Summary
Ici, nous présentons un protocole pour créer des xénogreffes orthotopiques de carcinome hépatocellulaire avec et sans ligature de l’artère hépatique et effectuer une imagerie non invasive par tomographie par émission de positrons (TEP) de l’hypoxie tumorale en utilisant [18 F]Fluoromisonidazole ([18 F]FMISO) et [18 F]Fluorodésoxyglucose ([18F]FDG).
Abstract
Les modèles expérimentaux précliniques de carcinome hépatocellulaire (CHC) qui récapitulent la maladie humaine représentent un outil important pour étudier la tumorigenèse et évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. L’imagerie non invasive du corps entier utilisant la tomographie par émission de positrons (TEP) fournit des informations essentielles sur les caractéristiques in vivo des tissus au niveau moléculaire en temps réel. Nous présentons ici un protocole pour la création de xénogreffes orthotopiques du CHC avec et sans ligature de l’artère hépatique (HAL) pour induire l’hypoxie tumorale et l’évaluation de leur métabolisme tumoral in vivo en utilisant [18 F]Fluoromisonidazole ([18 F]FMISO) et [18 F]Fluorodésoxyglucose ([18F]FDG) TEP/résonance magnétique (RM). L’hypoxie tumorale pouvait être facilement visualisée à l’aide du marqueur d’hypoxie [18 F]FMISO, et il a été constaté que l’absorption de [18 F]FMISO était plus élevée chez les souris CHC ayant subi HAL que dans le groupe non-HAL, alors que [18F]FDG ne pouvait pas distinguer l’hypoxie tumorale entre les deux groupes. Les tumeurs HAL ont également montré un niveau plus élevé d’expression du facteur inductible par l’hypoxie (HIF)-1α en réponse à l’hypoxie. La quantification des tumeurs HAL a montré une augmentation de 2,3 fois de l’absorption de [18F]FMISO sur la base de l’approche d’absorption de la valeur standardisée (SUV).
Introduction
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le sixième cancer le plus diagnostiqué et la troisième cause de décès par cancer dans le monde, avec plus de 900 000 nouveaux cas et 800 000 décès en 20201. Le principal facteur de risque est la cirrhose, qui survient à la suite d’infections virales (virus de l’hépatite B et C), de l’abus d’alcool, du diabète et de la stéatohépatite2 non alcoolique. La prise en charge du CHC est assez complexe et plusieurs options de traitement sont disponibles, notamment la résection chirurgicale, l’ablation thermique ou chimique, la transplantation, la chimioembolisation transartérielle, la radiothérapie et la chimiothérapie, selon la stadification de la maladie 2,3. Le CHC est une tumeur réfractaire à la chimiothérapie avec récidive de la maladie chez jusqu’à 70% des patients suivant un traitement à visée curative2.
Malgré le degré élevé d’hétérogénéité tumorale, le CHC est associé à deux résultats communs : (i) le CHC est très hypoxique, et (ii) l’hypoxie tumorale est liée à une plus grande agressivité tumorale et à l’échec du traitement. La prolifération incontrôlée des cellules CHC entraîne un taux de consommation d’oxygène élevé qui précède la vascularisation, créant ainsi un microenvironnement hypoxique. De faibles niveaux d’oxygène intra-tumoral déclenchent alors une gamme de réponses biologiques qui influencent l’agressivité tumorale et la réponse au traitement. Les facteurs inductibles par l’hypoxie (HIF) sont souvent reconnus comme les régulateurs transcriptionnels essentiels dans la réponse à l’hypoxie 2,3. Par conséquent, la capacité de détecter l’hypoxie est cruciale pour visualiser les tissus néoplasiques et identifier les sites inaccessibles, qui nécessitent des procédures invasives. Il aide également à mieux comprendre les changements moléculaires qui conduisent à l’agressivité tumorale et à améliorer les résultats du traitement des patients.
L’imagerie moléculaire par tomographie par émission de positrons (TEP) est couramment utilisée dans le diagnostic et la stadification de nombreux cancers, y compris le CHC. En particulier, l’utilisation combinée de l’imagerie TEP à double traceur impliquant [18 F]Fluorodésoxyglucose ([18F]FDG) et [11C]Acétate peut augmenter significativement la sensibilité globale dans le diagnostic du CHC 4,5. L’imagerie de l’hypoxie, d’autre part, peut être réalisée en utilisant le marqueur hypoxique couramment utilisé [18 F]Fluoromisonidazole ([18F]FMISO). En pratique clinique, l’évaluation non invasive de l’hypoxie est importante pour différencier les différents types de tumeurs et de régions pour la planification de la radiothérapie6.
L’imagerie préclinique est devenue un outil indispensable pour l’évaluation non invasive et longitudinale de modèles murins pour différentes maladies. Un modèle de CHC robuste et hautement reproductible représente une plate-forme importante pour la recherche préclinique et translationnelle sur la physiopathologie du CHC humain et l’évaluation de nouvelles thérapies. Avec l’imagerie TEP, les comportements in vivo peuvent être élucidés pour fournir des informations importantes au niveau moléculaire pour un point temporel donné. Ici, nous décrivons un protocole pour la génération de xénogreffes orthotopiques du CHC ligature de l’artère hépatique (HAL) et l’analyse de leur métabolisme tumoral in vivo en utilisant [18 F]FMISO et [18F]FDG PET/MR. L’incorporation de HAL permet d’obtenir un modèle approprié de xénogreffes de souris CHC transgéniques ou induites chimiquement pour étudier l’hypoxie tumorale in vivo, car HAL peut bloquer efficacement l’apport sanguin artériel pour induire une hypoxie intra-tumorale 7,8. En outre, contrairement à la coloration immunohistochimique ex vivo à l’aide de pimonidazole, les modifications du métabolisme tumoral résultant de l’hypoxie peuvent être facilement visualisées et quantifiées avec précision de manière non invasive à l’aide de l’imagerie TEP, ce qui permet une évaluation longitudinale de la réponse au traitement ou une mesure de l’émergence d’une résistance 3,7,8 . Notre méthode présentée ici permet la création d’un modèle de CHC hypoxique robuste ainsi qu’une surveillance non invasive de l’hypoxie tumorale à l’aide de l’imagerie TEP/RM pour étudier la biologie du CHC in vivo.
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Protocol
Toutes les études sur les animaux ont été réalisées conformément au Comité sur l’utilisation des animaux vivants dans l’enseignement et la recherche (CULATR) du Centre de recherche en médecine comparée (CCMR) de l’Université de Hong Kong, un programme accrédité par l’Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Les animaux utilisés dans l’étude étaient des souris femelles BALB / cAnN-nu (Nude) âgées de 6 à 8 semaines, pesant 20 g ± 2 g. La nourriture et l’eau ont été fournies ad libitum.
1. Injection sous-cutanée de lignées cellulaires de carcinome hépatocellulaire humain
REMARQUE : La CMHC97 est une lignée cellulaire humaine de CHC utilisée pour générer le modèle de xénogreffe sous-cutanée du CHC. Les cellules MHCC97L sont obtenues auprès de l’Institut du cancer du foie, Hôpital Zhongshan de l’Université Fudan, Shanghai, République populaire de Chine9 et authentifiées par un profilage à courte répétition en tandem (STR).
- Cultiver les cellules MHCC97L et les conserver dans des milieux de culture supplémentés avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline et de streptomycine dans une fiole de culture cellulaire T-75 à 37 °C dans un incubateur humidifié alimenté avec 5 % de CO2 (voir le tableau des matériaux). Changez les milieux de culture tous les 2 jours et récoltez les cellules à 80%-90% de confluence.
REMARQUE: Le numéro de cellule de départ est 1,5 x 106 cellules, et les cellules sont utilisées dans 6-8 passages. - Conserver les milieux de culture et l’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (trypsine-EDTA) à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à utilisation. Préchauffer le milieu de culture à 37 °C et la trypsine-EDTA à température ambiante avant utilisation. Reportez-vous au tableau des matériaux pour tous les réactifs et consommables utilisés dans cette section.
- Retirez le milieu de culture. Rincer la couche cellulaire avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate stérile (DPBS, voir le tableau des matières).
- Ajouter 5 mL de trypsine-EDTA dans le ballon de culture et incuber les cellules à 37 °C. Vérifiez les cellules au microscope inversé à un grossissement de 20x (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce que la couche cellulaire soit dispersée et complètement détachée du flacon. Assurez-vous que les cellules ne sont pas laissées dans la trypsine-EDTA pendant plus de 15 minutes.
- Ajouter 5 mL de milieu de culture dans le ballon de culture. Aspirer les cellules en les pipetant doucement. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et faire tourner à 1 107 x g pendant 5 minutes (voir le tableau des matériaux).
- Retirer le surnageant et remettre délicatement en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de PBS. Pipeter soigneusement pour obtenir une suspension unicellulaire. Déterminer le nombre de cellules à l’aide du compteur de cellules automatisé (voir le tableau des matériaux) et préparer la suspension cellulaire à une concentration de 5 x 106 cellules/mL dans le PBS.
- Prélever 200 μL de suspension cellulaire avec une aiguille de 25 G dans une seringue de 1 mL. Chaque seringue contient 1 x 106 cellules MHCC97L (dans 200 μL). Gardez la seringue sur de la glace humide.
- Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale (i.p.) d’un mélange de kétamine (87,5 mg/kg) et de xylazine (12,5 mg/kg). Assurez-vous d’une anesthésie adéquate en utilisant le réflexe de pincement des orteils. Assurez-vous d’appliquer un lubrifiant pour les yeux sur la souris pour prévenir le dessèchement et la formation potentielle d’ulcères cornéens. Placez la souris en décubitus dorsal sur un tampon stérile (voir le tableau des matières).
- Stériliser la région dorsale près du flanc inférieur (côté gauche ou droit) de la souris avec de l’éthanol à 70 % (voir le tableau des matériaux). Soulevez la peau avec une pince et insérez doucement le biseau de l’aiguille sous la peau.
- Avancez l’aiguille de 4 à 5 mm le long du plan sous-cutané à partir du site de ponction pour éviter toute fuite accidentelle de la suspension cellulaire du site d’injection lors du retrait de l’aiguille. Assurez-vous que l’insertion de l’aiguille n’est pas trop profonde sous la peau, ce qui peut causer des dommages accidentels aux organes.
