Summary
Qui, presentiamo un protocollo per creare xenotrapianti di carcinoma epatocellulare ortotopico con e senza legatura dell'arteria epatica ed eseguire la tomografia ad emissione di positroni (PET) non invasiva dell'ipossia tumorale utilizzando [18 F]Fluoromisonidazolo ([18 F]FMISO) e [18 F]Fluorodesossiglucosio ([18F]FDG).
Abstract
I modelli sperimentali preclinici di carcinoma epatocellulare (HCC) che ricapitolano la malattia umana rappresentano uno strumento importante per studiare la tumorigenesi e valutare nuovi approcci terapeutici. L'imaging non invasivo di tutto il corpo utilizzando la tomografia ad emissione di positroni (PET) fornisce informazioni critiche sulle caratteristiche in vivo dei tessuti a livello molecolare in tempo reale. Presentiamo qui un protocollo per la creazione di xenotrapianto ortotopico HCC con e senza legatura dell'arteria epatica (HAL) per indurre ipossia tumorale e la valutazione del loro metabolismo tumorale in vivo utilizzando [18 F]Fluoromisonidazolo ([18 F]FMISO) e [18 F]Fluorodesossiglucosio ([18F]FDG) PET / risonanza magnetica (MR). L'ipossia tumorale poteva essere facilmente visualizzata usando il marcatore di ipossia [18 F] FMISO, e si è scoperto che l'assorbimento di [18 F] FMISO era più alto nei topi HCC sottoposti a HAL rispetto al gruppo non-HAL, mentre [18F] FDG non poteva distinguere l'ipossia tumorale tra i due gruppi. I tumori HAL hanno anche mostrato un livello più elevato di espressione del fattore inducibile dall'ipossia (HIF)-1α in risposta all'ipossia. La quantificazione dei tumori HAL ha mostrato un aumento di 2,3 volte nell'assorbimento di [18F] FMISO basato sull'approccio standardizzato di assorbimento del valore (SUV).
Introduction
Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il sesto tumore più diagnosticato e la terza causa più comune di morte per cancro in tutto il mondo, con oltre 900.000 nuovi casi e 800.000 decessi nel 20201. Il principale fattore di rischio è la cirrosi, che si verifica a seguito di infezioni virali (virus dell'epatite B e C), abuso di alcol, diabete e steatoepatite non alcolica2. La gestione dell'HCC è piuttosto complessa e sono disponibili diverse opzioni di trattamento, tra cui resezione chirurgica, ablazione termica o chimica, trapianto, chemioembolizzazione transarteriosa, radiazioni e chemioterapia, a seconda della stadiazione della malattia 2,3. L'HCC è un tumore refrattario alla chemioterapia con recidiva della malattia fino al 70% dei pazienti che seguono una terapia curativa2.
Nonostante l'elevato grado di eterogeneità tumorale, l'HCC è associato a due esiti comuni: (i) l'HCC è molto ipossico e (ii) l'ipossia tumorale è legata a una maggiore aggressività del tumore e al fallimento del trattamento. La proliferazione incontrollata delle cellule HCC si traduce in un alto tasso di consumo di ossigeno che precede la vascolarizzazione, creando così un microambiente ipossico. Bassi livelli di ossigeno intratumorale innescano quindi una serie di risposte biologiche che influenzano l'aggressività del tumore e la risposta al trattamento. I fattori inducibili dall'ipossia (HIF) sono spesso riconosciuti come i regolatori trascrizionali essenziali nella risposta all'ipossia 2,3. Quindi, la capacità di rilevare l'ipossia è fondamentale per visualizzare i tessuti neoplastici e identificare i siti inaccessibili, che richiedono procedure invasive. Aiuta anche a comprendere meglio i cambiamenti molecolari che portano all'aggressività del tumore e migliorare i risultati del trattamento del paziente.
L'imaging molecolare mediante tomografia ad emissione di positroni (PET) è comunemente usato nella diagnosi e nella stadiazione di molti tumori, incluso l'HCC. In particolare, l'uso combinato dell'imaging PET a doppio tracciante che coinvolge [18 F]fluorodesossiglucosio ([18F]FDG) e [11C]acetato può aumentare significativamente la sensibilità complessiva nella diagnosi di HCC 4,5. L'imaging dell'ipossia, d'altra parte, può essere ottenuto utilizzando il marcatore ipossico comunemente usato [18 F] Fluoromisonidazolo ([18F] FMISO). Nella pratica clinica, la valutazione non invasiva dell'ipossia è importante per differenziare tra vari tipi di tumori e regioni per la pianificazione della radioterapia6.
