Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

توصيف البروتين عبر الغشاء الحويصلة خارج الخلية بواسطة قياس التدفق الخلوي النانوي

Published: July 26, 2022 doi: 10.3791/64020
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, *2, *2, *3, *1
1NanoFCM Co., Ltd, 2School of Sport, Exercise and Health Sciences, Loughborough University, 3Biomolecular Sciences Research Centre, Sheffield Hallam University
* These authors contributed equally

Summary

أحدث جيل من أدوات توصيف EV قادرة على تحليل EV واحد عبر معلمات متعددة في وقت واحد. يقيس قياس التدفق الخلوي النانوي جميع الجسيمات البيولوجية التي يزيد حجمها عن 45 نانومتر دون وضع العلامات ويحدد الخصائص المحددة للسكان الفرعيين من خلال مجموعة متنوعة من تقنيات وضع العلامات الفلورية.

Abstract

أصبح توصيف الجسيمات المفردة ذا أهمية متزايدة للبحث في الحويصلات خارج الخلية ، حيث تقدم من تقنيات التحليل السائب وتحليل الجسيمات من الجيل الأول إلى قياسات شاملة متعددة المعلمات مثل قياس التدفق الخلوي النانوي (nFCM). nFCM هو شكل من أشكال قياس التدفق الخلوي الذي يستخدم الأجهزة المصممة خصيصا لتحليل الجسيمات النانوية ، مما يسمح بتمييز الآلاف من المركبات الكهربائية في الدقيقة مع وبدون استخدام تقنيات التلطيخ. يسمح الكشف عن التشتت الجانبي عالي الدقة (SS) بتحديد الحجم والتركيز لجميع الجسيمات البيولوجية التي يزيد حجمها عن 45 نانومتر ، بينما يحدد الكشف عن التألق المتزامن (FL) وجود علامات وأهداف ذات أهمية. يمكن بعد ذلك وصف المجموعات الفرعية المصنفة بوحدات كمية من الجسيمات / المل أو كنسبة مئوية من إجمالي الجسيمات المحددة بواسطة التشتت الجانبي.

هنا ، يتم تصنيف EVs المشتقة من وسائط زراعة الخلايا المشروطة (CCM) مع كل من صبغة الدهون ، لتحديد الجسيمات ذات الغشاء ، والأجسام المضادة الخاصة ب CD9 و CD63 و CD81 كعلامات EV شائعة. يتم تحليل قياسات مواد المقارنة ، ومعيار التركيز ومعيار حجم السيليكا النانوية ، وكذلك مواد العينة الموسومة في تحليل مدته 1 دقيقة. ثم يتم استخدام البرنامج لقياس ملف تعريف توزيع التركيز والحجم لجميع الجسيمات ، بغض النظر عن وضع العلامات ، قبل تحديد الجسيمات الموجبة لكل من التسميات.

يمكن استخدام الكشف المتزامن عن SS و FL بمرونة مع العديد من مصادر EV المختلفة وأهداف وضع العلامات ، الخارجية والداخلية على حد سواء ، والتي تصف عينات EV بطريقة شاملة وكمية.

Introduction

ما هي السيارات الكهربائية؟
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي المصطلح الجماعي لمجموعة من الجسيمات الغشائية المشتقة من الخلايا التي تشكل جزءا لا يتجزأ من العديد من الأنشطة الخلوية والأنسجة الطبيعية. وقد أدى تأثيرها على مجموعة واسعة من المجالات العلمية وأهميتها السريرية المحتملة إلى نمو أبحاث السيارات الكهربائية والاهتمام الصناعي1. تركز أبحاث EV الصغيرة (sEV) في المقام الأول على الإكسوسومات ، وهي جسيمات 40-100 نانومتر التي تبدأ في التكون في الإندوسومات المبكرة قبل النضج وإطلاقها من خلال اندماج الأجسام متعددة الحويصلات (MVB) إلى غشاء البلازما ، وكذلك الحويصلات الدقيقة ، التي تبرعم مباشرة من غشاء البلازما الذي يشكل جسيمات 80-1000 نانومتر2. ثالث مجموعة EV هي أجسام استماتية ، جسيمات 50-1,500 نانومتر تشكلت أثناء موت الخلايا مما يعني أن نسبتها النسبية إلى المركبات الكهربائية الأخرى يمكن أن تكون متغيرة إلى حد كبير3.

نظرا لأن خصائص EV قد تمثل التغيرات التي تحدث في خلاياها / أنسجتها الأصلية ، فهناك إمكانية لاستخدامها في التشخيص. بدأت العديد من تحليلات "omics" في تحديد علامات أصل الخلايا وحالة المرض ، مما قد يسمح بإجراء تقييم غير جراحي للمرضى الذين يستخدمون مصادر EV مثل بلازما الدم / المصل والبول واللعاب والسائل الشوكي الدماغي (CSF) 4,5. القوة الدافعة وراء هذه الابتكارات المتعلقة بالسيارات الكهربائية هي تقنيات التوصيف الجديدة التي تتغلب على القيود السابقة.

الحاجة إلى توصيف EV واحد والتحديات التي تواجهه
أصبح توصيف EV الفردي ذا أهمية متزايدة لكل من التحقق من صحة ووصف عزلات EV ، بالإضافة إلى توضيح السمات الرئيسية لهذه الجسيمات النانوية لتقدم العلاجات والتشخيص القائم على EV6. اعتمادا على مصدر EV والاستخدام المقصود ، يمكن أن يتطلب تحليل النقاء ، الذي غالبا ما يوصف بأنه نسبة EV إلى جزيئات غير EV أو EV إلى البروتين الحر ، كميات كبيرة من البيانات من تحليلات متعددة7.

اعتمدت قياسات عد الجسيمات وتحجيمها في منشورات EV في السابق بشكل كبير على تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، واستشعار النبض المقاوم (RPS) ، والمجهر الإلكتروني (EM)2. تفتقر NTA و RPS القياسية إلى القدرة على التمييز بين المركبات الكهربائية والجسيمات غير EV ولها محاذيرها الخاصة مثل الإنتاجية البطيئة8 والحد الأدنى غير المناسب للكشف الذي شوهد مع NTA 9,10,11.

كانت tetraspanins CD9 و CD63 و CD81 تاريخيا معرفات مهمة لوجود EVs في عزلات / تحضيرات EV. عادة ، يتم استخدام تقنيات النشاف الغربي (WB) والنشاف النقطي لإظهار إثراء هذه البروتينات في عزلات EV مقارنة ب12 خلية محللة. ومع ذلك ، فإن عدم وجود تحديد كمي لهذه الطرق وعدم تجانس علامات EV هذه ، فيما يتعلق بكل من العرض داخل المجموعات الفرعية EV والتباين المرتبط بالخلايا أو الأنسجة أو المريض ، يشجع التقنيات التحليلية المتقدمة ، التي توحد التوصيف الفيزيائي والمظهري13.

قياس التدفق الخلوي النانوي كتقنية شاملة لتحليل المركبات الكهربائية
يتطلب تحديد تركيزات EV الحقيقية تحديد الجسيمات السليمة وعلامة عالمية ، خاصة في عزلات الجسيمات المعقدة ، مع دقة قادرة على اكتشاف جميع المركبات الكهربائية مع تمييزها عن الجسيمات غير EV14.

قياس التدفق الخلوي النانوي (nFCM) هو تقنية تسمح بالتحليل غير المسمى للجسيمات التي يتراوح حجمها بين 45-1000 نانومتر مع استخدام وضع العلامات الفلورية والكشف عنها في نفس الوقت لتحديد المجموعات الفرعية للجسيمات. ومن الفروق الرئيسية عن قياس التدفق الخلوي التقليدي استخدام معدات مخصصة لتحليل الجسيمات النانوية، مما يسمح بأكبر قدر من الدقة15. تحليل EV ، الذي يستخدم أجهزة التدفق التقليدية المعاد استخدامها لتحليل الجسيمات الصغيرة يتحسن ، لكنه لا يزال يكافح من أجل تحقيق الدقة للكشف عن وتحليل <100 نانومتر EVs16,17. يعد قياس التدفق الخلوي القائم على الخرز تكيفا إضافيا يستخدم غالبا لتحليل المركبات الكهربائية ، ولكن هذا يزيل إمكانية اكتشاف جسيم واحد ويدخل تحيزات قائمة على الالتقاط18.

الاستفادة من حد أدنى للكشف عن ~ 45 نانومتر في قناة التشتت الجانبي (SS) لتحليل EV ، يستخدم nFCM تشغيل SS. يمكن اعتبار هذا التحليل "جسيما أولا" لأنه يعني أن الأحداث يجب أن توفر إشارة SS ، متجاوزة عتبة محددة قبل تحليل شدة التألق. هذا يزيل الإيجابيات الكاذبة مثل الغشاء المتدهور وتجمعات الفلوروفور ، ويركز التحليل على EVs15 سليمة. تستخدم قياسات SS أيضا لحجم الجسيمات الفردية مقارنة بمعيار السيليكا النانوي19 رباعي الوسائط. يتم أخذ قياسات التألق على كاشفين آخرين مما يسمح بثلاثة قياسات متزامنة لكل جسيم لوصف تركيز الجسيمات وأحجامها ووجود علامات أو أهداف أخرى ذات أهمية من أجل تحديد المجموعات الفرعية EV20.

في التجربة التالية ، يتم استخدام قياسات SS والفلورسنت (FL) لقياس جسيمات >45 نانومتر ، وإظهار المجموعة الفرعية من المركبات الكهربائية الإيجابية للغشاء ، وتحديد عرض CD9 و CD63 و CD81 على المجموعات الفرعية EV. يتم وصف كل من تركيز هذه المجموعات الفرعية ونسبتها كجزء من إجمالي الجسيمات التي تم قياسها بواسطة SS ، وكذلك ملفات تعريف حجمها.

Protocol

1. إعداد أداة nFCM وقياسات معايير nFCM

ملاحظة: يتم أخذ ثلاثة قياسات قبل البدء في الحصول على البيانات للعينات للتحقق من المحاذاة الصحيحة لأداة nFCM وتوفير مقارنة قوية بين الأدوات. هذه هي معايير التركيز / مراقبة الجودة (QC) ، ومعيار الحجم ، والفراغ.

  1. تمييع حبات مراقبة الجودة 1:100 في الماء المقطر في أنبوب مناسب 0.6 ميكرولتر ووضعها في خليج التحميل.
  2. من القائمة المنسدلة تدفق العينة، حدد تعزيز لإدخال عينة مراقبة الجودة في النظام لمدة 45 ثانية لاستبدال حل العينة/التنظيف السابق بالكامل.
    1. أثناء التعزيز ، اضبط طاقة الليزر على القالب المحدد مسبقا لخرز مراقبة الجودة "معيار مراقبة الجودة FL 250 نانومتر" ، على سبيل المثال ، 10/40 ميجاوات لليزر الأزرق ، و 20/50 ميجاوات لليزر الأحمر ، مع اضمحلال SS بنسبة 0.2٪.
  3. حدد ضغط أخذ العينات من نفس القائمة السفلية لتقليل ضغط النظام.
  4. اضبط ضغط أخذ العينات التلقائي على 1.0 كيلوباسكال للحفاظ على ضغط ثابت.
  5. ابدأ تحليل 1 دقيقة عن طريق تحديد وقت التسجيل من عناصر التحكم في الاستحواذ. سيتم رسم البيانات على مخطط النقاط الذي يعرض مقياس سجل لكثافة SS وكثافة FL محددة.
  6. أدخل اسم الملف وتخفيف العينة قبل حفظ الملف.
  7. حدد إلغاء التحميل لإزالة الأنبوب من حاوية التحميل. استبدل بمحلول تنظيف سعة 150 ميكرولتر ونظفه لمدة >30 ثانية عن طريق تحديد التعزيز قبل إزالة محلول التنظيف عن طريق تحديد تفريغ.
    1. قم بإزالة أي محلول تنظيف زائد من الطرف الشعري باستخدام أنبوب يحتوي على 150 ميكرولتر من الماء.
  8. قم بتخفيف حجم الخرز القياسي 1:100 في الماء وقم بتحميل 100 ميكرولتر في خليج التحميل ، قبل زيادة العينة لمدة 45 ثانية.
  9. اضبط طاقة الليزر على القالب المحدد مسبقا "S16 exo 68-155 nm". هذا الإعداد مخصص لكل من معيار الحجم والعينات التي تحتوي على EVs < 200 نانومتر. على سبيل المثال ، 15/40 ميجاوات لليزر الأزرق ، 20/50 ميجاوات لليزر الأحمر ، مع اضمحلال SS بنسبة 0.2٪.
  10. حدد أخذ العينات وانتقل إلى تسجيل العينة لمدة 1 دقيقة كما كان من قبل.
  11. قم بإجراء القياس الثالث باستخدام عينة ماء أو PBS لإنشاء قياس فارغ لملاءمتك ، وتحديد الإيجابيات الخاطئة لإزالتها بواسطة البرنامج. يتم وصف إدخال القياسات القياسية في القسم التالي.

