Summary
Vi presenterar ett protokoll för att mäta den elastiska modulen i kollagenrika områden i normal och sjuk lever med hjälp av atomkraftsmikroskopi. Samtidig användning av polarisationsmikroskopi ger hög rumslig precision för lokalisering av kollagenrika områden i leversektionerna.
Abstract
Matrisförstyvning har erkänts som en av de viktigaste drivkrafterna för utvecklingen av leverfibros. Det har djupgående effekter på olika aspekter av cellbeteende såsom cellfunktion, differentiering och rörlighet. Men eftersom dessa processer inte är homogena i hela organet har det blivit allt viktigare att förstå förändringar i vävnadernas mekaniska egenskaper på cellulär nivå.
För att kunna övervaka förstyvningen av kollagenrika områden i leverloberna presenterar detta papper ett protokoll för mätning av levervävnadselastiska moduler med hög rumslig precision med atomkraftsmikroskopi (AFM). AFM är en känslig metod med potential att karakterisera lokala mekaniska egenskaper, beräknad som Youngs (även kallad elastisk) modul. AFM i kombination med polarisationsmikroskopi kan användas för att specifikt lokalisera områdena för fibrosutveckling baserat på birefringens av kollagenfibrer i vävnader. Med hjälp av det presenterade protokollet karakteriserade vi styvheten hos kollagenrika områden från fibrotiska muslever och motsvarande områden i levern hos kontrollmöss.
En framträdande ökning av styvheten hos kollagenpositiva områden observerades med fibrosutveckling. Det presenterade protokollet möjliggör en mycket reproducerbar metod för AFM-mätning, på grund av användningen av milt fixerad levervävnad, som kan användas för att främja förståelsen av sjukdomsinitierade förändringar i lokala vävnadsmekaniska egenskaper och deras effekt på ödet för angränsande celler.
Introduction
Levern är ett viktigt organ för att upprätthålla homeostas i organismer 1,2. Kroniska leversjukdomar står för ~ 2 miljoner dödsfall världen över årligen3. De har oftast sitt ursprung som virusinfektioner, autoimmuna störningar, metaboliska syndrom eller alkoholmissbruksrelaterade sjukdomar och åtföljs av progressiv leverfibros. Leverskada framkallar ett inflammatoriskt svar, vilket leder till aktivering av celler som deponerar extracellulär matris (ECM) i ett sårläkningssvar. Men i närvaro av en kronisk förolämpning bildar överskott av ECM olöst ärrvävnad i levern, vilket leder till utveckling av leverfibros, cirros, leverkarcinom och i slutändan till leversvikt4.
Hepatocytskada resulterar omedelbart i ökad leverstyvhet 5,6. Detta påverkar direkt hepatocytfunktionen, aktiverar leverstellatceller (HSC) och portalfibroblaster och resulterar i deras transdifferentiering till kollagendeponerande myofibroblaster 7,8. Avsättningen av fibrös ECM ökar ytterligare leverstyvheten, vilket skapar en självförstärkande återkopplingsslinga av leverförstyvning och matrisproducerande cellaktivering.
Leverstelhet har därmed blivit en viktig parameter i leversjukdomsprognosen. Förändringen i biomekaniska vävnadsegenskaper kan detekteras tidigare än fibros kan diagnostiseras genom histologisk analys. Därför har olika tekniker för mätning av leverstelhet utvecklats inom både forskning och kliniska tillämpningar. I kliniska miljöer har övergående elastografi (TE)9,10,11,12,13 och magnetisk resonanselastografi (MRE)14,15,16,17,18 använts för att icke-invasivt diagnostisera tidiga stadier av leverskador genom att undersöka grov leverstelhet 19.
I TE sprids ultraljudsvågor med mild amplitud och låg frekvens (50 Hz) genom levern och deras hastighet mäts, som sedan används för att beräkna vävnadselasticmodul13. Denna teknik är emellertid inte användbar för patienter med ascites, fetma eller lägre interkostala utrymmen på grund av felaktig överföring av ultraljudsvågorna genom vävnaderna som omger levern9.
MRE är baserad på magnetisk resonansavbildningsmodalitet och använder 20-200 Hz mekaniska skjuvvågor för att rikta in sig på levern. En specifik magnetisk resonansavbildningssekvens används sedan för att spåra vågorna inuti vävnaden och för att beräkna vävnadsstyvheten16. Styvhetsvärden som rapporterats med både TE- och MRE-tekniker korrelerar väl med graden av leverfibros erhållen från biopsier av humana leverprover rankade med hjälp av histologiska METAVIR-poäng20 (tabell 1). TE och MRE har också anpassats för mätning av leverstelhet i gnagarmodeller för forskningsändamål21,22,23. Men eftersom båda metoderna härleder styvhetsvärdena från vävnadens svar på de förökande skjuvvågorna, kanske de erhållna värdena inte återspeglar vävnadens absoluta mekaniska styvhet.
utvecklade en modell-gel-vävnadsanalys (MGT-analys) som involverade inbäddning av levervävnad i levervävnad i polyakrylamidgel24. Denna gel komprimeras av en pulserad likformig kraft från vilken Youngs modul kan beräknas. MGT-analysen visar en god korrelation med en indragningsanalys anpassad för både normala och fibrotiska lever24 (tabell 1).
Tabell 1: Leverstyvhetsvärden på bulknivå. TE och MRE jämfört med direkta ex vivo mekaniska mätningar av leverelastic moduli med hjälp av indragning och MGT-analyser för lever från olika källor. Förhållandet mellan E och G ges av E = 2G (1 + v), där v är Poissons förhållande mellan provet; F0 till F4 representerar fibrospoängen i METAVIR-poängsystemet, med F0 som betecknar låg eller ingen fibros och F4-cirrotiska lever. Förkortningar: TE = övergående elastografi; MRE = magnetisk resonans elastografi; MGT = modell-gel-vävnad; E = elastisk (Youngs) modul; G = skjuvmodul. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
En av de största nackdelarna med generiska leverstyvhetsmätningar är att de inte ger cellulär upplösning av styvhet heterogenitet i levern. Under utvecklingen av fibros visar kollagenrika områden högre styvhet jämfört med det omgivande parenkymet25,26. Denna styvhetsgradient påverkar lokalt de bosatta cellerna och spelar en viktig roll för att driva HSC-heterogenitet27. Således måste förändringar i lokala mekaniska egenskaper under leversjukdomsutveckling karakteriseras på mikroskopisk nivå för att bättre förstå fibrosprogression.
AFM gör att vävnadens mekaniska egenskaper kan mätas med hög upplösning och hög kraftkänslighet. AFM använder spetsen på en cantilever för att dra in ytan på ett prov med krafter så låga som flera piconewtons, vilket inducerar en deformation på mikroskopisk eller nanoskopisk nivå baserat på geometrin och storleken på den använda spetsen. Provets kraftrespons på den applicerade töjningen mäts sedan som avböjningen i utskjutande28. Kraftförskjutningskurvor samlas in från inflygningen och indragningen av cantileveren, som kan utrustas med lämpliga kontaktmekanikmodeller för att utvärdera provets lokala styvhet29.