L'imaging preclinico è diventato uno strumento indispensabile per la valutazione non invasiva e longitudinale di modelli murini per diverse malattie. Un modello di HCC robusto e altamente riproducibile rappresenta un'importante piattaforma per la ricerca preclinica e traslazionale sulla fisiopatologia dell'HCC umano e la valutazione di nuove terapie. Insieme all'imaging PET, i comportamenti in vivo possono essere chiariti per fornire importanti informazioni a livello molecolare per un dato punto temporale. Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di xenotrapianti HCC ortotopici di legatura dell'arteria epatica (HAL) e l'analisi del loro metabolismo tumorale in vivo utilizzando [18 F]FMISO e [18F]FDG PET/MR. L'incorporazione di HAL rende un modello adatto di xenotrapianti di topi HCC transgenici o indotti chimicamente per studiare l'ipossia tumorale in vivo, poiché HAL può bloccare efficacemente l'afflusso di sangue arterioso per indurre ipossia intratumorale 7,8. Inoltre, a differenza della colorazione immunoistochimica ex vivo con pimonidazolo, i cambiamenti nel metabolismo tumorale a seguito di ipossia possono essere facilmente visualizzati e quantificati con precisione in modo non invasivo utilizzando l'imaging PET, consentendo la valutazione longitudinale della risposta al trattamento o la misurazione dell'emergenza di resistenza 3,7,8 . Il nostro metodo mostrato qui consente la creazione di un robusto modello di HCC ipossico insieme al monitoraggio non invasivo dell'ipossia tumorale utilizzando l'imaging PET / MR per studiare la biologia dell'HCC in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con il Comitato sull'uso di animali vivi nell'insegnamento e nella ricerca (CULATR) presso il Centre for Comparative Medicine Research (CCMR) dell'Università di Hong Kong, un programma accreditato dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio internazionale (AAALAC). Gli animali utilizzati nello studio erano topi femmina BALB/cAnN-nu (Nude) all'età di 6-8 settimane, pesati a 20 g ± 2 g. Cibo e acqua erano forniti ad libitum.
1. Iniezione sottocutanea di linee cellulari di carcinoma epatocellulare umano
NOTA: MHCC97 è una linea cellulare HCC umana che viene utilizzata per generare il modello di xenotrapianto sottocutaneo di HCC. Le cellule MHCC97L sono ottenute dal Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital della Fudan University, Shanghai, Repubblica popolare cinese9 e autenticate mediante profilazione a ripetizione tandem breve (STR).
- Coltura di cellule MHCC97L e mantenimento in terreni di coltura integrati con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina e streptomicina in un pallone di coltura cellulare T-75 a 37 °C in un incubatore umidificato fornito con il 5% di CO2 (vedi tabella dei materiali). Cambiare i terreni di coltura ogni 2 giorni e raccogliere le cellule all'80% -90% di confluenza.
NOTA: Il numero di celle iniziali è 1,5 x 10 6 celle e le celle vengono utilizzate entro6-8 passaggi. - Conservare i terreni di coltura e l'acido tripsin-etilendiamminotetraacetico (tripsina-EDTA) a 4 °C al buio fino all'uso. Preriscaldare i terreni di coltura a 37 °C e la tripsina-EDTA a temperatura ambiente prima dell'uso. Fare riferimento alla tabella dei materiali per tutti i reagenti e materiali di consumo utilizzati in questa sezione.
- Rimuovere i terreni colturali. Risciacquare lo strato cellulare con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato sterile (DPBS, vedere Tabella dei materiali).
- Aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA al matraccio di coltura e incubare le cellule a 37 °C. Controllare le cellule al microscopio invertito con un ingrandimento 20x (vedi Tabella dei materiali) fino a quando lo strato cellulare non è disperso e completamente staccato dal pallone. Assicurarsi che le cellule non vengano lasciate nella tripsina-EDTA per più di 15 minuti.
- Aggiungere 5 mL di terreno di coltura al pallone di coltura. Aspirare le cellule pipettando delicatamente. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga e ruotare a 1.107 x g per 5 minuti (vedere Tabella dei materiali).
- Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare con 1 mL di PBS. Pipettare accuratamente per ottenere una sospensione a cella singola. Determinare il numero di celle utilizzando il contatore automatico delle celle (vedere Tabella dei materiali) e preparare la sospensione cellulare a una concentrazione di 5 x 106 cellule / ml in PBS.
- Aspirare 200 μL di sospensione cellulare con un ago da 25 G in una siringa da 1 ml. Ogni siringa contiene 1 x 106 cellule MHCC97L (in 200 μL). Tenere la siringa su ghiaccio bagnato.
- Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una miscela di ketamina (87,5 mg/kg) e xilazina (12,5 mg/kg). Garantire una corretta anestesia utilizzando il riflesso del dito. Assicurati di applicare lubrificante per gli occhi al topo per prevenire l'essiccazione e la potenziale formazione di ulcere corneali. Posizionare il mouse in posizione supina su un tampone sterile (vedere Tabella dei materiali).
- Sterilizzare la regione dorsale vicino al fianco inferiore (lato sinistro o destro) del topo con etanolo al 70% (vedi Tabella dei materiali). Sollevare la pelle con una pinza e inserire delicatamente la smussatura dell'ago sotto la pelle.
- Far avanzare l'ago di 4-5 mm lungo il piano sottocutaneo dal sito di puntura per evitare perdite accidentali della sospensione cellulare dal sito di iniezione al momento del prelievo dell'ago. Assicurarsi che l'inserimento dell'ago non sia troppo profondo sotto la pelle, che potrebbe causare danni accidentali agli organi.
