna krökningen i mer realistiska cellulära sammanhang.

I lösning inducerade blandning av LUVs med septiner genereringen av septin-lipidaggregat även vid låga koncentrationer av proteiner och lipider. Proverna var alltså heterogena, och det är klokt att leta efter tunnare isdomäner där mindre och mer definierade septin-vesikelobjekt finns. Detta är särskilt viktigt när man väljer intresseområden där kryotomografi kommer att utföras. Ofta, även vid låga förstostoringar, är vesiklar som visar utsprång av starka deformationer, jämfört med sfäriska vesiklar, mer benägna att ha en hög densitet av septinfilament bundna. Detta protokoll fokuserar på att få en beskrivning av den globala ultrastrukturen av filament på biomimetiska membran. För närvarande kan högre upplösningar nås. Upplösningsbegränsningen beror på det begränsade antalet visningar som är tillgängliga genom avbildning. Detta ligger dock fortfarande utanför tillämpningsområdet för detta protokoll.

Vi har genom detta protokoll visat att en kombination av kompletterande metoder är avgörande för att förstå och dissekera hur det specifika arrangemanget av cytoskeletala septinfilament kan känna av och omforma membran på ett krökningsberoende sätt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi tackar Patricia Bassereau och Daniel Lévy för deras goda råd och diskussioner. Detta arbete fick stöd från ANR (Agence Nationale de la Recherche) för att finansiera projektet "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 och projektet "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin finansieras av Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" och Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa stöddes av Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink stöddes av Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) genom "BaSyC-Building a Synthetic Cell". Gravitation bidrag (024.003.019). Vi tackar Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) och Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Vi tackar Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, medlem av den franska nationella forskningsinfrastrukturen France-BioImaging (ANR10-INBS-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids 840035
Bath sonicator Elma Elmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramide invitrogen, Thermo Fischer scientific 11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol Sigma Aldrich
Confocal microscope nikon spinning disk or confocal
Critical point dryer Leica microsystems CPD300
Deionized water generator MilliQ F1CA38083B MilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051
Field Emission Gun SEM (FESEM) Carl Zeiss Gemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution Thermo Fischer scientific 50-262-19
High vacuum grease, Dow corning VWR
IMOD software https://bio3d.colorado.edu/imod/ software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids Eloise 01883-F
Lipids Avanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046
Metal evaporator Leica microsystems EM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 Norland Products NOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4% delta microscopies 19170
Osmometer Löser 15 M
Plasma cleaner Alcatel pascal 2005 SD
Plasma generator Electron Microscopy Science
Plunge freezing equipment leica microsystems EMGP
Transmission electron microscope Thermofischer Tecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetate Electron Microscopy Science 22451 this product is not available for purchase any longer
Wax plates, Vitrex VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -H., Kuo, Y. -C., Chiang, H. -S., Kuo, P. -L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, Pt 1 79-89 (1998).

Tags

Biologi utgåva 186
Bottom-Up <em>In Vitro-metoder</em> för att analysera ultrastrukturell organisation, membranomformning och krökningskänslighetsbeteende hos septiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chauvin, B., Nakazawa, K., Beber,… More

Chauvin, B., Nakazawa, K., Beber, A., Di Cicco, A., Hajj, B., Iv, F., Mavrakis, M., Koenderink, G. H., Cabral, J. T., Trichet, M., Mangenot, S., Bertin, A. Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins. J. Vis. Exp. (186), e63889, doi:10.3791/63889 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter