Summary
यहां, हम हेपेटिक धमनी बंधाव के साथ और बिना ऑर्थोटोपिक हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा जेनोग्राफ्ट्स बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और [18 एफ] फ्लोरोमिसोनिडाज़ोल ([18 एफ] एफएमआईएसओ) और [18एफ] फ्लोरोडीऑक्सीग्लूकोज ([18एफ] एफडीजी) का उपयोग करके ट्यूमर हाइपोक्सिया की गैर-इनवेसिव पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग करते हैं।
Abstract
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) के प्रीक्लिनिकल प्रयोगात्मक मॉडल जो मानव रोग को पुन: उत्पन्न करते हैं, ट्यूमरजेनिसिस का अध्ययन करने और नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) का उपयोग करके गैर-इनवेसिव पूरे शरीर की इमेजिंग वास्तविक समय में आणविक स्तर पर ऊतकों की विवो विशेषताओं में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। हम यहां ट्यूमर हाइपोक्सिया को प्रेरित करने के लिए हेपेटिक धमनी बंधाव (एचएएल) के साथ और उसके बिना ऑर्थोटोपिक एचसीसी जेनोग्राफ्ट निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और [18एफ] फ्लोरोमिसोनिडाज़ोल ([18एफ] एफएमआईएसओ) और [18एफ] फ्लोरोडीऑक्सीग्लूकोज ([18एफ] एफडीजी) पीईटी / चुंबकीय अनुनाद (एमआर) इमेजिंग का उपयोग करके विवो में उनके ट्यूमर चयापचय का आकलन करते हैं। हाइपोक्सिया मार्कर [18एफ] एफएमआईएसओ का उपयोग करके ट्यूमर हाइपोक्सिया को आसानी से देखा जा सकता है, और यह पाया गया कि गैर-एचएएल समूह की तुलना में एचएएल से गुजरने वाले एचसीसी चूहों में [18एफ] एफएमआईएसओ अपटेक अधिक था, जबकि [18एफ] एफडीजी दो समूहों के बीच ट्यूमर हाइपोक्सिया को अलग नहीं कर सका। एचएएल ट्यूमर ने हाइपोक्सिया के जवाब में हाइपोक्सिया-इंड्यूसेबल फैक्टर (एचआईएफ) -1 की अभिव्यक्ति का एक उच्च स्तर भी प्रदर्शित किया। एचएएल ट्यूमर की मात्रा ने मानकीकृत मूल्य अपटेक (एसयूवी) दृष्टिकोण के आधार पर एफएमआईएसओअपटेक में 2.3 गुना वृद्धि दिखाई।
Introduction
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) छठा सबसे अधिक निदान किया गया कैंसर है और दुनिया भर में कैंसर से मृत्यु का तीसरा सबसे आम कारण है, जिसमें 2020 में 900,000 से अधिक नए मामले और 800,000 मौतें हैं। प्रमुख जोखिम कारक सिरोसिस है, जो वायरल संक्रमण (हेपेटाइटिस बी और सी वायरस), शराब के दुरुपयोग, मधुमेह और गैर-मादक स्टीटोहेपेटाइटिस2 के परिणामस्वरूप होता है। एचसीसी का प्रबंधन जटिल है, और कई उपचार विकल्प उपलब्ध हैं, जिनमें सर्जिकल रिसेक्शन, थर्मल या रासायनिक पृथक्करण, प्रत्यारोपण, ट्रांसआर्टेरियल केमोएम्बोलाइजेशन, विकिरण और कीमोथेरेपी शामिल हैं, जो रोग स्टेजिंग 2,3 पर निर्भर करता है। एचसीसी एक कीमोथेरेपी-दुर्दम्य ट्यूमर है जिसमें उपचारात्मक-इरादे थेरेपी के बाद 70% रोगियों में रोग पुनरावृत्ति होतीहै।
ट्यूमर विषमता की उच्च डिग्री के बावजूद, एचसीसी दो सामान्य परिणामों से जुड़ा हुआ है: (i) एचसीसी बहुत हाइपोक्सिक है, और (ii) ट्यूमर हाइपोक्सिया अधिक ट्यूमर आक्रामकता और उपचार विफलता से जुड़ा हुआ है। एचसीसी कोशिकाओं के अनियंत्रित प्रसार के परिणामस्वरूप एक उच्च ऑक्सीजन खपत दर होती है जो वैस्कुलराइजेशन से पहले होती है, इस प्रकार एक हाइपोक्सिक माइक्रोएन्वायरमेंट बनाती है। कम इंट्रा-ट्यूमरल ऑक्सीजन का स्तर तब जैविक प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला को ट्रिगर करता है जो ट्यूमर आक्रामकता और उपचार प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है। हाइपोक्सिया-इंड्यूसेबल कारक (एचआईएफ) को अक्सर हाइपोक्सिया 2,3 की प्रतिक्रिया में आवश्यक ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के रूप में मान्यता दी जाती है। इसलिए, हाइपोक्सिया का पता लगाने की क्षमता नियोप्लास्टिक ऊतकों की कल्पना करने और दुर्गम साइटों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, जिन्हें आक्रामक प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है। यह आणविक परिवर्तनों को बेहतर ढंग से समझने में भी मदद करता है जो ट्यूमर आक्रामकता का कारण बनते हैं और रोगी उपचार के परिणामों में सुधार करते हैं।
पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) का उपयोग करके आणविक इमेजिंग आमतौर पर एचसीसी सहित कई कैंसर के निदान और मंचन में उपयोग की जाती है। विशेष रूप से, दोहरे-ट्रेसर पीईटी इमेजिंग का संयुक्त उपयोग जिसमें [18एफ] फ्लोरोडीऑक्सीग्लूकोज ([18एफ] एफडीजी) और [11सी] एसीटेट शामिल हैं, एचसीसी निदान 4,5 में समग्र संवेदनशीलता में काफी वृद्धि कर सकते हैं। दूसरी ओर, हाइपोक्सिया की इमेजिंग, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले हाइपोक्सिक मार्कर [18एफ] फ्लोरोमिसोनिडाज़ोल ([18एफ] एफएमआईएसओ) का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है। नैदानिक अभ्यास में, हाइपोक्सिया का गैर-इनवेसिव मूल्यांकन विकिरण चिकित्सा योजनाके लिए विभिन्न प्रकार के ट्यूमर और क्षेत्रों के बीच अंतर करने के लिए महत्वपूर्ण है।
प्रीक्लिनिकल इमेजिंग विभिन्न बीमारियों के लिए माउस मॉडल के गैर-इनवेसिव और अनुदैर्ध्य मूल्यांकन के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन गया है। एक मजबूत और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एचसीसी मॉडल मानव एचसीसी के पैथोफिज़ियोलॉजी और नए उपचारों के मूल्यांकन में प्रीक्लिनिकल और ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण मंच का प्रतिनिधित्व करता है। पीईटी इमेजिंग के साथ, विवो व्यवहार में किसी भी समय बिंदु के लिए आणविक स्तर पर महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए स्पष्ट किया जा सकता है। यहां, हम हेपेटिक धमनी बंधाव (एचएएल) ऑर्थोटोपिक एचसीसी जेनोग्राफ्ट्स की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और [18एफ] एफएमआईएसओ और [18एफ] एफडीजी पीईटी / एमआर का उपयोग करके विवो ट्यूमर चयापचय में उनके विश्लेषण का वर्णन करते हैं। एचएएल का समावेश विवो में ट्यूमर हाइपोक्सिया का अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक या रासायनिक रूप से प्रेरित एचसीसी चूहों का एक उपयुक्त मॉडल बनाता है, क्योंकि एचएएल इंट्रा-ट्यूमरल हाइपोक्सिया 7,8 को प्रेरित करने के लिए धमनी रक्त की आपूर्ति को प्रभावी ढंग से अवरुद्ध कर सकता है। इसके अलावा, पिमोनिडाज़ोल का उपयोग करके एक्स विवो इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग के विपरीत, हाइपोक्सिया के परिणामस्वरूप ट्यूमर चयापचय में परिवर्तन को पीईटी इमेजिंग का उपयोग करके गैर-आक्रामक रूप से आसानी से देखा और सटीक रूप से परिमाणित किया जा सकता है, जिससे उपचार प्रतिक्रिया के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन या प्रतिरोध 3,7,8 के उद्भव का अनुमान लगाया जा सकता है। . यहां दिखाई गई हमारी विधि विवो में एचसीसी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए पीईटी / एमआर इमेजिंग का उपयोग करके ट्यूमर हाइपोक्सिया की गैर-इनवेसिव निगरानी के साथ एक मजबूत हाइपोक्सिक एचसीसी मॉडल के निर्माण की अनुमति देती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी पशु अध्ययन हांगकांग विश्वविद्यालय में तुलनात्मक चिकित्सा अनुसंधान केंद्र (सीसीएमआर) में शिक्षण और अनुसंधान (CULATR) में जीवित जानवरों के उपयोग पर समिति के अनुसार किए गए थे, जो एसोसिएशन फॉर द असेसमेंट एंड एक्रेडिटेशन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर इंटरनेशनल (AAALAC) द्वारा मान्यता प्राप्त कार्यक्रम है। अध्ययन में इस्तेमाल किए गए जानवर 6-8 सप्ताह की उम्र में मादा बीएएलबी / सीएएन-एनयू (नग्न) चूहे थे, जिनका भार 20 ग्राम ± 2 ग्राम था। भोजन और पानी लिबिटम प्रदान किया गया था।
1. मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइनों के चमड़े के नीचे इंजेक्शन
नोट: एमएचसीसी 97 एक मानव एचसीसी सेल लाइन है जिसका उपयोग चमड़े के नीचे एचसीसी जेनोग्राफ्ट मॉडल उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। एमएचसीसी 97 एल कोशिकाओं को लिवर कैंसर इंस्टीट्यूट, फुदान विश्वविद्यालय, शंघाई के झोंगशान अस्पताल, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना9 से प्राप्त किया जाता है और शॉर्ट टेंडम रिपीट (एसटीआर) प्रोफाइलिंग द्वारा प्रमाणित किया जाता है।
- संस्कृति एमएचसीसी 97 एल कोशिकाओं को बनाए रखने और संस्कृति मीडिया में बनाए रखने के लिए टी -75 सेल कल्चर फ्लास्क में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया जाता है। हर 2 दिनों में कल्चर मीडिया को बदलें और कोशिकाओं को 80% -90% कंफ्लुएंसी पर काटें।
नोट: प्रारंभिक सेल संख्या 1.5 x 106 कोशिकाएं हैं, और कोशिकाओं का उपयोग 6-8 मार्गों के भीतर किया जाता है। - उपयोग तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर मीडिया और ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ट्रिप्सिन-ईडीटीए) स्टोर करें। उपयोग से पहले संस्कृति मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस और ट्रिप्सिन-ईडीटीए को कमरे के तापमान पर गर्म करें। इस खंड में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्रियों के लिए सामग्री की तालिका देखें।
- संस्कृति मीडिया को हटा दें। 10 एमएल बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस, सामग्री की तालिका देखें) के साथ सेल परत को कुल्ला करें।
- कल्चर फ्लास्क में ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 5 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 20x आवर्धन पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें ( सामग्री की तालिका देखें) जब तक कि सेल परत फैल न जाए और फ्लास्क से पूरी तरह से अलग न हो जाए। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को ट्रिप्सिन-ईडीटीए में 15 मिनट से अधिक समय तक नहीं छोड़ा जाता है।
- संस्कृति फ्लास्क में 5 एमएल संस्कृति मीडिया जोड़ें। धीरे-धीरे पाइप करके कोशिकाओं को एस्पिरेट करें। सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 1,107 x g पर स्पिन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- सतह पर तैरने वाले को हटा दें और धीरे से 1 एमएल पीबीएस के साथ सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें। सिंगल-सेल सस्पेंशन प्राप्त करने के लिए पिपेट पूरी तरह से। स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल नंबर निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और पीबीएस में 5 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए सेल निलंबन तैयार करें।
- 1 एमएल सिरिंज में 25 ग्राम सुई के साथ 200 μL सेल सस्पेंशन खींचें। प्रत्येक सिरिंज में 1 x 106 MHCC97L कोशिकाएं (200 μL में) होती हैं। सिरिंज को गीली बर्फ पर रखें।