- Rilasciare la pinza e scaricare con attenzione e lentamente il contenuto della siringa, facendo attenzione a non penetrare nel lato opposto. Tiri fuori l'ago per verificare la presenza di un rigonfiamento sull'iniezione. Riposizionare il mouse nella gabbia seduto sopra una piastra riscaldante preriscaldata per aiutare con il recupero dall'anestesia e per recuperare la mobilità. Continuare a monitorare il mouse fino a quando il mouse è completamente sveglio e mantiene la reclinazione sternale.
- Monitorare la crescita tumorale e il benessere del topo su base settimanale. Misurare il volume del tumore (V) usando un calibro (vedi Tabella dei materiali). Calcolare e registrare il volume del tumore utilizzando la seguente formula10:
V = (L 2× L)/2
dove W è la larghezza e L è la lunghezza del tumore. - Tra 4-6 settimane dopo l'iniezione, verificare che si ottenga una dimensione significativa del tumore sottocutaneo, tra 800-1000 mm3. Assicurarsi che il carico tumorale totale non superi il 10% del peso corporeo.
2. Impianto epatico ortotopico e legatura dell'arteria epatica
- Preparare i seguenti reagenti e strumenti chirurgici in un armadio di sicurezza biologica disinfettato: 10 ml di terreno di coltura in un piatto, soluzione di iodio povidone al 10%, etanolo al 70%, strumenti chirurgici in autoclave, cioè forbici affilate, forbici a molla, pinza (curva fine e dritta smussata), porta aghi, lama di bisturi, sutura di nylon 6-0 e 5-0, una piastra riscaldante.
- Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici e maneggiarli solo su un banco sterile. Fornire l'adeguata e necessaria assistenza pre, intra e post-operatoria ai topi durante le procedure chirurgiche (vedere i passaggi seguenti).
- Per alleviare il dolore preoperatorio, iniettare nel topo un'iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,1 mg/kg) almeno 30 minuti prima dell'inizio della procedura chirurgica. Per la cura e la gestione post-operatoria, iniettare nel topo un'iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,1 mg/kg) per 3 giorni continuativi, una volta ogni 8-12 ore. Fare riferimento alla tabella dei materiali per tutti i reagenti e materiali di consumo utilizzati in questa sezione.
- Eutanasia del topo portatore di tumore sottocutaneo con un'iniezione endovenosa di pentobarbital (330 mg/kg). Fai un'incisione sulla pelle del sito tumorale usando una lama di bisturi. Asportare il blocco tumorale sottocutaneo e trasferirlo immediatamente ai terreni di coltura. Eseguire questo passaggio il più rapidamente possibile.
- Tagliare il blocco tumorale in 1 mm3 piccoli cubi tumorali usando forbici chirurgiche affilate. Mantenere tutti i cubi tumorali nei terreni di coltura. Evitare di utilizzare la regione centrale del blocco tumorale sottocutaneo.
- Anestetizzare il topo che sarà sottoposto al successivo intervento chirurgico di impianto tumorale ortotopico con un'iniezione endovenosa di una miscela di ketamina (87,5 mg/kg) e xilazina (12,5 mg/kg). Assicurarsi che siano trascorsi almeno 30 minuti dalla somministrazione della buprenorfina prima di anestetizzare il topo. Assicurati di applicare lubrificante per gli occhi al mouse per evitare l'essiccazione e la potenziale formazione di ulcere corneali.
- Posizionare il mouse in posizione supina su un tampone sterile che si trova sopra una piastra riscaldante preriscaldata. Monitorare e registrare lo stato fisiologico del topo ogni 15 minuti fino alla fine della procedura chirurgica.
- Estendi gli arti del mouse. Fissarli con del nastro adesivo per massimizzare l'esposizione dell'addome ventrale e del torace. Sterilizzare l'intera pelle addominale del topo con una soluzione di povidone-iodio al 10%, seguita da etanolo al 70%. Valutare la profondità anestetica del mouse controllando la mancata risposta al pizzicamento del piede: il riflesso di ritiro del pedale.
- Eseguire una laparotomia praticando un'incisione della linea mediana di circa 10 mm per accedere al peritoneo usando forbici affilate. Bloccare e tirare il processo xifoideo verso la testa con una pinza e applicare i divaricatori subcostali per aprire il campo chirurgico. Assicurarsi che venga eseguita un'incisione corretta per consentire una buona visione chirurgica del sito operatorio.
- Ritrarre i lobi mediana e sinistra verso l'alto con un tampone di garza bagnato. Spostare l'intestino fuori dall'addome sul lato sinistro del mouse e coprirli con un tampone di garza bagnato. Eseguire la legatura dell'arteria epatica (HAL) sull'arteria epatica comune (CHA), che ha origine dalla testa pancreatica alla sua radice nel peduncolo epatico, sotto una lampada d'ingrandimento per una visualizzazione ottimizzata.
- Ritrarre i lobi mediana e sinistra indietro / verso il basso con un tampone di garza bagnato per esporre il lobo sinistro. Fare un'incisione di circa 2 mm di lunghezza e profondità sulla superficie del lobo sinistro con una lama sterile di bisturi.
