Summary
Aquí, presentamos un protocolo para crear xenoinjertos de carcinoma hepatocelular ortotópico con y sin ligadura de la arteria hepática y realizar imágenes no invasivas de tomografía por emisión de positrones (PET) de hipoxia tumoral utilizando [18 F] fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) y [18 F] fluorodesoxiglucosa ([18F] FDG).
Abstract
Los modelos experimentales preclínicos de carcinoma hepatocelular (CHC) que recapitulan la enfermedad humana representan una herramienta importante para estudiar la tumorigénesis y evaluar nuevos enfoques terapéuticos. Las imágenes no invasivas de cuerpo entero mediante tomografía por emisión de positrones (PET) proporcionan información crítica sobre las características in vivo de los tejidos a nivel molecular en tiempo real. Presentamos aquí un protocolo para la creación de xenoinjertos ortotópicos de CHC con y sin ligadura de la arteria hepática (HAL) para inducir hipoxia tumoral y la evaluación de su metabolismo tumoral in vivo utilizando [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) y [18 F]Fluorodesoxiglucosa ([18F]FDG) PET/resonancia magnética (MR). La hipoxia tumoral se pudo visualizar fácilmente utilizando el marcador de hipoxia [18 F] FMISO, y se encontró que la captación de [18 F] FMISO fue mayor en ratones HCC que se sometieron a HAL que en el grupo sin HAL, mientras que [18F] FDG no pudo distinguir la hipoxia tumoral entre los dos grupos. Los tumores HAL también mostraron un nivel más alto de expresión del factor inducible por hipoxia (HIF)-1α en respuesta a la hipoxia. La cuantificación de los tumores HAL mostró un aumento de 2,3 veces en la captación de [18F]FMISO según el enfoque de captación de valor estandarizado (SUV).
Introduction
El carcinoma hepatocelular (CHC) es el sexto cáncer más diagnosticado y la tercera causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo, con más de 900.000 nuevos casos y 800.000 muertes en 20201. El principal factor de riesgo es la cirrosis, que ocurre como resultado de infecciones virales (virus de la hepatitis B y C), abuso de alcohol, diabetes y esteatohepatitis2 no alcohólica. El manejo del CHC es bastante complejo, y hay varias opciones de tratamiento disponibles, incluyendo resección quirúrgica, ablación térmica o química, trasplante, quimioembolización transarterial, radiación y quimioterapia, dependiendo de la estadificación de la enfermedad 2,3. El CHC es un tumor resistente a la quimioterapia con recidiva de la enfermedad en hasta 70 % de los pacientes después de la terapia con intención curativa2.
A pesar del alto grado de heterogeneidad tumoral, el CHC se asocia con dos resultados comunes: (i) el CHC es muy hipóxico, y (ii) la hipoxia tumoral está relacionada con una mayor agresividad tumoral y fracaso del tratamiento. La proliferación incontrolada de células HCC da como resultado una alta tasa de consumo de oxígeno que precede a la vascularización, creando así un microambiente hipóxico. Los niveles bajos de oxígeno intratumoral desencadenan una variedad de respuestas biológicas que influyen en la agresividad del tumor y la respuesta al tratamiento. Los factores inducibles por hipoxia (HIFs) son a menudo reconocidos como los reguladores transcripcionales esenciales en la respuesta a la hipoxia 2,3. Por lo tanto, la capacidad de detectar hipoxia es crucial para visualizar los tejidos neoplásicos e identificar los sitios inaccesibles, que requieren procedimientos invasivos. También ayuda a comprender mejor los cambios moleculares que conducen a la agresividad tumoral y mejorar los resultados del tratamiento del paciente.
Las imágenes moleculares mediante tomografía por emisión de positrones (TEP) se usan comúnmente en el diagnóstico y la estadificación de muchos cánceres, incluido el CHC. En particular, el uso combinado de imágenes PET de doble trazador que involucran [18 F]Fluorodesoxiglucosa ([18F]FDG) y [11C]Acetato puede aumentar significativamente la sensibilidad general en el diagnóstico de CHC 4,5. Las imágenes de hipoxia, por otro lado, se pueden lograr mediante el uso del marcador hipóxico de uso común [18 F] fluoromisonidazol ([18F] FMISO). En la práctica clínica, la evaluación no invasiva de la hipoxia es importante para diferenciar entre varios tipos de tumores y regiones para la planificación de la radioterapia6.
La imagen preclínica se ha convertido en una herramienta indispensable para la evaluación no invasiva y longitudinal de modelos de ratón para diferentes enfermedades. Un modelo de CHC robusto y altamente reproducible representa una plataforma importante para la investigación preclínica y traslacional sobre la fisiopatología del CHC humano y la evaluación de nuevas terapias. Junto con las imágenes PET, los comportamientos in vivo se pueden dilucidar para proporcionar información importante a nivel molecular para cualquier punto de tiempo dado. Aquí, describimos un protocolo para la generación de xenoinjertos de HCC ortotópicos de ligadura de la arteria hepática (HAL) y el análisis de su metabolismo tumoral in vivo utilizando [18 F]FMISO y [18F]FDG PET/MR. La incorporación de HAL hace un modelo adecuado de xenoinjertos de ratones HCC transgénicos o inducidos químicamente para estudiar la hipoxia tumoral in vivo, ya que HAL puede bloquear eficazmente el riego sanguíneo arterial para inducir hipoxia intratumoral 7,8. Además, a diferencia de la tinción inmunohistoquímica ex vivo con pimonidazol, los cambios en el metabolismo tumoral como resultado de la hipoxia pueden visualizarse fácilmente y cuantificarse con precisión de forma no invasiva utilizando imágenes PET, lo que permite la evaluación longitudinal de la respuesta al tratamiento o la medición de la aparición de resistencia 3,7,8 . Nuestro método que se muestra aquí permite la creación de un modelo robusto de HCC hipóxico junto con el monitoreo no invasivo de la hipoxia tumoral utilizando imágenes PET / MR para estudiar la biología del HCC in vivo.
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Protocol
Todos los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Comité sobre el Uso de Animales Vivos en la Enseñanza y la Investigación (CULATR) en el Centro de Investigación de Medicina Comparativa (CCMR) de la Universidad de Hong Kong, un programa acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratory Animal Care International (AAALAC). Los animales utilizados en el estudio fueron ratones hembra BALB/cAnN-nu (Desnudo) a la edad de 6-8 semanas, con un peso de 20 g ± 2 g. Se proporcionaron alimentos y agua ad libitum.
1. Inyección subcutánea de líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano
NOTA: MHCC97 es una línea celular de HCC humano que se utiliza para generar el modelo de xenoinjerto de HCC subcutáneo. Las células MHCC97L se obtienen del Instituto de Cáncer de Hígado, Hospital Zhongshan de la Universidad de Fudan, Shanghai, República Popular de China9 y se autentican mediante perfiles cortos de repetición en tándem (STR).
- Cultivar células MHCC97L y mantener en medios de cultivo suplementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina y estreptomicina en un matraz de cultivo celular T-75 a 37 °C en una incubadora humidificada suministrada con 5% deCO2 (ver Tabla de Materiales). Cambiar los medios de cultivo cada 2 días y cosechar las células al 80%-90% de confluencia.
NOTA: El número de celda inicial es 1.5 x 10 6 celdas, y las celdas se usan dentro de6-8 pasajes. - Conservar los medios de cultivo y el ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (tripsina-EDTA) a 4 °C en la oscuridad hasta su uso. Precaliente los medios de cultivo a 37 °C y la tripsina-EDTA a temperatura ambiente antes de su uso. Consulte la Tabla de materiales para todos los reactivos y consumibles utilizados en esta sección.
- Quite los medios de cultivo. Enjuague la capa celular con 10 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (DPBS, consulte la Tabla de materiales).
- Añadir 5 ml de tripsina-EDTA al matraz de cultivo e incubar las células a 37 °C. Verifique las celdas bajo un microscopio invertido con un aumento de 20x (consulte la Tabla de materiales) hasta que la capa celular se disperse y se separe completamente del matraz. Asegúrese de que las células no se dejan en tripsina-EDTA durante más de 15 minutos.
- Añadir 5 ml de medios de cultivo al matraz de cultivo. Aspirar las células pipeteando suavemente. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga y gire a 1.107 x g durante 5 minutos (consulte la Tabla de materiales).
- Retire el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet celular con 1 ml de PBS. Pipetear minuciosamente para obtener una suspensión unicelular. Determine el número de células utilizando el contador automático de células (consulte la Tabla de materiales) y prepare la suspensión celular a una concentración de 5 x 106 células/ml en PBS.
- Extraiga 200 μL de suspensión celular con una aguja de 25 G en una jeringa de 1 ml. Cada jeringa contiene 1 x 106 células MHCC97L (en 200 μL). Mantenga la jeringa en hielo húmedo.
- Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de ketamina (87,5 mg/kg) y xilazina (12,5 mg/kg). Asegure la anestesia adecuada utilizando el reflejo de pellizco del dedo del pie. Asegúrese de aplicar lubricante ocular al ratón para evitar el secado y la posible formación de úlceras corneales. Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla estéril (consulte la Tabla de materiales).
- Esterilice la región dorsal cerca del flanco inferior (ya sea el lado izquierdo o derecho) del ratón con etanol al 70% (consulte la Tabla de materiales). Levante la piel con fórceps e inserte suavemente el bisel de la aguja debajo de la piel.
- Avance la aguja 4-5 mm a lo largo del plano subcutáneo desde el sitio de punción para evitar fugas accidentales de la suspensión celular desde el lugar de inyección al retirar la aguja. Asegúrese de que la inserción de la aguja no sea demasiado profunda debajo de la piel, lo que puede causar daño accidental a los órganos.
