Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att skapa ortotopiskt hepatocellulärt karcinom xenotransplantat med och utan leverartärligering och utföra icke-invasiv positronemissionstomografi (PET) avbildning av tumörhypoxi med [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) och [18 F] Fluorodeoxiglukos ([18F] FDG).
Abstract
Prekliniska experimentella modeller av hepatocellulärt karcinom (HCC) som rekapitulerar mänsklig sjukdom utgör ett viktigt verktyg för att studera tumörgenes och utvärdera nya terapeutiska metoder. Icke-invasiv helkroppsavbildning med positronemissionstomografi (PET) ger kritiska insikter i vävnadernas in vivo-egenskaper på molekylär nivå i realtid. Vi presenterar här ett protokoll för ortotopisk HCC xenograftskapande med och utan leverartärligering (HAL) för att inducera tumörhypoxi och bedömningen av deras tumörmetabolism in vivo med användning av [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) och [18 F] Fluorodeoxyglukos ([18F] FDG) PET / magnetisk resonans (MR) avbildning. Tumörhypoxi kunde lätt visualiseras med hjälp av hypoximarkören [18 F] FMISO, och det visade sig att [18 F] FMISO-upptaget var högre hos HCC-möss som genomgick HAL än i icke-HAL-gruppen, medan [18F] FDG inte kunde skilja tumörhypoxi mellan de två grupperna. HAL-tumörer visade också en högre nivå av hypoxiinducerbar faktor (HIF)-1α-uttryck som svar på hypoxi. Kvantifiering av HAL-tumörer visade en 2,3-faldig ökning av [18F] FMISO-upptag baserat på metoden för standardiserat värdeupptag (SUV).
Introduction
Hepatocellulärt karcinom (HCC) är den sjätte mest diagnostiserade cancern och den tredje vanligaste dödsorsaken från cancer över hela världen, med mer än 900 000 nya fall och 800 000 dödsfall 20201. Den största riskfaktorn är cirros, som uppstår som ett resultat av virusinfektioner (hepatit B- och C-virus), alkoholmissbruk, diabetes och alkoholfri steatohepatit2. Hanteringen av HCC är ganska komplex, och flera behandlingsalternativ finns tillgängliga, inklusive kirurgisk resektion, termisk eller kemisk ablation, transplantation, transarteriell kemoembolisering, strålning och kemoterapi, beroende på sjukdomsstadiet 2,3. HCC är en kemoterapirefraktär tumör med sjukdomsåterfall hos upp till 70% av patienterna efter behandling med botande avsikt2.
Trots den höga graden av tumörheterogenitet är HCC associerad med två vanliga resultat: (i) HCC är mycket hypoxisk och (ii) tumörhypoxi är kopplad till större tumöraggressivitet och behandlingssvikt. Den okontrollerade spridningen av HCC-celler resulterar i en hög syreförbrukningshastighet som föregår vaskularisering, vilket skapar en hypoxisk mikromiljö. Låga intratumorala syrenivåer utlöser sedan en rad biologiska svar som påverkar tumöraggressivitet och behandlingssvar. Hypoxiinducerbara faktorer (HIF) erkänns ofta som de väsentliga transkriptionsregulatorerna vid svar på hypoxi 2,3. Därför är förmågan att upptäcka hypoxi avgörande för att visualisera neoplastiska vävnader och identifiera de otillgängliga platserna, som kräver invasiva förfaranden. Det bidrar också till att bättre förstå de molekylära förändringar som leder till tumöraggressivitet och förbättra patientens behandlingsresultat.
Molekylär avbildning med positronemissionstomografi (PET) används ofta vid diagnos och stadieindelning av många cancerformer, inklusive HCC. I synnerhet kan kombinerad användning av PET-avbildning med dubbla spårämnen som involverar [18 F]fluorodeoxiglukos ([18F]FDG) och [11 C]acetat avsevärt öka den totala känsligheten vid HCC-diagnos 4,5. Avbildning av hypoxi kan å andra sidan uppnås genom att använda den vanliga hypoxiska markören [18 F] Fluoromisonidazol ([18F] FMISO). I klinisk praxis är den icke-invasiva bedömningen av hypoxi viktig för att skilja mellan olika typer av tumörer och regioner för strålterapiplanering6.
Preklinisk avbildning har blivit ett oumbärligt verktyg för icke-invasiv och longitudinell utvärdering av musmodeller för olika sjukdomar. En robust och mycket reproducerbar HCC-modell utgör en viktig plattform för preklinisk och translationell forskning om patofysiologin hos humanläkemedel och bedömningen av nya terapier. Tillsammans med PET-avbildning kan in vivo-beteenden belysas för att ge viktiga insikter på molekylär nivå för en given tidpunkt. Här beskriver vi ett protokoll för generering av leverartärligering (HAL) ortotopisk HCC xenotransplantat och analys av deras in vivo tumörmetabolism med användning av [18 F] FMISO och [18F] FDG PET / MR. Inkorporeringen av HAL gör en lämplig modell av transgena eller kemiskt inducerade HCC-möss xenotransplantat för att studera tumörhypoxi in vivo, eftersom HAL effektivt kan blockera den arteriella blodtillförseln för att inducera intratumoral hypoxi 7,8. Dessutom, till skillnad från immunohistokemisk färgning ex vivo med pimonidazol, kan förändringar i tumörmetabolism som ett resultat av hypoxi lätt visualiseras och kvantifieras noggrant icke-invasivt med hjälp av PET-avbildning, vilket möjliggör longitudinell bedömning av behandlingssvar eller mätning av uppkomsten av resistens 3,7,8 . Vår metod som visas här möjliggör skapandet av en robust hypoxisk HCC-modell tillsammans med icke-invasiv övervakning av tumörhypoxi med PET / MR-avbildning för att studera HCC-biologi in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier utfördes i enlighet med kommittén för användning av levande djur i undervisning och forskning (CULATR) vid Center for Comparative Medicine Research (CCMR) vid University of Hong Kong, ett program ackrediterat av Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Djuren som användes i studien var honmöss av typen BALB/cAnN-nu (naken) vid 6-8 veckors ålder, viktade vid 20 g ± 2 g. Mat och vatten tillhandahölls ad libitum.
1. Subkutan injektion av humana hepatocellulära karcinomcellinjer
MHCC97 är en human HCC-cellinje som används för att generera den subkutana HCC-xenograftmodellen. MHCC97L-celler erhålls från Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital of Fudan University, Shanghai, Folkrepubliken Kina9 och autentiseras genom kort tandemupprepning (STR) profilering.
- Odla MHCC97L-celler och behåll i odlingsmedier kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin och streptomycin i en T-75-cellodlingskolv vid 37 °C i en fuktad inkubator försedd med 5 % CO2 (se materialtabell). Byt odlingsmedia var 2: e dag och skörda cellerna vid 80% -90% sammanflöde.
OBS: Startcellnumret är 1,5 x 10 6 celler, och cellerna används inom6-8 passager. - Förvara odlingsmediet och trypsin-etylendiamintetraättiksyra (trypsin-EDTA) vid 4 °C i mörker tills de används. Förvärm odlingsmediet till 37 °C och trypsin-EDTA till rumstemperatur före användning. Se materialförteckningen för alla reagenser och förbrukningsvaror som används i det här avsnittet.
- Ta bort kulturmediet. Skölj cellskiktet med 10 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (DPBS, se Materialförteckning).
- Tillsätt 5 ml trypsin-EDTA till odlingskolven och inkubera cellerna vid 37 °C. Kontrollera cellerna under ett inverterat mikroskop med 20x förstoring (se materialförteckning) tills cellskiktet är dispergerat och helt lossnat från kolven. Se till att cellerna inte lämnas i trypsin-EDTA i mer än 15 minuter.
- Tillsätt 5 ml odlingsmedia till odlingskolven. Aspirera cellerna genom att pipettera försiktigt. Överför cellsuspensionen till ett centrifugrör och snurra vid 1,107 x g i 5 minuter (se Materialförteckning).
- Ta bort supernatanten och suspendera försiktigt cellpelleten med 1 ml PBS. Pipettera noggrant för att erhålla en encellssuspension. Bestäm cellnumret med hjälp av den automatiska cellräknaren (se materialförteckning) och förbered cellsuspensionen till en koncentration av 5 x 106 celler / ml i PBS.
- Dra upp 200 μl cellsuspension med en 25 G nål i en 1 ml spruta. Varje spruta innehåller 1 x 106 MHCC97L-celler (i 200 μL). Håll sprutan på våt is.
- Bedöva musen med en intraperitoneal (i.p.) injektion av en blandning av ketamin (87,5 mg/kg) och xylazin (12,5 mg/kg). Se till att anestesi är korrekt med hjälp av tå-klämreflexen. Se till att applicera ögonsmörjmedel på musen för att förhindra torkning och potentiell bildning av hornhinnessår. Placera musen i ryggläge på en steril dyna (se Materialförteckning).
- Sterilisera ryggområdet nära musens nedre flank (antingen vänster eller höger sida) med 70% etanol (se materialtabell). Lyft upp huden med pincett och för försiktigt in nålfasningen under huden.
- För nålen 4–5 mm längs det subkutana planet från punkteringsstället för att undvika oavsiktligt läckage av cellsuspensionen från injektionsstället när nålen dras upp. Se till att nålinsättningen inte är för djup under huden, vilket kan orsaka oavsiktlig organskada.