Förutom att mäta styvheten i ett visst område kan AFM också ge topografisk information om specifika egenskaper i provet, såsom strukturen hos kollagenfibrer30,31,32. Flera studier har beskrivit tillämpningen av AFM för att mäta styvheten hos olika friska och sjuka vävnader, såsom hud 32,33, lunga 34,35, hjärna36, bröst37,38,39, brosk 40 eller hjärta41,42,43,44 från både patient- och musmodellprover. Dessutom har AFM också använts in vitro för att bestämma styvheten hos celler och extracellulära proteinställningar45,46,47.
Mätningen av de mekaniska egenskaperna hos biologiska prover med AFM är nontrivial på grund av deras mjukhet och bräcklighet. Således har olika studier standardiserat olika förhållanden och inställningar, vilket ger mycket fluktuerande värden på Youngs moduli (granskad av Mckee et al.48). I likhet med andra mjuka vävnader visar lever Youngs modulvärden vid olika grader av leverfibros också omfattande variation (tabell 2). Skillnaderna i Youngs modulvärden härrör från skillnader i läget för AFM-drift, utskjutande spets, provberedningsmetod, provtjocklek, indragningsdjup och krafter, levervävnadsmiljö under mätning och analysmetod (tabell 2).
Tabell 2: Leverstyvhetsvärden på cellnivå. Leverstyvhetsvärden erhållna med AFM beskriver leverns mekaniska egenskaper på cellnivå. Förkortningar: AFM = atomkraftsmikroskopi; E = elastisk (Youngs) modul; PFA = paraformaldehyd; PBS = fosfatbuffrad saltlösning. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Detta dokument beskriver ett protokoll för reproducerbar mätning av Youngs moduli av kollagenrika fibrotiska områden i levervävnad av AFM med en exakt lokalisering som tillhandahålls genom användning av polarisationsmikroskopi. Vi administrerade koltetraklorid (CCl4) för att inducera kollagenavsättning på ett centrilobulärt sätt49 i en musmodell, vilket på ett tillförlitligt sätt efterliknade viktiga aspekter av mänsklig leverfibros50. Polariserade mikroskopiska bilder möjliggör visualisering av kollagen i levern på grund av birefringens av kollagenfibrer51, vilket möjliggör exakt positionering av cantileverspetsen över det önskade intresseområdet inom leverlobule52.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med ett djurprotokoll som godkänts av Institutet för molekylärgenetiks djurvårdskommitté och enligt EU-direktivet 2010/63/EU för djurförsök. Ett övergripande schematiskt diagram över det presenterade protokollet visas i figur 1.
Figur 1: Övergripande schematisk för AFM-utvärdering av Youngs modul från muslever. (A) Isolering av levern från kontroll eller behandlade möss följt av sektionering och förvaring vid −80 °C (maximal lagring, 2 veckor). (B) Fastsättning av den sfäriska pärlan på utskjutande medel med efterföljande härdning av lim över natten (vänster). Cantilever-kalibrering följt av provmontering (höger). (C) Inriktning av polarisatorn och analysatorn för att visualisera ljusa kollagenstrukturer följt av ett överlägg av bilden i kameran med mätfältet under AFM-utskjutaren. (D) Förvärv av styvhetskartor och analys. Förkortningar: AFM = atomkraftsmikroskopi; PBS = fosfatbuffrad saltlösning; OCT = optimal skärtemperaturförening; CCl4 = koltetraklorid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Provberedning I
- Skär ut levern från den öppnade buken på en mus som avlivas av cervikal dislokation under anestesi. Isolera den vänstra lateralloben och bädda in den laterala halvan av loben i optimal skärtemperatur (OCT) förening genom snabb frysning på torris. Förvara den OCT-inbäddade vävnaden vid −80 °C.
OBS: Tidigare studier har visat att styvhetsvärdena är likartade mellan frysta och färska vävnader25,26. - Avsnitt 30 μm tjocka leversektioner på positivt laddade objektglas med hjälp av en kryotom, och förvara objektglasen vid −80 °C fram till dagen för AFM-mätning senast 2 veckor därefter.
2. Inrättande av instrumentet
- Fastsättning av en 5,7 μm pärla på AFM fribärande spets (kompletterande figur S1, steg 1-5)
OBS: Fastsättningen av pärlan på cantilever beskrevs också tidigare av Norman et al.46.- Sprid suspensionen av melaminhartspärlor med en diameter på 5,7 μm jämnt på hälften av ytan på en glasskiva och lufttorka för att förånga lösningsmedlet (kompletterande figur S1, steg 1).
- På den andra halvan av bilden, med en 10 μL spets, gör en tunn linje av förblandat epoxiharts med lång arbetstid (kompletterande figur S1, steg 1).
- Ladda den utskjutande sonden till AFM-huvudet enligt tillverkarens instruktioner.
- Montera rutschkanan och locket med AFM-huvudet försett med utskjutande sond.
OBS: En SD-qp-BioT-TL-10 cantilever användes i studien. - För det förblandade epoxihartslimmet till mitten av bilden och närma dig limet med utskjutaren med låg kraft (ställ in ett börvärde på 1 V för att följa detta protokoll; Kompletterande figur S1, steg 2).
OBS: Innan du närmar dig glidytan, se till att lasern är inriktad i mitten av utskjutande spetsen, indikerad av en hög summaspänning genom att följa stegen 6-8 i avsnitt 2, del 3, Kalibrering av fjäderkonstanten för AFM-utskjutaren. - När spetsen på den utskjutande sonden har kommit i kontakt med limet, flytta den strax ovanför bilden för att ta bort överflödigt lim.
- Dra nu tillbaka den utskjutande spetsen från bilden och flytta bilden för att få en enda pärla i mitten (kompletterande figur S1, steg 3). Närma dig pärlan igen med AFM-utskjutande sond med högre kraft (börvärde 2 V) för att fästa pärlan i mitten av den utskjutande sonden och lämna den i minst 10 s (kompletterande figur S1, steg 4).
- Extrahera cantileversonden och förvara den över natten vid rumstemperatur för att härda limet eller följ instruktionerna för epoxihartset (kompletterande figur S1, steg 5).
- Ställa in polarisatorn och analysatorn
- För att lokalisera de intressanta områdena inom leversektionerna, ställ in mikroskopet med polarisatorn och analysatorn. Rikta in deras vibrationsazimuths i en vinkel mellan 0 ° och 90 ° mot varandra genom att rotera antingen en av dem i förhållande till den andra manuellt eller på ett automatiserat sätt för att minimera överfört ljus och maximera extraordinära strålar som passerar genom målet. Se till att kollagenfibrerna ser ljusa ut mot en mörk bakgrund i den polariserade bilden (figur 2), vilket återspeglas av en förskjutning av bildens histograms topp mot ljusa pixlar.
