Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling av leverstivhet ved bruk av atomkraftmikroskopi kombinert med polarisasjonsmikroskopi

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63974
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 4, 1, 1
1Laboratory of Integrative Biology, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2CEITEC MU, Masaryk University, 3Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, 4Laboratory of Biomathematics, Czech-BioImaging IPHYS, Institute of Physiology of the Czech Academy of Sciences

Summary

Vi presenterer en protokoll for å måle elastisk moduli av kollagenrike områder i normal og syk lever ved hjelp av atomkraftmikroskopi. Samtidig bruk av polarisasjonsmikroskopi gir høy romlig presisjon for lokalisering av kollagenrike områder i leverseksjonene.

Abstract

Matrix stivning har blitt anerkjent som en av de viktigste driverne for progresjon av leverfibrose. Det har dype effekter på ulike aspekter av celleadferd som cellefunksjon, differensiering og motilitet. Men da disse prosessene ikke er homogene gjennom hele orgelet, har det blitt stadig viktigere å forstå endringer i de mekaniske egenskapene til vev på mobilnivå.

For å kunne overvåke avstivningen av kollagenrike områder i leverlappene, presenterer dette papiret en protokoll for måling av levervevselastisk moduli med høy romlig presisjon ved atomkraftmikroskopi (AFM). AFM er en sensitiv metode med potensial til å karakterisere lokale mekaniske egenskaper, beregnet som Youngs (også referert til som elastisk) modul. AFM kombinert med polarisasjonsmikroskopi kan brukes til å spesifikt lokalisere områdene av fibroseutvikling basert på birefringence av kollagenfibre i vev. Ved hjelp av den presenterte protokollen karakteriserte vi stivheten i kollagenrike områder fra fibrotiske muselever og tilsvarende områder i leveren til kontrollmus.

En fremtredende økning i stivheten i kollagenpositive områder ble observert med fibroseutvikling. Den presenterte protokollen tillater en svært reproduserbar metode for AFM-måling, på grunn av bruk av mildt fast levervev, som kan brukes til å fremme forståelsen av sykdomsinitierte endringer i lokale vevsmekaniske egenskaper og deres effekt på skjebnen til naboceller.

Introduction

Leveren er et viktig organ for å opprettholde homeostase i organismer 1,2. Kroniske leversykdommer står for ~ 2 millioner dødsfall over hele verden årlig3. De stammer oftest som virusinfeksjoner, autoimmune sykdommer, metabolske syndromer eller alkoholmisbruksrelaterte sykdommer og ledsages av progressiv leverfibrose. Leverskade fremkaller en inflammatorisk respons, noe som fører til aktivering av celler som deponerer ekstracellulær matriks (ECM) i en sårhelingsrespons. Imidlertid, i nærvær av en kronisk fornærmelse, danner overskytende ECM uløst arrvev i leveren, noe som fører til utvikling av leverfibrose, skrumplever, leverkarsinom og til slutt til leversvikt4.

Hepatocyttskade resulterer umiddelbart i økt leverstivhet 5,6. Dette påvirker direkte hepatocyttfunksjonen, aktiverer hepatiske stellatceller (HSC) og portalfibroblaster, og resulterer i transdifferensiering til kollagenavsettende myofibroblaster 7,8. Avsetningen av fibrøs ECM øker ytterligere leverstivheten, og skaper en selvforsterkende tilbakemeldingssløyfe av leverstivning og matriksproduserende celleaktivering.

Leverstivhet har dermed blitt en viktig parameter i leversykdomsprognosen. Endringen i biomekaniske vevsegenskaper kan oppdages tidligere enn fibrose kan diagnostiseres ved histologisk analyse. Derfor har ulike teknikker for måling av leverstivhet blitt utviklet i både forskning og kliniske applikasjoner. I kliniske omgivelser har forbigående elastografi (TE) 9,10,11,12,13 og magnetisk resonanselastografi (MRE)14,15,16,17,18 blitt ansatt for å ikke-invasivt diagnostisere tidlige stadier av leverskade ved å undersøke brutto leverstivhet 19.

I TE forplantes ultralydbølger med mild amplitude og lav frekvens (50 Hz) gjennom leveren, og deres hastighet måles, som deretter brukes til å beregne vevselastisk modul13. Imidlertid er denne teknikken ikke nyttig for pasienter med ascites, fedme eller lavere interkostale rom på grunn av feil overføring av ultralydbølgene gjennom vevet rundt leveren9.

MRE er basert på magnetisk resonans imaging modalitet og bruker 20-200 Hz mekaniske skjærbølger for å målrette leveren. En spesifikk magnetisk resonansavbildningssekvens brukes deretter til å spore bølgene inne i vevet og for å beregne vevsstivheten16. Stivhetsverdier rapportert med både TE- og MRE-teknikker korrelerer godt med graden av leverfibrose fra biopsier av humane leverprøver rangert ved histologisk METAVIR-skår20 (tab 1). TE og MRE er også tilpasset for måling av leverstivhet i gnagermodeller for forskningsformål21,22,23. Men da begge metodene avleder stivhetsverdiene fra vevets respons på de forplantende skjærbølgene, kan de oppnådde verdiene ikke gjenspeile vevets absolutte mekaniske stivhet.

For en direkte mekanisk karakterisering av gnagerlever utviklet Barnes og medarbeidere en modell-gel-vevsanalyse (MGT-analyse) som involverte innebygging av levervev i polyakrylamidgel24. Denne gelen komprimeres av en pulserende jevn kraft som Youngs modul kan beregnes fra. MGT-analysen viser god korrelasjon med en innrykksanalyse tilpasset både normal og fibrotisk lever24 (tab 1).

Tabell 1: Leverstivhetsverdier ved bulknivå. TE og MRE sammenlignet med direkte ex vivo mekaniske målinger av leverelastisk moduli ved bruk av innrykk og MGT-analyser for lever fra forskjellige kilder. Forholdet mellom E og G er gitt ved E = 2G (1 + v), hvor v er Poissons forhold til prøven; F0 til F4 representerer fibroseskår i METAVIR scoring system, med F0 som angir lav eller ingen fibrose og F4 cirrhotisk lever. Forkortelser: TE = forbigående elastografi; MRE = magnetisk resonans elastografi; MGT = modell-gel-vev; E = elastisk (Youngs) modul; G = skjærmodul. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

En av de største ulempene med generiske leverstivhetsmålinger er at de ikke gir cellenivåoppløsning av stivhet heterogenitet i leveren. Under utviklingen av fibrose viser kollagenrike områder høyere stivhet sammenlignet med den omkringliggende parenchymen25,26. Denne stivhetsgradienten påvirker lokalt de bosatte cellene og spiller en viktig rolle i å drive HSC-heterogenitet27. Dermed må endringer i lokale mekaniske egenskaper under utvikling av leversykdom karakteriseres på mikroskopisk nivå for bedre å forstå fibroseprogresjon.

AFM gjør at de mekaniske egenskapene til vev kan måles med høy oppløsning og høy kraftfølsomhet. AFM bruker spissen av en utkrager for å rykke inn overflaten av en prøve med krefter så lave som flere piconewtons, og induserer en deformasjon på et mikroskopisk eller nanoskopisk nivå basert på geometrien og størrelsen på spissen som brukes. Kraftresponsen til prøven til den påførte belastningen måles deretter som avbøyningen i utkrageren28. Kraftforskyvningskurver hentes fra tilnærming og tilbaketrekning av utkrageren, som kan utstyres med passende kontaktmekaniske modeller for å evaluere den lokale stivheten til prøven29.

I tillegg til å måle stivheten til et gitt område, kan AFM også gi topografisk informasjon om spesifikke egenskaper i prøven, for eksempel strukturen av kollagenfibre30,31,32. Flere studier har beskrevet anvendelsen av AFM for å måle stivheten til forskjellige sunne og syke vev, for eksempel hud 32,33, lunge 34,35, hjerne36, bryst37,38,39, brusk 40 eller hjerte41,42,43,44 fra både pasient- og musemodellprøver. Videre har AFM også blitt brukt in vitro for å bestemme stivheten til celler og ekstracellulære proteinstillaser45,46,47.

Måling av de mekaniske egenskapene til biologiske prøver ved bruk av AFM er ikke-triviell på grunn av deres mykhet og skjøthet. Dermed har ulike studier standardisert forskjellige forhold og innstillinger, noe som gir mye svingende verdier av Youngs moduli (gjennomgått av Mckee et al.48). I likhet med annet bløtvev viser også leveren Youngs modulverdier ved ulike grader av leverfibrose stor variasjon (tab 2). Forskjellene i Youngs modulverdier stammer fra forskjeller i modus for AFM-drift, utkragetips, prøveprepareringsmetode, prøvetykkelse, innrykksdybde og krefter, levervevsmiljø under måling og analysemetode (tabell 2).

Tabell 2: Leverstivhetsverdier på cellenivå. Leverstivhetsverdier oppnådd ved bruk av AFM beskriver leverens mekaniske egenskaper på mobilnivå. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; E = elastisk (Youngs) modul; PFA = paraformaldehyd; PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Dette papiret beskriver en protokoll for reproduserbar måling av Youngs moduli av kollagenrike fibrotiske områder i levervev ved AFM med en presis lokalisering gitt ved bruk av polarisasjonsmikroskopi. Vi administrerte karbontetraklorid (CCl4) for å indusere kollagenavsetning på en sentrilobulær måte49 i en musemodell, som pålitelig etterligner viktige aspekter ved human leverfibrose50. Polariserte mikroskopiske bilder muliggjør visualisering av kollagen i leveren på grunn av birefringence av kollagenfibre51, noe som muliggjør nøyaktig posisjonering av utkragespissen over ønsket interesseområde i hepatisk lobule52.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til en dyreprotokoll godkjent av Dyrepleieutvalget ved Institutt for molekylærgenetikk og i henhold til EU-direktiv 2010/63/EU for dyreforsøk. Et samlet skjematisk diagram over den presenterte protokollen er vist i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Samlet skjema for AFM-evaluering av Youngs modul fra muselever. (A) Isolering av lever fra kontrollerte eller behandlede mus etterfulgt av snitting og lagring ved -80 °C (maksimal lagring, 2 uker). (B) Festing av den sfæriske perlen til utkragingen med påfølgende herding av lim over natten (venstre). Utkragekalibrering etterfulgt av prøvemontering (høyre). (C) Justering av polarisatoren og analysatoren for å visualisere lyse kollagenstrukturer etterfulgt av et overlegg av bildet i kameraet med målefeltet under AFM-utkrageren. (D) Anskaffelse av stivhetskart og analyse. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; PBS = fosfatbufret saltvann; OCT = optimal skjæretemperaturforbindelse; CCl4 = karbontetraklorid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1. Prøvepreparering I

  1. Excise leveren fra den åpne magen av en mus avlivet ved cervikal dislokasjon under anestesi. Isoler venstre sidelapp og bygg inn den laterale halvdelen av i optimal skjæretemperatur (OCT) ved rask frysing på tørris. Oppbevar det OCT-innebygde vevet ved −80 °C.
    MERK: Tidligere studier har vist at stivhetsverdiene er like mellom frosset og friskt vev25,26.
  2. Seksjon 30 μm tykke leverseksjoner på positivt ladede lysbilder ved hjelp av en kryotome og oppbevar lysbildene ved -80 ° C til dagen for AFM-måling ikke mer enn 2 uker derav.

2. Sette opp instrumentet

  1. Feste av en 5,7 μm perle til AFM cantilever spissen (Supplerende Figur S1, trinn 1-5)
    MERK: Vedlegget av perlen til utkragingen ble også tidligere beskrevet av Norman et al.46.
    1. Spred suspensjonen av 5,7 μm diameter melaminharpiksperler jevnt på halvparten av arealet av et glassglass og lufttørk for å fordampe løsningsmidlet (tilleggsfigur S1, trinn 1).
    2. På den andre halvdelen av lysbildet, ved hjelp av en 10 μL-spiss, lag en tynn linje med ferdigblandet epoksyharpiks med lang arbeidstid (tilleggsfigur S1, trinn 1).
    3. Legg cantilever-sonden til AFM-hodet i henhold til produsentens instruksjoner.
    4. Monter lysbildet og dekselet med AFM-hodet utstyrt med utkragesonden.
      MERK: En SD-qp-BioT-TL-10 cantilever ble brukt i studien.
    5. Ta det ferdigblandede epoksyharpikslimet til midten av lysbildet og nærme limet med utkrageren med lav kraft (sett et settpunkt til 1 V for å følge denne protokollen; Supplerende figur S1, trinn 2).
      MERK: Før du nærmer deg lysbildeoverflaten, må du sørge for at laseren er justert i midten av utkragespissen, indikert med høy sumspenning ved å følge trinn 6-8 i seksjon 2, del 3, Kalibrering av fjærkonstanten til AFM-utkrageren.
    6. Etter at spissen av cantilever-sonden kommer i kontakt med limet, flytt den like over lysbildet for å fjerne overflødig lim.
    7. Trekk nå utkragespissen fra lysbildet og flytt lysbildet for å få en enkelt perle i midten (tilleggsfigur S1, trinn 3). Tilnærm perlen igjen med AFM cantilever-sonden med høyere kraft (settpunkt 2 V) for å feste perlen i midten av cantilever-sonden og la den stå i minst 10 s (tilleggsfigur S1, trinn 4).
    8. Trekk ut utkragingssonden og oppbevar den over natten ved romtemperatur for å herde limet eller følg instruksjonene for epoksyharpiksen (supplerende figur S1, trinn 5).
  2. Sette opp polarisatoren og analysatoren
    1. For å finne interesseområdene i leverseksjonene, sett opp mikroskopet med polarisatoren og analysatoren. Juster vibrasjonsasimutene deres i en vinkel mellom 0 ° og 90 ° til hverandre ved å rotere en av dem i forhold til den andre manuelt eller på en automatisert måte for å minimere overført lys og maksimere ekstraordinære stråler som passerer gjennom målet. Forsikre deg om at kollagenfibrene ser lyse ut mot en mørk bakgrunn i det polariserte bildet (figur 2), noe som gjenspeiles av et skifte i toppen av bildets histogrammet mot lyse piksler.

Figure 2
Figur 2: Representative mikroskopibilder viser uttalt visualisering av kollagenfibre i polarisert mikroskopi sammenlignet med brightfield-bilder. Leverseksjoner fra mus behandlet med CCl4 i 3 uker ble utsatt for (A) brightfield og (B) polarisert mikroskopi. Birefringent kollagenfibre er tydelig synlige i hvitt i polariserte bilder sammenlignet med brightfield-bilder. Den røde boksen representerer kollagenrikt område som brukes til AFM-måling. Rammesett viser innzoomede visninger av området i den røde boksen. Skala bar = 100 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; CCl4 = karbontetraklorid; CV = sentral vene; PV = portalvene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

MERK: For denne protokollen kan AFM-hodet installeres på et hvilket som helst egnet invertert mikroskop med mulighet for å sette inn en polarisator og en analysator. Systemet må plasseres i en isolasjonsenhet for å redusere bakgrunnsstøyen.

  1. Kalibrering av fjærkonstanten til AFM-utkrageren
    1. Legg utkragingssonden (klargjort i henhold til trinn 1-8 i avsnitt 2, del 1, festing av en 5,7 μm perle til AFM-utkragespissen) til AFM-hodet i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. Rengjør utkragingen med 70 % etanol for å forhindre kontaminering av utkragingen under målingen. Vask grundig med destillert vann for å fjerne gjenværende etanol fra spissen.
    3. Aktiver kontaktmodus og velg kraftkartlegging som målemetode.
    4. Åpne alle relevante vinduer (Z Stepper Motors, Motorized Stage Control, Data Viewer, Force Scan Map Oscilloskop, Laser Alignment og Kameravindu ) i programvarefanene ved å klikke på de tilsvarende knappene.
    5. Monter et rent glassglass som inneholder 1,2 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i et område på ca. 2 cm x 4 cm avgrenset med en hydrofob markørpenn. Monter AFM-hodet på mikroskoptrinnet og sørg for at utkrageren er helt nedsenket i PBS.
    6. Fokuser målet på utkragespissen. Reduser intensiteten av overført lys på mikroskopet for å få bedre oversikt over laserposisjonen på skjermen.
    7. Mål laseren til den gjennomsiktige enden av utkrageren (under hvilken den sfæriske perlen er festet) og juster speilet ved hjelp av knottene på AFM-hodet for å maksimere den totale intensiteten til laserstrålen på detektoren (avbildet av summen i laserjusteringsvinduet ).
    8. Juster fotodiodedetektoren ved hjelp av knottene som er tilstede på AFM-hodet for å plassere laseren i midten.
    9. La utkrageren stabilisere seg i 15 minutter før du fortsetter kalibreringen.
    10. Åpne kalibreringslederen og sett inn typen utkragende, utkragende dimensjoner og miljøforhold. Kalibrer fjærkonstanten og følsomheten (også kjent som invers optisk spakfølsomhet, InvOLS) ved å klikke på Calibrate. Bekreft nøyaktigheten av fjærkonstanten oppnådd etter kalibrering med produsentens erklæring. Kalibrer utkrageren i kontaktfri modus (kalibrering utføres av programvaren ved hjelp av termisk teorem avledet av Sader et al.58).
      MERK: Fjærkonstanten til utkrageren representerer stivheten til utkrageren og er gitt av motstandskraften til utkrageren når den deformeres per deformasjonslengden i form av N / m. Følsomheten til cantilever skildrer verdien av fotodioderespons (i volt) som svar på avbøyningen av cantilever (i nanometer) og presenteres vanligvis i form av nm / V59. I kontaktfri modus registreres det termiske støyspekteret og utstyres med den hydrodynamiske funksjonen60 av AFM-kontrollprogramvaren automatisk etter kalibrering. Beslaget gir kalibreringsparametrene, nemlig fjærkonstanten og InvOLS. Vårkonstanten til SD-qp-BioT-TL-10 cantilever brukt i denne studien var 0,09 N / m, som deklarert av produsenten.

3. Prøvepreparering II

  1. Tine de frosne seksjonene (lagret ved -80 °C, som beskrevet i avsnitt 1, prøvepreparering I) ved romtemperatur i 2 minutter.
  2. Fest seksjonene med iskaldt 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 10 minutter ved 4 °C etterfulgt av omfattende vask (5x) med 1x PBS. Tørk gjenværende PBS rundt seksjonen med et vev og merk en grense på ca. 2 cm x 4 cm rundt leverseksjonen med en hydrofob markørpenn. Dekk prøven med 1x PBS (sørg for at det avgrensede området inneholder ~ 1,2 ml 1x PBS). Bruk prøven for AFM-målinger.
    MERK: Siden PFA er et farlig kjemikalie, må det håndteres med forsiktighet for å forhindre kontakt med hud eller øyne. For å unngå giftig røyk må alle prosedyrer som involverer PFA utføres i en sertifisert kjemisk avtrekkshette eller annet godkjent ventilert område.

4. Måling

  1. Aktiver automatisk lagring ved å gå til Oppsett-fanen og gjøre et kryss på Autosave. Angi filnavnet og katalogen for lagring av målefilene ved å gå til kategorien Oppsett og deretter klikke på Lagre innstillinger.
  2. Last inn prøven (klargjort i henhold til avsnitt 3, prøvepreparering II). Tilnærm deg vevsoverflaten med AFM-utkrageren ved å slå på laseren og klikke på Approach-tasten . Etter at spissen er i kontakt med vevsoverflaten, trekk utkragespissen slik at spissen forblir i fokus for målet (ved å klikke på tilbaketrekningstasten , som trekker utkrageren til den øverste enden av piezoområdet). Juster detektoren på nytt hvis laserposisjonen flyttes bort fra midten i laserjusteringsvinduet .
  3. Slå av laseren og legg over mikroskopets optiske felt med AFM-målekart ved å klikke på kategorien Tilbehør og deretter velge Optisk kalibrering med direkte overlegg. I det påfølgende vinduet klikker du på Neste for å ta en serie bilder av utkrageren som skanner et bestemt område. Klikk Neste igjen for å gå til neste vindu.
  4. I det første bildet klikker du på midten av spissen av utkrageren manuelt for å skildre spissposisjonen i programvaren. Sirkelen som viser spissposisjonen kan manipuleres i størrelse ved å indikere radiusen for å øke nøyaktigheten. Klikk på Kalibrer for automatisk å oppdage utkragespissposisjonen i alle bilder. Bekreft nøyaktigheten av tipsdeteksjonen ved å gå gjennom bildene.
  5. Klikk Neste og deretter Fullfør for å fullføre det optiske overlegget og lagre bildeserien som ble tatt under optisk kalibrering.
  6. Trekk utkrageren ytterligere for å unngå kollisjon med høyere overflater på lysbildet. Flytt scenen for å plassere et kollagenrikt område inne i den grønne boksen som er synlig i Datavisning-fanen ved hjelp av det polariserte bildet. Velg det kollagenrike området ved å lage et rektangel rundt det ved å trykke lenge på venstre museknapp inne i den angitte grønne boksen. Definer dimensjonene, retningen og oppløsningen for det valgte området under Rutenett-fanen på venstre side. Klikk på Bekreft ny skanneregion for å angi det valgte området som måleområde.
  7. Behold IGain- og PGain-parametere for tilbakemeldingssløyfen ved standardverdier, hvis ingen store ustabiliteter presenteres i form av overfølsomhet i systemet. For å følge denne protokollen, sett IGain på 50 Hz og PGain på 0,001.
  8. Sett settpunktet til 1 nN.
    MERK: Settpunkt er kraften i samspillet mellom spiss og overflate under stasjonær tilstand. For de fleste bløtprøver (celler, geler og vev) er settpunktverdier i området 0,5-2,0 nN passende.
  9. Velg den relative settpunktverdien i henhold til de mekaniske egenskapene til det studerte materialet og stivheten til utkrageren. For denne protokollen setter du verdien til 5 nN.
    MERK: Det relative settpunktet representerer den maksimale interaksjonskraften når toppen av kraftavstandskurven er nådd og spissbevegelsen går tilbake til grunnlinjen. For myke materialer (1-50 kPa) er denne parameteren satt i enheter av nanonewton (nN). For en myk utkrager (med fjærkonstant fra 0,05 N/m til 0,35 N/m) er dessuten den maksimale kraften som kan påføres ca. 50 nN. Juster setpoint - og relative settpunktverdier tilsvarende.
    1. Forsikre deg om at den gitte settpunktverdien ikke fører til en innrykksdybde som er større enn radiusen til den sfæriske innrykkeren, ellers kan ikke innrykksoverflaten defineres riktig i beregningen av Youngs modul. Beregn gjennomsnittsverdien av innrykksdybden etter den første kjøringen av innrykkene; Se avsnitt 5, Dataanalyse, for å lære hvordan du behandler de registrerte dataene. Juster settpunktverdien om nødvendig.
  10. Sett Juster grunnlinje som 5.
    MERK: Her refererer grunnlinjen til graden av polynom som brukes til å tilpasse tilnærmings- og tilbaketrekkingskurvene. Å sette grunnlinjen til 5 passer kurvene til høy oppløsning og sikrer dermed fangst av bakgrunnsstøy under målinger.
  11. Velg lengden på utkragingsbevegelsen i Z-aksen (Z-lengden) i henhold til overflatetopografien til prøven. For å følge denne protokollen, sett Z-lengden til 15 μm.
    MERK: En høy verdi (f.eks. 15 μm) reduserer målefølsomheten, men er vanligvis nødvendig for prøver med en svært uregelmessig overflate som fibrotisk levervev.
  12. Sett Z-bevegelse til Konstant varighet.
    MERK: Z-bevegelse kan også settes til Konstant hastighet for å vise data som refererer til Z-bevegelse (Utvid hastighet og Forleng tid) i en annen modus.
  13. Sett forlengingstiden til 1 s. Angi forlengelsesforsinkelse og tilbaketrekningsforsinkelse som 0.
    MERK: Bruk forlengede hastigheter på >5,0 μm / s for svært myke materialer61, da lavere innrykkshastigheter vil resultere i en mer viskøs og mindre elastisk respons fra myke overflater. Forlengelsesforsinkelse og tilbaketrekningsforsinkelse er parametere som kan brukes til å studere spesifikk interaksjon mellom utkragespissen og substratet (f.eks. interaksjoner av proteiner immobilisert på overflaten av utkrageren med proteiner immobilisert på lysbildeoverflaten).
  14. Angi samplingsfrekvens til 5000 Hz.
    MERK: Samplingsfrekvensen refererer til frekvensen av punkter som registreres på en komplett innflygings-tilbaketrekningskurve. Sett dette til en høy verdi (f.eks. 5000 Hz) for å unngå å gå glipp av visse områder av kurvene på grunn av deres ekstremt raske overgang.
  15. Merk Z Closed Loop med en Tick for å aktivere et tilbakemeldingssløyfesystem, som sikrer kontantavstand mellom prøveoverflaten og utkragespissen.
  16. Koble fra det motoriserte trinnet ved å velge Engage and Click on Approach for å nærme seg prøven med utkrageren. Klikk på Start skanning for å begynne å samle kraftavstandskurver i området som er angitt i trinn 6; § 4, Måling.

5. Analyse av data

  1. Analyser de oppkjøpte dataene ved hjelp av åpen kildekode-programvaren "AtomicJ" (som kan lastes ned fra https://sourceforge.net/projects/jrobust/).
    MERK: Den støtter filer samlet fra Agilent Technologies, JPK Instruments eller Bruker atomkraftmikroskoper.
  2. Last kraftkurvene inn i programmet ved å klikke på prosesskraftkurvene og kartikonet i AtomicJ (tilleggsfigur S2A, x). I behandlingsassistenten legger du til kartene som skal analyseres ved å klikke på Legg til-knappen (tilleggsfigur S2A, y). Klikk på Neste etter at kartene er lastet inn (tilleggsfigur S2A, z).
  3. Angi behandlingsinnstillingene i neste vindu i henhold til trinnene beskrevet nedenfor (tilsvarende trinnene i tilleggsfigur S2B, trinn 1-11):
    1. Beregn kontaktpunktet mellom prøven og utkrageren manuelt ved beregning eller automatisk ved hjelp av et sett med passende kurveparametere. For å følge denne protokollen, bruk automatisk estimering av kontaktpunktet.
    2. Bestem kontaktpunktet mellom utkrageren og prøven ved hjelp av klassisk fokusert rutenettmetode.
    3. Velg estimeringsmetoden for å gi den beste bestemmelsen av kontaktpunktet basert på kvaliteten på de målte kraftkurvene, som må bestemmes empirisk under optimalisering av dataanalyse. Hvis du vil følge denne protokollen, bruker du den modelluavhengige metoden.
    4. Tilpass kraftinnrykkskurven ved hjelp av en klassisk modell (bruk klassisk L2 for modelltilpasning for å følge denne protokollen).
      MERK: Model fit og Contact estimator er parametere som styrer hvordan kurvene monteres av programvaren og hvordan kontaktpunktet er etablert i den monterte kurven, henholdsvis. For disse målingene ble det klassiske alternativet brukt, som bruker minste kvadraters regresjon. Dette behandler hvert lavkraftpunkt på kurven som et prøvekontaktpunkt og passer et polynom til regionen før prøvekontaktpunktet. Den passer deretter til riktig kontaktmodell til de innsamlede kraftinnrykksdataene. Punktet som gir lavest kvadratsum antas som kontaktpunkt. Andre metoder kan brukes basert på kvaliteten på kraftkurver oppnådd62,63.
    5. Sett passformen til modellen til Uttak-kurven .
    6. Sett Poissons forhold til 0,45, som anbefalt for bløtvev som lever24.
    7. Still inn kurvens passform ved hjelp av en grunnlinjegrad på 3 og en kontaktgrad på 1. Endre graden av polynomtilpasning basert på skalaen for avvik fra kurvene fra modellen.
    8. Velg modellen som brukes til å passe til tilbaketrekningskurvene. Bruk Sneddon-modellen , som beregner Youngs modul basert på ligning (1) og ligning (2):
      Equation 1(1)
      δ = Equation 2 (2)
      hvor F er kraft, E er Youngs modul, v er prøvens Poissons forhold, δ er dybden av innrykk, a er kontaktradiusen, og R er kuleradiusen62,63.
    9. Fyll ut radiusen til den sfæriske spissen i mikrometer (2,9 μm i denne protokollen).
    10. Last fjærkonstanten og InvOLS fra datafilene ved å aktivere innlesing (merk av i boksene).
    11. Klikk på Fullfør.
      MERK: De analyserte dataene presenteres i form av kart over vertikal avbøyning, høyde, vedheft, kontaktkraft, deformasjon, adhesjonskraft, R2-verdier , helning, Youngs modul, overgangsinnrykk, overgangskraft og kontaktposisjon beregnet for hver kraftkurve (tilleggsfigur S3, øverst til venstre). To ekstra vinduer viser kraftkurver og råverdier (tilleggsfigur S3, henholdsvis øvre høyre og nedre panel).
  4. Ekskluder kraftkurver der utkrageren nærmet seg overflaten av leverseksjonen feil. For å identifisere disse, se etter kurver med høy støy, avvikende former og / eller ufullstendig tilnærming, som vist i figur 3 og diskutert i detalj andre steder46.