NOTA: È anche possibile utilizzare il lobo mediano del fegato per l'impianto del tumore per ridurre al minimo le lacrime accidentali o la lacerazione da trauma agli organi addominali vicini. - Inserire immediatamente un frammento di tumore nell'incisione epatica con una pinza sterile. Seppellire il tumore in modo che si trovi saldamente nel fegato. Applicare una sutura a forma di otto con una sutura di nylon 6-0 sul sito di incisione per garantire il corretto impianto del frammento tumorale nel fegato e nell'emostasi. Eseguire questa operazione il più rapidamente possibile per evitare un eccessivo sanguinamento. Al termine, chiudere l'incisione dell'addome con punti di sutura 5-0 interrotti.
- Rimetti il mouse nella gabbia seduto sopra una piastra riscaldante preriscaldata per aiutare con il recupero dall'anestesia e per recuperare il riflesso raddrizzante. Continuare a monitorare e registrare lo stato fisiologico del topo ogni 15 minuti fino a quando il topo è completamente sveglio e mantiene la reclinazione sternale.
- Ripetere la procedura fino a quando tutti i topi hanno attraversato l'impianto di tumore ortotopico. Fornire assistenza post-operatoria a tutti i topi monitorando continuamente il loro stato fisiologico ogni giorno per i successivi 3 giorni dopo l'operazione chirurgica. Somministrare buprenorfina (0,1 mg/kg) ogni 8-12 ore.
3. Impostazione delle tarature PET/MR e del flusso di lavoro
NOTA: L'imaging viene eseguito utilizzando un sistema preclinico PET/MR 3T (vedere Tabella dei materiali).
- Utilizzare isoflurano al 5% (1 L/min Medical O2) per anestetizzare il topo in una camera a induzione. Per ogni scansione, posizionare con cura il topo anestetizzato su un letto di imaging con riscaldamento continuo; in primo luogo, scansione con MR (vista scout) come riferimento anatomico per scansioni statiche [18 F]FMISO o [18F]FDG PET, seguite da imaging RM anatomico di riferimento.
- Creare un flusso di lavoro di imaging PET/MR sequenziale nel software (vedere Tabella dei materiali) per includere una scansione PET statica, imaging MR pesato T1 (correzione dell'attenuazione) e pesato T2 (riferimento anatomico) e ricostruzione PET 1 giorno prima della sessione di imaging pianificata.
- Per acquisire PET, selezionare la discriminazione del livello 400-600 keV, l'isotopo dello studio F-18, la modalità di coincidenza 1-5 e le scansioni di 20 minuti.
- Per acquisire MR pesata T1 per tutto il corpo, utilizzare l'eco-3D gradiente con TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, campo visivo (FOV) = 90 mm x 60 mm, numero di eccitazioni (NEX) = 3, 28 fette con spessore 0,9 mm e dimensione voxel = 0,375 mm 3 x 0,375 mm 3 x 0,9 mm 3.
- Per acquisire MR pesato T2 per tutto il corpo, utilizzare eco a rotazione rapida 2D con TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 28 fette con spessore 0,9 mm, dimensione voxel = 0,265 mm 3 x 0,268 mm 3 x 0,9 mm 3.
- Per ricostruire il PET, selezionare l'algoritmo Tera-Tomo (TT3D), iterazioni = 8, sottoinsiemi = 6, modalità di coincidenza 1-3 e con correzioni di decadimento, tempo morto, casuale, attenuazione e dispersione per creare immagini con una dimensione complessiva del voxel di 0,3 mm3.
- Eseguire un test di attività PET prima dell'inizio dell'esperimento per verificare l'accuratezza della quantificazione del PET11.
- Riempire una siringa da 5 mL con 5-8 MBq [18F] FMISO diluito in acqua o soluzione salina secondo la raccomandazione del produttore. Usare un calibratore di dose per registrare l'attività della siringa (vedere Tabella dei materiali). Annotare l'ora della misurazione.
- Disegnare un volume di interesse (VOI) sull'immagine ricostruita per coprire l'intera siringa. Confrontare l'attività recuperata dall'immagine con il valore ottenuto dal calibratore della dose. Procedere con studi di imaging quando l'attività recuperata è accurata entro il ±5%.
4. [18 F]FMISO e [18F]FDG iniezione
- Ottenere una dose clinica di [18F]FMISO dal fornitore 30 minuti prima dell'inizio degli studi di imaging. Indossare i dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, come un camice da laboratorio, guanti, sopra gli occhiali, un distintivo cinematografico e dosimetri ad anello quando si maneggiano materiali radioattivi. Cambiare frequentemente i guanti per evitare la contaminazione incrociata delle sostanze radioattive.
- Collocare le soluzioni di stock radioattivo nel contenitore di stoccaggio del piombo dietro uno schermo da tavolo a L. Distribuire un'aliquota di [18F]FMISO e diluire con soluzione salina sterilizzata. Assicurarsi che la concentrazione totale dell'attività sia di 18-20 MBq in 100 μL.
- Aspirare il [18F]FMISO con una siringa da 1 mL con ago (vedere Tabella dei materiali). Registrare la radioattività e il tempo indicati sul calibratore di dose.