2. تحديد تركيز الجسيمات لعينة غير مصنفة وإنشاء تقرير PDF

  1. قم بتخفيف عينة EV غير المصنفة في PBS إلى نطاق تركيز جسيمات مناسب لتحليل nFCM ، 1 × 10 8- 5 × 108 جسيمات / مل. قم بتحميل 10-100 ميكرولتر من العينة المخففة في خليج التحميل.
  2. عندما يكون تركيز الجسيمات غير معروف، ابدأ بتخفيف 1:100 لعينة EV. يمكن تقريب تركيز العينة بسرعة من خلال حجم بقعة الليزر على كاميرا CCD أثناء التعزيز ، أو عن طريق مراقبة تتبع انفجار الحدث أثناء أخذ العينات.
  3. عزز العينة المحملة لمدة 45 ثانية قبل تحديد أخذ العينات وسجل لمدة 1 دقيقة، مع الحفظ كما هو موضح سابقا.
  4. لبدء تحليل هذه البيانات، قم بالتبديل من علامة التبويب اكتساب إلى علامة التبويب تحليل . افتح ملفات nfa المحفوظة.
  5. للسماح بقياس دقيق للعينة، استخدم القياسين القياسيين المأخوذين قبل قياس العينة لتعيين قيم لمقارنة العينات بالإضافة إلى الفراغ.
  6. قم بإنشاء منحنى قياسي للحجم ، لتحويل SS إلى قطر ، عن طريق تحديد حجم الملف القياسي أولا واستخدام أداة عتبة المجموعة (المعروفة أيضا باسم العتبة التلقائية). وتحدد العتبة، المرئية في تتبع انفجار الحدث، الحد الأدنى لشدة الإشارة المطلوبة لاعتبار الحدث ذا أهمية.
  7. مع تعيين العتبة ، تحقق من معلمات مخطط النقطة x و y هي SS-H أو SS-A على المحور x و FITC-A على المحور y.
  8. افتح أداة إنشاء المنحنى القياسي وحدد S16 exo 68-155 nm كقالب التحجيم. انقر فوق Find Peaks لتحديد شدة SS القصوى إما كجسيم قطره 68 أو 91 أو 113 أو 155 نانومتر.
  9. تحقق مما إذا كان قد تم إنشاء منحنى SS إلى القطر بقيمة r قريبة من 1 قبل إغلاق النافذة.
  10. اضبط معيار التركيز عن طريق تحديد الملف المحفوظ والنقر فوق حساب STD. أدخل تركيز الجسيمات للمعيار.
  11. بعد تعيين المعلومات القياسية ، حدد ملف نموذج EV وقم بتعيين العتبة.
  12. حدد الملف الفارغ وانقر فوق تعيين فارغ لتحديد عدد الإيجابيات الخاطئة للإزالة من عدد العينات. يجب أن يتم ذلك بنفس عتبة عينتك. ارجع إلى نموذج ملف EV.
  13. افتح أداة إنشاء PDF وحدد التحجيم والتركيز. أدخل تخفيفات العينة. يتم عرض تركيز العينة وتوزيع حجم الجسيمات.

3. وضع العلامات عينة

ملاحظة: يمكن استخدام استراتيجيتين للتلطيخ في وقت واحد لإجراء تحليل شامل للجسيمات المعلقة. غالبا ما تتطلب بروتوكولات وضع العلامات تحسينا للأجسام المضادة الجديدة أو مصادر العينات.