- Suelte los fórceps y descargue con cuidado y lentamente el contenido de la jeringa, teniendo cuidado de no penetrar en el lado opuesto. Saque la aguja para verificar si hay una hinchazón en la inyección. Coloque el ratón de nuevo en la jaula sentado encima de una almohadilla térmica precalentada para ayudar con la recuperación de la anestesia y para recuperar la movilidad. Continúe monitoreando al ratón hasta que esté completamente despierto y mantenga la decúbito esternal.
- Controle el crecimiento del tumor y el bienestar del ratón semanalmente. Medir el volumen del tumor (V) usando un calibrador (consulte la Tabla de materiales). Calcule y registre el volumen del tumor utilizando la siguiente fórmula10:
V = (W 2× L)/2
donde W es el ancho y L es la longitud del tumor. - Entre 4-6 semanas después de la inyección, comprobar que se obtiene un tamaño significativo de tumor subcutáneo, entre 800-1000 mm3. Asegúrese de que la carga tumoral total no exceda el 10% del peso corporal.
2. Implantación hepática ortotópica y ligadura de la arteria hepática
- Prepare los siguientes reactivos y herramientas quirúrgicas en un gabinete de seguridad biológica desinfectado: 10 ml de medios de cultivo en un plato, solución de povidona yodada al 10%, etanol al 70%, instrumentos quirúrgicos esterilizados en autoclave, es decir, tijeras afiladas, tijeras de resorte, pinzas (curvas finas y rectas romas), soporte de agujas, hoja de bisturí, sutura de nylon 6-0 y 5-0, una almohadilla térmica.
- Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y manejarlos sólo en un banco estéril. Proporcionar el cuidado pre, intra y postoperatorio adecuado y necesario a los ratones durante los procedimientos quirúrgicos (consulte los pasos a continuación).
- Para aliviar el dolor preoperatorio, inyecte al ratón una inyección subcutánea de buprenorfina (0,1 mg/kg) al menos 30 minutos antes del inicio del procedimiento quirúrgico. Para el cuidado y manejo postoperatorio, inyecte al ratón una inyección subcutánea de buprenorfina (0,1 mg / kg) durante 3 días continuamente, una vez cada 8-12 h. Consulte la Tabla de materiales para todos los reactivos y consumibles utilizados en esta sección.
- Eutanasia al ratón portador de tumor subcutáneo con una inyección i.p. de pentobarbital (330 mg/kg). Haga una incisión en la piel del sitio del tumor con una hoja de bisturí. Extirpar el bloqueo tumoral subcutáneo y transferirlo inmediatamente a los medios de cultivo. Realice este paso lo más rápido posible.
- Corte el bloque tumoral en cubos tumorales pequeños de 1 mm3 con tijeras quirúrgicas afiladas. Mantenga todos los cubos tumorales en los medios de cultivo. Evite usar la región central del bloqueo tumoral subcutáneo.
- Anestesiar al ratón que se someterá a la posterior cirugía de implantación de tumor ortotópico con una inyección i.p. de una mezcla de ketamina (87,5 mg/kg) y xilazina (12,5 mg/kg). Asegúrese de que hayan transcurrido al menos 30 minutos después de administrar la buprenorfina antes de anestesiar al ratón. Asegúrese de aplicar lubricante ocular al ratón para evitar el secado y la posible formación de úlceras corneales.
- Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla estéril que esté encima de una almohadilla térmica precalentada. Monitoree y registre el estado fisiológico del ratón cada 15 minutos hasta el final del procedimiento quirúrgico.
- Extiende las extremidades del ratón. Asegúrelos con cinta adhesiva para maximizar la exposición del abdomen ventral y el tórax. Esterilice toda la piel abdominal del ratón con una solución de povidona yodada al 10%, seguida de etanol al 70%. Evalúe la profundidad anestésica del ratón comprobando si no hay respuesta al pellizco del dedo del pie, el reflejo de retirada del pedal.
- Realice una laparotomía haciendo una incisión de aproximadamente 10 mm en la línea media para acceder al peritoneo con tijeras afiladas. Sujete y tire del proceso xifoide hacia la cabeza con fórceps y aplique los retractores subcostales para abrir el campo quirúrgico. Asegúrese de que se realiza una incisión adecuada para permitir una buena vista quirúrgica del sitio de la operación.
- Retraiga los lóbulos mediano e izquierdo hacia arriba con un hisopo de gasa húmedo. Mueva los intestinos fuera del abdomen hacia el lado izquierdo del ratón y cúbralos con un hisopo de gasa húmedo. Realizar la ligadura de la arteria hepática (HAL) en la arteria hepática común (ACS), que se origina desde la cabeza pancreática hasta su raíz en el pedículo hepático, bajo una lámpara de aumento para una visualización optimizada.
- Retraiga los lóbulos mediano e izquierdo hacia atrás / hacia abajo con un hisopo de gasa húmedo para exponer el lóbulo izquierdo. Haga una incisión de aproximadamente 2 mm de longitud y profundidad en la superficie del lóbulo izquierdo con una hoja de bisturí estéril.