Figure 3
Figur 3: Eksempler på representative kraftforskyvningskurver. (A,B) Representative tolkbare kraftkurver for stivere (A; E = 10,5 kPa) og mykere (B; E = 1,78 kPa) områder som er egnet for analyse. (C-F) Representative uforståelige grafer som må utelukkes fra analysen på grunn av (C-E) feil tilnærming eller (F) høyere støy. Som angitt i forklaringen gitt i (A), viser røde kurver tilnærmingen til utkrageren, og grønne kurver viser tilbaketrekningen av utkrageren. Svarte linjer viser monteringen av tilbaketrekningskurven til utkrageren. Hellingen på de svarte linjene tilsvarer Youngs modul. De røde og blå punktene tilsvarer henholdsvis kontaktpunktet og overgangspunktet. Kontaktpunktet er det siste kontaktpunktet mellom utkrageren og substratet under tilbaketrekning, mens overgangspunktet beskriver overgangen til utkrageren fra tilnærming til tilbaketrekning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Representative Results

Mildt faste, 30 μm tykke leverseksjoner oppnådd fra kontrollmus og fra mus med mild eller avansert fibrose (indusert ved injeksjon av CCl4 i henholdsvis 3 uker eller 6 uker,49) ble undersøkt med AFM som beskrevet i denne protokollen. Kollagenfibre nær sentrale vener ble valgt for måling av stivhetskart. Områder nær de sentrale venene, som tilsvarer områdene der kollagenfibre i CCl 4-behandlede dyr vanligvis dannes, ble analysert i kontrolllever (figur 4A). Fordelingen av Youngs moduli var reproduserbar på tvers av forskjellige kontrolllever og kollagenrike områder innenfor en enkelt leverseksjon (figur 4B: venstre fiolinplott).

I CCl 4-behandlede dyr viste stivhetskart tilsvarende pericentralområdene av kollagenavsetninger signifikant høyere verdier av Youngs moduli sammenlignet med ekvivalente områder hos kontrollmus (figur 4B: 1,9 kPa vs. 2,6 kPa median Youngs modulverdier for kontroll vs. 3 ukers CCl 4-behandlet mus; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa median Youngs modulverdier for kontroll vs. 6 uker CCl4 -behandlet mus; p = 0,02). Videre var det en signifikant økning i verdiene av Youngs moduli med lengre CCl 4-behandling (figur 4B; 2,6 kPa vs. 5,1 kPa median Youngs modulverdier for 3 uker vs. 6 ukers CCl4-behandlet mus; p = 0,04). Dette viser en gradvis avstivning av kollagenavsetninger med fibroseprogresjon og at AFM-målinger reflekterer fibrogenesen.

For å evaluere effekten av langvarig lagring av OCT-innebygde leverseksjoner på de mekaniske egenskapene til kollagenfibre, målte vi stivheten til kollagenfibre i seksjoner av CCl 4-behandlede mus, som ble lagret ved -80 ° C i 2 uker eller 3 måneder på lysbildet etter kutting (figur 5). AFM-målinger viste signifikant lavere verdier av Youngs moduli i kollagenrike områder for seksjoner lagret i 3 måneder sammenlignet med de som ble oppnådd fra seksjoner målt innen 2 uker etter prøveseksjonering (figur 5; 4,7 kPa vs. 3,6 kPa median Youngs modulverdier i 2 uker vs. 3 måneders lagring; p < 0,001). Det er derfor viktig å måle de mekaniske egenskapene til levervevet kort tid etter at seksjonene er fremstilt fra de OCT-innebygde leverlappene.