  1. قم بتخفيف جزء من عينة EV إلى تركيز 1.25 × 1010 جسيمات / مل في PBS. احتضان 8 ميكرولتر من عينة EV المخففة مع 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة و 1 ميكرولتر من الصبغة لتركيز جسيمات 1 × 10 10 جسيمات / مل (سيكون إجمالي الجسيمات 1 × 108 معلقا في10 ميكرولتر). نسبة حضانة الجسم المضاد هي 1:50 (1 ميكرولتر من 1:5 جسم مضاد) في هذه الحالة.
    1. استخدم أكثر من ثلاثة تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة أو الصبغة أثناء التحسين ، لتوفير بيانات تشير إلى أن البروتوكول يسمح بأقصى قدر من ربط epitope دون الإفراط في تشبع الملصق المختار ، مما قد يضعف تحديد أحداث التألق منخفضة الكثافة. تركيز الحضانة لصبغة الغشاء هو 40 نانومتر (1 ميكرولتر من 400 نانومتر).
  2. امزج عينة 10 ميكرولتر عن طريق الدوامة لمدة 5 ثوان واحتضنها في RT لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    ملاحظة: يتم تضمين توصيات بشأن الضوابط في المناقشة.
  3. بعد الحضانة ، خذ 1 ميكرولتر من العينة المصنفة وقم بتخفيف 1:50 في PBS في أنبوب 0.6 مل.
  4. قم بتحميل العينة في حجرة التحميل وقم بتطبيق ضغط معزز لمدة 45 ثانية. تأكد من صحة إعدادات الليزر وتحميل العدسات المناسبة.
  5. قم بالتبديل إلى ضغط أخذ العينات وحدد وقت التسجيل. بعد الحصول على 1 دقيقة ، قم بتسمية ملف البيانات وحفظه.
  6. قم بتفريغ العينة واستبدلها بمحلول التنظيف. عزز هذا لمدة >30 ثانية قبل تحميل العينة التالية المصنفة.

4. تحليل nFCM - جيل PDF لتحليل السكان الفرعيين

  1. بالنسبة لتوليد PDF ، قم بتطبيق نفس المعايير كما تم سابقا ؛ سيتم تعيين القياس الفارغ فقط بشكل مختلف.
  2. حدد نموذج الملف واضبط العتبة. على مخطط النقاط، قم بتغيير المحور y لإظهار قياسات FL من القناة الخضراء أو الحمراء.
  3. حدد أداة بوابة التربيع، ثم استخدم النقر بزر الماوس الأيسر لرسم مربع حول مجموعة FL+ السكانية.
  4. افتح ملف القياس الفارغ وانقر فوق تعيين فارغ قبل العودة إلى ملف العينة.
  5. افتح أداة إنشاء PDF كما كان من قبل ويتم تحديد توزيع الحجم والتركيز والنسبة المئوية (مقارنة بجميع أحداث SS+ ) للسكان الفرعيين FL+.
    1. كرر ذلك لكل مجموعة فرعية ذات أهمية تم تحديدها على أنها "المجموع ، P1 ، P2 ، إلخ".

Representative Results

عرض Tetraspanin حول المركبات الكهربائية المشتقة من SW620 والمركبات الكهربائية المشتقة من C2C12
وقد أبرز التحليل الحديث لوفرة التتراسبانين الرئيسية CD9 و CD63 و CD81 على المركبات الكهربائية من مجموعة متنوعة من المصادر التباين الشديد لوجودها ، سواء في التحليلات السائبة أو عند تحليل عرضها على المجموعات الفرعية للمركبات الكهربائية21. ومن المرجح أن يكون ذلك مرتبطا بتوافر مسارات مختلفة للتكوين الحيوي مثل المسارات المستقلة والمعتمدة على الحقوق الاقتصادية والاجتماعية والثقافية22.

تم تقديم CD9 على أكبر نسبة مئوية من المركبات الكهربائية C2C12 بنسبة ~ 50٪ ، مع عرض CD63 على ~ 30٪ فقط ، في الشكل 1. عندما تم إجراء وضع العلامات باستخدام جميع مضادات التتراسبانين الثلاثة في حضانة واحدة ، تبين أن 70٪ من الجسيمات تقدم واحدة على الأقل من علامات EV. أظهرت القياسات المتكررة أدنى انحراف معياري لوضع العلامات CD9/63/81 على المركبات الكهربائية C2C12 عند ~ 3.8٪ ، في حين كان هذا ~ 8.1٪ ل CD81 المسمى C2C12 EVs.

أظهرت المركبات الكهربائية المشتقة من SW620 ملفا مختلفا للرباعي سبانين، مع وجود فرق أكبر بكثير بين CD9 الأكثر تقديما بنسبة ~ 40٪ وCD63 الأقل عرضا بنسبة ~ 7٪. على غرار المركبات الكهربائية C2C12 ، كان CD9 موجودا على غالبية السكان الإيجابيين للرباعي ، حيث حدد وضع العلامات CD9/63/81 مجتمعة ~ 42٪ من الجسيمات على أنها تحتوي على واحد على الأقل من العلامات الثلاثة.

تراوحت غالبية الجسيمات المشتقة من C2C12 ، إجمالي عدد سكان SS + ، في الحجم من 45-120 نانومتر ، بقطر متوسط ~ 65 نانومتر. تتشابه ملامح الحجم لكل من المجموعات الفرعية الفردية التي تحمل اسم tetraspanin ، الموضحة في الشكل 1 ، مع بعضها البعض ، حيث تظهر حجما متوسطا أكبر يبلغ ~ 75-85 نانومتر وأقل من <65 نانومتر EVs مقارنة بإجمالي عدد الجسيمات.

تراوحت الجسيمات المشتقة من SW620 بين 45-160 نانومتر مع متوسط حجم ~ 65 نانومتر ، مما يدل على توزيع منحرف. تظهر المركبات الكهربائية التي تحمل اسم tetraspanin توزيعا طبيعيا أكثر وقطرا متوسطا أكبر بين 90-110 نانومتر ، مع توزيعات مماثلة بين المجموعات الفرعية الإيجابية الفردية للرباعي.

في حين أن التتراسبانين الأكثر والأقل عرضا هما نفسهما بالنسبة لهذين الخطين الخلويين ، فإن تمثيلهما النسبي يختلف اختلافا كبيرا وهناك فرق مثير للاهتمام بين العرض المشترك المحتمل للرباعي الذي يمكن ملاحظته من الفرق في إيجابية CD9 وإيجابية CD9/63/81.

الجمع بين وضع العلامات على غشاء EV ووضع العلامات على الأجسام المضادة
يوفر الغشاء ثنائي الطبقة للمركبات الكهربائية هدفا أكثر عمومية لوضع العلامات ، والذي قد يسمح بالتمييز عن الجسيمات غير EV ذات الحجم المماثل مثل مجاميع البروتين وبعض أشكال LDL مع أحادي الطبقاتالدهنية 23. يجب التحقق من خصوصية هذا النوع من وضع العلامات حيث ثبت أن بعض الأصباغ الغشائية الشائعة المستخدمة في أبحاث EV ترتبط بجزيئات غير EV وكذلك24.

أظهر وضع العلامات الغشائية مرارا وتكرارا إيجابية بنسبة 80٪ تقريبا من المركبات الكهربائية المشتقة من C2C12 و SW620 EVs. تظهر كثافة SS (SS-H) ارتباطا جيدا مع شدة FITC على مخططات النقاط لكل من نتائج C2C12 و SW620 الموضحة في الشكل 2. ومن المتوقع أن يكون هذا لأن شدة SS مرتبطة بحجم الجسيمات وبالتالي مساحة سطح الغشاء.

كانت غالبية الأجسام المضادة التي تحمل علامة EVs إيجابية أيضا لوضع العلامات على الغشاء تظهر نسب مئوية إيجابية مزدوجة (FITC+ و APC+) تشبه إلى حد كبير النسب المئوية الإيجابية للرباعي. تظهر مخططات FITC مقابل APC dot علاقة طفيفة بين وضع العلامات على الغشاء والتتراسبانين مع وضع العلامات CD63 على ما يبدو لإظهار أضعف علاقة بوضع العلامات على الغشاء. تم الكشف عن عدد قليل من الأحداث التي كانت إيجابية لوضع العلامات على الأجسام المضادة ولكنها سلبية لوضع العلامات على الغشاء.