NOTA: También es posible utilizar el lóbulo mediano del hígado para la implantación del tumor para minimizar los desgarros accidentales o laceraciones por traumatismo en los órganos abdominales vecinos. - Inserte inmediatamente un fragmento de tumor en la incisión hepática con fórceps estériles. Enterre el tumor para que se asiente firmemente en el hígado. Aplique una sutura en forma de ocho con una sutura de nylon 6-0 sobre el sitio de la incisión para garantizar la implantación adecuada del fragmento tumoral en el hígado y la hemostasia. Realice esta operación lo más rápido posible para evitar el sangrado excesivo. Al finalizar, cierre la incisión del abdomen con suturas 5-0 interrumpidas.
- Coloque el ratón de nuevo en la jaula sentado encima de una almohadilla térmica precalentada para ayudar con la recuperación de la anestesia y para recuperar el reflejo de enderezamiento. Continúe monitoreando y registrando el estado fisiológico del ratón cada 15 minutos hasta que el ratón esté completamente despierto y mantenga la decúbito esternal.
- Repita el procedimiento hasta que todos los ratones hayan pasado por la implantación del tumor ortotópico. Proporcionar atención postoperatoria a todos los ratones mediante el monitoreo continuo de su estado fisiológico diariamente durante los próximos 3 días después de la operación quirúrgica. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) cada 8-12 h.
3. Configuración de calibraciones y flujo de trabajo de PET/MR
NOTA: Las imágenes se realizan utilizando un sistema preclínico PET/MR 3T (consulte la Tabla de materiales).
- Use isoflurano al 5% (1 L/min deO2 médico) para anestesiar al ratón en una cámara de inducción. Para cada exploración, coloque cuidadosamente el ratón anestesiado en una cama de imágenes con calentamiento continuo; primero, escanee con MR (vista scout) como referencia anatómica para exploraciones estáticas [18 F]FMISO o [18F]FDG PET, seguidas de imágenes de RM de referencia anatómica.
- Cree un flujo de trabajo secuencial de imágenes PET/MR en el software (consulte Tabla de materiales) para incluir una exploración PET estática, imágenes de RM ponderadas en T1 (corrección de atenuación) y ponderadas en T2 (referencia anatómica) y reconstrucción de PET 1 día antes de la sesión de imágenes programada.
- Para adquirir PET, seleccione una discriminación de nivel de 400-600 keV, isótopo de estudio F-18, modo de coincidencia 1-5 y escaneos de 20 minutos.
- Para adquirir MR ponderada en T1 de cuerpo entero, use eco-3D de gradiente con TE = 4.3 ms, TR = 16 ms, campo de visión (FOV) = 90 mm x 60 mm, número de excitaciones (NEX) = 3, 28 cortes con 0.9 mm de espesor y tamaño de vóxel = 0.375 mm 3 x 0.375 mm 3 x 0.9 mm 3.
- Para adquirir MR ponderada en T2 de cuerpo entero, use eco de giro rápido 2D con TE = 71.8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 28 cortes con 0.9 mm de espesor, tamaño de vóxel = 0.265 mm 3 x 0.268 mm 3 x 0.9 mm 3.
- Para reconstruir el PET, seleccione el algoritmo Tera-Tomo (TT3D), iteraciones = 8, subconjuntos = 6, modo de coincidencia 1-3, y con correcciones de decaimiento, tiempo muerto, aleatorio, atenuación y dispersión para crear imágenes con un tamaño total de vóxel de0,3 mm 3.
- Realizar una prueba de actividad de PET antes del inicio del experimento para verificar la precisión de la cuantificación de PET11.
- Llene una jeringa de 5 ml con 5-8 MBq [18F]FMISO diluido en agua o solución salina según la recomendación del fabricante. Utilice un calibrador de dosis para registrar la actividad de la jeringa (consulte la Tabla de materiales). Anote el tiempo de medición.
- Dibuje un volumen de interés (VOI) en la imagen reconstruida para cubrir toda la jeringa. Compare la actividad recuperada de la imagen con el valor obtenido del calibrador de dosis. Proceda con estudios de imagen cuando la actividad recuperada sea precisa dentro del ±5%.
4. Inyección de [18 F]FMISO y [18F]FDG
- Obtenga una dosis clínica de [18F]FMISO del proveedor 30 min antes del inicio de los estudios de imagen. Use el equipo de protección personal (EPP) apropiado, como una bata de laboratorio, guantes, anteojos, una placa de película y dosímetros de anillo cuando manipule materiales radiactivos. Cambie los guantes con frecuencia para evitar la contaminación cruzada de las sustancias radiactivas.
- Coloque las soluciones madre radiactivas en el contenedor de almacenamiento de plomo detrás de un protector de mesa de bloque L. Dispensar una alícuota de [18F]FMISO y diluir con solución salina esterilizada. Asegúrese de que la concentración total de actividad sea de 18-20 MBq en 100 μL.
- Extraiga el [18F]FMISO con una jeringa de 1 ml con aguja (ver Tabla de materiales). Registre la radiactividad y el tiempo que se muestra en el calibrador de dosis.
- Registre el peso del ratón antes de la inyección de la radiosonda. Use isoflurano al 5% (1 L/min deO2 médico) para anestesiar al ratón, luego inyecte cuidadosamente el [18F]FMISO preparado a través de la vena de la cola. Registre el tiempo de inyección y la actividad de residuos de la jeringa para tener en cuenta la corrección de caries. Vuelva a colocar el ratón en el armazón durante 180 minutos para permitir la absorción de [18F]FMISO antes de la exploración por TEP. Deje que el ratón se recupere durante 1 día después de [18F]FMISO PET.
NOTA: A pesar de los perfiles farmacocinéticos in vivo muy diferentes para [18 F]FMISO y [18 F]FDG, ambos radiotrazadores están radiomarcados con F-18, que es un radionúclido PET con una vida media de 109,77min (< 2 h). Dado que la señal PET se origina en F-18, la mitad de la radiactividad inyectada inicial se perderá cada 2 h. En este caso, la señal residual 24 h después de la inyección ya no puede ser detectada por el escáner PET. Además, el intervalo de 1 día entre las inyecciones de [18 F]FMISO (día 1) y [18 F]FDG (día 3) permitirá la desintegración completa de [18 F]FMISO cuando se realice [18 F]FDG PET, por lo tanto, no hay superposición de la señal [18 F]FMISO en la exploración [18F]FDG PET. - Repita los pasos 4.1.-4.4. para la inyección de [18F]FDG el día 3, con la excepción de que se inyecta una concentración de actividad total de 6-8 MBq en 100 μL con una captación de 60 minutos antes del inicio de la exploración PET.
- Calcule la actividad inyectada [18 F]FMISO o [18F]FDG utilizando la siguiente fórmula 11:
Actividad inyectada (MBq) = Actividad en la jeringa antes de la inyección - Actividad en la jeringa después de la inyección
5. Adquisición de PET/MR
- Encienda el calentador de aire para calentar la cama de imágenes del ratón antes de la exploración PET programada. Use isoflurano al 5% (1 L/min deO2 médico) para anestesiar al ratón en una cámara de inducción.
- Una vez anestesiado y revisado adecuadamente utilizando la respuesta de pellizco del dedo del pie, transfiera cuidadosa e inmediatamente el ratón a la cama de calentamiento y mantenga la anestesia con isoflurano al 2% -2.5%. Coloque la cabeza del ratón boca abajo en la barra de mordida y aplique lubricante ocular en ambos ojos para evitar la sequedad y la posible formación de úlceras corneales. Cubra la cama de imágenes con una lámina de plástico para mantener la temperatura ambiente de la cama.
- Monitoree y registre la frecuencia respiratoria y la temperatura corporal del ratón utilizando la almohadilla respiratoria interna y la sonda térmica, respectivamente. Asegúrese de que la temperatura corporal del ratón se mantenga a 37 ° C, mientras que la frecuencia respiratoria se mantiene en el rango de 40-50 respiraciones por minuto (lpm) ajustando el nivel de isoflurano.
- Realice una vista de exploración para localizar la posición del ratón dentro del escáner. Ajuste la posición de la cama del ratón para cubrir todo el cuerpo del ratón, con la región del torso situada en el campo de visión central del MR.
- Para iniciar una exploración PET, seleccione Adquisición de PET en la ventana de la lista de estudio y, a continuación, elija Rango de exploración en la adquisición anterior para utilizar la posición predeterminada de la cama del ratón en la vista de exploración. Haga clic en Preparar > OK para mover automáticamente la cama del ratón de MR a PET e iniciar la adquisición.
- En el Editor de radiofármacos, seleccione el radionúclido apropiado y, a continuación, introduzca los detalles de la dosis de inyección y el tiempo antes y después de la inyección de [18 F]FMISO o [18F]FDG, según se mide en el paso 4.3. y paso 4.4. Introduzca el peso del ratón en el menú Información del asunto.
- Proceda con las adquisiciones de RM una vez completada la exploración PET. Para ello, seleccione Preparar para mover el ratón a MR desde PET. Haga clic en Aceptar para continuar.
- Una vez que se hayan completado todos los escaneos, seleccione Inicio para mover la cama de imágenes a la posición predeterminada.
- Apague la anestesia y enjuague la cama de imágenes conO2 médico. Compruebe el reflejo de retirada del pedal del ratón. Transfiera el ratón de la cama de imágenes a una jaula de alojamiento limpia colocada encima de una almohadilla térmica para ayudar con la recuperación de la anestesia y recuperar el reflejo de enderezamiento.
- En Raw Scan, seleccione PET Acquisition (Adquisición de PET) para cargar los datos de PET sin procesar adquiridos para la reconstrucción de PET. Seleccione MM para utilizarlo como mapa de materiales. Proceda con la reconstrucción de PET utilizando el parámetro como se describe en el paso 3.6.
- Adhiérase estrictamente a las pautas locales e institucionales al manipular ratones después de los estudios de imágenes PET. Trate todos los consumibles usados, por ejemplo, jeringas, agujas, guantes, toallitas húmedas y desechos biológicos, por ejemplo, ropa de cama de jaula y materia fecal, que hayan estado en contacto directo con el ratón como desechos radiactivos, y manéjelos con cuidado de acuerdo con las regulaciones locales.