- Registrare il peso del mouse prima dell'iniezione del radiotracciante. Utilizzare isoflurano al 5% (1 L/min Medical O2) per anestetizzare il topo, quindi iniettare con cautela il preparato [18F]FMISO attraverso la vena caudale. Registrare il tempo di iniezione e l'attività residua della siringa per tenere conto della correzione del decadimento. Rimettere il mouse nella gabbia per 180 minuti per consentire l'assorbimento di [18F]FMISO prima della scansione PET. Lasciare che il mouse si riprenda per 1 giorno dopo [18F]FMISO PET.
NOTA: Nonostante i profili farmacocinetici in vivo molto diversi per [18 F]FMISO e [18 F]FDG, entrambi i radiotraccianti sono radiomarcati con F-18, che è un radionuclide PET con un'emivita di 109,77min (< 2 h). Poiché il segnale PET proviene dall'F-18, metà della radioattività iniettata iniziale verrà persa ogni 2 ore. In questo caso, il segnale residuo 24 ore dopo l'iniezione non può più essere rilevato dallo scanner PET. Inoltre, l'intervallo di 1 giorno tra le iniezioni di [18 F]FMISO (giorno 1) e [18 F]FDG (giorno 3) consentirà il decadimento completo di [18 F]FMISO quando viene eseguita la [18 F]FDG PET, quindi nessuna sovrapposizione del segnale [18 F]FMISO nella scansione [18F]FDG PET. - Ripetere i passaggi 4.1.-4.4. per l'iniezione di [18F]FDG il giorno 3, con l'eccezione che una concentrazione di attività totale di 6-8 MBq in 100 μL viene iniettata con un assorbimento di 60 minuti prima dell'inizio della scansione PET.
- Calcolare l'attività [18 F]FMISO o [18F]FDG iniettata utilizzando la seguente formula 11:
Attività iniettata (MBq) = Attività nella siringa prima dell'iniezione - Attività nella siringa dopo l'iniezione
5. Acquisizione PET/MR
- Accendere il riscaldatore d'aria per riscaldare il letto di imaging del mouse prima della scansione PET programmata. Utilizzare isoflurano al 5% (1 L/min Medical O2) per anestetizzare il topo in una camera a induzione.
- Una volta correttamente anestetizzato e controllato utilizzando la risposta del pizzico del piede, trasferire attentamente e immediatamente il mouse sul letto di riscaldamento e mantenere l'anestesia al 2% -2,5% di isoflurano. Posizionare la testa del topo sulla barra del morso e applicare lubrificante per gli occhi su entrambi gli occhi per evitare l'essiccazione e la potenziale formazione di ulcere corneali. Coprire il letto di imaging con un foglio di plastica per mantenere la temperatura circostante del letto.
- Monitorare e registrare la frequenza respiratoria e la temperatura corporea del mouse utilizzando rispettivamente il tampone respiratorio interno e la sonda termica. Assicurarsi che la temperatura corporea del topo sia mantenuta a 37 °C mentre la frequenza respiratoria viene mantenuta nell'intervallo di 40-50 respiri al minuto (bpm) regolando il livello di isoflurano.
- Eseguire una vista scout per individuare la posizione del mouse all'interno dello scanner. Regolare la posizione del letto del mouse per coprire l'intero corpo del mouse, con la regione del tronco situata al centro FOV del MR.
- Per avviare una scansione PET, selezionare Acquisizione PET nella finestra dell'elenco degli studi, quindi scegliere Intervallo di scansione su acquisizione precedente per utilizzare la posizione del letto del mouse predeterminata dalla vista di esplorazione. Fare clic su Prepara > OK per spostare automaticamente il letto del mouse da MR a PET e avviare l'acquisizione.
- Nell'Editor radiofarmaceutico, selezionare il radionuclide appropriato, quindi inserire i dettagli della dose di iniezione e il tempo prima e dopo l'iniezione di [18 F]FMISO o [18F]FDG, misurati al punto 4.3. e il passaggio 4.4. Immettere il peso del mouse nel menu Informazioni sull'oggetto.
- Procedere con le acquisizioni MR al completamento della scansione PET. A tale scopo, selezionare Prepara a spostare il mouse su MR da PET. Fare clic su OK per continuare.
- Una volta completate tutte le scansioni, selezionare Home per riportare il letto di imaging nella posizione predefinita.
- Spegnere l'anestesia e lavare il letto di imaging con O2 medico. Controllare il riflesso di ritiro del pedale del mouse. Trasferire il mouse dal letto di imaging a una gabbia di alloggiamento pulita posizionata sopra una piastra riscaldante per aiutare con il recupero dall'anestesia e per recuperare il riflesso di raddrizzamento.
- Sotto la scansione non elaborata, selezionare Acquisizione PET per caricare i dati PET grezzi acquisiti per la ricostruzione PET . Selezionate MM da utilizzare come mappa materiale. Procedere con la ricostruzione PET utilizzando il parametro descritto al punto 3.6.
- Attenersi rigorosamente alle linee guida locali e istituzionali quando si maneggiano i topi dopo gli studi di imaging PET. Trattare tutti i materiali di consumo usati, ad esempio siringhe, aghi, guanti, salviette e rifiuti biologici, ad esempio lettiere di gabbie e materia fecale, che sono stati a diretto contatto con il topo come rifiuti radioattivi e maneggiare con cura secondo le normative locali.