- Relâchez la pince et déchargez soigneusement et lentement le contenu de la seringue, en prenant soin de ne pas pénétrer dans le côté opposé. Retirez l’aiguille pour vérifier s’il y a un gonflement sur l’injection. Replacez la souris dans la cage posée sur un coussin chauffant préchauffé pour aider à récupérer de l’anesthésie et à retrouver sa mobilité. Continuez à surveiller la souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement éveillée et maintienne sa position couchée sternale.
- Surveillez la croissance tumorale et le bien-être de la souris sur une base hebdomadaire. Mesurer le volume tumoral (V) à l’aide d’un pied à coulisse (voir le tableau des matériaux). Calculez et enregistrez le volume tumoral en utilisant la formule10 suivante:
V = (W 2× L)/2
où W est la largeur et L est la longueur de la tumeur. - Entre 4 et 6 semaines après l’injection, vérifier qu’une taille significative de tumeur sous-cutanée, entre 800 et 1000 mm3, est obtenue. Assurez-vous que la charge tumorale totale ne dépasse pas 10% du poids corporel.
2. Implantation hépatique orthotopique et ligature de l’artère hépatique
- Préparer les réactifs et outils chirurgicaux suivants dans une enceinte de sécurité biologique désinfectée : 10 mL de milieux de culture dans une boîte, solution de povidone iodée à 10 %, éthanol à 70 %, instruments chirurgicaux autoclavés, c.-à-d. ciseaux tranchants, ciseaux à ressort, pinces (fines et émoussées courbées), porte-aiguilles, lame de scalpel, suture en nylon 6-0 et 5-0, coussin chauffant.
- Autoclavez tous les instruments chirurgicaux et manipulez-les uniquement sur un banc stérile. Fournir les soins pré, intra et postopératoires adéquats et nécessaires aux souris tout au long des interventions chirurgicales (voir les étapes ci-dessous).
- Pour soulager la douleur préopératoire, injectez à la souris une injection sous-cutanée de buprénorphine (0,1 mg / kg) au moins 30 minutes avant le début de l’intervention chirurgicale. Pour les soins et la prise en charge postopératoires, injectez à la souris une injection sous-cutanée de buprénorphine (0,1 mg / kg) pendant 3 jours en continu, une fois toutes les 8-12 heures. Reportez-vous au tableau des matériaux pour tous les réactifs et consommables utilisés dans cette section.
- Euthanasier la souris tumorale sous-cutanée avec une injection intraveineuse de pentobarbital (330 mg / kg). Faites une incision sur la peau du site tumoral à l’aide d’une lame de scalpel. Extrayez le bloc tumoral sous-cutané et transférez-le immédiatement dans le milieu de culture. Effectuez cette étape le plus rapidement possible.
- Couper le bloc tumoral en 1 mm3 petits cubes tumoraux à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants. Conservez tous les cubes tumoraux dans le milieu de culture. Évitez d’utiliser la région centrale du bloc tumoral sous-cutané.
- Anesthésiez la souris qui subira la chirurgie ultérieure d’implantation de tumeur orthotopique avec une injection intraveineuse d’un mélange de kétamine (87,5 mg / kg) et de xylazine (12,5 mg / kg). Assurez-vous qu’au moins 30 minutes se sont écoulées après l’administration de la buprénorphine avant d’anesthésier la souris. Assurez-vous d’appliquer un lubrifiant pour les yeux sur la souris pour éviter le dessèchement et la formation potentielle d’ulcères cornéens.
- Placez la souris en décubitus dorsal sur un tampon stérile qui se trouve au-dessus d’un coussin chauffant préchauffé. Surveillez et enregistrez l’état physiologique de la souris toutes les 15 minutes jusqu’à la fin de l’intervention chirurgicale.
- Étendez les membres de la souris. Fixez-les avec du ruban adhésif pour maximiser l’exposition de l’abdomen ventral et du thorax. Stérilisez toute la peau abdominale de la souris avec une solution de povidone iodée à 10%, suivie d’éthanol à 70%. Évaluez la profondeur anesthésique de la souris en vérifiant s’il n’y a pas de réponse au pincement des orteils - le réflexe de retrait de la pédale.
- Effectuez une laparotomie en faisant une incision médiane d’environ 10 mm pour accéder au péritoine à l’aide de ciseaux tranchants. Serrez et tirez le processus xiphoïde vers la tête avec une pince et appliquez les rétracteurs sous-costaux pour ouvrir le champ chirurgical. Assurez-vous qu’une incision appropriée est faite pour permettre une bonne vue chirurgicale du site d’opération.
- Rétractez le lobe médian et le lobe gauche vers le haut avec un écouvillon de gaze humide. Déplacez les intestins à l’extérieur de l’abdomen sur le côté gauche de la souris et couvrez-les avec un tampon de gaze humide. Effectuer la ligature de l’artère hépatique (HAL) sur l’artère hépatique commune (CHA), qui provient de la tête pancréatique à sa racine dans le pédicule hépatique, sous une lampe grossissante pour une visualisation optimisée.