Figure 4
Figur 4: AFM-målinger viser progressiv avstivning av kollagenrike områder som korrelerer med langvarig CCl4-behandling. (A) Leverseksjoner fra kontrollmus og mus behandlet med CCl4 i 3 uker eller 6 uker ble brukt til å måle de mekaniske egenskapene til kollagenrike områder. De boksede områdene av leverseksjoner vist i de polariserte mikroskopibildene (venstre) er kollagenrike skanneområder (eller tilsvarende regioner i kontrollleveren) valgt for AFM-målinger (30 μm x 100 μm, 10 piksler x 36 piksler). Youngs modulkart med fargeskalaer som tilsvarer disse boksede områdene vises til høyre, inkludert histogrammer av Youngs modulverdier fra disse kartene; innfelte spredningsdiagrammer viser verdier >10 kPa for hver betingelse. Avstivningen av leveren visualiseres som en gradvis høyreforskyvning i histogramfordelingen og en høyere frekvens av punkter i det innfelte spredningsplottet. Skalalinje = 20 μm. (B) Fiolinplott viser fordelingen av elastisk moduli fra tre områder målt for hver tilstand (venstre) og oppsummerte elastiske modulverdier fra alle tre kartene (høyre). Fiolinplott viser medianen (rød linje), 25. persentil og 75. persentil (svarte linjer); Prikker representerer middelverdiene for individuelle kart fra område 1-3. De presenterte p-verdiene ble beregnet ved hjelp av en Student t-test utført på gjennomsnitt. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; CCl4 = karbontetraklorid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Utvidet lagring av leverseksjoner fører til en reduksjon i stivhet i kollagenrike områder. Leverseksjoner (tilberedt fra mus behandlet med CCl4 i 2 uker) lagret ved -80 °C i 2 uker eller 3 måneder ble brukt til å måle Youngs modul. Polariserte mikroskopibilder (til venstre) med bokser som indikerer de kollagenrike områdene som brukes til AFM-måling (30 μm x 100 μm, 10 piksler x 36 piksler). Tilsvarende Youngs modulkart med fargeskalaer (høyre). Histogrammer viser Youngs modulverdier samlet inn fra 4-6 områder i hver prøve; innfelte spredningsgrafer viser verdier >10 kPa for hver betingelse. Skala bar = 20 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; CCl4 = karbontetraklorid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur S1: Metode for å modifisere cantilever med en melaminharpiks mikroperle. (A) Tegnet skjematisk illustrerer festingen av en sfærisk perle til spissen av utkrageren. For en trinnvis beskrivelse, se seksjon 2, del 1, Vedlegg av en 5.7 μm perle til AFM cantilever tip. (B) Mikroskopibilde av en sfærisk 5,7 μm perle festet til utkragespissen vist fra topp (venstre) og lateral visning (høyre). Skala barer = 20 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; RT = romtemperatur. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Dataanalyse i AtomicJ. (A) Sekvensen av trinn som skal følges for å åpne stivhetskart i AtomicJ. Et enkelt venstreklikk på prosesskraftkurvene og kartene (x) åpner behandlingsassistenten. Filer kan lastes til behandlingsassistenten ved å klikke på legg til (y) og velge de nødvendige filene. Klikk på neste (z) for å gå videre til neste trinn. (B) Parametere for kurvetilpasning, passende kontaktmekanikkmodell og AFM-innstillinger som brukes under måling. Trinn 1-11 refererer til tilsvarende underpunkter beskrevet i protokoll trinn 3, avsnitt 5, Dataanalyse. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S3: Oversikt over analyserte data i AtomicJ. Forhåndsvisningen av analyserte data viser stivhetskart (øvre venstre vindu), kraftkurver (øvre høyre vindu) og rådata (nedre vindu). Forkortelse: AFM = atomkraftmikroskopi. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Den presenterte protokollen gir en trinnvis reproduserbar metode for AFM-måling av normalt og fibrotisk muselevervev. Koblet polarisasjonsmikroskopi gir høy romlig presisjon og muliggjør visualisering av kollagenfibre på grunn av deres birefringence. Videre er det gitt en detaljert beskrivelse av analysen av de oppnådde kraftkurvene. AFM-stivhetsmåling kan utføres på mobilnivå, noe som gjør at lokale endringer i levervevets mekaniske egenskaper på grunn av utvikling av fibrotisk sykdom kan overvåkes. Leverfibrose er ikke en homogen prosess som påvirker hele organet. Tvert imot er områder med kollagenrik fibrotisk septa ispedd områder med lave eller ingen kollagenavsetninger. Dermed er stivhetsendringer spesifikke for det lokale mikromiljøet og påvirker bare celler lokalt i kontakt med områder som er skadet av skade. Denne mikroskalaen av stivhet heterogenitet er også tydelig i detaljene i AFM Youngs modulkart, hvor punkter med høy stivhet grenser til områdene med nesten normal stivhet. Denne variasjonen viser at selv kollagen arrvevsområde ikke er mekanisk homogent og krever AFM-måling for å kunne karakteriseres på cellenivå (figur 4).

Den presenterte protokollen tillater målinger av leverstivhet ved AFM uavhengig av leversamlingen, da hele leverlappene innebygd i OCT kan lagres i en lengre periode ved -80 ° C. Når vevet er seksjonert, anbefaler vi imidlertid å måle prøvene innen ~ 2 uker, da vi har observert en gradvis mykning av vevsseksjoner lagret i lengre perioder (figur 5).

AFM utstyrt med polarisasjonsmikroskopi gjør det mulig å nøyaktig lokalisere interesseområdet i leveren lobule struktur. Det har imidlertid også noen begrensninger som må vurderes når man tolker resultatene. Stivhetsverdiene oppnådd her ble målt ved romtemperatur. Vi antar at effekten av temperatur på de mekaniske egenskapene til bløtvev vil være liten; Dette kan imidlertid være en av årsakene til forskjeller mellom de rapporterte in vivo-verdiene av mekaniske egenskaper til levervev og verdiene i denne studien.

Videre tillater denne protokollen AFM-analyse av levervev i opptil 3 timer, noe som krever mild fiksering av vevet. Den milde fiksering av vevsseksjoner, samt fryse-tine-syklusen, vil mest sannsynlig påvirke de absolutte verdiene til Youngs modul. Dermed kan de rapporterte verdiene til Youngs moduli avvike fra in vivo-verdier . Ytterligere studier er nødvendig for å optimalisere protokollen for måling av absolutte verdier av Youngs modul fra leverseksjoner, som kan oppnås ved en annen metode for fiksering av levervev64.

Likevel observerte vi økende stivhet av kollagenrike områder i leveren til mus behandlet med CCl4 i 3 uker sammenlignet med 6 uker. Slike forandringer samsvarer med fibroseprogresjon ved langvarig skade (figur 4) og viser at relative forskjeller kan undersøkes mellom ulike behandlinger med presentert protokoll. Dette er i samsvar med observasjonene til Calò og medarbeidere, som viste at mildt fikserte leverseksjoner viser lignende forskjeller i stivhetsverdier mellom kollagenrike og kollagenfattige områder som i ferskt vev25.

Vi brukte SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (teoretisk fjærkonstant ~ 0,09 N / m) modifisert med en 5,7 μm diameter sfærisk spiss for å minimere mekanisk forstyrrelse av levervevet under målinger. En 5,7 μm perle muliggjorde tilstrekkelig innrykk av prøven for å undersøke stivheten samtidig som den bevarte integriteten. En perle med mindre diameter kan brukes, etter flere optimaliseringer, for å få høyere oppløsning i stivhetskartene, men kan føre til ytterligere overestimering av Youngs modulverdier (for flere detaljer, se Crichton et al.65). Ved hjelp av det spesifiserte cantilever-perleensemblet var vi i stand til å karakterisere prøvestivhet i et bredt spekter, fra titalls enheter av Pa til ~ 100 kPa.

Sneddons modell ble brukt til å utlede Youngs modul fra kraftkurver, da den tillater analyse av dype innrykk med kolloidale sonder62. Sneddons modell, i motsetning til Hertz modell, lider ikke av begrensningen at kontaktradiusen må være mye mindre enn kuleradiusen. Det antas videre at prøvetykkelsen er flere ganger større enn innrykksdybden30,66. I denne studien var innrykket ~2 μm med en dråpestørrelse på 5,7 μm og en prøvetykkelse på 30 μm i kollagenrike områder; dermed var Sneddons modell passende. Andre modeller63 med tanke på adhesjonskraften mellom spiss og substrat kan brukes til forskjellige typer vev.

Analyse i AtomicJ implementerer korreksjoner for den endelige tykkelsen på prøvene for å minimere bidraget fra et substrat mens Youngs modul62,67 utledes. I analysen av de oppnådde kraftkurvene brukte vi et enkelt Poissons forhold på 0,45, som tidligere er anbefalt for bløtvevsorganer24. Denne tilnærmingen har ingen signifikant effekt på beregnede verdier av Youngs modul, da endringen i verdien av Poissons forhold fra 0,4 til 0,5 bare resulterer i en 0,893x reduksjon i Youngs modulverdier beregnet i henhold til Sneddons ligning. Gitt de mange forskjellene i Youngs modul mellom de forskjellige varighetene av CCl 4-behandlinger, er feilene som produseres ved å tilnærme Poissons forhold bare marginale.