6. Analisi dell'immagine PET
- Aprire il software di analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali) e selezionare Carica dati DICOM per aprire le immagini PET e MR.
- Trascinare le immagini PET e MR corrispondenti nella finestra di visualizzazione del software e selezionare Registrazione automatica per eseguire la co-registrazione automatica delle immagini PET e MR risultanti.
- Nel menu Impostazioni registrazione, selezionare Trasformazione rigida. Utilizzate Maiusc (Shift) e Rotazione (Rotation) nel menu Rigido/Affine.
- Nel menu Selezione ruolo globale , fare clic su MM come riferimento e su Scansione PET statica come reslice.
- Ispezionare le immagini PET/MR co-registrate per garantire il corretto allineamento. Se necessario, utilizzare la registrazione manuale per regolare manualmente le immagini.
- Individuare il tumore ortotopico nel fegato utilizzando l'immagine RM. Utilizzare il ROI dell'ellisse interpolata per disegnare un VOI sul tumore, utilizzando l'immagine MR come riferimento. Trasferire il VOI tumorale creato dalla RM all'immagine PET. Selezionate gli strumenti pennello e gomma per definire con attenzione il bordo VOI, scorrevole per diapositiva. Assicurarsi di evitare lo spillover dell'assorbimento di radioattività dal fegato sull'immagine PET.
- Utilizzare Ellipsoid VOI per creare un3 mm 3 VOI sul fegato come organo di riferimento. Assicurati di evitare aree di strutture vascolari e biliari epatiche visibili utilizzando l'immagine MR come guida.
- Selezionare Mostra tabella ROI per rinominare tutti i VOI disegnati. Registrare tutti i dati necessari, ad esempio la radioattività (kBq/mL) e il volume del tumore (mm3), in un foglio di calcolo. Salvare una copia dei disegni VOI e archiviare i dati di imaging grezzi e ricostruiti su un disco rigido esterno al termine.
- Calcolare il valore di assorbimento standardizzato (SUV) per tutti i VOI utilizzando la seguente equazione11:
SUV = CPET(t)/(ID/BW)
dove CPET(t) è l'attività misurata nel VOI, ID è la dose iniettata misurata in kBq e BW è il peso corporeo del topo in kg, assumendo una densità tissutale di 1 g/ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per ottenere un blocco tumorale adatto per il successivo impianto ortotopico, cloni stabili sono stati prima generati mediante iniezione sottocutanea di 200 μL di sospensione cellulare in DPBS (contenente cellule MHCC97L) nel fianco inferiore di topi nudi (Figura 1A). La crescita del tumore è stata monitorata e, quando le dimensioni del tumore hanno raggiunto 800-1000 mm 3 (circa 4 settimane dopo l'iniezione), i topi sono stati eutanasizzati e il blocco tumorale risultante è stato tagliato in circa 1 mm3 frammenti per il successivo impianto ortotopico del fegato in un altro lotto di topi nudi (n = 6). I topi sono stati randomizzati in due gruppi: controllo (C1, n = 3) e legatura dell'arteria epatica (H2, n = 3). HAL è stato eseguito legando un filo sottile attorno al ramo principale dell'arteria epatica. I topi C1 sono stati risparmiati dall'HAL prima dell'impianto ortotopico. Questa manipolazione ha portato all'ipossia tumorale nei topi H2 ma non C1, e lo stato ipossico del tumore potrebbe essere monitorato in modo non invasivo utilizzando il tracciante ipossico PET [18F]FMISO. Gli studi PET/MR hanno mostrato che un aumento dell'assorbimento del tumore [18 F]FMISO è stato osservato solo nei topi H2, mentre, utilizzando il marcatore glicolitico [18F]FDG, l'assorbimento del tumore è rimasto simile tra i due gruppi (Figura 1B).
L'ipossia indotta da HAL nei tumori è stata ulteriormente convalidata sondando i livelli di espressione di HIF-1α12 e sono stati effettuati confronti tra i gruppi. Coerentemente con un tumore più ipossico dopo HAL, il gruppo H2 ha mostrato una maggiore espressione di HIF-1α rispetto al gruppo C1 (densità ottica: 0,17 vs. 0,13, H2 vs. C1, rispettivamente), che corrobora con il loro tumore [18F]FMISO uptake (Figura 2A). [18F] L'assorbimento di FMISO è stato quantificato utilizzando l'approccio basato su SUV. I tumori H2 hanno mostrato un aumento di 2,3 volte dell'assorbimento di [18F] FMISO rispetto ai tumori C1 (SUVmax: 1,2 vs 2,8, rispettivamente, Figura 2B). Allo stesso modo, HAL ha anche comportato un maggiore assorbimento di SUV epatici in H2 rispetto ai topi C1 (Figura 2C). Nel loro insieme, mostriamo qui che l'HAL può indurre efficacemente l'ipossia tumorale negli xenotrapianti ortotopici HCC e l'ipossia tumorale può essere monitorata in modo non invasivo utilizzando l'imaging [18F]FMISO PET, supportato dall'espressione del marcatore immunoistochimico ex vivo HIF-1α. Inoltre, l'incorporazione dell'imaging MR offre un eccellente contrasto dei tessuti molli per consentire una chiara delineazione del tumore dal fegato, rendendo possibile un'accurata quantificazione della PET.