- Rétractez les lobes médian et gauche vers l’arrière / vers le bas avec un écouvillon de gaze humide pour exposer le lobe gauche. Faites une incision d’environ 2 mm de longueur et de profondeur à la surface du lobe gauche avec une lame de scalpel stérile.
REMARQUE: Il est également possible d’utiliser le lobe médian du foie pour l’implantation de tumeurs afin de minimiser les déchirures accidentelles ou la lacération par traumatisme aux organes abdominaux voisins. - Insérez immédiatement un fragment de tumeur dans l’incision du foie avec une pince stérile. Enterrez la tumeur afin qu’elle se trouve en toute sécurité dans le foie. Appliquez une suture en huit avec une suture en nylon 6-0 sur le site d’incision pour assurer une implantation correcte du fragment de tumeur dans le foie et l’hémostase. Effectuez cette opération le plus rapidement possible pour éviter des saignements excessifs. Une fois terminé, fermez l’incision abdominale avec des sutures interrompues 5-0.
- Replacez la souris dans la cage posée sur un coussin chauffant préchauffé pour aider à la récupération de l’anesthésie et pour retrouver le réflexe de redressement. Continuez à surveiller et à enregistrer l’état physiologique de la souris toutes les 15 minutes jusqu’à ce que la souris soit complètement éveillée et maintienne sa position couchée sternale.
- Répétez la procédure jusqu’à ce que toutes les souris aient subi l’implantation de tumeurs orthotopiques. Fournir des soins postopératoires à toutes les souris en surveillant continuellement leur état physiologique quotidiennement pendant les 3 jours suivant l’opération chirurgicale. Donnez de la buprénorphine (0,1 mg/kg) toutes les 8-12 h.
3. Mise en place des étalonnages TEP/RM et du flux de travail
REMARQUE : L’imagerie est réalisée à l’aide d’un système préclinique TEP/RM 3T (voir le tableau des matériaux).
- Utilisez de l’isoflurane à 5 % (1 L/min médicalO2) pour anesthésier la souris dans une chambre à induction. Pour chaque scan, placez soigneusement la souris anesthésiée sur un lit d’imagerie à chauffage continu; Tout d’abord, le scan avec MR (vue scoute) comme référence anatomique pour les scanners statiques [18 F]FMISO ou [18F]FDG TEP, suivi de l’imagerie RM de référence anatomique.
- Créez un flux de travail d’imagerie TEP/RM séquentiel dans le logiciel (voir le tableau des matériaux) pour inclure une imagerie TEP statique, pondérée T1 (correction d’atténuation) et pondérée T2 (référence anatomique) et une reconstruction TEP 1 jour avant la séance d’imagerie programmée.
- Pour acquérir un TEP, sélectionnez la discrimination de niveau de 400 à 600 keV, l’isotope d’étude F-18, le mode de coïncidence 1-5 et les balayages de 20 minutes.
- Pour acquérir une RM pondérée T1 du corps entier, utilisez l’écho-3D de gradient avec TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, le champ de vision (FOV) = 90 mm x 60 mm, le nombre d’excitations (NEX) = 3, 28 tranches d’épaisseur de 0,9 mm et la taille du voxel = 0,375 mm 3 x 0,375 mm3 x 0,9 mm3.
- Pour acquérir une RM pondérée en T2 du corps entier, utilisez l’écho à rotation rapide 2D avec TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 28 tranches avec 0,9 mm d’épaisseur, taille du voxel = 0,265 mm 3 x 0,268 mm 3 x 0,9 mm3.
- Pour reconstruire le PET, sélectionnez l’algorithme Tera-Tomo (TT3D), itérations = 8, sous-ensembles = 6, mode coïncidence 1-3, et avec des corrections de désintégration, de temps mort, aléatoires, d’atténuation et de dispersion pour créer des images avec une taille voxel globale de 0,3 mm3.
- Effectuer un test d’activité TEP avant le début de l’expérience pour vérifier l’exactitude de la quantification du PET11.
- Remplir une seringue de 5 mL avec 5-8 MBq [18F]FMISO dilué dans de l’eau ou une solution saline selon les recommandations du fabricant. Utilisez un calibrateur de dose pour noter l’activité de la seringue (voir le tableau des matières). Notez l’heure de mesure.
- Dessinez un volume d’intérêt (VOI) sur l’image reconstruite pour couvrir toute la seringue. Comparez l’activité récupérée de l’image à la valeur obtenue à partir du calibrateur de dose. Procéder à des études d’imagerie lorsque l’activité récupérée est précise à moins de ±5 %.
4. [18 F]FMISO et [18F]FDG injection
- Obtenir une dose clinique de [18F]FMISO auprès du fournisseur 30 min avant le début des études d’imagerie. Portez l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié, comme une blouse de laboratoire, des gants, des lunettes, un insigne de film et des dosimètres annulaires lorsque vous manipulez des matières radioactives. Changez fréquemment de gants pour éviter la contamination croisée des substances radioactives.
- Placez les solutions matérielles dans le conteneur de stockage de plomb derrière un écran de table en L-block. Distribuer une partie aliquote de [18F]FMISO et diluer avec une solution saline stérilisée. S’assurer que la concentration totale d’activité est de 18 à 20 MBq dans 100 μL.