Figur 2: Representativa mikroskopibilder visar uttalad visualisering av kollagenfibrer i polariserad mikroskopi jämfört med ljusfältsbilder. Leversektioner från möss behandlade med CCl4 i 3 veckor utsattes för (A) ljusfält och (B) polariserad mikroskopi. Birefringenta kollagenfibrer är tydligt synliga i vitt i polariserade bilder jämfört med ljusfältbilder. Den röda rutan representerar kollagenrikt område som används för AFM-mätningen. Indrag visar inzoomade vyer av området i den röda rutan. Skalstreck = 100 μm. Förkortningar: AFM = atomkraftsmikroskopi; CCl4 = koltetraklorid; CV = central ven; PV = portalven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
OBS: För detta protokoll kan AFM-huvudet installeras på alla lämpliga inverterade mikroskop med möjlighet att sätta in en polarisator och en analysator. Systemet måste placeras i en isoleringsenhet för att minska bakgrundsbruset.
- Kalibrering av fjäderkonstanten på AFM-utskjutaren
- Ladda fribärande sonden (förberedd enligt steg 1-8 i avsnitt 2, del 1, fastsättning av en 5,7 μm pärla till AFM cantilever spets) på AFM-huvudet enligt tillverkarens instruktioner.
- Rengör fribärande medel med 70% etanol för att förhindra kontaminering av fribärande medel under mätningen. Tvätta i stor utsträckning med destillerat vatten för att ta bort kvarvarande etanol från spetsen.
- Aktivera kontaktläge och välj kraftmappning som mätmetod.
- Öppna alla relevanta fönster (Z Stepper Motors, Motorized Stage Control, Data Viewer, Force Scan Map Oscilloscope, Laser Alignment och Camera window) i programvaruflikarna genom att klicka på motsvarande knappar.
- Montera en ren glasskiva som innehåller 1,2 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i ett område på cirka 2 cm x 4 cm avgränsat med en hydrofob markörpenna. Montera AFM-huvudet på mikroskopsteget och se till att fribärande är helt nedsänkt i PBS.
- Fokusera målet på cantilever-spetsen. Minska intensiteten av överfört ljus på mikroskopet för att få en bättre bild av laserpositionen på bildskärmen.
- Rikta lasern mot den genomskinliga änden av cantilever (under vilken den sfäriska pärlan är fäst) och rikta in spegeln med hjälp av vreden på AFM-huvudet för att maximera den totala intensiteten hos laserstrålen på detektorn (avbildad av summan i laserjusteringsfönstret ).
- Rikta in fotodioddetektorn med hjälp av vreden som finns på AFM-huvudet för att placera lasern i dess centrum.
- Låt fribärande stabiliseras i 15 min innan du fortsätter med kalibreringen.
- Öppna kalibreringshanteraren och sätt in typen av fribärande, utskjutande dimensioner och miljöförhållanden. Kalibrera fjäderkonstanten och känsligheten (även känd som omvänd optisk spakkänslighet, InvOLS) genom att klicka på Kalibrera. Bekräfta noggrannheten hos fjäderkonstanten som erhållits efter kalibrering med tillverkarens deklaration. Kalibrera cantilevern i kontaktfritt läge (kalibrering utförs av programvaran med hjälp av den termiska satsen härledd av Sader et al.58).
OBS: Cantileverens fjäderkonstant representerar utskjutarens styvhet och ges av utskjutarens motståndskraft när den deformeras per deformationslängd i termer av N / m. Utskjutarens känslighet visar värdet av fotodiodrespons (i volt) som svar på avböjningen av cantilever (i nanometer) och presenteras vanligtvis i termer av nm / V59. I ett kontaktfritt läge registreras det termiska brusspektrumet och utrustas med den hydrodynamiska funktionen60 av AFM-styrprogramvaran automatiskt efter kalibrering. Beslaget ger kalibreringsparametrarna, nämligen fjäderkonstanten och InvOLS. Fjäderkonstanten för SD-qp-BioT-TL-10 cantilever som användes i denna studie var 0,09 N/m, enligt tillverkarens förklaring.
3. Provberedning II
- Tina de frysta sektionerna (förvaras vid −80 °C, enligt beskrivningen i avsnitt 1, Provberedning I) vid rumstemperatur i 2 minuter.
- Fixera sektionerna med iskall 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 10 min vid 4 °C följt av omfattande tvätt (5x) med 1x PBS. Torka av kvarvarande PBS runt sektionen med en vävnad och markera en gräns på cirka 2 cm x 4 cm runt leversektionen med en hydrofob markörpenna. Täck provet med 1x PBS (se till att det avgränsade området innehåller ~ 1,2 ml 1x PBS). Använd exemplet för AFM-mätningar.
OBS: Eftersom PFA är en farlig kemikalie måste den hanteras med försiktighet för att förhindra kontakt med hud eller ögon. För att undvika giftiga ångor måste alla procedurer som involverar PFA utföras i en certifierad kemisk dragskåp eller annat godkänt ventilerat område.
4. Mätning
- Aktivera autospara genom att gå till fliken Inställningar och markera Autosave. Ange filnamn och katalog för att spara mätfilerna genom att gå till fliken Inställningar och sedan klicka på Spara inställningar.
- Ladda provet (berett enligt avsnitt 3, Provberedning II). Närma dig vävnadsytan med AFM-utskjutaren genom att slå på lasern och klicka på inflygningsknappen . När spetsen är i kontakt med vävnadsytan, dra tillbaka cantileverspetsen så att spetsen förblir i fokus för målet (genom att klicka på Retraction-tangenten , som drar tillbaka cantilever till den övre änden av piezoområdet). Justera om detektorn om laserpositionen flyttas bort från dess centrum i laserjusteringsfönstret .
- Stäng av lasern och lägg över mikroskopets optiska fält med AFM-mätkartor genom att klicka på fliken Tillbehör och sedan välja Direct Overlay Optical Calibration. I det efterföljande fönstret klickar du på Nästa för att ta en serie bilder av cantilever som skannar ett visst område. Klicka på Nästa igen för att gå till nästa fönster.
- I den första bilden klickar du på mitten av spetsen på cantilever manuellt för att visa spetspositionen i programvaran. Cirkeln som visar spetspositionen kan manipuleras i storlek genom att ange dess radie för att öka noggrannheten. Klicka på Kalibrera för att automatiskt upptäcka den utskjutande spetspositionen i alla bilder. Bekräfta noggrannheten i tipsdetekteringen genom att gå igenom bilderna.
- Klicka på Nästa och sedan på Slutför för att avsluta det optiska överlägget och spara serien med bilder som tagits under optisk kalibrering.
- Dra tillbaka fribärande ytterligare för att undvika kollision med högre ytor på bilden. Flytta scenen för att placera ett kollagenrikt område inuti den gröna rutan som visas på fliken Datavisare med hjälp av den polariserade bilden. Välj det kollagenrika området genom att skapa en rektangel runt det med ett långt tryck på vänster musknapp inuti den angivna gröna rutan. Definiera mått, orientering och upplösning för det markerade området under fliken Rutnät till vänster. Klicka på Bekräfta ny skanningsregion för att ställa in det valda området som mätområde.