6. Análisis de imágenes PET
- Abra el software de análisis de imágenes (consulte Tabla de materiales) y seleccione Cargar datos DICOM para abrir las imágenes PET y MR.
- Arrastre las imágenes PET y MR correspondientes a la ventana de visualización del software y seleccione Registro automático para realizar el registro conjunto automático de las imágenes PET y MR resultantes.
- En el menú Configuración de registro , seleccione Transformación rígida . Utilice Mayús y Rotación en el menú Rígido/Afin .
- En el menú Selección global de roles , haga clic en MM como referencia y Exploración de TEP estática como reslice.
- Inspeccione las imágenes PET/MR registradas conjuntamente para garantizar una alineación adecuada. Si es necesario, utilice Registro manual para ajustar las imágenes manualmente.
- Localice el tumor ortotópico en el hígado mediante la imagen de RMN. Utilice el ROI de la elipse interpolada para dibujar un VOI en el tumor, utilizando la imagen de RM como referencia. Transfiera el VOI tumoral creado de la RM a la imagen PET. Seleccione la herramienta Pincel y la herramienta Borrador para definir cuidadosamente el borde VOI deslizamiento por diapositiva. Asegúrese de evitar el desbordamiento de la captación de radiactividad del hígado en la imagen PET.
- Utilice VOI elipsoide para crear un VOI de 3 mm3 en el hígado como órgano de referencia. Asegúrese de evitar áreas de estructuras hepáticas vasculares y biliares visibles utilizando la imagen de RM como guía.
- Seleccione Mostrar tabla ROI para cambiar el nombre de todas las VOI dibujadas. Registre todos los datos necesarios, por ejemplo, radiactividad (kBq/mL) y volumen tumoral (mm3), en una hoja de cálculo. Guarde una copia de los dibujos de VOI y archive los datos de imágenes sin procesar y reconstruidos en un disco duro externo cuando haya terminado.
- Calcule el valor de absorción estandarizado (SUV) para todos los VOI utilizando la siguiente ecuación11:
SUV = CPET(t)/(ID/BW)
donde CPET(t) es la actividad medida en el VOI, ID es la dosis inyectada medida en kBq y BW es el peso corporal del ratón en kg, suponiendo una densidad tisular de 1 g/ml.
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Representative Results
Para obtener un bloqueo tumoral adecuado para la implantación ortotópica sucesiva, primero se generaron clones estables mediante inyección subcutánea de 200 μL de suspensión celular en DPBS (que contiene células MHCC97L) en el flanco inferior de ratones desnudos (Figura 1A). Se monitorizó el crecimiento tumoral y, cuando el tamaño del tumor alcanzó 800-1000 mm 3 (alrededor de 4 semanas después de la inyección), los ratones fueron sacrificados y el bloqueo tumoral resultante se cortó en aproximadamente 1 mm3 fragmentos para su posterior implantación ortotópica hepática en otro lote de ratones desnudos (n = 6). Los ratones fueron aleatorizados en dos grupos: control (C1, n = 3) y ligadura de la arteria hepática (H2, n = 3). HAL se realizó atando un hilo fino alrededor de la rama principal de la arteria hepática. Los ratones C1 se salvaron del HAL antes de la implantación ortotópica. Esta manipulación condujo a hipoxia tumoral en ratones H2 pero no C1, y el estado hipóxico del tumor podría monitorearse de forma no invasiva utilizando el trazador hipóxico PET [18F] FMISO. Los estudios PET/MR mostraron que solo se observó un aumento en la captación tumoral de [18 F]FMISO en los ratones H2, mientras que, utilizando el marcador glucolítico [18F]FDG, la captación tumoral se mantuvo similar entre los dos grupos (Figura 1B).
La hipoxia inducida por HAL en tumores se validó aún más mediante el sondeo de los niveles de expresión de HIF-1α12, y se realizaron comparaciones entre los grupos. Consistente con un tumor más hipóxico después de HAL, el grupo H2 exhibió una mayor expresión de HIF-1α que el grupo C1 (densidad óptica: 0.17 vs. 0.13, H2 vs. C1, respectivamente), lo que corrobora con su captación tumoral [18F]FMISO (Figura 2A). [18F] La aceptación de FMISO se cuantificó utilizando el enfoque basado en SUV. Los tumores H2 mostraron un aumento de 2,3 veces en la captación de [18F]FMISO en comparación con los tumores C1 (SUVmax: 1,2 vs. 2,8, respectivamente, Figura 2B). Del mismo modo, HAL también resultó en una mayor absorción de SUV hepático en ratones H2 que C1 (Figura 2C). En conjunto, mostramos aquí que HAL puede inducir eficazmente hipoxia tumoral en xenoinjertos ortotópicos de CHC, y la hipoxia tumoral se puede controlar de forma no invasiva utilizando imágenes de PET [18F]FMISO, respaldadas por el marcador inmunohistoquímico ex vivo HIF-1α expresión. Además, la incorporación de imágenes de RM ofrece un excelente contraste de tejidos blandos para permitir una delineación clara del tumor del hígado, lo que hace posible una cuantificación precisa de la PET.
