Summary
Her præsenterer vi en protokol til oprettelse af ortotopiske hepatocellulære carcinomxenotransplantater med og uden leverarterieligering og udfører ikke-invasiv positronemissionstomografi (PET) billeddannelse af tumorhypoxi ved hjælp af [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) og [18 F] fluorodeoxyglucose ([18F] FDG).
Abstract
Prækliniske eksperimentelle modeller af hepatocellulært carcinom (HCC), der rekapitulerer menneskelig sygdom, repræsenterer et vigtigt redskab til at studere tumorigenese og evaluere nye terapeutiske tilgange. Ikke-invasiv helkropsbilleddannelse ved hjælp af positronemissionstomografi (PET) giver kritisk indsigt i vævets in vivo-egenskaber på molekylært niveau i realtid. Vi præsenterer her en protokol for ortotopisk HCC-xenograftdannelse med og uden leverarterieligering (HAL) for at inducere tumorhypoxi og vurderingen af deres tumormetabolisme in vivo ved anvendelse af [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) og [18 F] Fluorodeoxyglucose ([18F] FDG) PET / magnetisk resonans (MR) billeddannelse. Tumorhypoxi kunne let visualiseres ved hjælp af hypoxi-markøren [18 F] FMISO, og det blev fundet, at [18 F] FMISO-optagelsen var højere hos HCC-mus, der gennemgik HAL end i ikke-HAL-gruppen, mens [18F] FDG ikke kunne skelne tumorhypoxi mellem de to grupper. HAL-tumorer viste også et højere niveau af hypoxi-inducerbar faktor (HIF)-1α-ekspression som reaktion på hypoxi. Kvantificering af HAL-tumorer viste en 2,3 gange stigning i [18F] FMISO-optagelse baseret på den standardiserede værdioptagelsesmetode (SUV).
Introduction
Hepatocellulært karcinom (HCC) er den sjette mest diagnosticerede kræft og den tredje mest almindelige dødsårsag fra kræft på verdensplan med mere end 900,000 nye tilfælde og 800,000 dødsfald i 20201. Den største risikofaktor er skrumpelever, der opstår som følge af virusinfektioner (hepatitis B- og C-vira), alkoholmisbrug, diabetes og ikke-alkoholisk steatohepatitis2. Håndteringen af HCC er ret kompleks, og flere behandlingsmuligheder er tilgængelige, herunder kirurgisk resektion, termisk eller kemisk ablation, transplantation, transarteriel kemoembolisering, stråling og kemoterapi, afhængigt af sygdomsstadiet 2,3. HCC er en kemoterapi-ildfast tumor med sygdomstilbagefald hos op til 70% af patienterne efter helbredende hensigtterapi 2.
På trods af den høje grad af tumorheterogenitet er HCC forbundet med to almindelige resultater: (i) HCC er meget hypoxisk, og (ii) tumorhypoxi er forbundet med større tumoraggressivitet og behandlingssvigt. Den ukontrollerede spredning af HCC-celler resulterer i et højt iltforbrug, der går forud for vaskularisering, hvilket skaber et hypoxisk mikromiljø. Lave intratumorale iltniveauer udløser derefter en række biologiske reaktioner, der påvirker tumoraggressivitet og behandlingsrespons. Hypoxi-inducerbare faktorer (HIF'er) anerkendes ofte som de væsentlige transkriptionelle regulatorer som reaktion på hypoxi 2,3. Derfor er evnen til at detektere hypoxi afgørende for at visualisere neoplastisk væv og identificere de utilgængelige steder, som kræver invasive procedurer. Det hjælper også til bedre at forstå de molekylære ændringer, der fører til tumoraggressivitet og forbedrer patientbehandlingsresultaterne.
Molekylær billeddannelse ved hjælp af positronemissionstomografi (PET) anvendes almindeligvis til diagnosticering og iscenesættelse af mange kræftformer, herunder HCC. Navnlig kan kombineret anvendelse af dobbeltsporet PET-billeddannelse, der involverer [18 F]fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) og [11C]acetat, øge den samlede følsomhed ved HCC-diagnose 4,5 betydeligt. Billeddannelse af hypoxi kan derimod opnås ved anvendelse af den almindeligt anvendte hypoxiske markør [18 F]Fluoromisonidazol ([18F]FMISO). I klinisk praksis er den ikke-invasive vurdering af hypoxi vigtig for at skelne mellem forskellige typer tumorer og regioner til planlægning af strålebehandling6.
Præklinisk billeddannelse er blevet et uundværligt værktøj til ikke-invasiv og langsgående evaluering af musemodeller for forskellige sygdomme. En robust og meget reproducerbar HCC-model udgør en vigtig platform for præklinisk og translationel forskning i patofysiologien af humant HCC og vurdering af nye terapier. Sammen med PET-billeddannelse kan in vivo-adfærd belyses for at give vigtig indsigt på molekylært niveau for et givet tidspunkt. Her beskriver vi en protokol til generering af hepatisk arterieligering (HAL) ortopisk HCC-xenotransplantater og analyse af deres in vivo tumormetabolisme ved hjælp af [18 F] FMISO og [18F] FDG PET / MR. Inkorporeringen af HAL gør en passende model af transgene eller kemisk inducerede HCC-mus xenotransplantater til at studere tumorhypoxxi in vivo, da HAL effektivt kan blokere arteriel blodforsyning for at inducere intratumoral hypoxi 7,8. I modsætning til ex vivo immunhistokemisk farvning ved anvendelse af pimonidazol kan ændringer i tumormetabolisme som følge af hypoxi desuden let visualiseres og nøjagtigt kvantificeres ikke-invasivt ved hjælp af PET-billeddannelse, hvilket muliggør langsgående vurdering af behandlingsrespons eller måling af fremkomsten af resistens 3,7,8 . Vores metode, der er vist her, gør det muligt at skabe en robust hypoxisk HCC-model sammen med ikke-invasiv overvågning af tumorhypoxi ved hjælp af PET/MR-billeddannelse til at studere HCC-biologi in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Udvalget for Anvendelse af Levende Dyr i Undervisning og Forskning (CULATR) i Center for Komparativ Medicinsk Forskning (CCMR) ved University of Hong Kong, et program akkrediteret af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). De dyr, der blev anvendt i undersøgelsen, var hunmus med BALB/cAnN-nu (Nøgen) i alderen 6-8 uger, vægtet ved 20 g ± 2 g. Mad og vand blev leveret ad libitum.
1. Subkutan injektion af humane hepatocellulære carcinomcellelinjer
BEMÆRK: MHCC97 er en human HCC-cellelinje, der bruges til at generere den subkutane HCC-xenograftmodel. MHCC97L-celler fås fra Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital ved Fudan University, Shanghai, Folkerepublikken Kina9 og godkendes ved kort tandemgentagelse (STR) profilering.
- Kultur MHCC97L-celler og vedligehold i dyrkningsmedier suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin og streptomycin i en T-75-cellekulturkolbe ved 37 °C i en befugtet inkubator forsynet med 5% CO2 (se materialetabel). Skift kulturmediet hver 2. dag og høst cellerne ved 80% -90% sammenløb.
BEMÆRK: Startcellenummeret er 1,5 x 10 6 celler, og cellerne bruges inden for6-8 passager. - Kulturmediet og trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (trypsin-EDTA) opbevares mørkt ved 4 °C indtil brug. Forvarm kulturmediet til 37 °C og trypsin-EDTA til stuetemperatur før brug. Se materialetabellen for alle reagenser og forbrugsvarer, der anvendes i dette afsnit.
- Fjern kulturmediet. Skyl cellelaget med 10 ml sterilt fosfatbufret saltvand (DPBS, se materialetabel).
- Der tilsættes 5 ml trypsin-EDTA til dyrkningskolben og inkuberes cellerne ved 37 °C. Kontroller cellerne under et omvendt mikroskop ved 20x forstørrelse (se materialetabel), indtil cellelaget er spredt og helt løsnet fra kolben. Sørg for, at cellerne ikke efterlades i trypsin-EDTA i mere end 15 minutter.
- Tilsæt 5 ml kulturmedier til kulturkolben. Opsug cellerne ved at pipettere forsigtigt. Overfør cellesuspensionen til et centrifugeglas og drej ved 1.107 x g i 5 minutter (se materialetabel).
- Supernatanten fjernes og opslæmmes forsigtigt cellepillen med 1 ml PBS. Pipetten pipetteres grundigt for at opnå en enkeltcellesuspension. Bestem cellenummeret ved hjælp af den automatiske celletæller (se materialetabel), og forbered cellesuspensionen til en koncentration på 5 x 106 celler/ml i PBS.
- Træk 200 μL cellesuspension op med en 25 G kanyle i en 1 ml sprøjte. Hver sprøjte indeholder 1 x 106 MHCC97L-celler (i 200 μL). Opbevar sprøjten på våd is.
- Bedøv musen med en intraperitoneal (i.p.) injektion af en blanding af ketamin (87,5 mg / kg) og xylazin (12,5 mg / kg). Sørg for korrekt anæstesi ved hjælp af tåklemmerefleksen. Sørg for at anvende øjensmøremiddel på musen for at forhindre udtørring og potentiel dannelse af hornhindesår. Placer musen i liggende stilling på en steril pude (se Materialetabel).
- Steriliser dorsalområdet nær musens nedre flanke (enten venstre eller højre side) med 70% ethanol (se materialetabel). Løft huden op med pincet og stik forsigtigt kanylen under huden.
- Før nålen 4-5 mm langs det subkutane plan fra punkteringsstedet for at undgå utilsigtet lækage af cellesuspensionen fra injektionsstedet, når nålen trækkes ud. Sørg for, at nålen ikke er for dybt under huden, da det kan forårsage utilsigtet organskade.
- Slip tangen og udlad forsigtigt og langsomt indholdet af sprøjten, pas på ikke at trænge ind i den modsatte side. Træk kanylen ud for at kontrollere, om injektionen svulmer op. Placer musen tilbage i buret, der sidder oven på en forvarmet varmepude for at hjælpe med genopretning fra anæstesien og for at genvinde mobiliteten. Fortsæt med at overvåge musen, indtil musen er helt vågen og opretholder brystliggende.
- Overvåg tumorvækst og trivsel hos musen ugentligt. Mål tumorvolumen (V) ved hjælp af en tykkelse (se materialetabel). Beregn og registrer tumorvolumenet ved hjælp af følgende formel10:
V = (B 2× L)/2
hvor W er bredden og L er tumorens længde. - Mellem 4-6 uger efter injektion skal du kontrollere, at der opnås en betydelig størrelse subkutan tumor, mellem 800-1000 mm3. Sørg for, at den samlede tumorbelastning ikke overstiger 10% af kropsvægten.
2. Ortopisk leverimplantation og leverarterieligering
- Forbered følgende kirurgiske reagenser og værktøjer i et desinficeret biologisk sikkerhedsskab: 10 ml kulturmedier i en skål, 10% povidon-jodopløsning, 70% ethanol, autoklaverede kirurgiske instrumenter, dvs. skarp saks, fjedersaks, tang (buet fin og lige stump), nåleholder, skalpelblad, 6-0 og 5-0 nylonsutur, en varmepude.
- Autoklave alle kirurgiske instrumenter og håndter dem kun på en steril bænk. Sørg for tilstrækkelig og nødvendig præ-, intra- og postoperativ pleje til musene under de kirurgiske procedurer (se trin nedenfor).
- Til præoperativ smertelindring injiceres musen med en subkutan injektion af buprenorphin (0,1 mg/kg) mindst 30 minutter før operationens start. Til postoperativ pleje og behandling injiceres musen med en subkutan injektion af buprenorphin (0,1 mg/kg) i 3 dage kontinuerligt, en gang hver 8.-12. time. Se materialetabellen for alle reagenser og forbrugsvarer, der anvendes i dette afsnit.
- Aflive den subkutane tumorbærende mus med en IP-injektion af pentobarbital (330 mg / kg). Lav et snit på tumorstedets hud ved hjælp af et skalpelblad. Punktafgifter den subkutane tumorblok og overfør den straks til kulturmediet. Udfør dette trin så hurtigt som muligt.
- Skær tumorblokken i 1 mm3 små tumorterninger ved hjælp af skarp kirurgisk saks. Opbevar alle tumorkuberne i kulturmedierne. Undgå at bruge kerneområdet i den subkutane tumorblok.
- Bedøv musen, der skal gennemgå den efterfølgende ortopiske tumorimplantationsoperation med en IP-injektion af en blanding af ketamin (87,5 mg / kg) og xylazin (12,5 mg / kg). Sørg for, at der er gået mindst 30 minutter, efter at buprenorphin er givet, før musen bedøves. Sørg for at anvende øjensmøremiddel på musen for at undgå udtørring og potentiel dannelse af hornhindesår.
- Placer musen i liggende stilling på en steril pude, der er oven på en forvarmet varmepude. Overvåg og registrer musens fysiologiske tilstand hvert 15. minut indtil afslutningen af den kirurgiske procedure.
- Forlæng musens lemmer. Fastgør dem med tape for at maksimere eksponeringen af den ventrale mave og thorax. Steriliser hele musens abdominale hud med en 10% povidon-jodopløsning efterfulgt af 70% ethanol. Vurder musens bedøvelsesdybde ved at kontrollere, om der ikke er noget svar på tåklemning - pedaludtagningsrefleksen.
- Udfør en laparotomi ved at lave et ca. 10 mm midterlinjesnit for at få adgang til bughinden ved hjælp af en skarp saks. Klem og træk xiphoidprocessen mod hovedet med tang og påfør de subkostale retraktorer for at åbne det kirurgiske felt. Sørg for, at der foretages et korrekt snit for at muliggøre et godt kirurgisk overblik over operationsstedet.
- Træk medianen og venstre lobes opad med en våd gasbindspindel. Flyt tarmene uden for maven på venstre side af musen og dæk dem med en våd gasbindspindel. Udfør leverarterieligering (HAL) på den fælles leverarterie (CHA), der stammer fra bugspytkirtelhovedet til dets rod i leverpediklen under en forstørrelseslampe for optimeret visualisering.
- Træk medianen og venstre lapper tilbage/nedad tilbage med en våd gazespind for at blotte venstre lap. Lav et snit på ca. 2 mm i længde og dybde på overfladen af venstre lap med et sterilt skalpelblad.
BEMÆRK: Det er også muligt at bruge leverens medianlap til tumorimplantation for at minimere utilsigtede tårer eller laceration ved traumer til nærliggende abdominale organer. - Indsæt straks et tumorfragment i leversnittet med sterile tang. Begrave tumoren, så den sidder sikkert i leveren. Påfør en ottetalssutur med en 6-0 nylonsutur over snitstedet for at sikre korrekt tumorfragmentimplantation i leveren og hæmostasen. Udfør denne operation så hurtigt som muligt for at undgå overdreven blødning. Efter afslutningen lukkes mavesnittet med afbrudte 5-0 suturer.
- Placer musen tilbage i buret, der sidder oven på en forvarmet varmepude for at hjælpe med genopretning efter anæstesi og for at genvinde den oprettende refleks. Fortsæt med at overvåge og registrere musens fysiologiske tilstand hvert 15. minut, indtil musen er helt vågen og opretholder brystliggende.
- Gentag proceduren, indtil alle mus har gennemgået ortopisk tumorimplantation. Giv postoperativ pleje til alle mus ved løbende at overvåge deres fysiologiske tilstand dagligt i de næste 3 dage efter den kirurgiske operation. Giv buprenorphin (0,1 mg/kg) hver 8.-12. time.
3. Opsætning af PET/MR-kalibreringer og workflow
BEMÆRK: Billeddannelse udføres ved hjælp af et præklinisk PET/MR 3T-system (se materialetabel).
- Brug 5% isofluran (1 l / min medicinskO2) til at bedøve musen i et induktionskammer. For hver scanning skal du forsigtigt placere den bedøvede mus på et billedbehandlingsleje med kontinuerlig opvarmning; Scan først med MR (spejdervisning) som anatomisk reference for statiske [18 F] FMISO- eller [18F] FDG PET-scanninger, efterfulgt af anatomisk reference MR-billeddannelse.
- Opret en sekventiel PET/MR-billedbehandlingsarbejdsgang i softwaren (se materialetabellen) for at inkludere en statisk PET-scanning, T1-vægtet (dæmpningskorrektion) og T2-vægtet (anatomisk reference) MR-billeddannelse og PET-rekonstruktion 1 dag før den planlagte billeddannelsessession.
- For at erhverve PET skal du vælge 400-600 keV niveaudiskrimination, F-18 undersøgelsesisotop, 1-5 tilfældighedstilstand og 20 minutters scanninger.
- For at opnå T1-vægtet MR i hele kroppen skal du bruge gradientekko-3D med TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, synsfelt (FOV) = 90 mm x 60 mm, antal excitationer (NEX) = 3, 28 skiver med 0,9 mm tykkelse og voxelstørrelse = 0,375 mm 3 x 0,375 mm 3 x 0,9 mm 3.
- For at erhverve hele kroppen T2-vægtet MR skal du bruge hurtigspin ekko 2D med TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 28 skiver med 0,9 mm tykkelse, voxelstørrelse = 0,265 mm 3 x 0,268 mm 3 x 0,9 mm 3.
- For at rekonstruere PET skal du vælge Tera-Tomo (TT3D) algoritme, iterationer = 8, delmængder = 6, 1-3 tilfældighedstilstand og med forfald, dødtid, tilfældig, dæmpning og scatter korrektioner for at oprette billeder med en samlet voxelstørrelse på 0,3 mm3.
- Der udføres en PET-aktivitetstest, inden forsøget påbegyndes, for at kontrollere nøjagtigheden af PET-kvantificering11.
- Fyld en 5 ml sprøjte med 5-8 MBq [18F] FMISO fortyndet i vand eller saltvand i henhold til producentens anbefaling. Brug en dosiskalibrator til at registrere sprøjtens aktivitet (se materialetabel). Bemærk måletidspunktet.
- Tegn et volumen af interesse (VOI) på det rekonstruerede billede for at dække hele sprøjten. Sammenlign den genvundne aktivitet fra billedet med værdien opnået fra dosiskalibratoren. Fortsæt med billeddannelsesundersøgelser, når den genvundne aktivitet er nøjagtig inden for ±5%.
4. [18 F]FMISO og [18F]FDG injektion
- Få en klinisk dosis på [18F]FMISO fra leverandøren 30 minutter før billeddannelsesundersøgelsernes start. Brug passende personlige værnemidler (PPE), såsom en laboratoriefrakke, handsker, overbriller, et filmmærke og ringdosimetre, når du håndterer radioaktive materialer. Skift handsker ofte for at undgå krydskontaminering af de radioaktive stoffer.
- Anbring de radioaktive lageropløsninger i blybeholderen bag en L-blok bordskærm. En delprøve af [18F]FMISO hældes og fortyndes med steriliseret saltvand. Sørg for, at den samlede aktivitetskoncentration er 18-20 MBq i 100 μL.
- Træk [18F]FMISO op med en 1 ml sprøjte med nål (se materialetabellen). Registrer radioaktiviteten og den viste tid på dosiskalibratoren.
- Registrer musens vægt før injektionen af radiosporeren. Brug 5% isofluran (1 l / min medicinsk O2) til bedøvelse af musen, og injicer derefter forsigtigt den tilberedte [18F] FMISO via halevenen. Registrer injektionstiden og restaktiviteten af sprøjten for at tage højde for henfaldskorrektion. Sæt musen tilbage i buret i 180 minutter for at tillade [18F]FMISO-optagelse før PET-scanningen. Lad musen komme sig i 1 dag efter [18F]FMISO PET.
BEMÆRK: På trods af de meget forskellige in vivo farmakokinetiske profiler for [18 F]FMISO og [18 F]FDG er begge radiosporstoffer radioaktivt mærket med F-18, som er et PET-radionuklid med en halveringstid på 109,77min (< 2 timer). Da PET-signalet stammer fra F-18, vil halvdelen af den oprindelige injicerede radioaktivitet gå tabt hver 2. time. I dette tilfælde kan restsignalet 24 timer efter injektion ikke længere detekteres af PET-scanneren. Derudover vil afstanden på 1 dag mellem både [18 F]FMISO (dag 1) og [18 F]FDG (dag 3) injektioner muliggøre fuldstændig henfald af [18 F]FMISO, når [18 F]FDG PET udføres, og derfor ingen overlapning af [18 F]FMISO-signalet i [18F]FDG PET-scanningen. - Gentag trin 4.1.-4.4. til [18F]FDG-injektionen på dag 3 med den undtagelse, at en samlet aktivitetskoncentration på 6-8 MBq i 100 μl injiceres med en optagelse på 60 minutter, inden PET-scanningen påbegyndes.
- Den injicerede [18 F]FMISO- eller [18F]FDG-aktivitet beregnes ved hjælp af følgende formel 11:
Injiceret aktivitet (MBq) = Aktivitet i sprøjten før injektion - Aktivitet i sprøjten efter injektion
5. Erhvervelse af PET/MR
- Tænd for luftvarmeren for at opvarme musens billedbehandlingsleje før den planlagte PET-scanning. Brug 5% isofluran (1 l / min medicinskO2) til at bedøve musen i et induktionskammer.
- Når den er korrekt bedøvet og kontrolleret ved hjælp af tåklemmeresponsen, skal du forsigtigt og straks overføre musen til varmelejet og opretholde anæstesi ved 2% -2,5% isofluran. Placer musens hoved-tilbøjelige på bidestangen og påfør øjensmøremiddel på begge øjne for at undgå udtørring og den potentielle dannelse af hornhindesår. Dæk billedbehandlingslejet med et plastikark for at opretholde sengens omgivende temperatur.
- Overvåg og registrer musens respirationsfrekvens og kropstemperatur ved hjælp af henholdsvis den interne åndedrætspude og termiske sonde. Sørg for, at musens kropstemperatur holdes på 37 °C, mens respirationsfrekvensen holdes i området 40-50 vejrtrækninger pr. minut (bpm) ved at justere isofluranniveauet.
- Udfør en spejdervisning for at finde musens position inde i scanneren. Juster musesengens position, så den dækker hele musekroppen, med torsoområdet placeret i midten af FOV på MR.
- Hvis du vil starte en PET-scanning, skal du vælge PET-anskaffelse i undersøgelseslistevinduet og derefter vælge Scanningsområde ved forrige anskaffelse for at bruge den forudbestemte muselejeposition fra spejdervisningen. Klik på Forbered > OK for automatisk at flytte muselejet fra MR til PET og starte erhvervelsen.
- Vælg det relevante radionuklid under Radiopharmaceutical Editor, og indtast derefter oplysninger om injektionsdosis og tid før og efter injektion [18 F]FMISO eller [18F]FDG som målt i trin 4.3. og trin 4.4. Indtast musens vægt under menuen Emneoplysninger.
- Fortsæt med MR-opkøb, når PET-scanningen er afsluttet. For at gøre det skal du vælge Forbered for at flytte musen til MR fra PET. Klik på OK for at fortsætte.
- Når alle scanningerne er fuldført, skal du vælge Hjem for at flytte billedlejet tilbage til standardpositionen.
- Sluk for anæstesien og skyl billedbehandlingssengen med medicinsk O2. Kontroller musepedalens tilbagetrækningsrefleks. Overfør musen fra billedbehandlingslejet tilbage til et rent husbur placeret oven på en varmepude for at hjælpe med genopretning efter anæstesi og for at genvinde den oprettende refleks.
- Under Raw Scan skal du vælge PET-anskaffelse for at indlæse de erhvervede rå PET-data til PET-rekonstruktion. Vælg MM til brug som materialekort. Fortsæt med PET-rekonstruktion ved hjælp af parameteren som beskrevet i trin 3.6.
- Overhold nøje de lokale og institutionelle retningslinjer, når du håndterer mus efter PET-billeddannelsesundersøgelser. Behandl alle brugte forbrugsvarer, f.eks. sprøjter, kanyler, handsker, servietter og biologisk affald, f.eks. burstrøelse og fækalt stof, der har været i direkte kontakt med musen, som radioaktivt affald, og håndter forsigtigt i henhold til de lokale regler.
6. Analyse af PET-billeder
- Åbn billedanalysesoftwaren (se materialetabellen), og vælg Indlæs DICOM-data for at åbne PET- og MR-billederne.
- Træk de tilsvarende PET- og MR-billeder til softwarevisningsvinduet, og vælg Automatisk registrering for at udføre automatisk samregistrering af de resulterende PET- og MR-billeder.
- Under menuen Registreringsopsætning skal du vælge Stiv transformation. Brug Skift og rotation i menuen Stiv/Affin .
- Under menuen Global rollevalg skal du klikke på MM som reference og statisk PET-scanning som reslice.
- Undersøg de medregistrerede PET/MR-billeder for at sikre korrekt justering. Brug om nødvendigt manuel registrering til at justere billederne manuelt.
- Find den ortopiske tumor i leveren ved hjælp af MR-billedet. Brug Interpoleret Ellipse ROI til at tegne en VOI på tumoren ved hjælp af MR-billedet som reference. Overfør den oprettede tumor VOI fra MR til PET-billedet. Vælg penselværktøjet og viskelæderværktøjet for omhyggeligt at definere VOI-kanten slide for slide. Sørg for at undgå afsmitning af radioaktivitetsoptagelse fra leveren på PET-billedet.
- Brug Ellipsoid VOI til at skabe en 3 mm3 VOI på leveren som referenceorgan. Sørg for at undgå områder med synlige levervaskulære og galdestrukturer ved at bruge MR-billedet som vejledning.
- Vælg Vis tabel over investeringsafkast for at omdøbe alle de tegnede VOI'er. Registrer alle de nødvendige data, f.eks. radioaktivitet (kBq / ml) og tumorvolumen (mm3), i et regneark. Gem en kopi af VOI-tegningerne, og arkiver både de rå og rekonstruerede billeddata på en ekstern harddisk, når du er færdig.
- Beregn den standardiserede optagelsesværdi (SUV) for alle VOI'er ved hjælp af følgende ligning11:
SUV = CPET(t)/(ID/BW)
hvor CPET(t) er den målte aktivitet i VOI, ID er den injicerede dosis målt i kBq, og BW er musens kropsvægt i kg, idet der antages en vævstæthed på 1 g/ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at opnå en passende tumorblok til successiv ortopisk implantation blev stabile kloner først genereret ved subkutan injektion af 200 μL cellesuspension i DPBS (indeholdende MHCC97L-celler) i den nedre flanke af nøgne mus (figur 1A). Tumorvækst blev overvåget, og når tumorstørrelsen nåede 800-1000 mm 3 (ca. 4 uger efter injektion), blev mus aflivet, og den resulterende tumorblok blev skåret i ca. 1 mm3 fragmenter til efterfølgende leverortotopisk implantation i et andet parti nøgne mus (n = 6). Mus blev randomiseret i to grupper: kontrol (C1, n = 3) og leverarterieligering (H2, n = 3). HAL blev udført ved at binde en fin tråd omkring hovedgrenen af leverarterien. C1-mus blev skånet for HAL før ortopisk implantation. Denne manipulation førte til tumorhypoxi i H2, men ikke C1-mus, og tumorhypoxisk status kunne overvåges ikke-invasivt ved hjælp af PET-hypoxisk sporstof [18F] FMISO. PET/MR-undersøgelser viste, at en stigning i tumoroptagelse [18 F]FMISO kun blev observeret hos H2-musene, mens tumoroptagelsen ved anvendelse af den glykolytiske markør [18F]FDG forblev ens mellem de to grupper (figur 1B).
HAL-induceret hypoxi i tumorer blev yderligere valideret ved at undersøge ekspressionsniveauerne for HIF-1α12, og sammenligninger blev foretaget mellem grupperne. I overensstemmelse med en mere hypoxisk tumor efter HAL udviste H2-gruppen højere HIF-1α-ekspression end C1-gruppen (optisk tæthed: henholdsvis 0,17 vs. 0,13, H2 vs. C1), hvilket bekræfter deres tumor [18F] FMISO-optagelse (figur 2A). [18F] FMISO-udbredelsen blev kvantificeret ved hjælp af den SUV-baserede tilgang. H2-tumorer viste en 2,3 gange stigning i [18F] FMISO-optagelse sammenlignet med C1-tumorer (SUVmax: henholdsvis 1,2 vs. 2,8, figur 2B). Tilsvarende resulterede HAL også i en højere lever-SUV-optagelse i H2 end C1-mus (figur 2C). Samlet set viser vi her, at HAL effektivt kan inducere tumorhypoxi i HCC-ortopiske xenotransplantater, og tumorhypoxi kan overvåges ikke-invasivt ved hjælp af [18F] FMISO PET-billeddannelse, understøttet af ex vivo immunohistokemimarkør HIF-1α-ekspression. Derudover tilbyder inkorporeringen af MR-billeddannelse en fremragende bløddelskontrast for at muliggøre klar afgrænsning af tumoren fra leveren, hvilket muliggør nøjagtig PET-kvantificering.
Figur 1: In vivo PET/MR-billeddannelse af ortopiske HCC-mus xenotransplantater. (A) Skematisk oversigt over subkutane og ortopiske xenograftkreationer og PET-billeddannelsesundersøgelser i ortopiske MHCC97L-tumorer. (B) Repræsentative maksimale intensitetsprojektionsbilleder (MIP) PET-billeder af [18 F]FMISO og [18F]FDG hos mus med ortopiske MHCC97L-tumorer (C1) uden eller (H2) med HAL. Blå cirkler angiver tumorens placering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse af mus med ortopiske MHCC97L-tumorer med og uden HAL. (A) Repræsentativt medregistreret [18F]FMISO PET/MR-billeder, immunhistokemisk farvning for HIF-1α og hæmatoxylin og eosin (HE) i tumorsektioner. (B-C) Kvantitativ analyse af [18F] FMISO optagelse i tumor og lever. N = 3 for hver gruppe. Værdier af SUV præsenteres som gennemsnitlig ± standardfejl for middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse beskrev vi procedurerne for udførelse af HAL på leverortotopiske HCC-xenotransplantater ved hjælp af subkutane tumorer sammen med metoder til ikke-invasiv overvågning af tumorhypoxxxi i ortotopiske xenotransplantater ved hjælp af [18 F] FMISO og [18F] FDG PET / MR. Vores interesse ligger i metabolisk billeddannelse af forskellige kræft- og sygdomsmodeller til tidlig diagnose og evaluering af behandlingsrespons11,13,14,15. Til dato er dannelsen af HAL HCC xenotransplantater og deres in vivo tumormetabolisme sjældent blevet beskrevet i litteraturen, hvilket fik os til at undersøge de metaboliske egenskaber ved disse tumormodeller ved hjælp af PET-billeddannelse.
Den vellykkede etablering af ortopiske xenotransplantater med HAL som en robust musemodel til undersøgelse af hypoxi i HCC repræsenterer et vigtigt aspekt for at studere HCC-biologi in vivo. Hypoxi er kendt for at stimulere kræft malignitet. Desuden har intratumoral hypoxi været forbundet med forbedret proliferation, metastase og radio- og kemoresistens og berettiger grundig karakterisering af responset på hypoxiske tilstande7. Mens subkutane xenotransplantater ofte bruges til at studere HCC-tumorigenese eller behandlingsstrategier, kan ortopiske modeller bedre rekapitulere human HCC-udvikling, da de afspejler mere præcist tumormikromiljøet, især indflydelserne på vaskularisering og tumor-stroma-interaktioner mod HCC-metastase12. Inkorporeringen af HAL i HCC ortopiske mus tillader induktion af intratumoral hypoxi ved at blokere den hepatiske arterielle blodige forsyning til tumoren7. Sådanne dyremodeller gør det muligt at belyse mekanismer, der ligger til grund for virkningerne af HAL på HCC, og skabe nye veje til effektiv terapi rettet mod hypoxivejen i HCC. Til ortopisk implantation udnyttede vi tumorkuben fra den subkutane tumor i stedet for direkte injektion af HCC-cellesuspensioner. Vi har fundet ud af, at direkte celleinjektioner ofte forårsager en lille mængde lækage fra injektionsstedet, selvom proceduren blev udført så langsomt som muligt med et lavt injektionsvolumen. Dette kan potentielt føre til peritoneal metastase, hvilket er skadeligt for dyrs trivsel, hvilket i sidste ende påvirker det samlede undersøgelsesresultat. På den anden side vil implantation af en lille tumorblok overvinde problemet, selvom man skal sørge for, at tumoren er sikkert sutureret efter implantation. Ved isolering af små tumorterninger fra den subkutane tumorblok er det også tilrådeligt at undgå kerneområderne i den faste tumor, som er relativt mindre vaskulariserede og mere metabolisk stressede på grund af hypoxi og næringsstofmangel. Dette vil reducere inkluderingen af døde tumorceller, der synes at være nekrotiske i den lille tumorterning og vil opretholde mere konsistente tumorvækstrater på tværs af individuelle mus.
Hypoxi er en prognostisk faktor for kræftresistens, og overvågning af ændringer i hypoxi ved hjælp af PET muliggør påvisning og kvantificering af hypoxisk væv i høj følsomhed og specificitet. En vigtig overvejelse for [18 F]FMISO og [18F]FDG PET involverer radiosporstofoptagelsestiden og administrationsvejen i mus. Begge radioaktive sporstoffer har forskellig in vivo-farmakokinetik, hvoraf den ene er den fysiologiske optagelsesforskel, observeret i tarmen / blæren og hjertet / blæren for henholdsvis [18 F] FMISO og [18 F] FDG, og den anden er, at [18 F] FMISO akkumuleres i tumorens hypoxiske område, og [18 F] FDG fortrinsvis optages i det høje metaboliske tumorområde 16. Den høje lipofilicitet og langsomme leverclearance af [18F] FMISO kræver en 2-4 timers tid efter injektion for at opnå en god tumor-til-lever-kontrast17. Vi fandt, at 3 timer efter injektion er tilstrækkelig til at differentiere og afgrænse tumor [18F] FMISO-optagelse fra leveren for både hypoxiske (H2) og kontrolgrupper (C1). I tilfælde af [18 F] FDG PET er en tid på 1 time efter injektion tilstrækkelig til at give god kontrast, som tidligere beskrevet13,15, og blev anvendt i denne undersøgelse. Ikke desto mindre er det bydende nødvendigt at opretholde en ensartet optagelsestid for radiosporet for at sikre pålideligheden af PET-resultater, især for SUV-baserede analyser. Her brugte vi intravenøse teknikker til at administrere radiosporstof til musene. Vellykket haleveneinjektion indikeres af et synligt blodflashback før radiosporstofinfusionen, hvor nålen er nøjagtigt placeret i venen. En stor ulempe ved denne metode er, at det forventede blodflashback kan være vanskeligt at observere på grund af hypotension, med variation observeret mellem mus. Ikke desto mindre kan sådanne vanskeligheder overvindes ved at opvarme halen i en kort periode på 1-2 minutter før nålindsættelse, enten med en varm vaskeklud eller med en varmelampe for at øge blodgennemstrømningen og forbedre venens synlighed for vellykket injektion.
Med den stigende brug af PET-billeddannelse til kvantificering af biodistribution af radiosporstof i små dyr er det vigtigt at bemærke brugen af en nøjagtig og velkalibreret PET-scanner til at give gode, reproducerbare og kvantificerbare PET-data. Et nøjagtigt PET-system gør det muligt at udføre billeddannelsesundersøgelser på en mere tidseffektiv og omkostningseffektiv måde og muliggør implementering af 3R-principperne (udskiftning, reduktion og forfining) i dyreforsøg. Derfor skal der udføres rutinemæssige kvalitetskontrolinspektioner, helst ugentligt, for at undersøge PET- og MR-komponenterne i billeddannelsessystemet i overensstemmelse med fabrikantens anbefaling. Navnlig bør nøjagtigheden af PET-aktivitet kontrolleres og registreres hyppigt samt inden påbegyndelsen af et billeddannelsesforsøg for at sikre pålideligheden af PET-kvantificeringen. Dette er afgørende for alle langsgående undersøgelser, der involverer kvantitativ evaluering af tumor og væv over en undersøgelsesperiode for at producere meningsfulde og sammenlignelige resultater. Kalibrering af systemet er påkrævet, når PET-aktivitetsnøjagtigheden viser sig at være uden for det anbefalede interval, samt når der opdages forkert justering af PET- og MR-billeder.
Selv om de teknikker, der er beskrevet her, muliggør PET-billeddannelse af de hypoxiske HCC-xenotransplantater til en lang række in vivo-undersøgelser , bør visse begrænsninger overvejes, når det overvejes at anvende disse protokoller. Oprettelsen af HAL HCC xenotransplantater er en kompleks intra-abdominal kirurgisk procedure til udførelse på 6-8 uger gamle immundefekte mus. Derudover kan den diminutive leverarterie hos disse unge mus være svær at lokalisere, hvilket gør ligeringsprocessen teknisk udfordrende. Disse procedurer kræver passende uddannet personale til at forbedre operationssuccessionsraten samt musenes overlevelse over en periode, dvs. 4-6 uger før xenotransplantater dannes, mens der forventes omfattende dyrepleje i hele operationsperioden, som er både tids- og ressourcekrævende. Det forventes også, at dannelsen af ortopiske HCC-xenotransplantater ved hjælp af denne metode vil kræve ca. 8 uger før vellykket PET-billeddannelse, da implantation af tumorterningen anvendes snarere end direkte injektion af cellesuspensioner for at undgå peritoneal metastase. Ikke desto mindre kan disse begrænsninger overvindes med passende planlægning og uddannelse af forskningspersonale. Stikprøvestørrelsen af de eksperimentelle grupper, der rapporteres her, er også lille, hvilket muligvis ikke er egnet til statistisk analyse. Vores observationer afslører imidlertid subjektivt en tendens, hvor HAL-induceret hypoxi blev målt i både tumoren og leveren i H2 sammenlignet med C1-gruppen, hvilket understøttes af mere fremtrædende HIF-1α-farvning i H2-tumorprøverne. Vi arbejder i øjeblikket på at udvide tumormodellerne med andre humane HCC-cellelinjer. Også terapeutiske undersøgelser rettet mod hypoxi-vejen i HCC, der involverer disse xenotransplantater, er i gang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi anerkender støtten fra Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) til billeddannelsesforsøg med små dyr. Vi takker også støtten fra Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) ved University of Hong Kong for levering af [18 F] FMISO og [18F] FDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