Figura 1: Imaging PET/RM in vivo di xenotrapianti ortotopici di topi HCC. (A) Schema delle creazioni di xenotrapianto sottocutaneo e ortotopico e studi di imaging PET nei tumori ortotopici MHCC97L. (B) Immagini PET rappresentative con proiezione di massima intensità (MIP) di [18 F]FMISO e [18F]FDG in topi portatori di tumori ortotopici MHCC97L (C1) senza o (H2) con HAL. I cerchi blu indicano la posizione del tumore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Analisi di topi portatori di tumori ortotopici MHCC97L con e senza HAL. (A) Immagini di PET/MR co-registrate [18F]FMISO, colorazione immunoistochimica per HIF-1α ed ematossilina ed eosina (HE) nelle sezioni tumorali. (B-C) Analisi quantitativa dell'assorbimento di [18F]FMISO nel tumore e nel fegato. N = 3 per ogni gruppo. I valori del SUV sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questo studio, abbiamo descritto le procedure per eseguire HAL su xenotrapianti ortotopici HCC epatici utilizzando tumori sottocutanei, insieme a metodi per il monitoraggio non invasivo dell'ipossia tumorale negli xenotrapianti ortotopici utilizzando [18 F] FMISO e [18F] FDG PET / MR. Il nostro interesse risiede nell'imaging metabolico di vari modelli di cancro e malattia per la diagnosi precoce e la valutazione della risposta al trattamento11,13,14,15. Ad oggi, la creazione di xenotrapianti HAL HCC e il loro metabolismo tumorale in vivo sono stati raramente descritti in letteratura, il che ci ha spinto a studiare le caratteristiche metaboliche di questi modelli tumorali utilizzando l'imaging PET.
Il successo dell'istituzione di xenotrapianti ortotopici con HAL come modello di topi robusti per studiare l'ipossia nell'HCC rappresenta un aspetto importante per lo studio della biologia dell'HCC in vivo. L'ipossia è nota per stimolare la malignità del cancro. Inoltre, l'ipossia intratumorale è stata associata a una maggiore proliferazione, metastasi e radio- e chemioresistenza e giustifica una caratterizzazione approfondita della risposta alle condizioni ipossiche7. Mentre gli xenotrapianti sottocutanei sono spesso utilizzati per studiare la tumorigenesi dell'HCC o le strategie di trattamento, i modelli ortotopici possono ricapitolare meglio lo sviluppo dell'HCC umano poiché riflettono più accuratamente il microambiente tumorale, in particolare le influenze sulla vascolarizzazione e le interazioni tumore-stroma verso le metastasi dell'HCC12. L'incorporazione di HAL nei topi ortotopici HCC consente l'induzione dell'ipossia intratumorale bloccando l'apporto sanguinante dell'arteria epatica al tumore7. Tali modelli animali consentono di chiarire i meccanismi alla base degli effetti dell'HAL sull'HCC e di creare nuove strade per terapie efficaci mirate al percorso dell'ipossia nell'HCC. Per l'impianto ortotopico, abbiamo utilizzato il cubo tumorale dal tumore sottocutaneo invece dell'iniezione diretta di sospensioni di cellule HCC. Abbiamo scoperto che le iniezioni cellulari dirette spesso causano un piccolo volume di perdite dal sito di iniezione, anche se la procedura è stata eseguita il più lentamente possibile con un basso volume di iniezione. Ciò può potenzialmente portare a metastasi peritoneali, che sono dannose per il benessere degli animali, influenzando in ultima analisi il risultato complessivo dello studio. D'altra parte, l'impianto di un piccolo blocco tumorale supererebbe il problema, anche se è necessario prestare attenzione per garantire che il tumore sia suturato in modo sicuro dopo l'impianto. Quando si isolano piccoli cubi tumorali dal blocco tumorale sottocutaneo, è anche consigliabile evitare le regioni centrali del tumore solido, che sono relativamente meno vascolarizzate e più metabolicamente stressate a causa dell'ipossia e della privazione di nutrienti. Ciò ridurrà l'inclusione di cellule tumorali morte che sembrano essere necrotiche all'interno del piccolo cubo tumorale e manterrà tassi di crescita tumorale più coerenti tra i singoli topi.