- Släpp pincetten och töm försiktigt och långsamt innehållet i sprutan, var försiktig så att du inte tränger in på motsatt sida. Dra ut nålen för att kontrollera om injektionen sväller. Placera musen tillbaka i buren sittande ovanpå en förvärmd värmedyna för att hjälpa till med återhämtning från anestesin och för att återfå rörligheten. Fortsätt att övervaka musen tills musen är helt vaken och bibehåller sternal liggande.
- Övervaka musens tumörtillväxt och välbefinnande varje vecka. Mät tumörvolymen (V) med hjälp av en bromsok (se materialtabell). Beräkna och registrera tumörvolymen med följande formel10:
V = (W 2× L)/2
där W är bredden och L är tumörens längd. - Mellan 4-6 veckor efter injektion, kontrollera att en signifikant storlek av subkutan tumör, mellan 800-1000 mm3, erhålls. Se till att den totala tumörbelastningen inte överstiger 10% av kroppsvikten.
2. Ortotopisk leverimplantation och leverartärligering
- Förbered följande kirurgiska reagens och verktyg i ett desinficerat biologiskt säkerhetsskåp: 10 ml odlingsmedia i en skål, 10% povidon-jodlösning, 70% etanol, autoklaverade kirurgiska instrument, dvs vass sax, fjädersax, pincett (böjd fin och rak trubbig), nålhållare, skalpellblad, 6-0 och 5-0 nylonsutur, en värmedyna.
- Autoklav alla kirurgiska instrument och hantera dem endast på en steril bänk. Ge adekvat och nödvändig pre-, intra- och postoperativ vård till mössen under hela kirurgiska ingrepp (se steg nedan).
- För preoperativ smärtlindring, injicera musen med en subkutan injektion av buprenorfin (0,1 mg/kg) minst 30 minuter före det kirurgiska ingreppet. För postoperativ vård och behandling, injicera musen med en subkutan injektion av buprenorfin (0,1 mg/kg) i 3 dagar kontinuerligt, en gång var 8-12 timme. Se materialförteckningen för alla reagenser och förbrukningsvaror som används i det här avsnittet.
- Avliva den subkutana tumörbärande musen med en intravenös injektion av pentobarbital (330 mg/kg). Gör ett snitt på tumörställets hud med ett skalpellblad. Punktmarkera det subkutana tumörblocket och överför det omedelbart till odlingsmediet. Utför detta steg så snabbt som möjligt.
- Skär tumörblocket i 1 mm3 små tumörbitar med vass kirurgisk sax. Håll alla tumörbitar i odlingsmediet. Undvik att använda kärnregionen i det subkutana tumörblocket.
- Bedöva musen som kommer att genomgå den efterföljande ortotopiska tumörimplantationsoperationen med en ip-injektion av en blandning av ketamin (87,5 mg / kg) och xylazin (12,5 mg / kg). Se till att minst 30 minuter har gått efter att buprenorfin har givits innan musen bedövas. Se till att applicera ögonsmörjmedel på musen för att undvika torkning och potentiell bildning av hornhinnessår.
- Placera musen i ryggläge på en steril dyna som ligger ovanpå en förvärmd värmedyna. Övervaka och registrera musens fysiologiska tillstånd var 15: e minut fram till slutet av det kirurgiska ingreppet.
- Förläng musens lemmar. Säkra dem med tejp för att maximera exponeringen av buken och bröstkorgen. Sterilisera hela bukhuden på musen med en 10% povidon-jodlösning, följt av 70% etanol. Bedöm musens bedövningsdjup genom att kontrollera om det inte finns något svar på tåklämning - pedaluttagsreflexen.
- Utför en laparotomi genom att göra ett cirka 10 mm mittlinjesnitt för att komma åt bukhinnan med en vass sax. Kläm fast och dra xiphoidprocessen mot huvudet med pincett och applicera subkostalupprullarna för att öppna det kirurgiska fältet. Se till att ett korrekt snitt görs för att möjliggöra en bra kirurgisk bild av operationsstället.
- Dra tillbaka medianen och vänstra loberna uppåt med en våt gaspinne. Flytta tarmarna utanför buken på vänster sida av musen och täck dem med en våt gaspinne. Utför leverartärligering (HAL) på den gemensamma leverartären (CHA), som härstammar från bukspottskörtelhuvudet till dess rot i leverpedikeln, under en förstoringslampa för optimerad visualisering.
- Dra in median- och vänsterloberna bakåt/nedåt med en våt gaspinne för att exponera vänster lob. Gör ett snitt på ungefär 2 mm i längd och djup på ytan av vänster lob med ett sterilt skalpellblad.
OBS: Det är också möjligt att använda medianloben i levern för tumörimplantation för att minimera oavsiktliga tårar eller laceration genom trauma till närliggande bukorgan. - Sätt omedelbart in ett tumörfragment i leversnittet med sterila pincett. Begrava tumören så att den sitter säkert i levern. Applicera en figur-av-åtta sutur med en 6-0 nylonsutur över snittstället för att säkerställa korrekt tumörfragmentimplantation i levern och hemostasen. Utför denna operation så snabbt som möjligt för att undvika överdriven blödning. När du är klar, stäng buksnittet med avbrutna 5-0 suturer.
- Placera musen tillbaka i buren och sitta ovanpå en förvärmd värmedyna för att hjälpa till med återhämtning från anestesi och för att återfå rätningsreflexen. Fortsätt att övervaka och registrera musens fysiologiska tillstånd var 15:e minut tills musen är helt vaken och bibehåller sternal liggande.
- Upprepa proceduren tills alla möss har gått igenom ortotopisk tumörimplantation. Ge postoperativ vård till alla möss genom att kontinuerligt övervaka deras fysiologiska tillstånd dagligen under de närmaste 3 dagarna efter operationen. Ge buprenorfin (0,1 mg/kg) var 8-12:e timme.
3. Inställning av PET/MR-kalibreringar och arbetsflöde
OBS: Bildtagning utförs med hjälp av ett prekliniskt PET/MR 3T-system (se Materialförteckning).
- Använd 5% isofluran (1 l/min medicinsk O2) för att bedöva musen i en induktionskammare. För varje skanning, placera försiktigt den bedövade musen på en bildbädd med kontinuerlig uppvärmning; skanna först med MR (scoutvy) som en anatomisk referens för statiska [18 F] FMISO- eller [18F] FDG PET-skanningar, följt av anatomisk referens MR-avbildning.
- Skapa ett sekventiellt arbetsflöde för PET/MR-avbildning i programvaran (se Materialförteckning) för att inkludera en statisk PET-skanning, T1-viktad (dämpningskorrigering) och T2-viktad (anatomisk referens) MR-avbildning och PET-rekonstruktion 1 dag före den schemalagda bildsessionen.
- För att få PET, välj 400-600 keV nivådiskriminering, F-18-studieisotop, 1-5 sammanfallsläge och 20 minuters skanningar.
- För att få helkropps T1-viktad MR, använd gradient echo-3D med TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, synfält (FOV) = 90 mm x 60 mm, antal excitationer (NEX) = 3, 28 skivor med 0,9 mm tjocklek och voxelstorlek = 0,375 mm 3 x 0,375 mm 3 x 0,9 mm 3.
- För att få helkropps T2-viktad MR, använd snabbspinneko 2D med TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 28 skivor med 0,9 mm tjocklek, voxelstorlek = 0,265 mm 3 x 0,268 mm 3 x 0,9 mm 3.
- För att rekonstruera PET, välj Tera-Tomo (TT3D) algoritm, iterationer = 8, delmängder = 6, 1-3 sammanfallsläge och med sönderfall, dödtid, slumpmässig, dämpning och spridningskorrigeringar för att skapa bilder med en total voxelstorlek på 0,3 mm3.
- Utför ett PET-aktivitetstest innan experimentet påbörjas för att kontrollera noggrannheten i PET-kvantifieringen11.
- Fyll en 5 ml spruta med 5-8 MBq [18F] FMISO utspädd i vatten eller saltlösning enligt tillverkarens rekommendation. Använd en doskalibrator för att registrera sprutans aktivitet (se Materialförteckning). Notera mättiden.
- Rita en volym av intresse (VOI) på den rekonstruerade bilden för att täcka hela sprutan. Jämför den återvunna aktiviteten från bilden med värdet från doskalibratorn. Fortsätt med avbildningsstudier när den återvunna aktiviteten är korrekt inom ±5%.
4. [18 F]FMISO och [18F]FDG-injektion
- Erhåll en klinisk dos på [18F]FMISO från leverantören 30 minuter före starten av avbildningsstudierna. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE), såsom en labbrock, handskar, över glasögon, ett filmmärke och ringdosimetrar vid hantering av radioaktiva material. Byt handskar ofta för att undvika korskontaminering av de radioaktiva ämnena.
- Placera de radioaktiva stamlösningarna i blyförvaringsbehållaren bakom ett L-block bordsskydd. Fördela en alikvot av [18F]FMISO och späd med steriliserad saltlösning. Se till att den totala aktivitetskoncentrationen är 18-20 MBq i 100 μL.
- Dra upp [18F]FMISO med en 1 ml spruta med nål (se Materialförteckning). Anteckna den radioaktivitet och tid som visas på doskalibratorn.
- Anteckna musens vikt före injektionen av radiotracern. Använd 5 % isofluran (1 l/min medicinskO2) för att bedöva musen och injicera sedan försiktigt den beredda [18F]FMISO via svansvenen. Registrera sprutans injektionstid och restaktivitet för att ta hänsyn till korrigering av sönderfall. Sätt tillbaka musen i buren i 180 minuter för att tillåta [18F]FMISO-upptag före PET-skanningen. Låt musen återhämta sig i 1 dag efter [18F]FMISO PET.
OBS: Trots de mycket olika farmakokinetiska profilerna in vivo för [18 F] FMISO och [18 F] FDG, är båda radiotracers radiomärkta med F-18, vilket är en PET-radionuklid med en halveringstid på 109,77min (< 2 timmar). Eftersom PET-signalen kommer från F-18 kommer hälften av den initiala injicerade radioaktiviteten att gå förlorad var 2: e timme. I detta fall kan restsignalen 24 timmar efter injektion inte längre detekteras av PET-skannern. Dessutom kommer 1 dags mellanrum mellan både [18 F] FMISO (dag 1) och [18 F] FDG (dag 3) injektioner att tillåta fullständigt sönderfall av [18 F] FMISO när [18 F] FDG PET utförs, därför ingen överlappning av [18 F] FMISO-signalen i [18F] FDG PET-skanningen. - Upprepa steg 4.1.-4.4. för [18F]FDG-injektionen på dag 3, med undantag för att en total aktivitetskoncentration på 6–8 MBq i 100 μl injiceras med 60 minuters upptag innan PET-skanningen påbörjas.
- Beräkna den injicerade [18 F]FMISO- eller [18F]FDG-aktiviteten med hjälp av följande formel 11:
Injicerad aktivitet (MBq) = Aktivitet i sprutan före injektion - Aktivitet i sprutan efter injektion
5. Förvärv av PET/MR
- Slå på luftvärmaren för att värma musavbildningsbädden före den schemalagda PET-skanningen. Använd 5% isofluran (1 l/min medicinsk O2) för att bedöva musen i en induktionskammare.
- När den är ordentligt bedövad och kontrollerad med tå-pinch-svaret, överför försiktigt och omedelbart musen till värmebädden och behåll anestesi vid 2% -2,5% isofluran. Placera mushuvudet på bettstången och applicera ögonsmörjmedel på båda ögonen för att undvika uttorkning och potentiell bildning av hornhinnessår. Täck bildbädden med ett plastlakan för att bibehålla sängens omgivningstemperatur.
- Övervaka och registrera musens andningsfrekvens och kroppstemperatur med hjälp av den egna andningsdynan respektive den termiska sonden. Se till att musens kroppstemperatur hålls på 37 °C medan andningsfrekvensen hålls i intervallet 40-50 andetag per minut (bpm) genom att justera isoflurannivån.
- Utför en scoutvy för att hitta muspositionen inuti skannern. Justera musbäddens position så att den täcker hela muskroppen, med bålregionen placerad i mitten av MR.
- För att starta en PET-skanning, välj PET-förvärv i fönstret med studielistan och välj sedan Skanna intervall vid tidigare förvärv för att använda den förutbestämda musbäddspositionen från scoutvyn. Klicka på Förbered > OK för att automatiskt flytta musbädden från MR till PET och starta förvärvet.
- Under Radiopharmaceutical Editor väljer du lämplig radionuklid och anger sedan information om injektionsdosen och tiden före och efter [18 F]FMISO eller [18F]FDG injektion, mätt i steg 4.3. och steg 4.4. Ange musens vikt under menyn Ämnesinformation.
- Fortsätt med MR-förvärv efter avslutad PET-skanning. Det gör du genom att välja Förbered för att flytta musen till MR från PET. Klicka på OK för att fortsätta.
- När alla skanningar är klara väljer du Hem för att flytta tillbaka bildbädden till standardpositionen.
- Stäng av bedövningen och spola bildbädden med medicinsk O2. Kontrollera muspedalens uttagsreflex. Överför musen från bildbädden tillbaka till en ren husbur placerad ovanpå en värmedyna för att hjälpa till med återhämtning från anestesi och för att återfå rätningsreflexen.
- Under Raw Scan väljer du PET-förvärv för att läsa in inhämtade rå-PET-data för PET-rekonstruktion. Välj MM för användning som materialmappning. Fortsätt med PET-rekonstruktion med parametern som beskrivs i steg 3.6.
- Följ strikt de lokala och institutionella riktlinjerna vid hantering av möss efter PET-avbildningsstudier. Behandla alla använda förbrukningsvaror, t.ex. sprutor, nålar, handskar, våtservetter och biologiskt avfall, t.ex. burströ och avföring, som har varit i direkt kontakt med musen som radioaktivt avfall, och hantera med försiktighet enligt lokala föreskrifter.
6. PET-bildanalys
- Öppna programvaran Bildanalys (se Materialförteckning) och välj Läs in DICOM-data för att öppna PET- och MR-bilderna.
- Dra motsvarande PET- och MR-bilder till programvarans visningsfönster och välj Automatisk registrering för att utföra automatisk samregistrering av de resulterande PET- och MR-bilderna.
- Under menyn Registreringsinställningar väljer du Styv transformering. Använd Skift och rotation i menyn Rigid/Affine .
- Under menyn Global Role Selection klickar du på MM som referens och Static PET Scan som Reslice.
- Kontrollera de samregistrerade PET/MR-bilderna för att säkerställa korrekt justering. Om det behövs använder du manuell registrering för att justera bilderna manuellt.
- Lokalisera den ortotopiska tumören i levern med hjälp av MR-bilden. Använd interpolerad ellips ROI för att rita en VOI på tumören, med hjälp av MR-bilden som referens. Överför den skapade tumören VOI från MR till PET-bilden. Välj penselverktyget och suddgummiverktyget för att noggrant definiera VOI-kantlinjen bild för bild. Se till att undvika spridning av radioaktivitetsupptag från levern på PET-bilden.
- Använd Ellipsoid VOI för att skapa en 3 mm3 VOI på levern som referensorgan. Se till att undvika områden med synliga lever-, kärl- och gallstrukturer genom att använda MR-bilden som vägledning.
- Välj Visa ROI-tabell för att byta namn på alla ritade VOI:er. Registrera alla nödvändiga data, t.ex. radioaktivitet (kBq / ml) och tumörvolym (mm3), i ett kalkylblad. Spara en kopia av VOI-ritningarna och arkivera både rådata och rekonstruerade bilddata på en extern hårddisk när du är klar.
- Beräkna det standardiserade upptagningsvärdet (SUV) för alla VOI med hjälp av följande ekvation11:
SUV = CPET (t) / (ID / BW)
där CPET(t) är den uppmätta aktiviteten i VOI, ID är den injicerade dosen mätt i kBq och BW är musens kroppsvikt i kg, med antagande av en vävnadsdensitet på 1 g/ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att erhålla ett lämpligt tumörblock för successiv ortotopisk implantation genererades stabila kloner först genom subkutan injektion av 200 μL cellsuspension i DPBS (innehållande MHCC97L-celler) i den nedre flanken av nakna möss (figur 1A). Tumörtillväxt övervakades och när tumörstorleken nådde 800-1000 mm 3 (cirka 4 veckor efter injektion) avlivades möss och det resulterande tumörblocket skars i cirka 1 mm3 fragment för efterföljande leverortotopisk implantation i en annan sats nakna möss (n = 6). Möss randomiserades i två grupper: kontroll (C1, n = 3) och leverartärligering (H2, n = 3). HAL utfördes genom att binda en fin tråd runt leverartärens huvudgren. C1-möss skonades från HAL före ortotopisk implantation. Denna manipulation ledde till tumörhypoxi hos H2 men inte C1-möss, och tumörens hypoxiska status kunde övervakas icke-invasivt med hjälp av PET-hypoxiskt spårämne [18F] FMISO. PET/MR-studier visade att en ökning av tumörupptaget [18 F]FMISO endast observerades hos H2-mössen, medan tumörupptaget förblev likartat mellan de två grupperna med användning av den glykolytiska markören [18F]FDG.
HAL-inducerad hypoxi i tumörer validerades ytterligare genom att undersöka uttrycksnivåerna av HIF-1α12, och jämförelser gjordes mellan grupperna. I överensstämmelse med en mer hypoxisk tumör efter HAL uppvisade H2-gruppen högre HIF-1α-uttryck än C1-gruppen (optisk densitet: 0,17 vs. 0,13, H2 respektive C1), vilket bekräftar deras tumör [18F] FMISO-upptag (figur 2A). [18F] FMISO-upptagningen kvantifierades med hjälp av den SUV-baserade metoden. H2-tumörer visade en 2,3-faldig ökning av [18F] FMISO-upptag jämfört med C1-tumörer (SUVmax: 1,2 respektive 2,8, figur 2B). På samma sätt resulterade HAL också i ett högre upptag av lever-SUV i H2 än C1-möss (figur 2C). Sammantaget visar vi här att HAL effektivt kan inducera tumörhypoxi i HCC-ortotopiska xenotransplantat, och tumörhypoxi kan övervakas icke-invasivt med hjälp av [18F] FMISO PET-avbildning, med stöd av ex vivo-immunohistokemimarkören HIF-1α-uttryck. Dessutom erbjuder införlivandet av MR-avbildning en utmärkt mjukvävnadskontrast för att möjliggöra tydlig avgränsning av tumören från levern, vilket möjliggör noggrann PET-kvantifiering.
Figur 1: PET/MR-avbildning in vivo av ortotopiska HCC-möss xenotransplantat. (A) Schematisk bild av subkutana och ortotopiska xenograftskapelser och PET-avbildningsstudier i ortotopiska MHCC97L-tumörer. (B) Representativa PET-bilder med maximal intensitet (MIP) av [18 F] FMISO och [18F] FDG hos möss med ortotopiska MHCC97L-tumörer (C1) utan eller (H2) med HAL. Blå cirklar indikerar tumörens placering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Analys av möss med ortotopiska MHCC97L-tumörer med och utan HAL. (A) Representativ samregistrerad [18F] FMISO PET / MR-bilder, immunhistokemifärgning för HIF-1α och hematoxylin och eosin (HE) i tumörsektioner. (B-C) Kvantitativ analys av [18F] FMISO upptag i tumör och lever. N = 3 för varje grupp. Värden för SUV presenteras som medelvärde ± medelfel (SEM). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie beskrev vi procedurerna för att utföra HAL på leverortotopiska HCC-xenotransplantat med subkutana tumörer, tillsammans med metoder för icke-invasiv övervakning av tumörhypoxi i ortotopiska xenotransplantat med användning av [18 F] FMISO och [18F] FDG PET / MR. Vårt intresse ligger i metabolisk avbildning av olika cancer- och sjukdomsmodeller för tidig diagnos och utvärdering av behandlingssvar11,13,14,15. Hittills har skapandet av HAL HCC xenotransplantat och deras in vivo tumörmetabolism sällan beskrivits i litteraturen, vilket fick oss att undersöka de metaboliska egenskaperna hos dessa tumörmodeller med hjälp av PET-avbildning.
Den framgångsrika etableringen av ortotopiska xenotransplantat med HAL som en robust musmodell för att studera hypoxi i HCC representerar en viktig aspekt för att studera HCC-biologi in vivo. Hypoxi är känt för att stimulera cancer malignitet. Dessutom har intratumoral hypoxi associerats med ökad proliferation, metastasering och radio- och kemoresistens och motiverar grundlig karakterisering av svaret på hypoxiska tillstånd7. Medan subkutana xenotransplantat ofta används för att studera HCC-tumörgenes eller behandlingsstrategier, kan ortotopiska modeller bättre rekapitulera human HCC-utveckling eftersom de återspeglar mer exakt tumörmikromiljön, särskilt påverkan på vaskularisering och tumör-stroma-interaktioner mot HCC-metastaser12. Inkorporeringen av HAL i HCC ortotopiska möss möjliggör induktion av intratumoral hypoxi genom att blockera den hepatiska arteriella blodiga tillförseln till tumören7. Sådana djurmodeller gör det möjligt att belysa mekanismer som ligger bakom effekterna av HAL på HCC och skapa nya vägar för effektiva terapier riktade mot hypoxivägen vid HCC. För ortotopisk implantation använde vi tumörkuben från den subkutana tumören istället för direkt injektion av HCC-cellsuspensioner. Vi har funnit att direkta cellinjektioner ofta orsakar en liten volym läckage från injektionsstället, även om proceduren utfördes så långsamt som möjligt med en låg injektionsvolym. Detta kan potentiellt leda till peritoneal metastasering, vilket är skadligt för djurens välbefinnande, vilket i slutändan påverkar det totala studieresultatet. Å andra sidan skulle implantation av ett litet tumörblock övervinna problemet, även om man måste se till att tumören är säkert suturerad efter implantation. Vid isolering av små tumörbitar från det subkutana tumörblocket är det också lämpligt att undvika kärnregionerna i den fasta tumören, som är relativt mindre vaskulariserade och mer metaboliskt stressade på grund av hypoxi och näringsbrist. Om du gör det kommer det att minska inkluderingen av döda tumörceller som verkar vara nekrotiska i den lilla tumörkuben och kommer att upprätthålla mer konsekventa tumörtillväxthastigheter över enskilda möss.
Hypoxi är en prognostisk faktor för cancerresistens, och övervakning av förändringar i hypoxi med PET möjliggör detektion och kvantifiering av hypoxiska vävnader i hög känslighet och specificitet. En viktig faktor för [18 F]FMISO och [18F]FDG PET gäller upptagningstiden för radiospårare och administreringsvägen hos möss. Båda radiotracers har olika farmakokinetik in vivo, den ena är den fysiologiska upptagsskillnaden, observerad i tarm / urinblåsa och hjärta / urinblåsa för [18 F] FMISO respektive [18 F] FDG, och den andra är att [18 F] FMISO ackumuleras i tumörens hypoxiska region, och [18F] FDG tas företrädesvis upp i den höga metaboliska tumörregionen 16. Den höga lipofiliciteten och långsamma leverclearance av [18F] FMISO kräver en 2-4 timmar efter injektionstiden för att uppnå en bra tumör-till-leverkontrast17. Vi fann att 3 timmar efter injektion är tillräcklig för att differentiera och avgränsa tumör [18F] FMISO upptag från levern för både hypoxiska (H2) och kontroll (C1) grupper. När det gäller [18 F]FDG PET är en tid på 1 timme efter injektionen tillräcklig för att ge god kontrast, som tidigare beskrivits13,15, och användes i denna studie. Att hålla en konsekvent upptagningstid för radiotracer är dock absolut nödvändigt för att säkerställa tillförlitligheten hos PET-resultat, särskilt för SUV-baserade analyser. Här använde vi intravenösa tekniker för att administrera radiotracer till mössen. Lyckad injektion av svansvenen indikeras av en synlig blodflashback före radiotracerinfusionen, där nålen är korrekt placerad i venen. En stor nackdel med denna metod är att den förväntade blodflashbacken kan vara svår att observera på grund av hypotoni, med variabilitet observerad mellan möss. Ändå kan sådana svårigheter övervinnas genom att värma svansen under en kort period av 1-2 minuter före nålinsättning, antingen med en varm tvättduk eller med en värmelampa för att öka blodflödet och förbättra venens synlighet för framgångsrik injektion.
Med den ökande användningen av PET-avbildning för att kvantifiera biodistribution av radiotracer hos små djur är en viktig faktor att notera användningen av en exakt och välkalibrerad PET-skanner för att ge bra, reproducerbara och kvantifierbara PET-data. Ett exakt PET-system gör det möjligt att utföra avbildningsstudier på ett mer tids- och kostnadseffektivt sätt och möjliggör implementering av 3R-principerna (ersättning, reduktion och förfining) i djurförsök. Därför måste rutinmässiga kvalitetskontroller utföras, helst en gång i veckan, för att undersöka PET- och MR-komponenterna i bildåtergivningssystemet enligt tillverkarens rekommendation. I synnerhet bör noggrannheten för PET-aktivitet kontrolleras och registreras ofta, liksom innan ett avbildningsexperiment inleds, för att säkerställa tillförlitligheten i PET-kvantifieringen. Detta är absolut nödvändigt för alla longitudinella studier som involverar kvantitativ utvärdering av tumören och vävnaderna under en undersökningsperiod för att ge meningsfulla och jämförbara resultat. Kalibrering av systemet krävs när PET-aktivitetens noggrannhet visar sig ligga utanför det rekommenderade intervallet, liksom när felinriktning av PET- och MR-bilder upptäcks.
Även om de tekniker som beskrivs här möjliggör PET-avbildning av hypoxiska HCC-xenotransplantat för ett brett spektrum av in vivo-undersökningar , bör vissa begränsningar beaktas när man överväger användningen av dessa protokoll. Skapandet av HAL HCC xenotransplantat är ett komplext intraabdominalt kirurgiskt ingrepp att utföra på 6-8 veckor gamla immunbristfälliga möss. Dessutom kan den diminutiva leverartären hos dessa unga möss vara svår att lokalisera, vilket gör ligeringsprocessen tekniskt utmanande. Dessa procedurer kräver lämpligt utbildad personal för att förbättra operationssuccessionshastigheten, liksom överlevnaden hos möss under en tidsperiod, dvs 4-6 veckor innan xenotransplantat bildas, medan tillhandahållandet av omfattande djurvård förväntas under hela operationsperioden, vilket är både tids- och resurskrävande. Det förväntas också att skapandet av ortotopiska HCC-xenotransplantat med denna metod kommer att kräva cirka 8 veckor före framgångsrik PET-avbildning, eftersom implantation av tumörkuben används snarare än direkt injektion av cellsuspensioner för att undvika peritoneal metastasering. Dessa begränsningar kan dock övervinnas genom lämplig planering och utbildning av forskningspersonal. Dessutom är provstorleken för de experimentgrupper som rapporteras här liten, vilket kanske inte är lämpligt för statistisk analys. Våra observationer avslöjar dock subjektivt en trend där HAL-inducerad hypoxi mättes i både tumören och levern i H2 jämfört med C1-gruppen, vilket stöds av mer framträdande HIF-1α-färgning i H2-tumörproverna. Vi arbetar för närvarande med att utöka tumörmodellerna med andra humana HCC-cellinjer. Dessutom pågår terapeutiska studier som riktar sig mot hypoxivägen i HCC som involverar dessa xenotransplantat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner stödet från Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) för smådjursavbildningsexperimenten. Vi tackar också stödet från Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) vid University of Hong Kong för tillhandahållandet av [18 F] FMISO och [18F] FDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