Vi brukte tilbaketrekningskurver for å beregne stivhetsverdier, da vi var interessert i vevets elastiske respons på belastningen fra utkrageren i stedet for i plastresponsen på innrykk68. På grunn av den viskoelastiske responsen til bløtvevet, kan passende tilbaketrekningskurver overvurdere Youngs modul, noe som bør huskes. Videre har vi observert at dataanalyse med tilnærmingskurver gir tilsvarende trender i stivhetsverdier mellom fibrotiske områder og kontrollområder, selv om absoluttverdiene er tilsvarende lavere (data ikke vist).

Mens vi optimaliserte protokollen, identifiserte vi flere trinn som er kritiske for reproduserbarheten av målingene. For det første er det viktig å sikre at perlen er omtrent i midten av den gjennomsiktige spissen mens den festes til utkrageren. Dette forhindrer mulig mekanisk ubalanse under innrykk. For det andre, under leverfiksering med PFA, er det nødvendig å følge tidsgrensene for tining og fiksering strengt. Endring av tidspunktet for dette trinnet kan ha alvorlig innvirkning på de mekaniske egenskapene til vevsseksjoner. For det tredje må utkragingen kalibreres gjentatte ganger med kontinuerlig overvåking og inntasting av samtidige temperaturverdier for å unngå artefakter som oppstår i stivhetsverdier på grunn av temperatursvingninger. Sist, en enkelt leverseksjon bør ikke måles i mer enn 3 timer fra forberedelse, da overlaid PBS kan fordampe over lengre perioder. Leserne kan se feilsøkingstabellen (tabell 3) for å løse problemer som oppstod under AFM-målingen, også diskutert i lengde i Norman et al.46.