- Behåll IGain- och PGain-parametrarna för återkopplingsslingan vid standardvärden, om inga större instabiliteter presenteras i form av systemöverkänslighet. För att följa detta protokoll, ställ in IGain på 50 Hz och PGain på 0,001.
- Ställ in börvärdet på 1 nN.
OBS: Börvärde är kraften i växelverkan mellan spets och yta under det stationära tillståndet. För de flesta mjuka prover (celler, geler och vävnader) är börvärdesvärden i intervallet 0,5-2,0 nN lämpliga. - Välj det relativa börvärdesvärdet enligt det studerade materialets mekaniska egenskaper och utskjutande egenskapers styvhet. För detta protokoll ställer du in värdet på 5 nN.
OBS: Det relativa börvärdet representerar den maximala interaktionskraften, när toppen av kraftavståndskurvan uppnås och spetsrörelsen återgår till baslinjen. För mjuka material (1-50 kPa) ställs denna parameter in i enheter av nanonewton (nN). För en mjuk fribärande (med en fjäderkonstant från 0,05 N/m till 0,35 N/m) är dessutom den maximala kraft som kan appliceras ungefär 50 nN. Justera börvärdet och de relativa börvärdena i enlighet med detta.- Se till att det givna börvärdesvärdet inte leder till ett indragningsdjup som är större än den sfäriska indenterns radie, annars kan indragningsytan inte definieras korrekt vid beräkningen av Youngs modul. Beräkna medelvärdet av indragningsdjupet efter den första körningen av indragningarna; se avsnitt 5, Dataanalys, för att lära dig hur du behandlar inspelade data. Justera börvärdesvärdet om det behövs.
- Ställ in Justera baslinje som 5.
OBS: Här hänvisar baslinjen till graden av polynom som används för att passa inflygnings- och indragningskurvorna. Att ställa in baslinjen till 5 anpassar kurvorna till hög upplösning och säkerställer därmed att bakgrundsbrus fångas upp under mätningarna. - Välj längden på den utskjutande rörelsen i Z-axeln (Z-längd) enligt provets yttopografi. För att följa detta protokoll, ställ in Z-längden på 15 μm.
OBS: Ett högt värde (t.ex. 15 μm) minskar mätkänsligheten men krävs vanligtvis för prover med en mycket oregelbunden yta såsom fibrotisk levervävnad. - Ställ in Z-rörelse på Konstant varaktighet.
OBS: Z-rörelse kan också ställas in på Konstant hastighet för att visa data som hänvisar till Z-rörelse (Extend Speed och Extend Time) i ett annat läge. - Ställ in Förläng tiden till 1 s. Ställ in förlängningsfördröjning och indragningsfördröjning som 0.
OBS: Använd förlängningshastigheter på >5,0 μm/s för mycket mjuka material61, eftersom lägre indragningshastigheter kommer att resultera i ett mer visköst och mindre elastiskt svar från mjuka ytor. Extension Delay and Retraction Delay är parametrar som kan användas för att studera specifik interaktion mellan cantileverspetsen och substratet (t.ex. interaktioner mellan ett protein immobiliserat på ytan av cantilever med proteiner immobiliserade på glidytan). - Ställ in samplingsfrekvensen som 5000 Hz.
OBS: Samplingsfrekvensen avser frekvensen av punkter som registreras på en fullständig inflygnings-indragningskurva. Ställ in detta på ett högt värde (t.ex. 5000 Hz) för att undvika att missa vissa regioner i kurvorna på grund av deras extremt snabba övergång. - Markera Z Closed Loop med en Tick för att möjliggöra ett återkopplingsslingsystem, vilket säkerställer contant avstånd mellan provytan och cantilever-spetsen.
- Koppla bort det motoriserade steget genom att avmarkera Aktivera och klicka på Tillvägagångssätt för att närma sig provet med utskjutande. Klicka på Starta skanning för att börja samla kraftavståndskurvor i det område som anges i steg 6; Avsnitt 4, Mätning.
5. Analys av data
- Analysera förvärvade data med hjälp av programvaran "AtomicJ" med öppen källkod (som kan laddas ner från https://sourceforge.net/projects/jrobust/).
OBS: Den stöder filer som samlats in från Agilent Technologies, JPK Instruments eller Bruker atomkraftmikroskop. - Ladda kraftkurvorna i programmet genom att klicka på processkraftskurvorna och kartikonen i AtomicJ (Kompletterande figur S2A, x). I bearbetningsassistenten lägger du till kartorna som ska analyseras genom att klicka på knappen Lägg till (Kompletterande figur S2A, y). Klicka på Nästa när kartorna har laddats (kompletterande figur S2A, z).
- Ange bearbetningsinställningarna i nästa fönster enligt stegen som beskrivs nedan (motsvarande stegen i kompletterande figur S2B, steg 1-11):
- Uppskatta kontaktpunkten mellan provet och fribärande manuellt genom beräkning eller automatiskt med hjälp av en uppsättning anpassningskurvparametrar. För att följa detta protokoll, använd den automatiska uppskattningen av kontaktpunkten.
- Bestäm kontaktpunkten mellan cantilever och provet med den klassiska fokuserade rutnätmetoden.
- Välj uppskattningsmetod för att ge den bästa bestämningen av kontaktpunkten baserat på kvaliteten på de uppmätta kraftkurvorna, som måste bestämmas empiriskt under optimeringen av dataanalys. Om du vill följa det här protokollet använder du den modelloberoende metoden.
- Anpassa kraftindragningskurvan med en klassisk modell (använd klassisk L2 för modellpassning för att följa detta protokoll).
OBS: Modellpassning och kontaktberäknare är parametrar som styr hur kurvorna monteras av programvaran respektive hur kontaktpunkten etableras i den monterade kurvan. För dessa mätningar användes det klassiska alternativet, som använder minsta kvadratregression. Detta bearbetar varje lågkraftspunkt på kurvan som en försökskontaktpunkt och passar ett polynom till regionen före försökskontaktpunkten. Den passar sedan lämplig kontaktmodell till insamlade kraftindragsdata. Den punkt som ger den lägsta summan av kvadrater antas som kontaktpunkt. Andra metoder kan användas baserat på kvaliteten på kraftkurvor erhållna62,63. - Ställ in modellens passform på uttagskurvan.
- Ställ in Poissons förhållande som 0,45, som rekommenderas för mjuka vävnader som lever24.
- Ställ in kurvans passform med en baslinjegrad på 3 och en kontaktgrad på 1. Ändra graden av polynompassning baserat på skalan av avvikelser från kurvorna från modellen.
- Välj den modell som används för att passa uttagskurvorna. Använd Sneddon-modellen , som beräknar Youngs modul baserat på ekvation (1) och ekvation (2):
(1)
δ =
(2)
där F är kraft, E är Youngs modul, v är provets Poissons förhållande, δ är indragningsdjupet, a är kontaktradien och R är sfärradien62,63. - Fyll i sfärspetsens radie i mikrometer (2,9 μm i detta protokoll).
- Läs in fjäderkonstanten och InvOLS från datafilerna genom att aktivera inläsning (markera rutorna).
- Klicka på Slutför.
OBS: De analyserade data presenteras i form av kartor över vertikal avböjning, höjd, vidhäftning, kontaktkraft, deformation, vidhäftningskraft, R2-värden , lutning, Youngs modul, övergångsindragning, övergångskraft och kontaktposition beräknad för varje kraftkurva (kompletterande figur S3, uppe till vänster). Ytterligare två fönster visar kraftkurvor och råvärden (kompletterande figur S3, övre högra respektive nedre paneler).
- Uteslut kraftkurvor där utskjutande medel närmade sig ytan på leversektionen felaktigt. För att identifiera dessa, leta efter kurvor med högt brus, avvikande former och/eller ofullständigt tillvägagångssätt, vilket visas i figur 3 och diskuteras i detalj någon annanstans46.
(1)
(2)
Figur 3: Exempel på representativa kraftförskjutningskurvor. (A,B) Representativa tolkningsbara kraftkurvor för styvare (A; E = 10,5 kPa) och mjukare (B; E = 1,78 kPa) områden som är lämpliga för analys. (C-F) Representativa oförståeliga grafer som måste uteslutas från analysen på grund av (C-E) felaktigt tillvägagångssätt eller (F) högre brus. Som anges i legenden i (A) visar röda kurvor cantileverens tillvägagångssätt och gröna kurvor visar utskjutande av cantileveren. Svarta linjer visar monteringen av utskjutande kraftuttagskurva. De svarta linjernas lutning motsvarar Youngs modul. De röda och blå punkterna motsvarar kontaktpunkten respektive övergångspunkten. Kontaktpunkten är den sista kontaktpunkten mellan cantilever och substrat under indragning, medan övergångspunkten beskriver övergången av cantilever från tillvägagångssätt till retraktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Milt fixerade, 30 μm tjocka leversektioner erhållna från kontrollmöss och från möss med mild eller avancerad fibros (inducerad genom injektion av CCl4 i 3 veckor respektive 6 veckor,respektive 49) undersöktes med AFM enligt beskrivningen i detta protokoll. Kollagenfibrer nära centrala vener valdes för mätning av styvhetskartor. Områden nära de centrala venerna, som motsvarar de områden där kollagenfibrer i CCl4-behandlade djur vanligtvis bildas, analyserades i kontrolllever (figur 4A). Fördelningen av Youngs moduli var reproducerbar över olika kontrolllever och kollagenrika områden inom en enda leversektion (figur 4B: vänster fiolplott).
I CCl 4-behandlade djur visade styvhetskartor som motsvarade pericentralområdena i kollagenavlagringar signifikant högre värden för Youngs moduli jämfört med motsvarande områden hos kontrollmöss (figur 4B: 1,9 kPa jämfört med 2,6 kPa median Youngs modulvärden för kontroll jämfört med 3 veckors CCl 4-behandlad mus; p = 0,07; 1,9 kPa jämfört med 5,1 kPa median Youngs modulvärden för kontroll jämfört med 6 veckor CCl4 -behandlad mus; p = 0,02). Dessutom skedde en signifikant ökning av värdena för Youngs moduli med längre CCl 4-behandling (figur 4B; 2,6 kPa jämfört med 5,1 kPa median Youngs modulvärden för 3 veckor jämfört med 6 veckors CCl4-behandlad mus; p = 0,04). Detta visar en gradvis förstyvning av kollagenavlagringar med fibrosprogression och att AFM-mätningar återspeglar fibrogenesen.
För att utvärdera effekten av långvarig lagring av OCT-inbäddade leversektioner på de mekaniska egenskaperna hos kollagenfibrer mätte vi styvheten hos kollagenfibrer i sektioner av CCl4-behandlade möss, som lagrades vid −80 ° C i 2 veckor eller 3 månader på bilden efter skärning (Figur 5). AFM-mätningar visade signifikant lägre värden på Youngs moduli i kollagenrika områden för sektioner lagrade i 3 månader jämfört med de som erhållits från sektioner uppmätta inom 2 veckor efter provsnittning (figur 5; 4,7 kPa jämfört med 3,6 kPa median Youngs modulvärden i 2 veckor jämfört med 3 månaders lagring; p < 0,001). Således är det viktigt att mäta de mekaniska egenskaperna hos levervävnaden strax efter att sektionerna har framställts från de OCT-inbäddade leverloberna.
Figur 4: AFM-mätningar visar progressiv förstyvning av kollagenrika områden som korrelerar med långvarig CCl4-behandling. (A) Leversektioner från kontrollmöss och möss som behandlats med CCl4 i 3 veckor eller 6 veckor användes för att mäta de mekaniska egenskaperna hos kollagenrika områden. De boxade områdena av leversektioner som visas i de polariserade mikroskopibilderna (vänster) är kollagenrika skanningsområden (eller motsvarande regioner i kontrollleveren) valda för AFM-mätningar (30 μm x 100 μm, 10 pixlar x 36 pixlar). Youngs modulkartor med färgskalor som motsvarar dessa boxade områden visas till höger, inklusive histogram av Youngs modulvärden från dessa kartor; infällda punktdiagram visar värden >10 kPa för varje villkor. Förstyvningen av levern visualiseras som en gradvis högerförskjutning i histogramfördelningen och en högre frekvens av punkter i det infällda spridningsdiagrammet. Skalstreck = 20 μm. (B) Fioldiagram visar fördelningen av elastisk moduli från tre områden uppmätta för varje tillstånd (vänster) och sammanfattade elastiska modulivärden från alla tre kartorna (höger). Fioldiagram visar median (röd linje), 25: e percentilen och 75:e percentilen (svarta linjer); Prickar representerar medelvärdena för enskilda kartor från områdena 1-3. De presenterade p-värdena beräknades med hjälp av en Students t-test utfört på medel. Förkortningar: AFM = atomkraftsmikroskopi; CCl4 = koltetraklorid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Utökad lagring av leversektioner leder till en minskning av styvheten i kollagenrika områden. Leversektioner (framställda från möss behandlade med CCl4 i 2 veckor) lagrade vid −80 °C i 2 veckor eller 3 månader användes för att mäta Youngs modul. Polariserade mikroskopibilder (vänster) med rutor som anger de kollagenrika områden som används för AFM-mätning (30 μm x 100 μm, 10 pixlar x 36 pixlar). Motsvarande Youngs modulkartor med färgskalor (höger). Histogram visar Youngs modulvärden som samlats in från 4-6 områden i varje prov; infällda punktdiagram visar värden >10 kPa för varje villkor. Skalstreck = 20 μm. Förkortningar: AFM = atomkraftsmikroskopi; CCl4 = koltetraklorid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur S1: Metod för att modifiera fribärande medel med en mikropärla av melaminharts. (A) Ritad schematisk illustrerar fästningen av en sfärisk pärla på spetsen av cantilever. För en stegvis beskrivning, se avsnitt 2, del 1, Fastsättning av en 5,7 μm pärla på AFM cantilever spets. (B) Mikroskopibild av en sfärisk 5,7 μm pärla fäst vid utskjutande spets som visas uppifrån (vänster) och sidovy (höger). Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: AFM = atomkraftsmikroskopi; RT = rumstemperatur. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Dataanalys i AtomicJ. (A) Den sekvens av steg som ska följas för att öppna styvhetskartor i AtomicJ. Ett enda vänsterklick på processkraftskurvorna och kartorna (x) öppnar bearbetningsassistenten. Filer kan laddas till bearbetningsassistenten genom att klicka på lägg till (y) och välja önskade filer. Klicka på nästa (z) för att gå vidare till nästa steg. (B) Parametrar för kurvmontering, lämplig kontaktmekanikmodell och AFM-inställningar som används under mätningen. Steg 1-11 hänvisar till motsvarande underpunkter som beskrivs i protokollsteg 3, avsnitt 5, Dataanalys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Översikt över analyserade data i AtomicJ. Förhandsgranskningen av analyserade data visar styvhetskartor (övre vänstra fönstret), kraftkurvor (övre högra fönstret) och rådata (nedre fönstret). Förkortning: AFM = atomkraftsmikroskopi. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Det presenterade protokollet tillhandahåller en steg-för-steg reproducerbar metod för AFM-mätning av normal och fibrotisk muslevervävnad. Kopplad polarisationsmikroskopi ger hög rumslig precision och möjliggör visualisering av kollagenfibrer på grund av deras birefringence. Vidare tillhandahålls en detaljerad beskrivning av analysen av de erhållna kraftkurvorna. AFM-styvhetsmätning kan utföras på cellnivå, vilket gör det möjligt att övervaka lokala förändringar i levervävnadens mekaniska egenskaper på grund av att utveckla fibrotisk sjukdom. Leverfibros är inte en homogen process som påverkar hela organet. Tvärtom varvas områden med kollagenrika fibrotiska septa med områden med låga eller inga kollagenavlagringar. Således är styvhetsförändringar specifika för den lokala mikromiljön och påverkar endast celler lokalt i kontakt med områden som skadats av skada. Denna mikroskala av styvhetsheterogenitet framgår också av detaljerna i AFM Youngs modulkartor, där punkter med hög styvhet gränsar till områdena med nästan normal styvhet. Denna variation visar att även kollagenärrvävnadsområdet inte är mekaniskt homogent och kräver att AFM-mätning karakteriseras på cellnivå (figur 4).
Det presenterade protokollet möjliggör mätningar av leverstyvhet av AFM oberoende av leveruppsamlingen, eftersom hela leverloberna inbäddade i OCT kan lagras under en längre period vid −80 °C. Men när vävnaden är snittad rekommenderar vi att du mäter proverna inom ~ 2 veckor eftersom vi har observerat en gradvis mjukning av vävnadssektioner som lagras under längre perioder (figur 5).
AFM utrustad med polarisationsmikroskopi gör det möjligt att exakt lokalisera intresseområdet inom leverlobulestrukturen. Det har dock också vissa begränsningar som måste beaktas vid tolkningen av resultaten. De styvhetsvärden som erhölls här mättes vid rumstemperatur. Vi antar att effekterna av temperatur på de mekaniska egenskaperna hos mjukvävnad kommer att vara små; Detta kan dock vara en av anledningarna till skillnader mellan de rapporterade in vivo-värdena för mekaniska egenskaper hos levervävnader och värdena i denna studie.
Dessutom tillåter detta protokoll AFM-analys av levervävnad i upp till 3 timmar, vilket kräver mild fixering av vävnaden. Den milda fixeringen av vävnadssektioner, liksom frys-upptiningscykeln, kommer sannolikt att påverka de absoluta värdena för Youngs modul. Således kan de rapporterade värdena för Youngs moduli skilja sig från in vivo-värden . Ytterligare studier behövs för att optimera protokollet för mätning av absoluta värden av Youngs modul från leversektioner, vilket kan uppnås med en annan metod för fixering av levervävnad64.
Icke desto mindre, Vi observerade ökande styvhet av kollagenrika områden i levern hos möss som behandlats med CCl4 för 3 veckor jämfört med 6 veckor. Sådana förändringar motsvarar fibrosprogression under långvarig skada (figur 4) och visar att relativa skillnader kan undersökas mellan olika behandlingar med hjälp av det presenterade protokollet. Detta överensstämmer med observationerna från Calò et al., som visade att milt fasta leversektioner visar liknande skillnader i styvhetsvärden mellan kollagenrika och kollagenfattiga områden som i färsk vävnad25.
Vi använde SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (teoretisk fjäderkonstant ~ 0,09 N / m) modifierad med en sfärisk spets på 5,7 μm diameter för att minimera mekanisk störning av levervävnaden under mätningar. En pärla på 5,7 μm möjliggjorde tillräcklig indragning av provet för att undersöka dess styvhet samtidigt som dess integritet bevarades. En pärla med mindre diameter kan efter flera optimeringar användas för att få högre upplösning i styvhetskartorna men kan leda till ytterligare överskattning av Youngs modulvärden (för mer information, se Crichton et al.65). Med hjälp av den angivna cantilever-pärlensemblen kunde vi karakterisera provstyvhet i ett brett spektrum, från tiotals enheter av Pa till ~ 100 kPa.
Sneddons modell användes för att härleda Youngs modul från kraftkurvor, eftersom den möjliggör analys av djupa indragningar med kolloidala sonder62. Sneddons modell, till skillnad från Hertz modell, lider inte av begränsningen att kontaktradien måste vara mycket mindre än sfärradien. Det förutsätter vidare att provtjockleken är flera gånger större än indragningsdjupet 30,66. I den aktuella studien var indragningen ~ 2 μm med en pärlstorlek på 5,7 μm och en provtjocklek på 30 μm i kollagenrika områden; således var Sneddons modell lämplig. Andra modeller63 med tanke på vidhäftningskraften mellan spets och substrat kan användas för olika typer av vävnader.
Analys i AtomicJ implementerar korrigeringar för provernas ändliga tjocklek för att minimera bidraget från ett substrat samtidigt som Youngs modul62,67 härleds. I analysen av de erhållna kraftkurvorna använde vi ett enda Poissons förhållande på 0,45, vilket tidigare har rekommenderats för mjukvävnadsorgan24. Denna approximation har ingen signifikant effekt på beräknade värden på Youngs modul, eftersom förändringen i värdet på Poissons förhållande från 0,4 till 0,5 endast resulterar i en minskning med 0,893x av Youngs modulvärden beräknade enligt Sneddons ekvation. Med tanke på de flerfaldiga skillnaderna i Youngs modul mellan de olika varaktigheterna av CCl4-behandlingar är de fel som produceras genom att approximera Poissons förhållande endast marginella.
Vi använde abstinenskurvor för att beräkna styvhetsvärden, eftersom vi var intresserade av vävnadens elastiska respons på belastningen som tillhandahålls av cantilever snarare än i plastsvaret på indragning68. På grund av den viskoelastiska responsen hos mjukvävnaden kan passande uttagskurvor överskatta Youngs modul, vilket bör hållas i åtanke. Dessutom har vi observerat att dataanalys med inflygningskurvor ger liknande trender i styvhetsvärden mellan fibrotiska och kontrollområden, även om de absoluta värdena är motsvarande lägre (data visas inte).
När vi optimerade protokollet identifierade vi flera steg som var kritiska för mätningarnas reproducerbarhet. För det första är det viktigt att se till att pärlan är ungefär i mitten av den genomskinliga spetsen medan den fästs på utskjutaren. Detta förhindrar eventuell mekanisk obalans under indragning. För det andra, under leverfixering med PFA, är det nödvändigt att strikt följa tidsgränserna för upptining och fixering. Att ändra tidpunkten för detta steg kan allvarligt påverka de mekaniska egenskaperna hos vävnadssektioner. För det tredje måste utskjutaren kalibreras upprepade gånger med kontinuerlig övervakning och inmatning av samtidiga temperaturvärden för att undvika att artefakter uppstår i styvhetsvärden på grund av temperaturfluktuationer. Slutligen bör en enda leversektion inte mätas längre än 3 timmar från beredningen, eftersom överlagrad PBS kan avdunsta under längre perioder. Läsare kan hänvisa till felsökningstabellen (tabell 3) för att lösa problem som uppstått under AFM-mätningen, som också diskuteras i längd i Norman et al.46.
Tabell 3: Felsökningsguide. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Det presenterade protokollet möjliggör reproducerbar AFM-sondering av levervävnad. Det har potential att avslöja information om utveckling och eventuell regression av fibrotisk leversjukdom på mikroskopisk nivå och kan bidra till utvecklingen av terapier riktade mot fibrotiska ärrregioner som bildas under utvecklingen av kronisk leversjukdom.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Tjeckiens bidragsbyrå (18-02699S), den tjeckiska vetenskapsakademins institutionella forskningsprojekt (RVO 68378050) och MEYS CR-projektet NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU consortium, finansierat av MEYS CR infrastrukturprojekt LM2018127 och Europeiska regionala utvecklingsfonden-Project "UP CIISB" (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) gav ekonomiskt stöd till mätningarna vid CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Vi erkänner också Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Prag, Tjeckien, som stöds av MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) och RVO: 68378050-KAV-NPUI, för deras stöd med mikroskopiavbildningen som presenteras häri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM head | Bruker | JPK nanowizard 3 | |
| Cameras | Andor | Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled) | |
| The Imagingsource | S/N:12310015 | ||
| Cantilever | SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors | S/N:73750F05 | |
| Cryotome | Leica | CM1950 | |
| Epoxy resin glue (Long working time ) | Bison epoxy universal | ||
| Melamine beads; diameter, 5.7 um | Microparticles, GmbH | MF-R-5.7 | |
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Hydrophobic slide marker | SuperHT | PAP PEN | |
| Software | JPK nanowizard v6.1.151 | ||
| AtomicJ v2.3.1 | |||
| Superfrost slides | Thermoscientific | ref no. J1800AMNZ | |
| System | Ubuntu 14.04.5 LTS | ||
| Vibration isolation control unit | Tablestable | AVI-200-S |
References
- vanden Berghe, G. The role of the liver in metabolic homeostasis: Implications for inborn errors of metabolism. Journal of Inherited Metabolic Dis. 14 (4), 407-420 (1991).
- Stanger, B. Z. Cellular homeostasis and repair in the mammalian liver. Annual Reviews of Physiology. 77, 179-200 (2015).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annual Review of Pathology. 6, 425-456 (2011).
- Georges, P. C., et al. Increased stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: Implications for fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (6), 1147-1154 (2007).
- Perepelyuk, M., et al. Hepatic stellate cells and portal fibroblasts are the major cellular sources of collagens and lysyl oxidases in normal liver and early after injury. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (6), 605-614 (2013).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (5), 1394-1400 (2008).
- Olsen, A. L., et al. Hepatic stellate cells require a stiff environment for myofibroblastic differentiation. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (1), 110-118 (2011).
- Sandrin, L., et al. Transient elastography: A new noninvasive method for assessment of hepatic fibrosis. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (12), 1705-1713 (2003).
- Ling, W., et al. Effects of vascularity and differentiation of hepatocellular carcinoma on tumor and liver stiffness: In vivo and in vitro studies. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (4), 739-746 (2014).
- Wong, V. W. S., et al. Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 51 (2), 454-462 (2010).
- Cha, S. W., et al. Nondiseased liver stiffness measured by shearwave elastography a pilot study. Journal of Ultrasound in Medicine. 33 (1), 53-60 (2014).
- Castera, L., Forns, X., Alberti, A. Non-invasive evaluation of liver fibrosis using transient elastography. Journal of Hepatology. 48 (5), 835-847 (2008).
- Chang, W., et al. Liver fibrosis staging with MR elastography: Comparison of diagnostic performance between patients with chronic hepatitis B and those with other etiologic causes. Radiology. 280 (1), 88-97 (2016).
- Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Clinical applications. Journal of Computer Assisted Tomography. 37 (6), 887-896 (2013).
- Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Technique, analysis and clinical applications. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (3), 544-555 (2013).
- Venkatesh, S. K., Wang, G., Teo, L. L. S., Ang, B. W. L. Magnetic resonance elastography of liver in healthy Asians: Normal liver stiffness quantification and reproducibility assessment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 1-8 (2014).
- Lee, D. H., Lee, J. M., Han, J. K., Choi, B. I. MR elastography of healthy liver parenchyma: Normal value and reliability of the liver stiffness value measurement. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 38 (5), 1215-1223 (2013).
- Mueller, S. Liver stiffness: A novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine. Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
- Goodman, Z. D. Grading and staging systems for inflammation and fibrosis in chronic liver diseases. Journal of Hepatology. 47 (4), 598-607 (2007).
- Salameh, N., et al. Hepatic viscoelastic parameters measured with MR elastography: Correlations with quantitative analysis of liver fibrosis in the rat. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 26 (4), 956-962 (2007).
- Yin, M., et al. Quantitative assessment of hepatic fibrosis in an animal model with magnetic resonance elastography. Magnetic Resonance in Medicine. 58 (2), 346-353 (2007).
- Bastard, C., et al. Transient micro-elastography: A novel non-invasive approach to measure liver stiffness in mice. World Journal of Gastroenterology. 17 (8), 968-975 (2011).
- Barnes, S. L., Lyshchik, A., Washington, M. K., Gore, J. C., Miga, M. I. Development of a mechanical testing assay for fibrotic murine liver. Medical Physics. 34 (11), 4439-4450 (2007).
- Calò, A., et al. Spatial mapping of the collagen distribution in human and mouse tissues by force volume atomic force microscopy. Scientific Reports. 10, 15664 (2020).
- Desai, S. S., et al. Physiological ranges of matrix rigidity modulate primary mouse hepatocyte function in part through hepatocyte nuclear factor 4 alpha. Hepatology. 64 (1), 261-275 (2016).
- Kostallari, E., et al. Stiffness is associated with hepatic stellate cell heterogeneity during liver fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 322 (2), 234-246 (2022).
- Binnig, G., Qaute, C. F., Gerber, C. Atomic force microscope. Physical Review Letters. 56 (9), (1986).
- Johnson, K. L. Contact Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1985).
- Asgari, M., Latifi, N., Giovanniello, F., Espinosa, H. D., Amabili, M. Revealing layer-specific ultrastructure and nanomechanics of fibrillar collagen in human aorta via atomic force microscopy testing: Implications on tissue mechanics at macroscopic scale. Advanced NanoBiomed Research. 2 (5), 2100159 (2022).
- Amabili, M., et al. Microstructural and mechanical characterization of the layers of human descending thoracic aortas. Acta Biomaterialia. 134, 401-421 (2021).
- Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: Effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomaterialia. 8 (11), 4123-4129 (2012).
- Geerligs, M., et al. In vitro indentation to determine the mechanical properties of epidermis. Journal of Biomechanics. 44 (6), 1176-1181 (2011).
- Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
- Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
- Babu, P. K. V., Radmacher, M. Mechanics of brain tissues studied by atomic force microscopy: A perspective. Frontiers in Neuroscience. 13, 600 (2019).
- del Mar Vivanco, M. Mammary Stem Cells: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
- Zanetti-Dällenbach, R., et al. Length scale matters: Real-time elastography versus nanomechanical profiling by atomic force microscopy for the diagnosis of breast lesions. Biomed Research International. 2018, 3840597 (2018).
- Lopez, J. I., Kang, I., You, W. -K., McDonald, D. M., Weaver, V. M. In situ force mapping of mammary gland transformation. Integrative Biology. 3 (9), 910-921 (2011).
- Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnol. 4 (3), 186-192 (2009).
- Borin, D., Pecorari, I., Pena, B., Sbaizero, O. Novel insights into cardiomyocytes provided by atomic force microscopy. Seminars in Cell & Developmental Biology. 73, 4-12 (2018).
- Lachaize, V., et al. Atomic Force Microscopy: An innovative technology to explore cardiomyocyte cell surface in cardiac physio/pathophysiology. Letters in Applied NanoBioScience. 4 (4), 321-324 (2015).
- Lieber, S. C., et al. Aging increases stiffness of cardiac myocytes measured by atomic force microscopy nanoindentation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (2), 645-651 (2004).
- Guedes, A. F., et al. Atomic force microscopy as a tool to evaluate the risk of cardiovascular diseases in patients. Nature Nanotechnology. 11 (8), 687-692 (2016).
- Zhu, Y., Dong, Z., Wejinya, U. C., Jin, S., Ye, K. Determination of mechanical properties of soft tissue scaffolds by atomic force microscopy nanoindentation. Journal of Biomechanics. 44 (13), 2356-2361 (2011).
- Norman, M. D. A., Ferreira, S. A., Jowett, G. M., Bozec, L., Gentleman, E. Measuring the elastic modulus of soft culture surfaces and three-dimensional hydrogels using atomic force microscopy. Nature Protocols. 16 (5), 2418-2449 (2021).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation versus tensile measurements of Young's modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 17 (3), 155-164 (2011).
- Scholten, D., Trebicka, J., Liedtke, C., Weiskirchen, R. The carbon tetrachloride model in mice. Laboratory Animals. 49, 4-11 (2015).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ribeiro, J. F., dos Anjos, E. H. M., Mello, M. L. S., de Campos Vidal, B. Skin collagen fiber molecular order: A pattern of distributional fiber orientation as assessed by optical anisotropy and image analysis. PLoS One. 8 (1), 54724 (2013).
- Ozkan, A., et al. The influence of chronic liver diseases on hepatic vasculature: A liver-on-a-chip review. Micromachines. 11 (5), 487 (2020).
- Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
- Khajehahmadi, Z., et al. Liver stiffness correlates with serum osteopontin and TAZ expression in human liver cirrhosis. Annals of the New York Academy of Sciences. 1465 (1), 117-131 (2020).
- Tian, M., et al. The nanomechanical signature of liver cancer tissues and its molecular origin. Nanoscale. 7 (30), 12998-13010 (2015).
- Zhao, G., et al. Mechanical stiffness of liver tissues in relation to integrin β1 expression may influence the development of hepatic cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 102 (5), 482-489 (2010).
- Gang, Z., Qi, Q., Jing, C., Wang, C. Measuring microenvironment mechanical stress of rat liver during diethylnitrosamine induced hepatocarcinogenesis by atomic force microscope. Microscopy Research and Technique. 72 (9), 672-678 (2009).
- Sader, J. E., et al. Spring constant calibration of atomic force microscope cantilevers of arbitrary shape. The Review of Scientific Instruments. 83 (10), 103705 (2012).
- JPK Instruments. A practical guide to AFM force spectroscopy and data analysis. JPK Instruments Technical Note. JPK Instruments. , 1-8 (2016).
- van Eysden, C. A., Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids. Journal of Applied Physics. 101, 044908 (2015).
- Kim, Y., Yang, Y. I., Choi, I., Yi, J. Dependence of approaching velocity on the force-distance curve in AFM analysis. Korean Journal of Chemical Engineering. 27, 324-327 (2010).
- Hermanowicz, P., Sarna, M., Burda, K., Gabryś, H. AtomicJ: An open source software for analysis of force curves. The Review of Scientific Instruments. 85 (6), 063703 (2014).
- Hermanowicz, P. AtomicJ 2.3.1 User's Manual. , (2021).
- Iwashita, M., et al. Comparative Analysis of Brain Stiffness Among Amniotes Using Glyoxal Fixation and Atomic Force Microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
- Crichton, M. L., et al. The viscoelastic, hyperelastic and scale dependent behaviour of freshly excised individual skin layers. Biomaterials. 32 (20), 4670-4681 (2011).
- Puricelli, L., Galluzzi, M., Schulte, C., Podestà, A., Milani, P. Nanomechanical and topographical imaging of living cells by atomic force microscopy with colloidal probes. The Review of Scientific Instruments. 86 (3), 033705 (2015).
- Hermanowicz, P. Determination of Young's modulus of samples of arbitrary thickness from force distance curves: Numerical investigations and simple approximate formulae. International Journal of Mechanical Sciences. 193, 106138 (2021).
- Han, R., Chen, J. A modified Sneddon model for the contact between conical indenters and spherical samples. Journal of Materials Research. 36, 1762-1771 (2021).