Figura 1: Imágenes PET/MR in vivo de xenoinjertos ortotópicos en ratones HCC. (A) Esquema de creaciones de xenoinjertos subcutáneos y ortotópicos y estudios de imagen PET en tumores ortotópicos MHCC97L. (B) Imágenes PET representativas de proyección de intensidad máxima (MIP) de [18 F]FMISO y [18F]FDG en ratones portadores de tumores ortotópicos MHCC97L (C1) sin o (H2) con HAL. Los círculos azules indican la ubicación del tumor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de ratones portadores de tumores ortotópicos MHCC97L con y sin HAL. (A) Imágenes de TEP/RM representativas co-registradas [18F]FMISO, tinción inmunohistoquímica para HIF-1α y hematoxilina y eosina (HE) en secciones tumorales. (B-C) Análisis cuantitativo de la captación de [18F]FMISO en el tumor y el hígado. N = 3 para cada grupo. Los valores de SUV se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, describimos los procedimientos para realizar HAL en xenoinjertos de HCC ortotópicos hepáticos con tumores subcutáneos, junto con métodos para la monitorización no invasiva de la hipoxia tumoral en xenoinjertos ortotópicos utilizando [18 F]FMISO y [18F]FDG PET/MR. Nuestro interés radica en la imagen metabólica de diversos modelos de cáncer y enfermedad para el diagnóstico precoz y la evaluación de la respuesta al tratamiento11,13,14,15. Hasta la fecha, la creación de xenoinjertos HAL HCC y su metabolismo tumoral in vivo rara vez se han descrito en la literatura, lo que nos llevó a investigar las características metabólicas de estos modelos tumorales utilizando imágenes PET.
El establecimiento exitoso de xenoinjertos ortotópicos con HAL como un modelo robusto de ratones para estudiar la hipoxia en HCC representa un aspecto importante para estudiar la biología del HCC in vivo. Se sabe que la hipoxia estimula la neoplasia maligna del cáncer. Además, la hipoxia intratumoral se ha asociado con mayor proliferación, metástasis y radio- y quimiorresistencia y justifica una caracterización exhaustiva de la respuesta a las condiciones hipóxicas7. Mientras que los xenoinjertos subcutáneos se utilizan a menudo para estudiar la tumorigénesis del CHC o las estrategias de tratamiento, los modelos ortotópicos pueden recapitular mejor el desarrollo humano del CHC, ya que reflejan con mayor precisión el microambiente tumoral, en particular las influencias sobre la vascularización y las interacciones tumor-estroma hacia la metástasis del CHC12. La incorporación de HAL en ratones ortotópicos HCC permite la inducción de hipoxia intratumoral al bloquear el suministro sanguíneo arterial hepático al tumor7. Tales modelos animales permiten dilucidar los mecanismos subyacentes a los efectos del HAL en el CHC y crear nuevas vías para terapias efectivas dirigidas a la vía de la hipoxia en el CHC. Para la implantación ortotópica, utilizamos el cubo tumoral del tumor subcutáneo en lugar de la inyección directa de suspensiones de células HCC. Hemos encontrado que las inyecciones directas de células a menudo causan un pequeño volumen de fuga desde el sitio de inyección, a pesar de que el procedimiento se llevó a cabo lo más lentamente posible con un volumen de inyección bajo. Esto puede conducir potencialmente a metástasis peritoneales, que es perjudicial para el bienestar animal, afectando en última instancia el resultado general del estudio. Por otro lado, la implantación de un pequeño bloqueo tumoral superaría el problema, aunque se debe tener cuidado para garantizar que el tumor se suture de forma segura después de la implantación. Al aislar pequeños cubos tumorales del bloqueo tumoral subcutáneo, también es aconsejable evitar las regiones centrales del tumor sólido, que están relativamente menos vascularizadas y más estresadas metabólicamente debido a la hipoxia y la privación de nutrientes. Hacerlo reducirá la inclusión de células tumorales muertas que parecen ser necróticas dentro del pequeño cubo tumoral y mantendrá tasas de crecimiento tumoral más consistentes en ratones individuales.
La hipoxia es un factor pronóstico de resistencia al cáncer, y el monitoreo de los cambios en la hipoxia mediante PET permite la detección y cuantificación de tejidos hipóxicos en alta sensibilidad y especificidad. Una consideración importante para [18 F]FMISO y [18F]FDG PET implica el tiempo de captación del radiotrazador y la vía de administración en ratones. Ambos radiotrazadores tienen diferentes farmacocinéticas in vivo, una de ellas es la diferencia fisiológica de captación, observada en el intestino/vejiga y corazón/vejiga para [18 F]FMISO y [18 F]FDG, respectivamente, y la otra es que [18 F]FMISO se acumula en la región hipóxica del tumor, y [18F]FDG se absorbe preferentemente en la región tumoral metabólica alta 16. La alta lipofilicidad y el lento aclaramiento hepático de [18F]FMISO requieren un tiempo de 2-4 h después de la inyección para obtener un buen contraste tumoral-hepático17. Encontramos que 3 h después de la inyección es suficiente para diferenciar y delinear la captación tumoral [18F]FMISO del hígado para los grupos hipóxico (H2) y control (C1). En el caso de [18F]FDG PET, un tiempo de 1 h después de la inyección es adecuado para producir un buen contraste, como se describió anteriormente13,15, y se empleó en este estudio. Sin embargo, mantener un tiempo de absorción de radiotrazador constante es imperativo para garantizar la fiabilidad de los resultados de PET, especialmente para los análisis basados en SUV. Aquí, utilizamos técnicas intravenosas para administrar radiosonda a los ratones. La inyección exitosa de la vena de la cola se indica mediante un flashback de sangre visible antes de la infusión de radiosonda, donde la aguja se coloca con precisión dentro de la vena. Un inconveniente importante de este método es que el flashback sanguíneo esperado puede ser difícil de observar debido a la hipotensión, con variabilidad observada entre ratones. Sin embargo, tal dificultad se puede superar calentando la cola durante un corto período de 1-2 minutos antes de la inserción de la aguja, ya sea con un paño tibio o con una lámpara de calor para aumentar el flujo sanguíneo y mejorar la visibilidad de la vena para una inyección exitosa.
Con el creciente uso de imágenes PET para cuantificar la biodistribución de radiotrazadores en animales pequeños, una consideración importante a tener en cuenta es el uso de un escáner PET preciso y bien calibrado para producir datos PET buenos, reproducibles y cuantificables. Un sistema PET preciso permite que los estudios de imágenes se realicen de una manera más eficiente en el tiempo y rentable y permite la implementación de los principios de las 3R (Reemplazo, Reducción y Refinamiento) en la investigación con animales. Por esa razón, se deben realizar inspecciones rutinarias de control de calidad, preferiblemente semanalmente, para examinar los componentes PET y MR del sistema de imágenes según la recomendación del fabricante. En particular, la precisión de la actividad de PET debe verificarse y registrarse con frecuencia, así como antes del inicio de un experimento de imagen, para garantizar la fiabilidad de la cuantificación de PET. Esto es imprescindible para cualquier estudio longitudinal que implique la evaluación cuantitativa del tumor y los tejidos durante un período de examen para producir resultados significativos y comparables. La calibración del sistema es necesaria cuando se descubre que la precisión de la actividad de PET está fuera del rango recomendado, así como cuando se descubre una desalineación de las imágenes de PET y MR.
Aunque las técnicas descritas aquí permiten obtener imágenes PET de los xenoinjertos hipóxicos de HCC para una amplia gama de investigaciones in vivo , se deben considerar algunas limitaciones al contemplar el uso de estos protocolos. La creación de xenoinjertos HAL HCC es un procedimiento quirúrgico intraabdominal complejo para realizar en ratones inmunodeficientes de 6-8 semanas de edad. Además, la diminuta arteria hepática en estos ratones jóvenes puede ser difícil de localizar, lo que hace que el proceso de ligadura sea técnicamente desafiante. Estos procedimientos requieren personal adecuadamente capacitado para mejorar la tasa de sucesión de la cirugía, así como la supervivencia de los ratones durante un período de tiempo, es decir, 4-6 semanas antes de que se formen los xenoinjertos, mientras que se espera la provisión de un cuidado animal extenso durante todo el período de cirugía, que requiere mucho tiempo y recursos. También se anticipa que la creación de xenoinjertos ortotópicos de HCC utilizando este método requerirá alrededor de 8 semanas antes de una imagen PET exitosa, ya que se utiliza la implantación del cubo tumoral en lugar de la inyección directa de suspensiones celulares para evitar la metástasis peritoneal. Sin embargo, estas limitaciones pueden superarse con una planificación y capacitación adecuadas del personal investigador. Además, el tamaño de la muestra de los grupos experimentales informados aquí es pequeño, lo que podría no ser adecuado para el análisis estadístico. Sin embargo, nuestras observaciones revelan subjetivamente una tendencia en la que la hipoxia inducida por HAL se midió tanto en el tumor como en el hígado en el grupo H2 en comparación con el grupo C1, que está respaldado por una tinción HIF-1α más prominente en las muestras tumorales H2. Actualmente estamos trabajando en la expansión de los modelos tumorales con otras líneas celulares de HCC humano. Además, se están realizando estudios terapéuticos dirigidos a la vía de la hipoxia en el CHC que involucran estos xenoinjertos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos el apoyo del Fondo Fiduciario contra el Cáncer de Hong Kong, el Fondo de Investigación Colaborativa del Consejo de Subvenciones de Investigación de Hong Kong (CRF C7018-14E) para los experimentos de imágenes de animales pequeños. También agradecemos el apoyo del Centro de Imágenes Moleculares y Ciclotrón Médico (MIMCC) de la Universidad de Hong Kong para la provisión de [18 F] FMISO y [18F] FDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
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