- Prélever le [18F]FMISO avec une seringue de 1 mL avec une aiguille (voir tableau des matières). Enregistrer la radioactivité et le temps indiqués sur le calibrateur de dose.
- Enregistrer le poids de la souris avant l’injection du radiotraceur. Utiliser de l’isoflurane à 5 % (1 L/min médicalO2) pour anesthésier la souris, puis injecter soigneusement le [18F]FMISO préparé par la veine de la queue. Consigner le temps d’injection et l’activité résiduelle de la seringue pour tenir compte de la correction de la carie. Replacez la souris dans la cage pendant 180 minutes pour permettre l’absorption de [18F]FMISO avant la TEP. Laissez la souris récupérer pendant 1 jour après [18F]FMISO PET.
NOTA : Malgré les profils pharmacocinétiques in vivo très différents pour [18 F]FMISO et [18 F]FDG, les deux radiotraceurs sont radiomarqués avec F-18, qui est un radionucléide TEP avec une demi-vie de 109,77min (< 2 h). Étant donné que le signal PET provient du F-18, la moitié de la radioactivité injectée initiale sera perdue toutes les 2 heures. Dans ce cas, le signal résiduel 24 h après l’injection ne peut plus être détecté par le scanner TEP. De plus, l’intervalle de 1 jour entre les injections de [18 F]FMISO (jour 1) et de [18 F]FDG (jour 3) permettra une désintégration complète de [18 F]FMISO lorsque [18 F]FDG PET est effectué, donc pas de chevauchement du signal [18 F]FMISO dans le [18F]FDG TEP. - Répétez les étapes 4.1.-4.4. pour l’injection de [18F]FDG au jour 3, à l’exception du fait qu’une concentration d’activité totale de 6 à 8 MBq dans 100 μL est injectée 60 minutes avant le début de la TEP.
- Calculer l’activité [18 F]FMISO ou [18F]FDG injectée à l’aide de la formule 11suivante :
Activité injectée (MBq) = Activité dans la seringue avant l’injection - Activité dans la seringue après injection
5. Acquisition de PET/MR
- Allumez le réchauffeur d’air pour réchauffer le lit d’imagerie de la souris avant la TEP prévue. Utilisez de l’isoflurane à 5 % (1 L/min médicalO2) pour anesthésier la souris dans une chambre à induction.
- Une fois correctement anesthésiée et vérifiée à l’aide de la réponse de pincement des orteils, transférer soigneusement et immédiatement la souris dans le lit chauffant et maintenir l’anesthésie à 2% -2,5% isoflurane. Placez la tête de souris couchée sur la barre de morsure et appliquez du lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour éviter le dessèchement et la formation potentielle d’ulcères cornéens. Couvrez le lit d’imagerie avec une feuille de plastique pour maintenir la température ambiante du lit.
- Surveillez et enregistrez la fréquence respiratoire et la température corporelle de la souris à l’aide de l’appareil respiratoire interne et de la sonde thermique, respectivement. Assurez-vous que la température corporelle de la souris est maintenue à 37 °C tandis que la fréquence respiratoire est maintenue dans la plage de 40-50 respirations par minute (bpm) en ajustant le niveau d’isoflurane.
- Effectuez une vue éclaireuse pour localiser la position de la souris à l’intérieur du scanner. Ajustez la position du lit de la souris pour couvrir tout le corps de la souris, avec la région du torse située au centre du champ de vision de l’IRM.
- Pour démarrer une TEP, sélectionnez Acquisition TEP dans la fenêtre de la liste d’étude, puis choisissez Plage de balayage lors de l’acquisition précédente pour utiliser la position prédéterminée du lit de souris dans la vue scout. Cliquez sur Préparer > OK pour déplacer automatiquement le lit de souris de MR à PET et commencer l’acquisition.
- Sous l’éditeur radiopharmaceutique, sélectionnez le radionucléide approprié, puis entrez les détails de la dose d’injection et le temps avant et après l’injection de [18 F]FMISO ou [18F]FDG, tels que mesurés à l’étape 4.3. et étape 4.4. Entrez le poids de la souris dans le menu Informations sur l’objet.
- Procéder aux acquisitions d’IRM à la fin de la TEP. Pour ce faire, sélectionnez Préparer pour déplacer la souris vers MR à partir de PET. Cliquez sur OK pour continuer.
- Une fois toutes les analyses terminées, sélectionnez Accueil pour remettre le lit d’imagerie à la position par défaut.
- Éteignez l’anesthésie et rincez le lit d’imagerie avec de l’O2 médical. Vérifiez le réflexe de retrait de la pédale de la souris. Transférez la souris du lit d’imagerie vers une cage de logement propre placée au-dessus d’un coussin chauffant pour aider à la récupération de l’anesthésie et pour retrouver le réflexe de redressement.
- Sous Raw Scan, sélectionnez PET Acquisition pour charger les données PET brutes acquises pour la reconstruction TEP. Sélectionnez MM à utiliser comme carte de matériaux. Procédez à la reconstruction TEP en utilisant le paramètre décrit à l’étape 3.6.