Tabell 3: Feilsøkingsveiledning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Den presenterte protokollen tillater reproduserbar AFM-sondering av levervev. Det har potensial til å avsløre informasjon om utvikling og eventuell regresjon av fibrotisk leversykdom på mikroskopisk nivå og kan bidra til utvikling av terapier rettet mot fibrotiske arrregioner dannet under utviklingen av kronisk leversykdom.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Grant Agency of the Czech Republic (18-02699S), Institutional Research Project of the Czech Academy of Sciences (RVO 68378050) og MEYS CR-prosjektet NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU-konsortium, finansiert av MEYS CR infrastrukturprosjekt LM2018127 og European Regional Development Fund-Project "UP CIISB" (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) støttet målingene ved CF Nanobiotechnology, CEITEC MU, økonomisk. Vi anerkjenner også kjernefasiliteten for lysmikroskopi, IMG CAS, Praha, Tsjekkia, støttet av MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) og RVO: 68378050-KAV-NPUI, for deres støtte med mikroskopiavbildningen som presenteres her.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM head Bruker JPK nanowizard 3
Cameras Andor Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)
The Imagingsource  S/N:12310015
Cantilever SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors S/N:73750F05
Cryotome Leica  CM1950
Epoxy resin glue (Long working time ) Bison epoxy universal
Melamine beads; diameter, 5.7 um Microparticles, GmbH MF-R-5.7
Microscope Olympus  IX81
Hydrophobic  slide marker SuperHT PAP PEN
Software JPK nanowizard  v6.1.151
AtomicJ v2.3.1
Superfrost slides Thermoscientific ref no. J1800AMNZ
System Ubuntu 14.04.5 LTS
Vibration isolation control unit Tablestable AVI-200-S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vanden Berghe, G. The role of the liver in metabolic homeostasis: Implications for inborn errors of metabolism. Journal of Inherited Metabolic Dis. 14 (4), 407-420 (1991).
  2. Stanger, B. Z. Cellular homeostasis and repair in the mammalian liver. Annual Reviews of Physiology. 77, 179-200 (2015).
  3. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annual Review of Pathology. 6, 425-456 (2011).
  5. Georges, P. C., et al. Increased stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: Implications for fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (6), 1147-1154 (2007).
  6. Perepelyuk, M., et al. Hepatic stellate cells and portal fibroblasts are the major cellular sources of collagens and lysyl oxidases in normal liver and early after injury. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (6), 605-614 (2013).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (5), 1394-1400 (2008).
  8. Olsen, A. L., et al. Hepatic stellate cells require a stiff environment for myofibroblastic differentiation. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (1), 110-118 (2011).
  9. Sandrin, L., et al. Transient elastography: A new noninvasive method for assessment of hepatic fibrosis. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (12), 1705-1713 (2003).
  10. Ling, W., et al. Effects of vascularity and differentiation of hepatocellular carcinoma on tumor and liver stiffness: In vivo and in vitro studies. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (4), 739-746 (2014).
  11. Wong, V. W. S., et al. Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 51 (2), 454-462 (2010).
  12. Cha, S. W., et al. Nondiseased liver stiffness measured by shearwave elastography a pilot study. Journal of Ultrasound in Medicine. 33 (1), 53-60 (2014).
  13. Castera, L., Forns, X., Alberti, A. Non-invasive evaluation of liver fibrosis using transient elastography. Journal of Hepatology. 48 (5), 835-847 (2008).
  14. Chang, W., et al. Liver fibrosis staging with MR elastography: Comparison of diagnostic performance between patients with chronic hepatitis B and those with other etiologic causes. Radiology. 280 (1), 88-97 (2016).
  15. Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Clinical applications. Journal of Computer Assisted Tomography. 37 (6), 887-896 (2013).
  16. Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Technique, analysis and clinical applications. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (3), 544-555 (2013).
  17. Venkatesh, S. K., Wang, G., Teo, L. L. S., Ang, B. W. L. Magnetic resonance elastography of liver in healthy Asians: Normal liver stiffness quantification and reproducibility assessment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 1-8 (2014).
  18. Lee, D. H., Lee, J. M., Han, J. K., Choi, B. I. MR elastography of healthy liver parenchyma: Normal value and reliability of the liver stiffness value measurement. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 38 (5), 1215-1223 (2013).
  19. Mueller, S. Liver stiffness: A novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine. Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
  20. Goodman, Z. D. Grading and staging systems for inflammation and fibrosis in chronic liver diseases. Journal of Hepatology. 47 (4), 598-607 (2007).
  21. Salameh, N., et al. Hepatic viscoelastic parameters measured with MR elastography: Correlations with quantitative analysis of liver fibrosis in the rat. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 26 (4), 956-962 (2007).
  22. Yin, M., et al. Quantitative assessment of hepatic fibrosis in an animal model with magnetic resonance elastography. Magnetic Resonance in Medicine. 58 (2), 346-353 (2007).
  23. Bastard, C., et al. Transient micro-elastography: A novel non-invasive approach to measure liver stiffness in mice. World Journal of Gastroenterology. 17 (8), 968-975 (2011).
  24. Barnes, S. L., Lyshchik, A., Washington, M. K., Gore, J. C., Miga, M. I. Development of a mechanical testing assay for fibrotic murine liver. Medical Physics. 34 (11), 4439-4450 (2007).
  25. Calò, A., et al. Spatial mapping of the collagen distribution in human and mouse tissues by force volume atomic force microscopy. Scientific Reports. 10, 15664 (2020).
  26. Desai, S. S., et al. Physiological ranges of matrix rigidity modulate primary mouse hepatocyte function in part through hepatocyte nuclear factor 4 alpha. Hepatology. 64 (1), 261-275 (2016).
  27. Kostallari, E., et al. Stiffness is associated with hepatic stellate cell heterogeneity during liver fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 322 (2), 234-246 (2022).
  28. Binnig, G., Qaute, C. F., Gerber, C. Atomic force microscope. Physical Review Letters. 56 (9), (1986).
  29. Johnson, K. L. Contact Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1985).
  30. Asgari, M., Latifi, N., Giovanniello, F., Espinosa, H. D., Amabili, M. Revealing layer-specific ultrastructure and nanomechanics of fibrillar collagen in human aorta via atomic force microscopy testing: Implications on tissue mechanics at macroscopic scale. Advanced NanoBiomed Research. 2 (5), 2100159 (2022).
  31. Amabili, M., et al. Microstructural and mechanical characterization of the layers of human descending thoracic aortas. Acta Biomaterialia. 134, 401-421 (2021).
  32. Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: Effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomaterialia. 8 (11), 4123-4129 (2012).
  33. Geerligs, M., et al. In vitro indentation to determine the mechanical properties of epidermis. Journal of Biomechanics. 44 (6), 1176-1181 (2011).
  34. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
  35. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  36. Babu, P. K. V., Radmacher, M. Mechanics of brain tissues studied by atomic force microscopy: A perspective. Frontiers in Neuroscience. 13, 600 (2019).
  37. del Mar Vivanco, M. Mammary Stem Cells: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
  38. Zanetti-Dällenbach, R., et al. Length scale matters: Real-time elastography versus nanomechanical profiling by atomic force microscopy for the diagnosis of breast lesions. Biomed Research International. 2018, 3840597 (2018).
  39. Lopez, J. I., Kang, I., You, W. -K., McDonald, D. M., Weaver, V. M. In situ force mapping of mammary gland transformation. Integrative Biology. 3 (9), 910-921 (2011).
  40. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnol. 4 (3), 186-192 (2009).
  41. Borin, D., Pecorari, I., Pena, B., Sbaizero, O. Novel insights into cardiomyocytes provided by atomic force microscopy. Seminars in Cell & Developmental Biology. 73, 4-12 (2018).
  42. Lachaize, V., et al. Atomic Force Microscopy: An innovative technology to explore cardiomyocyte cell surface in cardiac physio/pathophysiology. Letters in Applied NanoBioScience. 4 (4), 321-324 (2015).
  43. Lieber, S. C., et al. Aging increases stiffness of cardiac myocytes measured by atomic force microscopy nanoindentation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (2), 645-651 (2004).
  44. Guedes, A. F., et al. Atomic force microscopy as a tool to evaluate the risk of cardiovascular diseases in patients. Nature Nanotechnology. 11 (8), 687-692 (2016).
  45. Zhu, Y., Dong, Z., Wejinya, U. C., Jin, S., Ye, K. Determination of mechanical properties of soft tissue scaffolds by atomic force microscopy nanoindentation. Journal of Biomechanics. 44 (13), 2356-2361 (2011).
  46. Norman, M. D. A., Ferreira, S. A., Jowett, G. M., Bozec, L., Gentleman, E. Measuring the elastic modulus of soft culture surfaces and three-dimensional hydrogels using atomic force microscopy. Nature Protocols. 16 (5), 2418-2449 (2021).
  47. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  48. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation versus tensile measurements of Young's modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 17 (3), 155-164 (2011).
  49. Scholten, D., Trebicka, J., Liedtke, C., Weiskirchen, R. The carbon tetrachloride model in mice. Laboratory Animals. 49, 4-11 (2015).
  50. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  51. Ribeiro, J. F., dos Anjos, E. H. M., Mello, M. L. S., de Campos Vidal, B. Skin collagen fiber molecular order: A pattern of distributional fiber orientation as assessed by optical anisotropy and image analysis. PLoS One. 8 (1), 54724 (2013).
  52. Ozkan, A., et al. The influence of chronic liver diseases on hepatic vasculature: A liver-on-a-chip review. Micromachines. 11 (5), 487 (2020).
  53. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
  54. Khajehahmadi, Z., et al. Liver stiffness correlates with serum osteopontin and TAZ expression in human liver cirrhosis. Annals of the New York Academy of Sciences. 1465 (1), 117-131 (2020).
  55. Tian, M., et al. The nanomechanical signature of liver cancer tissues and its molecular origin. Nanoscale. 7 (30), 12998-13010 (2015).
  56. Zhao, G., et al. Mechanical stiffness of liver tissues in relation to integrin β1 expression may influence the development of hepatic cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 102 (5), 482-489 (2010).
  57. Gang, Z., Qi, Q., Jing, C., Wang, C. Measuring microenvironment mechanical stress of rat liver during diethylnitrosamine induced hepatocarcinogenesis by atomic force microscope. Microscopy Research and Technique. 72 (9), 672-678 (2009).
  58. Sader, J. E., et al. Spring constant calibration of atomic force microscope cantilevers of arbitrary shape. The Review of Scientific Instruments. 83 (10), 103705 (2012).
  59. JPK Instruments. A practical guide to AFM force spectroscopy and data analysis. JPK Instruments Technical Note. JPK Instruments. , 1-8 (2016).
  60. van Eysden, C. A., Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids. Journal of Applied Physics. 101, 044908 (2015).
  61. Kim, Y., Yang, Y. I., Choi, I., Yi, J. Dependence of approaching velocity on the force-distance curve in AFM analysis. Korean Journal of Chemical Engineering. 27, 324-327 (2010).
  62. Hermanowicz, P., Sarna, M., Burda, K., Gabryś, H. AtomicJ: An open source software for analysis of force curves. The Review of Scientific Instruments. 85 (6), 063703 (2014).
  63. Hermanowicz, P. AtomicJ 2.3.1 User's Manual. , (2021).
  64. Iwashita, M., et al. Comparative Analysis of Brain Stiffness Among Amniotes Using Glyoxal Fixation and Atomic Force Microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  65. Crichton, M. L., et al. The viscoelastic, hyperelastic and scale dependent behaviour of freshly excised individual skin layers. Biomaterials. 32 (20), 4670-4681 (2011).
  66. Puricelli, L., Galluzzi, M., Schulte, C., Podestà, A., Milani, P. Nanomechanical and topographical imaging of living cells by atomic force microscopy with colloidal probes. The Review of Scientific Instruments. 86 (3), 033705 (2015).
  67. Hermanowicz, P. Determination of Young's modulus of samples of arbitrary thickness from force distance curves: Numerical investigations and simple approximate formulae. International Journal of Mechanical Sciences. 193, 106138 (2021).
  68. Han, R., Chen, J. A modified Sneddon model for the contact between conical indenters and spherical samples. Journal of Materials Research. 36, 1762-1771 (2021).

Tags

Biologi utgave 185 Leverfibrose kollagenavsetninger leverstivhet elastisk modul atomkraftmikroskopi
Måling av leverstivhet ved bruk av atomkraftmikroskopi kombinert med polarisasjonsmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ojha, S., Pribyl, J., Klimovic, S.,… More

Ojha, S., Pribyl, J., Klimovic, S., Hadraba, D., Jirouskova, M., Gregor, M. Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63974, doi:10.3791/63974 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter