Summary
Her presenterer vi en protokoll for å lage ortotopiske hepatocellulære karsinomxenotransplantater med og uten leverarterieligering og utføre ikke-invasiv positronemisjonstomografi (PET) avbildning av tumorhypoksi ved bruk av [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) og [18 F]Fluorodeoksyglukose ([18F]FDG).
Abstract
Prekliniske eksperimentelle modeller av hepatocellulært karsinom (HCC) som rekapitulerer menneskelig sykdom representerer et viktig verktøy for å studere tumorigenese og evaluere nye terapeutiske tilnærminger. Ikke-invasiv avbildning av hele kroppen ved hjelp av positronemisjonstomografi (PET) gir kritisk innsikt i in vivo-egenskapene til vev på molekylært nivå i sanntid. Vi presenterer her en protokoll for ortotopisk HCC xenograftopprettelse med og uten leverarterieligering (HAL) for å indusere tumorhypoksi og vurdering av tumormetabolismen in vivo ved bruk av [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) og [18 F]Fluorodeoksyglukose ([18F]FDG) PET/magnetisk resonans (MR) avbildning. Tumorhypoksi kunne lett visualiseres ved hjelp av hypoksimarkøren [18 F]FMISO, og det ble funnet at [18 F]FMISO-opptaket var høyere hos HCC-mus som gjennomgikk HAL enn i ikke-HAL-gruppen, mens [18F]FDG ikke kunne skille tumorhypoksi mellom de to gruppene. HAL-svulster viste også et høyere nivå av hypoksi-induserbar faktor (HIF)-1α-uttrykk som respons på hypoksi. Kvantifisering av HAL-svulster viste en 2,3 ganger økning i [18F] FMISO-opptak basert på standardisert verdiopptak (SUV) tilnærming.
Introduction
Hepatocellulært karsinom (HCC) er den sjette mest diagnostiserte kreftformen og den tredje vanligste dødsårsaken fra kreft på verdensbasis, med mer enn 900 000 nye tilfeller og 800 000 dødsfall i 20201. Den viktigste risikofaktoren er skrumplever, som oppstår som følge av virusinfeksjoner (hepatitt B- og C-virus), alkoholmisbruk, diabetes og ikke-alkoholisk steatohepatitt2. Forvaltningen av HCC er ganske kompleks, og flere behandlingsalternativer er tilgjengelige, inkludert kirurgisk reseksjon, termisk eller kjemisk ablasjon, transplantasjon, transarteriell kjemoembolisering, stråling og kjemoterapi, avhengig av sykdomsstaging 2,3. HCC er en kjemoterapi-refraktær svulst med sykdomsresidiv hos opptil 70% av pasientene etter kurativ intensjonsbehandling2.
Til tross for den høye graden av tumorheterogenitet, er HCC forbundet med to vanlige utfall: (i) HCC er svært hypoksisk, og (ii) tumorhypoksi er knyttet til større tumoraggressivitet og behandlingssvikt. Den ukontrollerte spredningen av HCC-celler resulterer i et høyt oksygenforbruk som går foran vaskularisering, og skaper dermed et hypoksisk mikromiljø. Lave intratumorale oksygennivåer utløser deretter en rekke biologiske responser som påvirker tumoraggressivitet og behandlingsrespons. Hypoksi-induserbare faktorer (HIF) blir ofte anerkjent som de essensielle transkripsjonsregulatorene i responsen på hypoksi 2,3. Derfor er evnen til å oppdage hypoksi avgjørende for å visualisere neoplastiske vev og identifisere de utilgjengelige stedene, som krever invasive prosedyrer. Det bidrar også til å bedre forstå de molekylære endringene som fører til tumoraggressivitet og forbedre pasientens behandlingsresultater.
Molekylær avbildning ved hjelp av positronutslippstomografi (PET) brukes ofte i diagnostisering og iscenesettelse av mange kreftformer, inkludert HCC. Spesielt kan kombinert bruk av dual-tracer PET-avbildning som involverer [18 F] fluorodeoksyglukose ([18F] FDG) og [11C] acetat øke den totale følsomheten betydelig i HCC-diagnose 4,5. Avbildning av hypoksi, derimot, kan oppnås ved å bruke den vanlige hypoksiske markøren [18 F]Fluoromisonidazol ([18F]FMISO). I klinisk praksis er ikke-invasiv vurdering av hypoksi viktig for å skille mellom ulike typer svulster og regioner for planlegging av strålebehandling6.
Preklinisk bildebehandling har blitt et uunnværlig verktøy for ikke-invasiv og langsgående evaluering av musemodeller for forskjellige sykdommer. En robust og svært reproduserbar HCC-modell representerer en viktig plattform for preklinisk og translasjonell forskning på patofysiologien til human HCC og vurdering av nye terapier. Sammen med PET-avbildning kan in vivo-oppførsel belyses for å gi viktig innsikt på molekylært nivå for et gitt tidspunkt. Her beskriver vi en protokoll for generering av hepatisk arterie ligering (HAL) ortotopiske HCC xenotransplantater og analyse av deres in vivo tumormetabolisme ved bruk av [18 F] FMISO og [18F] FDG PET / MR. Inkorporeringen av HAL gjør en egnet modell av transgene eller kjemisk induserte HCC-mus xenotransplantater for å studere tumorhypoksi in vivo, da HAL effektivt kan blokkere arteriell blodtilførsel for å indusere intratumoral hypoksi 7,8. I tillegg, i motsetning til ex vivo immunhistokjemisk farging ved bruk av pimonidazol, kan endringer i tumormetabolisme som følge av hypoksi lett visualiseres og nøyaktig kvantifiseres ikke-invasivt ved hjelp av PET-avbildning, noe som muliggjør longitudinell vurdering av behandlingsrespons eller måling av resistensutvikling 3,7,8 . Vår metode vist her gjør det mulig å lage en robust hypoksisk HCC-modell sammen med ikke-invasiv overvåking av tumorhypoksi ved hjelp av PET / MR-avbildning for å studere HCC-biologi in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med komiteen for bruk av levende dyr i undervisning og forskning (CULATR) i Senter for komparativ medisinforskning (CCMR) ved University of Hong Kong, et program akkreditert av Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Dyrene som ble brukt i studien var hunnmus med BALB/cAnN-nu (nakenmus) i alderen 6-8 uker, vektet til 20 g ± 2 g. Mat og vann ble gitt ad libitum.
1. Subkutan injeksjon av humane hepatocellulære karsinomcellelinjer
MERK: MHCC97 er en human HCC-cellelinje som brukes til å generere den subkutane HCC-xenograftmodellen. MHCC97L-celler er hentet fra Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital of Fudan University, Shanghai, Folkerepublikken Kina9 og autentisert ved kort tandemrepetisjon (STR) profilering.
- Kultur MHCC97L-celler og opprettholder i kulturmedier supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin og streptomycin i en T-75 cellekulturkolbe ved 37 ° C i en fuktet inkubator forsynt med 5% CO2 (se materialtabell). Bytt dyrkningsmedium hver 2. dag og høst cellene ved 80%-90% konfluens.
MERK: Startcellenummeret er 1,5 x 10 6 celler, og cellene brukes innen6-8 passasjer. - Oppbevar dyrkningsmediet og trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (trypsin-EDTA) ved 4 °C i mørket til bruk. Forvarm dyrkningsmediet til 37 °C og trypsin-EDTA til romtemperatur før bruk. Se materialfortegnelsen for alle reagenser og forbruksvarer som brukes i denne delen.
- Fjern kulturmediet. Skyll cellelaget med 10 ml sterilt fosfatbufret saltvann (DPBS, se materialfortegnelse).
- Tilsett 5 ml trypsin-EDTA til kulturkolben og inkuber cellene ved 37 °C. Sjekk cellene under et omvendt mikroskop ved 20x forstørrelse (se materialfortegnelse) til cellelaget er dispergert og helt løsrevet fra kolben. Pass på at cellene ikke er igjen i trypsin-EDTA i mer enn 15 minutter.
- Tilsett 5 ml kulturmedier til kulturkolben. Aspirer cellene ved å pipettere forsiktig. Overfør cellesuspensjonen til et sentrifugerør og spinn ved 1,107 x g i 5 minutter (se materialfortegnelse).
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten forsiktig med 1 ml PBS. Pipett grundig for å oppnå en encellesuspensjon. Bestem cellenummeret ved hjelp av den automatiserte celletelleren (se materialfortegnelse) og klargjør cellesuspensjonen til en konsentrasjon på 5 x 106 celler/ml i PBS.
- Trekk opp 200 mikrol cellesuspensjon med en 25 G kanyle i en 1 ml sprøyte. Hver sprøyte inneholder 1 x 106 MHCC97L-celler (i 200 μL). Oppbevar sprøyten på våt is.
- Bedøv musen med en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av en blanding av ketamin (87,5 mg/kg) og xylazin (12,5 mg/kg). Sørg for riktig anestesi ved hjelp av tåklemmerefleksen. Sørg for å bruke øyesmøremiddel på musen for å forhindre tørking og potensiell dannelse av hornhinnenesår. Plasser musen i liggende stilling på en steril pute (se Materialfortegnelse).
- Steriliser dorsalområdet nær nedre flanke (enten venstre eller høyre side) av musen med 70 % etanol (se materialfortegnelse). Løft huden opp med tang og stikk forsiktig nåleskråningen opp under huden.
- Før nålen 4-5 mm langs underhudsplanet fra stikkstedet for å unngå utilsiktet lekkasje av cellesuspensjonen fra injeksjonsstedet ved uttak av kanylen. Pass på at nålestikket ikke er for dypt under huden, noe som kan forårsake utilsiktet skade på organene.