L'ipossia è un fattore prognostico di resistenza al cancro e il monitoraggio dei cambiamenti nell'ipossia mediante PET consente l'individuazione e la quantificazione dei tessuti ipossici in alta sensibilità e specificità. Una considerazione importante per [18 F]FMISO e [18F]FDG PET riguarda il tempo di assorbimento del radiotracciante e la via di somministrazione nei topi. Entrambi i radiotraccianti hanno una farmacocinetica in vivo diversa, una è la differenza fisiologica di assorbimento, osservata nell'intestino / vescica e nel cuore / vescica per [18 F] FMISO e [18 F] FDG, rispettivamente, e l'altra è che [18 F] FMISO si accumula nella regione ipossica del tumore e [18 F] FDG è preferenzialmente assorbito nella regione tumorale ad alto metabolismo 16. L'elevata lipofilia e la lenta clearance epatica di [18F]FMISO richiedono un tempo post-iniezione di 2-4 ore per ottenere un buon contrasto tumore-fegato17. Abbiamo scoperto che 3 ore dopo l'iniezione sono sufficienti per differenziare e delineare l'assorbimento del tumore [18F] FMISO dal fegato sia per i gruppi ipossici (H2) che di controllo (C1). Nel caso di [18 F]FDG PET, un tempo post-iniezione di 1 ora è sufficiente per ottenere un buon contrasto, come descritto in precedenza13,15, ed è stato impiegato in questo studio. Tuttavia, mantenere un tempo di assorbimento del radiotracciante costante è fondamentale per garantire l'affidabilità dei risultati della PET, in particolare per le analisi basate su SUV. Qui, abbiamo usato tecniche endovenose per somministrare radiotraccianti ai topi. Il successo dell'iniezione della vena caudale è indicato da un flashback di sangue visibile prima dell'infusione del radiotracciante, dove l'ago è posizionato accuratamente all'interno della vena. Uno dei principali svantaggi di questo metodo è che il flashback di sangue atteso può essere difficile da osservare a causa dell'ipotensione, con variabilità osservata tra i topi. Tuttavia, tale difficoltà può essere superata riscaldando la coda per un breve periodo di 1-2 minuti prima dell'inserimento dell'ago, con un panno caldo o con una lampada termica per aumentare il flusso sanguigno e migliorare la visibilità della vena per un'iniezione di successo.
Con il crescente uso dell'imaging PET per quantificare la biodistribuzione dei radiotraccianti nei piccoli animali, una considerazione importante da notare è l'uso di uno scanner PET accurato e ben calibrato per produrre dati PET buoni, riproducibili e quantificabili. Un accurato sistema PET consente di eseguire studi di imaging in modo più efficiente in termini di tempo ed economico e consente l'implementazione dei principi 3R (sostituzione, riduzione e perfezionamento) nella ricerca sugli animali. Per questo motivo, devono essere eseguite ispezioni di controllo qualità di routine, preferibilmente su base settimanale, per esaminare i componenti PET e MR del sistema di imaging secondo la raccomandazione del produttore. In particolare, l'accuratezza dell'attività PET dovrebbe essere controllata e registrata frequentemente, nonché prima dell'inizio di un esperimento di imaging, per garantire l'affidabilità della quantificazione della PET. Questo è indispensabile per qualsiasi studio longitudinale che coinvolga la valutazione quantitativa del tumore e dei tessuti durante un periodo di esame per produrre risultati significativi e comparabili. La calibrazione del sistema è necessaria quando l'accuratezza dell'attività PET risulta essere fuori dall'intervallo raccomandato, nonché quando viene rilevato un disallineamento delle immagini PET e MR.
Sebbene le tecniche qui descritte consentano l'imaging PET degli xenotrapianti ipossici di HCC per un'ampia gamma di indagini in vivo , alcune limitazioni dovrebbero essere considerate quando si contempla l'uso di questi protocolli. La creazione di xenotrapianti HAL HCC è una complessa procedura chirurgica intra-addominale da eseguire su topi immunodeficienti di 6-8 settimane. Inoltre, la minuscola arteria epatica in questi giovani topi può essere difficile da localizzare, rendendo il processo di legatura tecnicamente impegnativo. Queste procedure richiedono personale adeguatamente addestrato per migliorare il tasso di successione chirurgica, nonché la sopravvivenza dei topi per un periodo di tempo, cioè 4-6 settimane prima della formazione degli xenotrapianti, mentre è prevista la fornitura di cure estese agli animali durante tutto il periodo chirurgico, che richiede tempo e risorse. Si prevede inoltre che la creazione di xenotrapianti ortotopici HCC utilizzando questo metodo richiederà circa 8 settimane prima di ottenere l'imaging PET di successo, poiché viene utilizzato l'impianto del cubo tumorale piuttosto che l'iniezione diretta di sospensioni cellulari per evitare metastasi peritoneali. Tuttavia, queste limitazioni possono essere superate con un'adeguata pianificazione e formazione del personale di ricerca. Inoltre, la dimensione del campione dei gruppi sperimentali qui riportati è piccola, il che potrebbe non essere adatto per l'analisi statistica. Tuttavia, le nostre osservazioni rivelano soggettivamente una tendenza in cui l'ipossia indotta da HAL è stata misurata sia nel tumore che nel fegato nel gruppo H2 rispetto al gruppo C1, che è supportato da una colorazione HIF-1α più prominente nei campioni tumorali H2. Attualmente stiamo lavorando per espandere i modelli tumorali con altre linee cellulari umane di HCC. Inoltre, sono in corso studi terapeutici mirati alla via dell'ipossia nell'HCC che coinvolgono questi xenotrapianti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo il sostegno dell'Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) per gli esperimenti di imaging di piccoli animali. Ringraziamo anche il supporto del Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) presso l'Università di Hong Kong per la fornitura di [18 F]FMISO e [18F]FDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