- Respecter strictement les directives locales et institutionnelles lors de la manipulation de souris après des études d’imagerie TEP. Traiter tous les consommables usagés, par exemple les seringues, les aiguilles, les gants, les lingettes et les déchets biologiques, par exemple la litière de la cage et les matières fécales, qui ont été en contact direct avec la souris comme des déchets radioactifs, et manipuler avec soin conformément aux réglementations locales.
6. Analyse d’images TEP
- Ouvrez le logiciel d’analyse d’images (voir Tableau des matériaux) et sélectionnez Charger les données DICOM pour ouvrir les images PET et MR.
- Faites glisser les images PET et MR correspondantes vers la fenêtre d’affichage du logiciel, puis sélectionnez Enregistrement automatique pour effectuer un co-enregistrement automatique des images PET et MR résultantes.
- Dans le menu Configuration de l’enregistrement , sélectionnez Transformation rigide . Utilisez Maj et rotation dans le menu Rigide/Affine .
- Dans le menu Sélection globale des rôles , cliquez sur MM comme référence et TEP statique comme Reslice.
- Inspectez les images TEP/RM co-enregistrées pour vous assurer qu’elles sont correctement alignées. Si nécessaire, utilisez l’enregistrement manuel pour ajuster les images manuellement.
- Localisez la tumeur orthotopique dans le foie à l’aide de l’image IRM. Utilisez le retour sur investissement de l’ellipse interpolée pour dessiner une VOI sur la tumeur, en utilisant l’image MR comme référence. Transférer la VOI tumorale créée de l’IRM à l’image TEP. Sélectionnez l’outil Pinceau et l’outil Gomme pour définir avec soin la bordure VOI diapositive par diapositive. Assurez-vous d’éviter le débordement de l’absorption de radioactivité par le foie sur l’image TEP.
- Utiliser la VOI ellipsoïde pour créer une VOI de 3 mm3 sur le foie comme organe de référence. Assurez-vous d’éviter les zones de structures vasculaires et biliaires hépatiques visibles en utilisant l’image IRM comme guide.
- Sélectionnez Afficher le tableau du retour sur investissement pour renommer tous les VOI dessinés. Enregistrez toutes les données nécessaires, par exemple la radioactivité (kBq/mL) et le volume tumoral (mm3), dans une feuille de calcul. Enregistrez une copie des dessins VOI et archivez les données d’imagerie brutes et reconstruites sur un disque dur externe une fois terminé.
- Calculer la valeur d’absorption normalisée (VUS) pour toutes les VOI à l’aide de l’équation11 suivante :
SUV = CPET(t)/(ID/BW)
où CPET(t) est l’activité mesurée dans l’indice VOI, ID est la dose injectée mesurée en kBq et BW est le poids corporel de la souris en kg, en supposant une densité tissulaire de 1 g/mL.
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Representative Results
Pour obtenir un bloc tumoral approprié pour les implantations orthotopiques successives, des clones stables ont d’abord été générés par injection sous-cutanée de 200 μL de suspension cellulaire dans DPBS (contenant des cellules MHCC97L) dans le flanc inférieur de souris nues (Figure 1A). La croissance tumorale a été surveillée et, lorsque la taille de la tumeur a atteint 800-1000 mm 3 (environ 4 semaines après l’injection), les souris ont été euthanasiées et le bloc tumoral résultant a été coupé en fragments d’environ 1 mm3 pour une implantation orthotopique hépatique ultérieure dans un autre lot de souris nues (n = 6). Les souris ont été randomisées en deux groupes : témoin (C1, n = 3) et ligature de l’artère hépatique (H2, n = 3). HAL a été réalisée en attachant un fil fin autour de la branche principale de l’artère hépatique. Les souris C1 ont été épargnées par HAL avant l’implantation orthotopique. Cette manipulation a conduit à une hypoxie tumorale chez les souris H2 mais pas C1, et le statut hypoxique tumoral a pu être surveillé de manière non invasive à l’aide du traceur hypoxique TEP [18F]FMISO. Les études TEP/RM ont montré qu’une augmentation de l’absorption tumorale [18 F]FMISO n’a été observée que chez les souris H2, alors que, en utilisant le marqueur glycolytique [18F]FDG, l’absorption tumorale est restée similaire entre les deux groupes (Figure 1B).
L’hypoxie induite par HAL dans les tumeurs a été validée en sondant les niveaux d’expression de HIF-1α12, et des comparaisons ont été faites entre les groupes. Compatible avec une tumeur plus hypoxique après HAL, le groupe H2 a présenté une expression HIF-1α plus élevée que le groupe C1 (densité optique: 0,17 vs 0,13, H2 vs C1, respectivement), ce qui corrobore leur absorption tumorale [18F]FMISO (Figure 2A). [18F] L’adoption de l’OSIGF a été quantifiée à l’aide de l’approche fondée sur les VUS. Les tumeurs H2 ont montré une augmentation de 2,3 fois de l’absorption de [18F]FMISO par rapport aux tumeurs C1 (SUVmax: 1,2 contre 2,8, respectivement, Figure 2B). De même, HAL a également entraîné une absorption plus élevée du SUV dans le foie chez les souris H2 que chez les souris C1 (Figure 2C). Dans l’ensemble, nous montrons ici que HAL peut induire efficacement l’hypoxie tumorale dans les xénogreffes orthotopiques CHC, et l’hypoxie tumorale peut être surveillée de manière non invasive à l’aide de l’imagerie TEP [18F]FMISO, soutenue par l’expression ex vivo du marqueur immunohistochimique HIF-1α. En outre, l’incorporation de l’imagerie par résonance magnétique offre un excellent contraste des tissus mous pour permettre une délimitation claire de la tumeur du foie, ce qui permet une quantification précise de la TEP.
Figure 1 : Imagerie in vivo TEP/RM de xénogreffes orthotopiques de souris CHC. (A) Schéma des créations de xénogreffes sous-cutanées et orthotopiques et des études d’imagerie TEP dans les tumeurs orthotopiques MHCC97L. (B) Images TEP représentatives par projection d’intensité maximale (MIP) de [18 F]FMISO et [18F]FDG chez des souris porteuses de tumeurs orthotopiques MHCC97L (C1) sans ou (H2) avec HAL. Les cercles bleus indiquent l’emplacement de la tumeur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse de souris porteuses de tumeurs orthotopiques MHCC97L avec et sans HAL. (A) Représentant co-enregistré [18images F]FMISO PET/MR, coloration immunohistochimique pour HIF-1α, et hématoxyline et éosine (HE) dans les coupes tumorales. (B-C) Analyse quantitative de l’absorption de [18F]FMISO dans la tumeur et le foie. N = 3 pour chaque groupe. Les valeurs de SUV sont présentées sous forme de moyenne ± d’erreur type de la moyenne (MEB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons décrit les procédures pour effectuer HAL sur des xénogreffes de CHC orthotopiques hépatiques utilisant des tumeurs sous-cutanées, ainsi que des méthodes de surveillance non invasive de l’hypoxie tumorale dans les xénogreffes orthotopiques en utilisant [18 F]FMISO et [18F]FDG PET/MR. Nous nous intéressons à l’imagerie métabolique de divers modèles de cancer et de maladie pour le diagnostic précoce et l’évaluation de la réponse au traitement11,13,14,15. À ce jour, la création de xénogreffes HAL HCC et leur métabolisme tumoral in vivo ont rarement été décrits dans la littérature, ce qui nous a incités à étudier les caractéristiques métaboliques de ces modèles tumoraux en utilisant l’imagerie TEP.
La mise en place réussie de xénogreffes orthotopiques avec HAL comme modèle de souris robuste pour étudier l’hypoxie dans le CHC représente un aspect important pour l’étude de la biologie du CHC in vivo. L’hypoxie est connue pour stimuler la malignité du cancer. De plus, l’hypoxie intratumorale a été associée à une prolifération accrue, à des métastases et à une radiorésistance et à une chimiorésistance et justifie une caractérisation approfondie de la réponse aux conditions hypoxiques7. Alors que les xénogreffes sous-cutanées sont souvent utilisées pour étudier la tumorigenèse du CHC ou les stratégies de traitement, les modèles orthotopiques peuvent mieux récapituler le développement du CHC humain car ils reflètent plus précisément le microenvironnement tumoral, en particulier les influences sur la vascularisation et les interactions tumeur-stroma vers les métastases du CHC12. L’incorporation de HAL chez les souris orthotopiques CHC permet l’induction d’une hypoxie intra-tumorale en bloquant l’apport sanguinaire artériel hépatique à la tumeur7. De tels modèles animaux permettent d’élucider les mécanismes sous-jacents aux effets de HAL sur le CHC et de créer de nouvelles voies pour des thérapies efficaces ciblant la voie de l’hypoxie dans le CHC. Pour l’implantation orthotopique, nous avons utilisé le cube tumoral de la tumeur sous-cutanée au lieu d’une injection directe de suspensions cellulaires du CHC. Nous avons constaté que les injections cellulaires directes provoquent souvent un petit volume de fuite du site d’injection, même si la procédure a été effectuée aussi lentement que possible avec un faible volume d’injection. Cela peut potentiellement conduire à des métastases péritonéales, ce qui nuit au bien-être des animaux, affectant finalement le résultat global de l’étude. D’autre part, l’implantation d’un petit bloc tumoral permettrait de surmonter le problème, bien qu’il faille veiller à ce que la tumeur soit suturée en toute sécurité après l’implantation. Lors de l’isolement de petits cubes tumoraux du bloc tumoral sous-cutané, il est également conseillé d’éviter les régions centrales de la tumeur solide, qui sont relativement moins vascularisées et plus stressées métaboliquement en raison de l’hypoxie et de la privation de nutriments. Cela réduira l’inclusion de cellules tumorales mortes qui semblent être nécrotiques dans le petit cube tumoral et maintiendra des taux de croissance tumorale plus constants chez les souris individuelles.
L’hypoxie est un facteur pronostique de résistance au cancer, et la surveillance des changements dans l’hypoxie à l’aide de la TEP permet la détection et la quantification des tissus hypoxiques avec une sensibilité et une spécificité élevées. Une considération importante pour [18 F]FMISO et [18F]FDG PET concerne le temps d’absorption du radiotraceur et la voie d’administration chez la souris. Les deux radiotraceurs ont une pharmacocinétique in vivo différente, l’une étant la différence d’absorption physiologique, observée dans l’intestin/vessie et le cœur/vessie pour [18 F]FMISO et [18 F]FDG, respectivement, et l’autre étant que [18 F]FMISO s’accumule dans la région hypoxique de la tumeur, et [18F]FDG est préférentiellement absorbé dans la région tumorale métabolique élevée 16. La lipophilie élevée et la clairance hépatique lente de [18F]FMISO nécessitent un temps post-injection de 2 à 4 heures pour obtenir un bon contraste tumeur-foie17. Nous avons constaté que 3 h après l’injection est suffisante pour différencier et délimiter l’absorption tumorale [18F]FMISO du foie pour les groupes hypoxique (H2) et témoin (C1). Dans le cas de [18F]FDG PET, un temps post-injection de 1 h est suffisant pour produire un bon contraste, comme décrit précédemment13,15, et a été utilisé dans cette étude. Néanmoins, il est impératif de maintenir un temps d’absorption constant du radiotraceur pour garantir la fiabilité des résultats TEP, en particulier pour les analyses basées sur les SUV. Ici, nous avons utilisé des techniques intraveineuses pour administrer un radiotraceur aux souris. Une injection réussie de la veine de la queue est indiquée par un flashback sanguin visible avant la perfusion du radiotraceur, où l’aiguille est positionnée avec précision dans la veine. Un inconvénient majeur de cette méthode est que le retour sanguin attendu peut être difficile à observer en raison de l’hypotension, avec une variabilité observée entre les souris. Néanmoins, une telle difficulté peut être surmontée en réchauffant la queue pendant une courte période de 1 à 2 minutes avant l’insertion de l’aiguille, soit avec une débarbouillette chaude, soit avec une lampe chauffante pour augmenter le flux sanguin et améliorer la visibilité de la veine pour une injection réussie.
Avec l’utilisation croissante de l’imagerie TEP pour quantifier la biodistribution des radiotraceurs chez les petits animaux, une considération importante à noter est l’utilisation d’un scanner TEP précis et bien calibré pour produire des données TEP bonnes, reproductibles et quantifiables. Un système TEP précis permet d’effectuer des études d’imagerie de manière plus rapide et rentable et permet la mise en œuvre des principes des 3R (remplacement, réduction et raffinement) dans la recherche animale. Pour cette raison, des inspections de contrôle de la qualité de routine doivent être effectuées, de préférence sur une base hebdomadaire, pour examiner les composants TEP et RM du système d’imagerie conformément aux recommandations du fabricant. En particulier, la précision de l’activité TEP doit être vérifiée et enregistrée fréquemment, ainsi qu’avant le début d’une expérience d’imagerie, afin de garantir la fiabilité de la quantification de la TEP. Ceci est impératif pour toute étude longitudinale impliquant l’évaluation quantitative de la tumeur et des tissus sur une période d’examen afin de produire des résultats significatifs et comparables. L’étalonnage du système est nécessaire lorsque la précision de l’activité TEP est jugée hors de la plage recommandée, ainsi que lorsque le désalignement des images TEP et RM est découvert.
Bien que les techniques décrites ici permettent l’imagerie TEP des xénogreffes hypoxiques du CHC pour un large éventail d’études in vivo , certaines limites doivent être prises en compte lors de l’utilisation de ces protocoles. La création de xénogreffes HAL HCC est une intervention chirurgicale intra-abdominale complexe à effectuer sur des souris immunodéficientes âgées de 6 à 8 semaines. De plus, la petite artère hépatique de ces jeunes souris peut être difficile à localiser, ce qui rend le processus de ligature techniquement difficile. Ces procédures nécessitent un personnel dûment formé pour améliorer le taux de succession chirurgicale, ainsi que la survie des souris sur une période de temps, c’est-à-dire 4 à 6 semaines avant la formation des xénogreffes, tandis que la fourniture de soins intensifs aux animaux est attendue tout au long de la période de chirurgie, ce qui demande beaucoup de temps et de ressources. Il est également prévu que la création de xénogreffes orthotopiques du CHC à l’aide de cette méthode nécessitera environ 8 semaines avant la réussite de l’imagerie TEP, car l’implantation du cube tumoral est utilisée plutôt que l’injection directe de suspensions cellulaires pour éviter les métastases péritonéales. Néanmoins, ces limites peuvent être surmontées grâce à une planification et à une formation adéquates du personnel de recherche. En outre, la taille de l’échantillon des groupes expérimentaux rapportés ici est petite, ce qui pourrait ne pas convenir à l’analyse statistique. Cependant, nos observations révèlent subjectivement une tendance où l’hypoxie induite par HAL a été mesurée à la fois dans la tumeur et le foie dans le groupe H2 par rapport au groupe C1, ce qui est soutenu par une coloration HIF-1α plus importante dans les échantillons tumoraux H2. Nous travaillons actuellement sur l’expansion des modèles tumoraux avec d’autres lignées cellulaires humaines de CHC. De plus, des études thérapeutiques ciblant la voie de l’hypoxie dans le CHC impliquant ces xénogreffes sont en cours.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons le soutien du Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14F) pour les expériences d’imagerie des petits animaux. Nous remercions également le Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) de l’Université de Hong Kong pour le soutien de [18 F]FMISO et [18F]FDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