- Slipp tangen og forsiktig og sakte tøm innholdet i sprøyten, pass på at du ikke trenger inn på motsatt side. Trekk ut nålen for å se etter hevelser på injeksjonen. Plasser musen tilbake i buret sitter på toppen av en forvarmet varmepute for å hjelpe til med utvinning fra anestesi og for å gjenvinne mobilitet. Fortsett å overvåke musen til musen er helt våken og opprettholder sternal recumbency.
- Overvåk musens vekst og velvære på ukentlig basis. Mål tumorvolumet (V) ved hjelp av en tykkelse (se materialfortegnelse). Beregn og registrer tumorvolumet ved hjelp av følgende formel10:
V = (W 2× L)/2
hvor W er bredden og L er lengden på svulsten. - Mellom 4-6 uker etter injeksjon, kontroller at en signifikant størrelse av subkutan tumor, mellom 800-1000 mm3, oppnås. Pass på at den totale tumorbelastningen ikke overstiger 10% av kroppsvekten.
2. Ortotopisk leverimplantasjon og ligering av leverarterien
- Forbered følgende kirurgiske reagenser og verktøy i et desinfisert biologisk sikkerhetsskap: 10 ml kulturmedier i en tallerken, 10% povidon-jodoppløsning, 70% etanol, autoklaverte kirurgiske instrumenter, dvs. skarp saks, fjærsaks, tang (buet fin og rett stump), nåleholder, skalpellblad, 6-0 og 5-0 nylonsutur, en varmepute.
- Autoklav alle kirurgiske instrumenter og håndter dem bare på en steril benk. Gi tilstrekkelig og nødvendig pre-, intra- og postoperativ omsorg til musene gjennom de kirurgiske prosedyrene (se trinnene nedenfor).
- For preoperativ smertelindring, injiser musen med en subkutan injeksjon av buprenorfin (0,1 mg/kg) minst 30 minutter før operasjonsstart. For postoperativ behandling og behandling, injiser musen med en subkutan injeksjon av buprenorfin (0,1 mg/kg) i 3 dager sammenhengende, én gang hver 8.-12. time. Se materialfortegnelsen for alle reagenser og forbruksvarer som brukes i denne delen.
- Avlive den subkutane tumorbærende musen med en i.p. injeksjon av pentobarbital (330 mg/kg). Gjør et snitt på huden på svulststedet ved hjelp av et skalpellblad. Excise den subkutane tumorblokken og overfør den umiddelbart til kulturmediet. Utfør dette trinnet så raskt som mulig.
- Klipp tumorblokken i 1 mm3 små tumorkuber ved hjelp av skarp kirurgisk saks. Hold alle tumorkuber i kulturmediet. Unngå å bruke kjerneområdet i den subkutane tumorblokken.
- Bedøv musen som skal gjennomgå den påfølgende ortotopiske tumorimplantasjonsoperasjonen med en IP-injeksjon av en blanding av ketamin (87,5 mg / kg) og xylazin (12,5 mg / kg). Forsikre deg om at det har gått minst 30 min etter at du har gitt buprenorfin før du bedøver musen. Sørg for å bruke øye smøremiddel til musen for å unngå tørking og potensiell dannelse av hornhinnenesår.
- Plasser musen i en liggende posisjon på en steril pute som er på toppen av en forvarmet varmepute. Overvåk og registrer musens fysiologiske tilstand hvert 15. minutt til slutten av den kirurgiske prosedyren.
- Forleng musens lemmer. Fest dem med tape for å maksimere eksponeringen av ventral mage og thorax. Steriliser hele bukhuden på musen med en 10% povidon-jodløsning, etterfulgt av 70% etanol. Vurder bedøvelsesdybden til musen ved å sjekke om det ikke er noen respons på tåklemming - pedaluttaksrefleksen.
- Utfør en laparotomi ved å gjøre et ca. 10 mm midtlinjesnitt for å få tilgang til bukhinnen ved hjelp av skarp saks. Klem og trekk xiphoidprosessen mot hodet med tang og påfør subcostal retractors for å åpne det kirurgiske feltet. Sørg for at et riktig snitt er gjort for å muliggjøre en god kirurgisk oversikt over operasjonsstedet.
- Trekk medianen og venstre lober oppover med en våt gasbindpinne. Flytt tarmene utenfor magen på venstre side av musen og dekk dem med en våt gasbindpinne. Utfør hepatisk arterieligering (HAL) på den vanlige leverarterien (CHA), som stammer fra bukspyttkjertelhodet til roten i leverpedicle, under en forstørrelseslampe for optimalisert visualisering.
- Trekk medianen og venstre flik bakover/nedover med en våt gasbindpinne for å eksponere venstre. Lag et snitt på omtrent 2 mm i lengde og dybde på overflaten av venstre lobe med et sterilt skalpellblad.
MERK: Det er også mulig å bruke medianlappen i leveren til tumorimplantasjon for å minimere utilsiktede tårer eller lacerasjon ved traumer til nærliggende bukorganer. - Sett umiddelbart et tumorfragment inn i leverinnsnittet med steril tang. Begrav svulsten slik at den sitter sikkert i leveren. Påfør en figur-av-åtte sutur med en 6-0 nylon sutur over snittstedet for å sikre riktig tumorfragmentimplantasjon i leveren og hemostase. Utfør denne operasjonen så raskt som mulig for å unngå overdreven blødning. Etter ferdigstillelse, lukk magesnittet med avbrutte 5-0 suturer.
- Plasser musen tilbake i buret sittende på toppen av en forvarmet varmepute for å hjelpe til med utvinning fra anestesi og for å gjenvinne høyre refleks. Fortsett å overvåke og registrere musens fysiologiske tilstand hvert 15. minutt til musen er helt våken og opprettholder sternal recumbency.
- Gjenta prosedyren til alle musene har gått gjennom ortotopisk tumorimplantasjon. Gi postoperativ omsorg til alle mus ved kontinuerlig å overvåke deres fysiologiske tilstand daglig de neste 3 dagene etter den kirurgiske operasjonen. Gi buprenorfin (0,1 mg/kg) hver 8.-12.
3. Oppsett av PET/MR-kalibreringer og arbeidsflyt
MERK: Avbildning utføres ved hjelp av et preklinisk PET / MR 3T-system (se materialfortegnelse).
- Bruk 5 % isofluran (1 l/min medisinskO2) til å bedøve musen i et induksjonskammer. For hver skanning, plasser forsiktig den bedøvede musen på en bildeseng med kontinuerlig oppvarming; Skann først med MR (scout view) som anatomisk referanse for statisk [18 F]FMISO eller [18F]FDG PET skanning, etterfulgt av anatomisk referanse MR-avbildning.
- Opprett en sekvensiell PET / MR-bildearbeidsflyt i programvaren (se materialfortegnelse) for å inkludere en statisk PET-skanning, T1-vektet (dempingskorreksjon) og T2-vektet (anatomisk referanse) MR-avbildning og PET-rekonstruksjon 1 dag før den planlagte bildebehandlingen.
- For å skaffe PET, velg 400-600 keV nivå diskriminering, F-18 studie isotop, 1-5 tilfeldighetsmodus, og 20 min skanninger.
- For å skaffe hele kroppen T1-vektet MR, bruk gradient ekko-3D med TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, synsfelt (FOV) = 90 mm x 60 mm, antall eksitasjoner (NEX) = 3, 28 skiver med 0,9 mm tykkelse og voxelstørrelse = 0,375 mm 3 x 0,375 mm 3 x 0,9 mm 3.
- For å skaffe hele kroppen T2-vektet MR, bruk hurtigspinnekko 2D med TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 28 skiver med 0,9 mm tykkelse, voxelstørrelse = 0,265 mm 3 x 0,268 mm 3 x 0,9 mm 3.
- For å rekonstruere PET, velg Tera-Tomo (TT3D) algoritme, iterasjoner = 8, delmengder = 6, 1-3 sammenfallsmodus, og med henfall, dødtid, tilfeldig, demping og spredningskorrigeringer for å lage bilder med en samlet voxelstørrelse på 0,3 mm3.
- Utfør en PET-aktivitetstest før starten av eksperimentet for å kontrollere nøyaktigheten av PET-kvantifisering11.
- Fyll en 5 ml sprøyte med 5-8 MBq [18F]FMISO fortynnet i vann eller saltvann i henhold til produsentens anbefaling. Bruk en dosekalibrator til å registrere sprøytens aktivitet (se Materialfortegnelse). Legg merke til måletidspunktet.
- Tegn et volum av interesse (VOI) på det rekonstruerte bildet for å dekke hele sprøyten. Sammenlign den gjenvunnede aktiviteten fra bildet med verdien fra dosekalibratoren. Fortsett med bildeundersøkelser når den gjenopprettede aktiviteten er nøyaktig innen ±5%.
4. [18 F]FMISO og [18F]FDG-injeksjon
- Få en klinisk dose på [18F]FMISO fra leverandøren 30 min før starten av bildestudiene. Bruk egnet personlig verneutstyr (PPE), for eksempel laboratoriefrakk, hansker, overbriller, et filmmerke og ringdosimetre når du håndterer radioaktivt materiale. Bytt hansker ofte for å unngå krysskontaminering av de radioaktive stoffene.
- Plasser de radioaktive stamløsningene i blybeholderen bak et L-blokk bordskjold. Dispenser en alikot av [18F] FMISO og fortynn med sterilisert saltvann. Sørg for at den totale aktivitetskonsentrasjonen er 18-20 MBq i 100 μL.
- Trekk opp [18F]FMISO med en 1 ml sprøyte med kanyle (se Materialfortegnelse). Registrer radioaktivitet og tid som er angitt på dosekalibratoren.