- केटामाइन (87.5 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलज़िन (12.5 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण के इंट्रापरिटोनियल (आई.पी.) इंजेक्शन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। पैर की अंगुली-चुटकी रिफ्लेक्स का उपयोग करके उचित संज्ञाहरण सुनिश्चित करें। सूखने और कॉर्नियल अल्सर के संभावित गठन को रोकने के लिए माउस पर आंख स्नेहक लागू करना सुनिश्चित करें। माउस को बाँझ पैड पर लापरवाह स्थिति में रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- माउस के निचले फ्लैंक (या तो बाएं या दाईं ओर) के पास पृष्ठीय क्षेत्र को 70% इथेनॉल के साथ निष्फल करें ( सामग्री की तालिका देखें)। त्वचा को बल के साथ ऊपर उठाएं और धीरे से सुई को त्वचा के नीचे डालें।
- सुई की वापसी पर इंजेक्शन साइट से सेल निलंबन के आकस्मिक रिसाव से बचने के लिए पंचर साइट से चमड़े के नीचे के विमान के साथ सुई को 4-5 मिमी आगे बढ़ाएं। सुनिश्चित करें कि सुई सम्मिलन त्वचा के नीचे बहुत गहरा नहीं है, जिससे आकस्मिक अंग क्षति हो सकती है।
- फोर्स को छोड़ दें और सावधानीपूर्वक और धीरे-धीरे सिरिंज की सामग्री का निर्वहन करें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि विपरीत पक्ष में प्रवेश न करें। इंजेक्शन पर सूजन की जांच के लिए सुई को बाहर निकालें। एनेस्थीसिया से वसूली में सहायता करने और गतिशीलता हासिल करने के लिए माउस को प्री-वार्मेड हीटिंग पैड के शीर्ष पर बैठे पिंजरे में वापस रखें। माउस की निगरानी तब तक जारी रखें जब तक कि माउस पूरी तरह से जाग न जाए और स्टर्नल रिकंबेंसी बनाए रखे।
- साप्ताहिक आधार पर माउस के ट्यूमर के विकास और भलाई की निगरानी करें। कैलिपर का उपयोग करके ट्यूमर की मात्रा (वी) को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)। निम्न सूत्र10 का उपयोग करके ट्यूमर की मात्रा की गणना और रिकॉर्ड करें:
V = (W2× L)/2
जहां डब्ल्यू चौड़ाई है और एल ट्यूमर की लंबाई है। - इंजेक्शन के बाद 4-6 सप्ताह के बीच, जांचें कि चमड़े के नीचे के ट्यूमर का एक महत्वपूर्ण आकार, 800-1000 मिमी3 के बीच, प्राप्त किया जाता है। सुनिश्चित करें कि कुल ट्यूमर लोड शरीर के वजन के 10% से अधिक नहीं है।
2. ऑर्थोटोपिक लिवर प्रत्यारोपण और हेपेटिक धमनी बंधाव
- एक कीटाणुरहित जैविक सुरक्षा कैबिनेट में निम्नलिखित सर्जिकल अभिकर्मकों और उपकरणों को तैयार करें: एक डिश में 10 एमएल कल्चर मीडिया, 10% पोविडोन-आयोडीन समाधान, 70% इथेनॉल, ऑटोक्लेव सर्जिकल उपकरण, यानी, तेज कैंची, स्प्रिंग कैंची, फोर्सप्स (घुमावदार बारीक और सीधे कुंद), सुई धारक, स्केलपेल ब्लेड, 6-0 और 5-0 नायलॉन सीवन, एक हीटिंग पैड।
- सभी सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेव करें और उन्हें केवल बाँझ बेंच पर संभालें। सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौरान चूहों को पर्याप्त और आवश्यक पूर्व, इंट्रा-और पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल प्रदान करें (नीचे दिए गए चरण देखें)।
- पूर्व-ऑपरेटिव दर्द से राहत के लिए, सर्जिकल प्रक्रिया की शुरुआत से कम से कम 30 मिनट पहले ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ माउस इंजेक्ट करें। पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल और प्रबंधन के लिए, माउस को ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ 3 दिनों के लिए लगातार, हर 8-12 घंटे में एक बार इंजेक्ट करें। इस खंड में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्रियों के लिए सामग्री की तालिका देखें।
- पेंटोबार्बिटल (330 मिलीग्राम / किग्रा) के आईपी इंजेक्शन के साथ चमड़े के नीचे ट्यूमर-असर माउस को यूथेनाइज़ करें। स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके ट्यूमर साइट की त्वचा पर चीरा लगाएं। चमड़े के नीचे ट्यूमर ब्लॉक को उत्पादित करें और इसे तुरंत संस्कृति मीडिया में स्थानांतरित करें। जितनी जल्दी हो सके इस चरण को करें।
- तेज सर्जिकल कैंची का उपयोग करके ट्यूमर ब्लॉक को 1 मिमी3 छोटे ट्यूमर क्यूब्स में काटें। संस्कृति मीडिया में सभी ट्यूमर क्यूब्स रखें। चमड़े के नीचे ट्यूमर ब्लॉक के मुख्य क्षेत्र का उपयोग करने से बचें।
- माउस को एनेस्थेटाइज करें जो केटामाइन (87.5 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलाज़िन (12.5 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण के आईपी इंजेक्शन के साथ बाद में ऑर्थोटोपिक ट्यूमर प्रत्यारोपण सर्जरी से गुजर रहा है। सुनिश्चित करें कि माउस को एनेस्थेटाइज करने से पहले ब्यूप्रेनोर्फिन देने के बाद कम से कम 30 मिनट बीत चुके हैं। सूखने और कॉर्नियल अल्सर के संभावित गठन से बचने के लिए माउस पर आंख स्नेहक लागू करना सुनिश्चित करें।
- माउस को एक बाँझ पैड पर लापरवाह स्थिति में रखें जो एक पूर्व-गर्म हीटिंग पैड के शीर्ष पर है। सर्जिकल प्रक्रिया के अंत तक हर 15 मिनट में माउस की शारीरिक स्थिति की निगरानी और रिकॉर्ड करें।
- माउस के अंगों का विस्तार करें। उदर पेट और वक्ष के जोखिम को अधिकतम करने के लिए उन्हें टेप के साथ सुरक्षित करें। माउस की पूरी पेट की त्वचा को 10% पोविडोन-आयोडीन समाधान के साथ निष्फल करें, इसके बाद 70% इथेनॉल। पैर की अंगुली की पिंचिंग-पेडल वापसी रिफ्लेक्स के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं होने की जांच करके माउस की एनेस्थेटिक गहराई का आकलन करें।
- तेज कैंची का उपयोग करके पेरिटोनियम तक पहुंचने के लिए लगभग 10 मिमी मध्य रेखा चीरा लगाकर लैप्रोटॉमी करें। सिर की ओर एक्सिफाइड प्रक्रिया को बल के साथ दबाएं और खींचें और सर्जिकल क्षेत्र को खोलने के लिए सबकोस्टल रिट्रैक्टर्स लागू करें। सुनिश्चित करें कि ऑपरेशन साइट के एक अच्छे सर्जिकल दृश्य को सक्षम करने के लिए एक उचित चीरा लगाया गया है।
- गीले धुंध स्वैब के साथ माध्य और बाएं लोब को ऊपर की ओर मोड़ें। पेट के बाहर आंतों को माउस के बाईं ओर ले जाएं और उन्हें गीले धुंध स्वैब से कवर करें। सामान्य यकृत धमनी (सीएचए) पर हेपेटिक धमनी बंधाव (एचएएल) करें, जो अनुकूलित विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक आवर्धक लैंप के तहत अग्नाशय के सिर से हेपेटिक पेडिकल में इसकी जड़ तक उत्पन्न होता है।
- बाएं लोब को उजागर करने के लिए गीले धुंध स्वैब के साथ माध्य और बाएं लोब को वापस / नीचे की ओर मोड़ें। बाँझ स्केलपेल ब्लेड के साथ बाएं लोब की सतह पर लंबाई और गहराई में लगभग 2 मिमी का चीरा लगाएं।
नोट: पड़ोसी पेट के अंगों को आघात द्वारा आकस्मिक आँसू या घाव को कम करने के लिए ट्यूमर प्रत्यारोपण के लिए यकृत के मध्य लोब का उपयोग करना भी संभव है। - तुरंत बाँझ बल के साथ यकृत चीरा में एक ट्यूमर का टुकड़ा डालें। ट्यूमर को दफनाएं ताकि यह यकृत में सुरक्षित रूप से बैठ जाए। जिगर और हेमोस्टेसिस में उचित ट्यूमर टुकड़ा प्रत्यारोपण सुनिश्चित करने के लिए चीरा साइट पर 6-0 नायलॉन सीवन के साथ आठ का एक चित्र लागू करें। अत्यधिक रक्तस्राव से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके इस ऑपरेशन को करें। पूरा होने पर, बाधित 5-0 सीवन के साथ पेट के चीरे को बंद करें।
- एनेस्थीसिया से वसूली में सहायता करने और राइटिंग रिफ्लेक्स को फिर से हासिल करने के लिए माउस को प्री-वार्मेड हीटिंग पैड के शीर्ष पर बैठे पिंजरे में वापस रखें। हर 15 मिनट में माउस की शारीरिक स्थिति की निगरानी और रिकॉर्ड करना जारी रखें जब तक कि माउस पूरी तरह से जाग न जाए और स्टर्नल रिकंबेंसी बनाए रखे।
- प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी चूहे ऑर्थोटोपिक ट्यूमर प्रत्यारोपण से नहीं गुजर जाते। सर्जिकल ऑपरेशन के बाद अगले 3 दिनों तक रोजाना उनकी शारीरिक स्थिति की लगातार निगरानी करके सभी चूहों को पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल प्रदान करें। हर 8-12 घंटे में ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) दें।
3. पीईटी/एमआर अंशांकन और वर्कफ़्लो की स्थापना
एमआर 3 टी सिस्टम का उपयोग करके इमेजिंग की जाती है ( सामग्री की तालिका देखें)।
- एक प्रेरण कक्ष में माउस को एनेस्थेटाइज करने के लिए 5% आइसोफ्लुरेन (1 एल / मिन मेडिकल ओ2) का उपयोग करें। प्रत्येक स्कैन के लिए, एनेस्थेटाइज्ड माउस को निरंतर हीटिंग के साथ इमेजिंग बेड पर सावधानीपूर्वक रखें; सबसे पहले, स्थैतिक [18 एफ] एफएमआईएसओ या [18एफ] एफडीजी पीईटी स्कैन के लिए एक शारीरिक संदर्भ के रूप में एमआर (स्काउट व्यू) के साथ स्कैन करें, इसके बाद एनाटॉमिक संदर्भ एमआर इमेजिंग।
- निर्धारित इमेजिंग सत्र से 1 दिन पहले एक स्थिर पीईटी स्कैन, टी 1-भारित (क्षीणन सुधार) और टी 2-भारित (शारीरिक संदर्भ) एमआर इमेजिंग, और पीईटी पुनर्निर्माण को शामिल करने के लिए सॉफ्टवेयर में एक अनुक्रमिक पीईटी / एमआर इमेजिंग वर्कफ़्लो बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
- पीईटी प्राप्त करने के लिए, 400-600 केवी स्तर भेदभाव, एफ -18 अध्ययन आइसोटोप, 1-5 संयोग मोड और 20 मिनट स्कैन का चयन करें।
- पूरे शरीर के T1-भारित MR प्राप्त करने के लिए, TE = 4.3 ms, TR = 16 ms, फील्ड ऑफ व्यू (FOV) = 90 mm x 60 mm, उत्तेजनाओं की संख्या (NEX) = 3, 0.9 मिमी मोटाई के साथ 28 स्लाइस, और वोक्सेल आकार = 0.375 मिमी3 x 0.375 मिमी3 x 0.9 मिमी3 का उपयोग करें।
- पूरे शरीर के T2-भारित MR प्राप्त करने के लिए, TE = 71.8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 0.9 मिमी मोटाई के साथ 28 स्लाइस, Voxel आकार = 0.265 mm3 x 0.268 mm3 x 0.9 mm3 के साथ फास्ट-स्पिन इको 2D का उपयोग करें।
- पीईटी के पुनर्निर्माण के लिए, टेरा-टोमो (टीटी 3 डी) एल्गोरिथ्म, पुनरावृत्तियों = 8, उपसमुच्चय = 6, 1-3 संयोग मोड का चयन करें, और क्षय, मृत-समय, यादृच्छिक, क्षीणन और स्कैटर सुधार के साथ 0.3 मिमी3 के समग्र वोक्सेल आकार के साथ छवियां बनाएं।
- पीईटी मात्रा11 की सटीकता की जांच करने के लिए प्रयोग की शुरुआत से पहले पीईटी गतिविधि परीक्षण करें।
- निर्माता की सिफारिश के अनुसार पानी या खारा में पतला 5-8 एमबीक्यू [18एफ] एफएमआईएसओ के साथ 5 एमएल सिरिंज भरें। सिरिंज की गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए खुराक कैलिब्रेटर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। माप के समय पर ध्यान दें।
- पूरे सिरिंज को कवर करने के लिए पुनर्निर्मित छवि पर ब्याज की मात्रा (वीओआई) खींचें। छवि से पुनर्प्राप्त गतिविधि की तुलना खुराक कैलिब्रेटर से प्राप्त मूल्य से करें। इमेजिंग अध्ययन के साथ आगे बढ़ें जब पुनर्प्राप्त गतिविधि ±5% के भीतर सटीक होती है।
4. [18एफ] एफएमआईएसओ और [18एफ] एफडीजी इंजेक्शन
- इमेजिंग अध्ययन की शुरुआत से 30 मिनट पहले आपूर्तिकर्ता से [18एफ] एफएमआईएसओ की नैदानिक खुराक प्राप्त करें। रेडियोधर्मी सामग्री को संभालते समय उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई), जैसे लैब कोट, दस्ताने, चश्मा, एक फिल्म बैज और रिंग डोसीमीटर पहनें। रेडियोधर्मी पदार्थों के क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए अक्सर दस्ताने बदलें।
- एल-ब्लॉक टेबल-टॉप शील्ड के पीछे लीड स्टोरेज कंटेनर में रेडियोधर्मी स्टॉक समाधान रखें। [18एफ] एफएमआईएसओ का एक एलिकोट वितरित करें और निष्फल खारा के साथ पतला करें। सुनिश्चित करें कि कुल गतिविधि एकाग्रता 100 μL में 18-20 MBq है।
- सुई के साथ 1एमएल सिरिंज के साथ एफएमआईएसओ खींचें ( सामग्री की तालिका देखें)। खुराक कैलिब्रेटर पर दिखाए गए रेडियोधर्मिता और समय को रिकॉर्ड करें।
- रेडियोट्रेसर के इंजेक्शन से पहले माउस वजन रिकॉर्ड करें। माउस को एनेस्थेटाइज करने के लिए 5% आइसोफ्लुरेन (1 एल / मिन मेडिकल ओ2) का उपयोग करें, फिर पूंछ की नस के माध्यम से तैयार [18एफ] एफएमआईएसओ को सावधानीपूर्वक इंजेक्ट करें। क्षय सुधार के लिए सिरिंज के इंजेक्शन समय और अवशेष गतिविधि को रिकॉर्ड करें। पीईटी स्कैन से पहले [18 एफ] एफएमआईएसओ अपटेक की अनुमति देने के लिए माउस को 180मिनट के लिए पिंजरे में वापस रखें। माउस को [18एफ] एफएमआईएसओ पीईटी के बाद 1 दिन के लिए पुनर्प्राप्त करने की अनुमति दें।
नोट: [18 एफ] एफएमआईएसओ और [18एफ] एफडीजी के लिए विवो फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल में बहुत अलग होने के बावजूद, दोनों रेडियोट्रैसर को एफ -18 के साथ रेडियोलेबल किया जाता है, जो 109.77 मिनट (< 2 घंटे) के आधे जीवन के साथ एक पीईटी रेडियोन्यूक्लाइड है। चूंकि पीईटी सिग्नल एफ -18 से उत्पन्न होता है, इसलिए प्रारंभिक इंजेक्शन रेडियोधर्मिता का आधा हिस्सा हर 2 घंटे खो जाएगा। इस मामले में, अवशिष्ट सिग्नल 24 एच पोस्ट इंजेक्शन अब पीईटी स्कैनर द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है। इसके अलावा, दोनों [18एफ] एफएमआईएसओ (दिन 1) और [18एफ] एफडीजी (दिन 3) इंजेक्शन के बीच 1 दिन का अंतर [18एफ] एफएमआईएसओ के पूर्ण क्षय की अनुमति देगा जब [18एफ] एफडीजी पीईटी किया जाता है, इसलिए [18एफ] एफडीजी पीईटी स्कैन में [18एफ] एफएमआईएसओ सिग्नल का कोई ओवरलैपिंग नहीं होता है। - चरण 4.1.-4.4 दोहराएँ। दिन 3 पर एफडीजी इंजेक्शन के लिए, अपवाद के साथ कि 100μL में 6-8 MBq की कुल गतिविधि एकाग्रता को पीईटी स्कैन की शुरुआत से पहले 60 मिनट के अपटेक के साथ इंजेक्ट किया जाता है।
- निम्नसूत्र 11 का उपयोग करके इंजेक्शन [18एफ] एफएमआईएसओ या [18एफ] एफडीजी गतिविधि की गणना करें:
इंजेक्शन गतिविधि (एमबीक्यू) = इंजेक्शन से पहले सिरिंज में गतिविधि - इंजेक्शन के बाद सिरिंज में गतिविधि
5. पीईटी / एमआर अधिग्रहण
- निर्धारित पीईटी स्कैन से पहले माउस इमेजिंग बिस्तर को गर्म करने के लिए एयर हीटर चालू करें। एक प्रेरण कक्ष में माउस को एनेस्थेटाइज करने के लिए 5% आइसोफ्लुरेन (1 एल / मिन मेडिकल ओ2) का उपयोग करें।
- एक बार पैर की अंगुली-चुटकी प्रतिक्रिया का उपयोग करके ठीक से एनेस्थेटाइज्ड और चेक किया जाता है, तो सावधानीपूर्वक और तुरंत माउस को हीटिंग बेड पर स्थानांतरित करें और 2% -2.5% आइसोफ्लुरेन पर संज्ञाहरण बनाए रखें। माउस सिर-प्रवण को काटने की पट्टी पर रखें और सूखने और कॉर्नियल अल्सर के संभावित गठन से बचने के लिए दोनों आंखों पर आंख स्नेहक लागू करें। बिस्तर के आसपास के तापमान को बनाए रखने के लिए इमेजिंग बेड को प्लास्टिक शीट के साथ कवर करें।
- क्रमशः इन-हाउस रेस्पिरेटरी पैड और थर्मल जांच का उपयोग करके माउस की श्वसन दर और शरीर के तापमान की निगरानी और रिकॉर्ड करें। सुनिश्चित करें कि माउस के शरीर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है, जबकि श्वसन दर आइसोफ्लुरेन स्तर को समायोजित करके 40-50 सांस प्रति मिनट (बीपीएम) की सीमा में रखी जाती है।
- स्कैनर के अंदर माउस की स्थिति का पता लगाने के लिए एक स्काउट दृश्य निष्पादित करें। एमआर के केंद्र एफओवी में स्थित धड़ क्षेत्र के साथ, पूरे माउस शरीर को कवर करने के लिए माउस बेड की स्थिति को समायोजित करें।
- पीईटी स्कैन शुरू करने के लिए, अध्ययन सूची विंडो में पीईटी अधिग्रहण का चयन करें, फिर स्काउट दृश्य से पूर्व-निर्धारित माउस बेड स्थिति का उपयोग करने के लिए पिछले अधिग्रहण पर स्कैन रेंज चुनें। माउस बेड को स्वचालित रूप से एमआर से पीईटी में ले जाने और अधिग्रहण शुरू करने के लिए तैयार > ओके पर क्लिक करें।
- रेडियोफार्मास्युटिकल एडिटर के तहत, उपयुक्त रेडियोन्यूक्लाइड का चयन करें, फिर चरण 4.3 में मापा गयाइंजेक्शन खुराक और समय से पहले और बाद का विवरणदर्ज करें। और चरण 4.4। विषय जानकारी मेनू के तहत माउस का वजन दर्ज करें।
- पीईटी स्कैन के पूरा होने पर एमआर अधिग्रहण के साथ आगे बढ़ें। ऐसा करने के लिए, माउस को पीईटी से एमआर में ले जाने के लिए तैयार करें का चयन करें। जारी रखने के लिए ठीक क्लिक करें.
- एक बार सभी स्कैन पूरा हो जाने के बाद, इमेजिंग बेड को वापस डिफ़ॉल्ट स्थिति में ले जाने के लिए होम का चयन करें।
- एनेस्थीसिया बंद करें और मेडिकल ओ2 के साथ इमेजिंग बेड को फ्लश करें। माउस पेडल वापसी रिफ्लेक्स की जांच करें। एनेस्थीसिया से वसूली में सहायता करने और राइटिंग रिफ्लेक्स को पुनः प्राप्त करने में सहायता के लिए माउस को इमेजिंग बेड से वापस हीटिंग पैड के शीर्ष पर रखे गए एक साफ आवास पिंजरे में स्थानांतरित करें।
- रॉ स्कैन के तहत, पीईटी पुनर्निर्माण के लिए अधिग्रहित कच्चे पीईटी डेटा को लोड करने के लिए पीईटी अधिग्रहण का चयन करें। सामग्री मानचित्र के रूप में उपयोग के लिए MM का चयन करें. चरण 3.6 में वर्णित पैरामीटर का उपयोग करके पीईटी पुनर्निर्माण के साथ आगे बढ़ें।
- पीईटी इमेजिंग अध्ययन के बाद चूहों को संभालते समय स्थानीय और संस्थागत दिशानिर्देशों का सख्ती से पालन करें। सभी उपयोग किए जाने वाले उपभोग्य पदार्थों, जैसे, सिरिंज, सुइयों, दस्ताने, वाइप्स और जैविक अपशिष्ट, जैसे, पिंजरे बिस्तर और फेकल पदार्थ का इलाज करें, जो रेडियोधर्मी कचरे के रूप में माउस के सीधे संपर्क में रहे हैं, और स्थानीय नियमों के अनुसार देखभाल के साथ संभालते हैं।
6. पीईटी छवि विश्लेषण
- छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिका देखें), और पीईटी और एमआर छवियों को खोलने के लिए लोड DICOM डेटा का चयन करें।
- संबंधित पीईटी और एमआर छवियों को सॉफ़्टवेयर डिस्प्ले विंडो में खींचें, और परिणामस्वरूप पीईटी और एमआर छवियों के स्वचालित सह-पंजीकरण करने के लिए स्वचालित पंजीकरण का चयन करें।
- पंजीकरण सेटअप मेनू के तहत, कठोर परिवर्तन का चयन करें। रिजिड/एफिन मेनू में शिफ्ट और रोटेशन का उपयोग करें।
- वैश्विक भूमिका चयन मेनू के तहत, संदर्भ के रूप में एमएम और रेसलिस के रूप में स्टेटिक पीईटी स्कैन पर क्लिक करें।
- उचित संरेखण सुनिश्चित करने के लिए सह-पंजीकृत पीईटी / एमआर छवियों का निरीक्षण करें। यदि आवश्यक हो, तो छवियों को मैन्युअल रूप से समायोजित करने के लिए मैन्युअल पंजीकरण का उपयोग करें।
- एमआर छवि का उपयोग करके यकृत में ऑर्थोटोपिक ट्यूमर का पता लगाएं। संदर्भ के लिए एमआर छवि का उपयोग करके, ट्यूमर पर वीओआई खींचने के लिए इंटरपोलेटेड एलिप्स आरओआई का उपयोग करें। बनाए गए ट्यूमर वीओआई को एमआर से पीईटी छवि में स्थानांतरित करें। VOI बॉर्डर स्लाइड-बाय-स्लाइड को सावधानीपूर्वक परिभाषित करने के लिए ब्रश टूल और इरेज़र टूल का चयन करें। पीईटी छवि पर यकृत से रेडियोधर्मिता के स्पिलओवर से बचना सुनिश्चित करें।
- एक संदर्भ अंग के रूप में यकृत पर3 मिमी 3 वीओआई बनाने के लिए दीर्घवृत्त वीओआई का उपयोग करें। एक गाइड के रूप में एमआर छवि का उपयोग करके दृश्य यकृत संवहनी और पित्त संरचनाओं के क्षेत्रों से बचना सुनिश्चित करें।
- सभी तैयार किए गए वीओआई का नाम बदलने के लिए ROI तालिका दिखाएँ का चयन करें. स्प्रेडशीट में सभी आवश्यक डेटा रिकॉर्ड करें, जैसे, रेडियोधर्मिता (kBq / mL) और ट्यूमर वॉल्यूम (mm3)। वीओआई चित्रों की एक प्रति सहेजें और पूरा होने पर कच्चे और पुनर्निर्मित इमेजिंग डेटा दोनों को बाहरी हार्ड ड्राइव पर संग्रहीत करें।
- निम्नलिखित समीकरण11 का उपयोग करके सभी वीओआई के लिए मानकीकृत अपटेक वैल्यू (एसयूवी) की गणना करें:
एसयूवी = सीपीईटी (टी)/(आईडी/बीडब्ल्यू)
जहां सीपीईटी (टी) वीओआई में मापा गतिविधि है, आईडी केबीक्यू में मापा गया इंजेक्शन खुराक है, और बीडब्ल्यू 1 ग्राम / एमएल के ऊतक घनत्व को मानते हुए किलोग्राम में माउस शरीर का वजन है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
क्रमिक ऑर्थोटोपिक आरोपण के लिए एक उपयुक्त ट्यूमर ब्लॉक प्राप्त करने के लिए, स्थिर क्लोन पहली बार नग्न चूहों के निचले फ्लैंक में डीपीबीएस (एमएचसीसी 97 एल कोशिकाओं सहित) में सेल निलंबन के 200 μL के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न किए गए थे (चित्रा 1 ए)। ट्यूमर के विकास की निगरानी की गई और, जब ट्यूमर का आकार 800-1000 मिमी3 (इंजेक्शन के बाद लगभग 4 सप्ताह) तक पहुंच गया, तो चूहों को इच्छामृत्यु दी गई, और परिणामस्वरूप ट्यूमर ब्लॉक को नग्न चूहों (एन = 6) के एक और बैच में बाद के यकृत ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के लिए लगभग 1 मिमी3 टुकड़ों में काट दिया गया। चूहों को दो समूहों में यादृच्छिक किया गया था: नियंत्रण (सी 1, एन = 3) और यकृत धमनी बंधाव (एच 2, एन = 3)। एचएएल को यकृत धमनी की मुख्य शाखा के चारों ओर एक बारीक धागा बांधकर किया गया था। ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण से पहले सी 1 चूहों को एचएएल से बचाया गया था। इस हेरफेर ने एच 2 में ट्यूमर हाइपोक्सिया का नेतृत्व किया, लेकिन सी 1 चूहों में नहीं, और ट्यूमर हाइपोक्सिक स्थिति को पीईटी हाइपोक्सिक ट्रेसर [18एफ] एफएमआईएसओ का उपयोग करके गैर-आक्रामक रूप से निगरानी की जा सकती है। पीईटी / एमआर अध्ययनों से पता चला है कि ट्यूमर [18एफ] एफएमआईएसओ अपटेक में वृद्धि केवल एच 2 चूहों में देखी गई थी, जबकि ग्लाइकोलाइटिक मार्कर [18एफ] एफडीजी का उपयोग करके, ट्यूमर अपटेक दो समूहों के बीच समान रहा (चित्रा 1 बी)।
ट्यूमर में एचएएल-प्रेरित हाइपोक्सिया को एचआईएफ -1 -12 के अभिव्यक्ति स्तरों की जांच करके आगे मान्य किया गया था, और समूहों के बीच तुलना की गई थी। एचएएल के बाद अधिक हाइपोक्सिक ट्यूमर के अनुरूप, एच 2 समूह ने सी 1 समूह (ऑप्टिकल घनत्व: 0.17 बनाम 0.13, एच 2 बनाम सी 1, क्रमशः) की तुलना में उच्च एचआईएफ -1 अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया, जो उनके ट्यूमर [18एफ] एफएमआईएसओ अपटेक (चित्रा 2 ए) के साथ पुष्टि करता है। [18एफ] एसयूवी-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके एफएमआईएसओ अपटेक की मात्रा निर्धारित की गई थी। एच 2 ट्यूमर ने सी 1 ट्यूमर (एसयूवीअधिकतम: 1.2 बनाम 2.8, क्रमशः, चित्रा 2 बी) की तुलना में एफएमआईएसओ अपटेक में 2.3 गुना वृद्धि दिखाई। इसी तरह, एचएएल के परिणामस्वरूप सी 1 चूहों (चित्रा 2 सी) की तुलना में एच 2 में उच्च यकृत एसयूवी अपटेक हुआ। एक साथ लिया गया, हम यहां दिखाते हैं कि एचएएल एचसीसी ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट्स में ट्यूमर हाइपोक्सिया को प्रभावी ढंग से प्रेरित कर सकता है, और ट्यूमर हाइपोक्सिया को एक्स विवो इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री मार्कर एचआईएफ -1 एक्स अभिव्यक्ति द्वारा समर्थित [18एफ] एफएमआईएसओ पीईटी इमेजिंग का उपयोग करके गैर-आक्रामक रूप से निगरानी की जा सकती है। इसके अलावा, एमआर इमेजिंग का समावेश यकृत से ट्यूमर के स्पष्ट चित्रण को सक्षम करने के लिए एक उत्कृष्ट नरम ऊतक कंट्रास्ट प्रदान करता है, जिससे सटीक पीईटी परिमाणीकरण संभव हो जाता है।
चित्रा 1: ऑर्थोटोपिक एचसीसी चूहों के विवो पीईटी / एमआर इमेजिंग में जेनोग्राफ्ट्स। (ए) ऑर्थोटोपिक एमएचसीसी 97 एल ट्यूमर में चमड़े के नीचे और ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट कृतियों और पीईटी इमेजिंग अध्ययनों का योजनाबद्ध। (बी) एचएएल के साथ ऑर्थोटोपिक एमएचसीसी 97 एल ट्यूमर (सी 1) या (एच 2) वाले चूहों में [18एफ] एफएमआईएसओ और [18 एफ] एफडीजी के प्रतिनिधि अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) पीईटी छवियां। नीले घेरे ट्यूमर के स्थान का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
(ए) प्रतिनिधि सह-पंजीकृत [18एफ] एफएमआईएसओ पीईटी / एमआर छवियां, एचआईएफ -1 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला, और ट्यूमर वर्गों में हेमटोक्सिलिन और ईओसिन (एचई)। (बी-सी) ट्यूमर और यकृत में एफएमआईएसओअपटेक का मात्रात्मक विश्लेषण। प्रत्येक समूह के लिए N = 3 एसयूवी के मूल्यों को माध्य ± मानक त्रुटि (एसईएम) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस अध्ययन में, हमने चमड़े के नीचे के ट्यूमर का उपयोग करके यकृत ऑर्थोटोपिक एचसीसी जेनोग्राफ्ट्स पर एचएएल करने की प्रक्रियाओं का वर्णन किया, साथ ही [18 एफ] एफएमआईएसओ और [18एफ] एफडीजी पीईटी / एमआर का उपयोग करके ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट्स में ट्यूमर हाइपोक्सिया की गैर-इनवेसिव निगरानी के तरीकों का वर्णन किया। हमारी रुचि प्रारंभिक निदान और उपचार प्रतिक्रिया मूल्यांकन 11,13,14,15 के लिए विभिन्न कैंसर और रोग मॉडल के चयापचय इमेजिंग में निहित है। आज तक, एचएएल एचसीसी जेनोग्राफ्ट्स और उनके विवो ट्यूमर चयापचय के निर्माण को साहित्य में शायद ही कभी वर्णित किया गया है, जिसने हमें पीईटी इमेजिंग का उपयोग करके इन ट्यूमर मॉडल की चयापचय विशेषताओं की जांच करने के लिए प्रेरित किया।
एचसीसी में हाइपोक्सिया का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत चूहों के मॉडल के रूप में एचएएल के साथ ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट्स की सफल स्थापना विवो में एचसीसी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू का प्रतिनिधित्व करती है। हाइपोक्सिया कैंसर घातकता को उत्तेजित करने के लिए जाना जाता है। इसके अलावा, इंट्रा-ट्यूमरल हाइपोक्सिया को बढ़े हुए प्रसार, मेटास्टेसिस और रेडियो- और केमोरेसिस्टेंस के साथ जोड़ा गया है औरहाइपोक्सिक स्थितियों की प्रतिक्रिया के गहन लक्षण वर्णन की आवश्यकता है। जबकि चमड़े के नीचे के जेनोग्राफ्ट्स का उपयोग अक्सर एचसीसी ट्यूमरजेनिसिस या उपचार रणनीतियों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, ऑर्थोटोपिक मॉडल मानव एचसीसी विकास को बेहतर ढंग से पुन: परिभाषित कर सकते हैं क्योंकि वे ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को अधिक सटीक रूप से दर्शाते हैं, विशेष रूप से एचसीसी मेटास्टेसिस12 की ओर वैस्कुलराइजेशन और ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन पर प्रभाव। एचसीसी ऑर्थोटोपिक चूहों में एचएएल का समावेश ट्यूमर 7 में यकृत धमनी खूनी आपूर्ति को अवरुद्ध करके इंट्रा-ट्यूमरल हाइपोक्सिया के प्रेरण की अनुमतिदेता है। इस तरह के पशु मॉडल एचसीसी पर एचएएल के प्रभावों को अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने और एचसीसी में हाइपोक्सिया मार्ग को लक्षित करने वाले प्रभावी चिकित्सीय के लिए नए रास्ते बनाने में सक्षम बनाते हैं। ऑर्थोटोपिक आरोपण के लिए, हमने एचसीसी सेल निलंबन के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के बजाय चमड़े के नीचे के ट्यूमर से ट्यूमर क्यूब का उपयोग किया। हमने पाया है कि प्रत्यक्ष सेल इंजेक्शन अक्सर इंजेक्शन साइट से रिसाव की एक छोटी मात्रा का कारण बनता है, भले ही प्रक्रिया को कम इंजेक्शन की मात्रा के साथ यथासंभव धीरे-धीरे किया गया हो। यह संभावित रूप से पेरिटोनियल मेटास्टेसिस का कारण बन सकता है, जो पशु कल्याण के लिए हानिकारक है, अंततः समग्र अध्ययन परिणाम को प्रभावित करता है। दूसरी ओर, एक छोटे ट्यूमर ब्लॉक का आरोपण इस मुद्दे को दूर करेगा, हालांकि यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि प्रत्यारोपण के बाद ट्यूमर सुरक्षित रूप से झुका हुआ है। चमड़े के नीचे के ट्यूमर ब्लॉक से छोटे ट्यूमर क्यूब्स को अलग करते समय, ठोस ट्यूमर के मुख्य क्षेत्रों से बचने की भी सलाह दी जाती है, जो हाइपोक्सिया और पोषक तत्वों की कमी के कारण अपेक्षाकृत कम संवहनी और अधिक चयापचय रूप से तनावग्रस्त होते हैं। ऐसा करने से मृत ट्यूमर कोशिकाओं का समावेश कम हो जाएगा जो छोटे ट्यूमर क्यूब के भीतर नेक्रोटिक प्रतीत होते हैं और व्यक्तिगत चूहों में अधिक सुसंगत ट्यूमर विकास दर बनाए रखेंगे।
हाइपोक्सिया कैंसर प्रतिरोध का एक पूर्वानुमान कारक है, और पीईटी का उपयोग करके हाइपोक्सिया में परिवर्तन की निगरानी उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता में हाइपोक्सिक ऊतकों का पता लगाने और परिमाणीकरण की अनुमति देती है। एफएमआईएसओ और एफडीजीपीईटी के लिए एक महत्वपूर्ण विचार में चूहों में रेडियोट्रेसर अपटेक समय और प्रशासन का मार्ग शामिल है। दोनों रेडियोट्रेसर्स विवो फार्माकोकाइनेटिक्स में अलग-अलग हैं, एक शारीरिक उत्थान अंतर है, जो क्रमशः आंत / मूत्राशय और हृदय / मूत्राशय में [18एफ] एफएमआईएसओ और [18एफ] एफडीजी के लिए देखा जाता है, और दूसरा यह है कि एफएमआईएसओ ट्यूमर के हाइपोक्सिक क्षेत्र में जमा होता है, और [18एफ] एफडीजी अधिमानतः उच्च चयापचय ट्यूमर क्षेत्र16 में लिया जाता है। एफएमआईएसओकी उच्च लिपोफिलिसिटी और धीमी हेपेटिक निकासी को एक अच्छा ट्यूमर-टू-लिवर कंट्रास्ट प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन के बाद 2-4 घंटे के समय की आवश्यकता होतीहै। हमने पाया कि हाइपोक्सिक (एच 2) और नियंत्रण (सी 1) दोनों समूहों के लिए यकृत से ट्यूमर [18एफ] एफएमआईएसओ अपटेक को अलग करने और चित्रित करने के लिए 3 एच पोस्ट इंजेक्शन पर्याप्त है। [18एफ] एफडीजी पीईटी के मामले में, इंजेक्शन के बाद का 1 घंटे का समय अच्छा कंट्रास्ट देने के लिए पर्याप्त है, जैसा कि पहलेवर्णित 13,15 था, और इस अध्ययन में नियोजित किया गया था। फिर भी, पीईटी परिणामों की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए एक सुसंगत रेडियोट्रेसर अपटेक समय रखना अनिवार्य है, खासकर एसयूवी-आधारित विश्लेषणों के लिए। यहां, हमने चूहों को रेडियोट्रेसर का प्रशासन करने के लिए अंतःशिरा तकनीकों का उपयोग किया। सफल पूंछ नस इंजेक्शन को रेडियोट्रैसर जलसेक से पहले एक दृश्य रक्त फ्लैशबैक द्वारा इंगित किया जाता है, जहां सुई को नस के भीतर सटीक रूप से तैनात किया जाता है। इस विधि का एक बड़ा दोष यह है कि चूहों के बीच देखी गई परिवर्तनशीलता के साथ हाइपोटेंशन के कारण अपेक्षित रक्त फ्लैशबैक का निरीक्षण करना मुश्किल हो सकता है। फिर भी, सुई डालने से पहले 1-2 मिनट की छोटी अवधि के लिए पूंछ को गर्म करके इस तरह की कठिनाई को दूर किया जा सकता है, या तो गर्म वॉशक्लॉथ के साथ या गर्मी लैंप के साथ रक्त प्रवाह को बढ़ाने और सफल इंजेक्शन के लिए नस दृश्यता में सुधार करने के लिए।
छोटे जानवरों में रेडियोट्रैसर बायोडिस्ट्रीब्यूशन को मापने के लिए पीईटी इमेजिंग के बढ़ते उपयोग के साथ, ध्यान देने योग्य एक महत्वपूर्ण विचार अच्छे, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मात्रात्मक पीईटी डेटा प्राप्त करने के लिए एक सटीक और अच्छी तरह से कैलिब्रेटेड पीईटी स्कैनर का उपयोग है। एक सटीक पीईटी प्रणाली इमेजिंग अध्ययन को अधिक समय-कुशल और लागत प्रभावी तरीके से करने की अनुमति देती है और पशु अनुसंधान में 3 आर सिद्धांतों (प्रतिस्थापन, कमी और शोधन) के कार्यान्वयन को सक्षम बनाती है। उस कारण से, निर्माता की सिफारिश के अनुसार इमेजिंग सिस्टम के पीईटी और एमआर घटकों की जांच करने के लिए नियमित गुणवत्ता नियंत्रण निरीक्षण किया जाना चाहिए, अधिमानतः साप्ताहिक आधार पर। विशेष रूप से, पीईटी गतिविधि के लिए सटीकता की जांच की जानी चाहिए और पीईटी परिमाणीकरण की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग प्रयोग की शुरुआत से पहले, साथ ही साथ इमेजिंग प्रयोग की शुरुआत से पहले। सार्थक और तुलनीय परिणाम उत्पन्न करने के लिए परीक्षा अवधि में ट्यूमर और ऊतकों के मात्रात्मक मूल्यांकन से जुड़े किसी भी अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए यह अनिवार्य है। सिस्टम के अंशांकन की आवश्यकता होती है जब पीईटी गतिविधि सटीकता अनुशंसित सीमा से बाहर पाई जाती है, साथ ही जब पीईटी और एमआर छवियों का गलत संरेखण खोजा जाता है।
यद्यपि यहां वर्णित तकनीकें विवो जांच की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए हाइपोक्सिक एचसीसी जेनोग्राफ्ट्स के पीईटी इमेजिंग को सक्षम करती हैं, इन प्रोटोकॉल के उपयोग पर विचार करते समय कुछ सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। एचएएल एचसीसी जेनोग्राफ्ट्स का निर्माण 6-8 सप्ताह के इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों पर प्रदर्शन करने के लिए एक जटिल इंट्रा-एब्डोमिनल सर्जिकल प्रक्रिया है। इसके अलावा, इन युवा चूहों में मंद यकृत धमनी का पता लगाना मुश्किल हो सकता है, जिससे बंधाव प्रक्रिया तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो जाती है। इन प्रक्रियाओं को सर्जरी उत्तराधिकार दर में सुधार करने के लिए उपयुक्त रूप से प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है, साथ ही समय की अवधि में चूहों के अस्तित्व की आवश्यकता होती है, यानी, जेनोग्राफ्ट्स बनने से 4-6 सप्ताह पहले, जबकि सर्जरी की अवधि के दौरान व्यापक पशु देखभाल का प्रावधान अपेक्षित है, जो समय और संसाधन-गहन दोनों हैं। यह भी अनुमान लगाया गया है कि इस विधि का उपयोग करके ऑर्थोटोपिक एचसीसी जेनोग्राफ्ट्स के निर्माण में सफल पीईटी इमेजिंग से पहले लगभग 8 सप्ताह की आवश्यकता होगी, क्योंकि पेरिटोनियल मेटास्टेसिस से बचने के लिए सेल सस्पेंशन के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के बजाय ट्यूमर क्यूब के आरोपण का उपयोग किया जाता है। फिर भी, इन सीमाओं को अनुसंधान कर्मचारियों की पर्याप्त योजना और प्रशिक्षण के साथ दूर किया जा सकता है। इसके अलावा, यहां रिपोर्ट किए गए प्रयोगात्मक समूहों का नमूना आकार छोटा है, जो सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। हालांकि, हमारे अवलोकन व्यक्तिपरक रूप से एक प्रवृत्ति को प्रकट करते हैं जहां एचएएल-प्रेरित हाइपोक्सिया को सी 1 समूह की तुलना में एच 2 में ट्यूमर और यकृत दोनों में मापा गया था, जो एच 2 ट्यूमर नमूनों में अधिक प्रमुख एचआईएफ -1+ धुंधला होने द्वारा समर्थित है। हम वर्तमान में अन्य मानव एचसीसी सेल लाइनों के साथ ट्यूमर मॉडल का विस्तार करने पर काम कर रहे हैं। इसके अलावा, इन जेनोग्राफ्ट्स से जुड़े एचसीसी में हाइपोक्सिया मार्ग को लक्षित करने वाले चिकित्सीय अध्ययन चल रहे हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम छोटे पशु इमेजिंग प्रयोगों के लिए हांगकांग एंटीकैंसर ट्रस्ट फंड, हांगकांग रिसर्च ग्रांट्स काउंसिल सहयोगी अनुसंधान कोष (सीआरएफ सी 7018-14 ई) के समर्थन को स्वीकार करते हैं। हम [18एफ] एफएमआईएसओ और [18एफ] एफडीजी के प्रावधान के लिए हांगकांग विश्वविद्यालय में आणविक इमेजिंग और मेडिकल साइक्लोट्रॉन सेंटर (एमआईएमसीसी) के समर्थन का भी धन्यवाद करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