- Registrer musens vekt før injeksjon av radiotraceren. Bruk 5 % isofluran (1 l/min medisinsk O2) til å bedøve musen, og injiser deretter forsiktig den klargjorte [18F]FMISO via halevenen. Registrer injeksjonstid og restaktivitet for sprøyten for å ta hensyn til forfallskorreksjon. Plasser musen tilbake i buret i 180 minutter for å tillate [18F]FMISO-opptak før PET-skanningen. La musen komme seg i 1 dag etter [18F]FMISO PET.
MERK: Til tross for de svært forskjellige in vivo farmakokinetiske profilene for [18 F]FMISO og [18 F]FDG, er begge radiotracerne radiomerket med F-18, som er en PET-radionuklid med en halveringstid på 109,77min (< 2 timer). Siden PET-signalet stammer fra F-18, vil halvparten av den opprinnelige injiserte radioaktiviteten gå tapt hver 2. I dette tilfellet kan restsignalet 24 timer etter injeksjon ikke lenger detekteres av PET-skanneren. I tillegg vil 1 dags gap mellom både [18 F] FMISO (dag 1) og [18 F] FDG (dag 3) injeksjoner tillate fullstendig forfall av [18 F] FMISO når [18 F] FDG PET utføres, og dermed ingen overlapping av [18 F] FMISO-signal i [18F] FDG PET-skanningen. - Gjenta trinn 4.1.-4.4. for [18F]FDG-injeksjonen på dag 3, med unntak av at en total aktivitetskonsentrasjon på 6-8 MBq i 100 μL injiseres med et 60 minutters opptak før starten av PET-skanningen.
- Beregn injisert [18 F] FMISO eller [18F] FDG aktivitet ved hjelp av følgende formel 11:
Injisert aktivitet (MBq) = Aktivitet i sprøyten før injeksjon - Aktivitet i sprøyten etter injeksjon
5. Innsamling av PET/MR
- Slå på luftvarmeren for å varme opp museavbildningssengen før den planlagte PET-skanningen. Bruk 5 % isofluran (1 l/min medisinskO2) til å bedøve musen i et induksjonskammer.
- Når den er riktig bedøvet og kontrollert ved hjelp av tåklemmeresponsen, overfør musen forsiktig og umiddelbart til varmesengen og oppretthold anestesi ved 2% -2,5% isofluran. Plasser musen med hodet på bittstangen og bruk øyesmøremiddel på begge øynene for å unngå tørking og potensiell dannelse av hornhinnenesår. Dekk bildesengen med et plastark for å opprettholde sengens omgivende temperatur.
- Overvåk og registrer respirasjonsfrekvensen og kroppstemperaturen til musen ved hjelp av henholdsvis den interne respirasjonsputen og termisk sonde. Sørg for at musens kroppstemperatur holdes på 37 °C mens respirasjonsfrekvensen holdes i området 40-50 pust per minutt (bpm) ved å justere isoflurannivået.
- Utfør en speidervisning for å finne museposisjonen inne i skanneren. Juster musesengposisjonen for å dekke hele musekroppen, med torsoområdet plassert i midten FOV av MR.
- For å starte en PET-skanning, velg PET-anskaffelse i studielistevinduet, og velg deretter Skanneområde ved forrige anskaffelse for å bruke den forhåndsbestemte musesengposisjonen fra speidervisningen. Klikk på Forbered > OK for automatisk å flytte musesengen fra MR til PET og starte oppkjøpet.
- Under Radiofarmasøytisk redigering, velg riktig radionuklid, og skriv deretter inn detaljene for injeksjonsdosen og tidspunktet før og etter [18 F]FMISO eller [18F]FDG injeksjon, som målt i trinn 4.3. og trinn 4.4. Skriv inn vekten av musen under Emneinformasjon-menyen.
- Fortsett med MR-oppkjøp når PET-skanningen er fullført. For å gjøre det, velg Forbered deg på å flytte musen til MR fra PET. Klikk OK for å fortsette.
- Når alle skanningene er fullført, velger du Hjem for å flytte bildesengen tilbake til standardposisjonen.
- Slå av anestesien og skyll bildesengen med medisinsk O2. Sjekk tilbaketrekningsrefleksen til musepedalen. Overfør musen fra bildesengen tilbake til et rent boligbur plassert på toppen av en varmepute for å hjelpe til med utvinning fra anestesi og for å gjenvinne høyre refleks.
- Under råskanningen velger du PET-innhenting for å laste inn de innhentede rå PET-dataene for PET-rekonstruksjon. Velg MM for bruk som materialkart. Fortsett med PET-rekonstruksjon ved hjelp av parameteren som beskrevet i trinn 3.6.
- Følg strengt de lokale og institusjonelle retningslinjene ved håndtering av mus etter PET-bildestudier. Behandle alle brukte forbruksvarer, for eksempel sprøyter, nåler, hansker, våtservietter og biologisk avfall, for eksempel bursengetøy og avføring, som har vært i direkte kontakt med musen som radioaktivt avfall, og håndter med forsiktighet i henhold til lokale forskrifter.
6. PET-bildeanalyse
- Åpne Image Analysis-programvaren (se Materialfortegnelse), og velg Last inn DICOM-data for å åpne PET- og MR-bildene.
- Dra de tilsvarende PET- og MR-bildene til programvarevisningsvinduet, og velg Automatisk registrering for å utføre automatisk samregistrering av de resulterende PET- og MR-bildene.
- Under menyen Registreringsoppsett velger du Stiv transformasjon. Bruk Skift og Rotasjon i menyen Rigid/Affine .
- Under Global Role Selection-menyen klikker du på MM som referanse og Static PET Scan as Reslice.
- Inspiser de samregistrerte PET/MR-bildene for å sikre riktig justering. Bruk om nødvendig Manuell registrering til å justere bildene manuelt.
- Finn den ortotopiske svulsten i leveren ved hjelp av MR-bildet. Bruk interpolert ellipseavkastning for å tegne en VOI på svulsten, ved å bruke MR-bildet som referanse. Overfør den opprettede tumor VOI fra MR til PET-bildet. Velg penselverktøyet og viskelærverktøyet for å definere VOI-kantlinjen lysbilde for lysbilde nøye. Sørg for å unngå smitte av radioaktivitetsopptak fra leveren på PET-bildet.
- Bruk Ellipsoid VOI til å lage en 3 mm3 VOI på leveren som referanseorgan. Sørg for å unngå områder med synlige hepatiske vaskulære og galdestrukturer ved å bruke MR-bildet som veiledning.
- Velg Vis ROI-tabell for å gi nytt navn til alle de tegnede VOI-ene. Registrer alle nødvendige data, for eksempel radioaktivitet (kBq / ml) og tumorvolum (mm3), i et regneark. Lagre en kopi av VOI-tegningene og arkiver både rå og rekonstruerte bildedata på en ekstern harddisk når du er ferdig.
- Beregn den standardiserte opptaksverdien (SUV) for alle VOIer ved hjelp av følgende ligning11:
SUV = CPET (t) / (ID / BW)
der CPET(t) er den målte aktiviteten i VOI, ID er den injiserte dosen målt i kBq, og BW er musens kroppsvekt i kg, forutsatt en vevstetthet på 1 g/ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å oppnå en egnet tumorblokk for suksessiv ortotopisk implantasjon ble stabile kloner først generert ved subkutan injeksjon av 200 μL cellesuspensjon i DPBS (inneholdende MHCC97L-celler) i nedre flanke av nakne mus (figur 1A). Tumorvekst ble overvåket, og når tumorstørrelsen nådde 800-1000 mm 3 (ca. 4 uker etter injeksjon), ble mus avlivet, og den resulterende tumorblokken ble kuttet i ca. 1 mm3 fragmenter for påfølgende ortotopisk implantasjon i en annen gruppe nakne mus (n = 6). Mus ble randomisert i to grupper: kontroll (C1, n = 3) og leverarterieligering (H2, n = 3). HAL ble utført ved å binde en fin tråd rundt hovedgrenen av leverarterien. C1-mus ble spart for HAL før ortotopisk implantasjon. Denne manipulasjonen førte til tumorhypoksi i H2, men ikke C1-mus, og tumorhypoksisk status kunne overvåkes ikke-invasivt ved bruk av PET-hypoksisk tracer [18F]FMISO. PET/MR-studier viste at en økning i tumoropptak [18 F]FMISO kun ble observert hos H2-musene, mens tumoropptaket ved bruk av glykolytisk markør [18F]FDG forble likt mellom de to gruppene (figur 1B).
HAL-indusert hypoksi i svulster ble ytterligere validert ved å undersøke ekspresjonsnivåene av HIF-1α12, og sammenligninger ble gjort mellom gruppene. I samsvar med en mer hypoksisk tumor etter HAL viste H2-gruppen høyere HIF-1α-uttrykk enn C1-gruppen (henholdsvis optisk tetthet: 0,17 vs. 0,13, H2 vs. C1), noe som bekrefter tumoropptaket [18F]FMISO (figur 2A). [18F] FMISO-opptaket ble kvantifisert ved hjelp av den SUV-baserte tilnærmingen. H2-svulster viste en 2,3 ganger økning i [18F]FMISO-opptak sammenlignet med C1-svulster (SUVmaks: 1,2 vs. 2,8, henholdsvis figur 2B). Tilsvarende resulterte HAL også i et høyere lever-SUV-opptak i H2 enn C1-mus (figur 2C). Samlet viser vi her at HAL effektivt kan indusere tumorhypoksi i HCC-ortotopiske xenotransplantater, og tumorhypoksi kan overvåkes ikke-invasivt ved bruk av [18F]FMISO PET-avbildning, støttet av ex vivo immunhistokjemimarkøren HIF-1α-uttrykk. I tillegg tilbyr inkorporering av MR-avbildning en utmerket bløtvevskontrast for å muliggjøre klar avgrensning av svulsten fra leveren, noe som gjør nøyaktig PET-kvantifisering mulig.
Figur 1: In vivo PET/MR-avbildning av ortotopiske HCC-mus xenotransplantater. (A) Skjematisk fremstilling av subkutane og ortotopiske xenograftkreasjoner og PET-avbildningsstudier i ortotopiske MHCC97L-svulster. (B) Representative maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) PET-bilder av [18 F] FMISO og [18F] FDG hos mus som bærer ortotopiske MHCC97L-svulster (C1) uten eller (H2) med HAL. Blå sirkler indikerer plasseringen av svulsten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Analyse av mus med ortotopiske MHCC97L-svulster med og uten HAL. (A) Representant samregistrerte [18F]FMISO PET/MR-bilder, immunhistokjemifarging for HIF-1α og hematoksylin og eosin (HE) i tumorseksjoner. (B-C) Kvantitativ analyse av [18F]FMISO opptak i svulst og lever. N = 3 for hver gruppe. Verdier av SUV er presentert som gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien beskrev vi prosedyrene for å utføre HAL på leverortotopiske HCC-xenotransplantater ved bruk av subkutane svulster, sammen med metoder for ikke-invasiv overvåking av tumorhypoksi i ortotopiske xenotransplantater ved bruk av [18 F]FMISO og [18F]FDG PET/MR. Vår interesse ligger i metabolsk avbildning av ulike kreft- og sykdomsmodeller for tidlig diagnose og evaluering av behandlingsrespons11,13,14,15. Hittil har opprettelsen av HAL HCC-xenotransplantater og deres in vivo-tumormetabolisme sjelden blitt beskrevet i litteraturen, noe som fikk oss til å undersøke de metabolske egenskapene til disse tumormodellene ved hjelp av PET-avbildning.
Den vellykkede etableringen av ortotopiske xenotransplantater med HAL som en robust musmodell for å studere hypoksi i HCC representerer et viktig aspekt for å studere HCC-biologi in vivo. Hypoksi er kjent for å stimulere kreft malignitet. Videre har intratumoral hypoksi vært assosiert med økt proliferasjon, metastase og radio- og kjemoresistens og garanterer grundig karakterisering av responsen på hypoksiske tilstander7. Mens subkutane xenotransplantater ofte brukes til å studere HCC-tumorigenese eller behandlingsstrategier, kan ortotopiske modeller bedre rekapitulere human HCC-utvikling siden de reflekterer mer nøyaktig tumormikromiljøet, spesielt påvirkningen på vaskularisering og tumor-stroma-interaksjoner mot HCC-metastase12. Inkorporering av HAL i HCC ortotopiske mus tillater induksjon av intratumoral hypoksi ved å blokkere leverarteriell blodig tilførsel til svulsten7. Slike dyremodeller gjør det mulig å belyse mekanismer som ligger til grunn for effektene av HAL på HCC og skape nye veier for effektiv terapi rettet mot hypoksibanen i HCC. Ved ortotopisk implantasjon benyttet vi tumorkuben fra subkutan tumor i stedet for direkte injeksjon av HCC-cellesuspensjoner. Vi har erfart at direkte celleinjeksjoner ofte gir små mengder lekkasje fra injeksjonsstedet, selv om inngrepet ble utført så langsomt som mulig med lavt injeksjonsvolum. Dette kan potensielt føre til peritoneal metastase, noe som er skadelig for dyrs velvære, og i siste instans påvirker det samlede studieresultatet. På den annen side vil implantasjon av en liten tumorblokk overvinne problemet, selv om det må tas hensyn til at svulsten er sikkert suturert etter implantasjon. Ved isolering av små tumorkuber fra den subkutane tumorblokken, anbefales det også å unngå kjerneområdene i den faste svulsten, som er relativt mindre vaskulariserte og mer metabolsk stresset på grunn av hypoksi og næringsmangel. Å gjøre det vil redusere inkluderingen av døde tumorceller som ser ut til å være nekrotiske i den lille tumorkuben og vil opprettholde mer konsistente tumorvekstrater på tvers av individuelle mus.
Hypoksi er en prognostisk faktor for kreftresistens, og overvåking av endringer i hypoksi ved bruk av PET gjør det mulig å oppdage og kvantifisere hypoksiske vev i høy følsomhet og spesifisitet. En viktig vurdering for [18 F]FMISO og [18F]FDG PET involverer opptakstid og administrasjonsmåte for radiotracer hos mus. Begge radiotracere har forskjellig in vivo farmakokinetikk, den ene er den fysiologiske opptaksforskjellen, observert i tarm / blære og hjerte / blære for [18 F] FMISO og [18 F] FDG, henholdsvis, og den andre er at [18 F] FMISO akkumuleres i den hypoksiske regionen av svulsten, og [18 F] FDG tas fortrinnsvis opp i den høye metabolske tumorregionen 16. Den høye lipofilisiteten og langsom leverclearance av [18F] FMISO krever en 2-4 timers tid etter injeksjon for å oppnå en god tumor-til-lever-kontrast17. Vi fant at 3 timer etter injeksjon er tilstrekkelig til å differensiere og avgrense tumoropptak [18F]FMISO fra lever for både hypoksiske (H2) og kontrollgrupper (C1). Når det gjelder [18 F]FDG PET, er en tid på 1 time etter injeksjon tilstrekkelig til å gi god kontrast, som tidligere beskrevet13,15, og ble brukt i denne studien. Likevel er det viktig å holde en konsekvent opptakstid for radiotracer for å sikre påliteligheten av PET-resultater, spesielt for SUV-baserte analyser. Her brukte vi intravenøse teknikker for å administrere radiotracer til musene. Vellykket injeksjon i halevene indikeres av et synlig tilbakeblikk i blodet før radiotracerinfusjonen, hvor nålen er nøyaktig plassert i venen. En stor ulempe med denne metoden er at forventet tilbakeblikk i blodet kan være vanskelig å observere på grunn av hypotensjon, med variabilitet observert mellom mus. Likevel kan slike vanskeligheter overvinnes ved å varme halen i en kort periode på 1-2 minutter før nålen settes inn, enten med en varm vaskeklut eller med en varmelampe for å øke blodstrømmen og forbedre venens synlighet for vellykket injeksjon.
Med den økende bruken av PET-avbildning for å kvantifisere radiotracer biodistribusjon hos små dyr, er en viktig vurdering å merke seg bruken av en nøyaktig og godt kalibrert PET-skanner for å gi gode, reproduserbare og kvantifiserbare PET-data. Et nøyaktig PET-system gjør det mulig å utføre bildebehandlingsstudier på en mer tidseffektiv og kostnadseffektiv måte, og muliggjør implementering av 3Rs-prinsippene (erstatning, reduksjon og forfining) i dyreforsøk. Av den grunn må rutinemessige kvalitetskontrollinspeksjoner utføres, helst på ukentlig basis, for å undersøke PET- og MR-komponentene i bildesystemet i henhold til produsentens anbefaling. Spesielt bør nøyaktigheten for PET-aktivitet kontrolleres og registreres ofte, så vel som før starten av et bildeeksperiment, for å sikre påliteligheten av PET-kvantifisering. Dette er viktig for alle langsgående studier som involverer kvantitativ evaluering av svulsten og vevet over en undersøkelsesperiode for å gi meningsfulle og sammenlignbare resultater. Kalibrering av systemet er nødvendig når PET-aktivitetsnøyaktigheten viser seg å være utenfor det anbefalte området, samt når feiljustering av PET- og MR-bilder oppdages.
Selv om teknikkene beskrevet her muliggjør PET-avbildning av de hypoksiske HCC-xenotransplantatene for et bredt spekter av in vivo-undersøkelser , bør det vurderes noen begrensninger når man vurderer bruken av disse protokollene. Opprettelsen av HAL HCC xenotransplantater er en kompleks intra-abdominal kirurgisk prosedyre for å utføre på 6-8 uker gamle immundefekte mus. I tillegg kan den lille leverarterien i disse unge musene være vanskelig å lokalisere, noe som gjør ligeringsprosessen teknisk utfordrende. Disse prosedyrene krever tilstrekkelig opplært personell for å forbedre operasjonssuksesjonsraten, samt overlevelse av mus over en periode, dvs. 4-6 uker før xenotransplantater dannes, mens det forventes omfattende dyrepleie gjennom operasjonsperioden, som er både tids- og ressurskrevende. Det forventes også at opprettelsen av ortotopiske HCC-xenotransplantater ved hjelp av denne metoden vil kreve rundt 8 uker før vellykket PET-avbildning, siden implantasjon av tumorkuben brukes i stedet for direkte injeksjon av cellesuspensjoner for å unngå peritoneal metastase. Likevel kan disse begrensningene overvinnes med tilstrekkelig planlegging og opplæring av forskerpersonale. Utvalgsstørrelsen til eksperimentgruppene som er rapportert her, er også liten, noe som kanskje ikke er egnet for statistisk analyse. Våre observasjoner viser imidlertid subjektivt en trend der HAL-indusert hypoksi ble målt i både tumor og lever i H2 sammenlignet med C1-gruppen, noe som støttes av mer fremtredende HIF-1α-farging i H2-tumorprøvene. Vi jobber for tiden med å utvide tumormodellene med andre humane HCC-cellelinjer. Også terapeutiske studier rettet mot hypoksibanen i HCC som involverer disse xenotransplantatene er i gang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi anerkjenner støtten fra Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) for eksperimentene med bildebehandling av små dyr. Vi takker også støtten fra Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) ved University of Hong Kong for levering av [18 F] FMISO og [18F] FDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