قابلية الاستنساخ، وكفاءة وضع العلامات المزدوجة، ومخرجات البيانات البديلة
أحد الاعتبارات المهمة في تصميم تجارب nFCM هو تفاعل الفلوروفور أو التسمية. يوضح الشكل 3 أ أن تكرار وسم الأجسام المضادة مع وبدون وسم غشاء إضافي يؤدي إلى قياسات إيجابية متشابهة جدا في المائة. على وجه الخصوص ، يظهر وضع العلامات SW620 اختلافا طفيفا جدا بين مجموعتي القياس. يظهر هذا تداخلا محدودا بين ربط الصبغة والأجسام المضادة ويسلط الضوء أيضا على قابلية التكرار الجيدة عند تكرار وضع العلامات على EV.

يمكن تصدير قياسات الكثافة ، سواء التشتت الجانبي أو التألق ، للتفوق لكل جسيم فردي تم قياسه. من هذا يمكننا توليد قياسات شدة التألق المتوسط (MFI) لتوفير تقديرات تقريبية مقارنة لوفرة هدفنا الموسوم. تشير مؤسسات التمويل الأصغر لمجموعات الفلورسنت من المركبات الكهربائية المشتقة من C2C12 إلى عرض أقل قليلا ل CD63 و CD81 مع قياسات MFI من ~ 550 و ~ 600 ، على التوالي ، مقارنة ب ~ 850 MFI التي شوهدت ل CD9 + EVs. وحدات قياس MFI في هذه الحالة هي FL-A وغير موحدة مقابل معايرة الفلورسنت. استخدام جميع الأجسام المضادة الثلاثة لا يثير تألقا أكبر بكثير من مجرد وضع العلامات على CD9. وهذا يختلف تماما عن قياسات SW620 MFI ، والتي تشير إلى أن استخدام كوكتيل من جميع الأجسام المضادة الثلاثة يوفر إشارة تألق أكبر للمركبات الكهربائية المصنفة ، من استخدام أي ملصق فردي للأجسام المضادة.

يمكن أيضا تصدير المدرج التكراري لتوزيع الحجم الذي ينتجه برنامج NanoFCM إلى Excel مما يسمح بتراكب مجموعات البيانات الثلاثية. تتشابه ملفات تعريف توزيعات الحجم في الشكل 3 مع تلك الموجودة في الشكل 1 ولكنها تتضمن أشرطة خطأ. يظهر متوسط حجم EV للمجموعات الفرعية الإيجابية tetraspanin في المركبات الكهربائية المشتقة من C2C12 متوسطا حوالي 70 نانومتر ، وهو أكبر قليلا من متوسط 60 نانومتر من إجمالي مجموعات الجسيمات. SW620 EVs إيجابية لعلامات tetraspanin أكبر ، وتظهر قمم عند ~ 100 نانومتر.

Figure 1
الشكل 1: CD9 و CD63 و CD81 المجموعات الفرعية الإيجابية EV التي تم تحديدها بواسطة وضع العلامات على الأجسام المضادة . (A) مخطط شريطي يوضح النسبة المئوية للمركبات الكهربائية المصنفة مقارنة بإجمالي الجسيمات التي لاحظتها SS للمركبات الكهربائية المشتقة من C2C12. (ب) مخطط شريطي يوضح النسبة المئوية للمركبات الكهربائية المصنفة مقارنة بإجمالي الجسيمات التي لاحظتها SS للمركبات الكهربائية المشتقة من SW620. (ج) ملفات تعريف توزيع الحجم التمثيلي للمركبات الكهربائية المشتقة من C2C12. كل رسم بياني مأخوذ من ملفات PDF التي تم إنشاؤها للقياس الأول لمجموعات البيانات الثلاثية. (د) ملفات تعريف توزيع الحجم التمثيلي للمركبات الكهربائية المشتقة من SW620. كل رسم بياني مأخوذ من ملفات PDF التي تم إنشاؤها للقياس الأول لمجموعات البيانات الثلاثية. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للقياسات الثلاثية لنفس العينات الموسومة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: وضع العلامات على الأغشية ووضع العلامات على الأجسام المضادة ل CD9 و CD63 و CD81 التي تعرض المجموعات الفرعية EV . (A) مخطط شريطي يوضح الغشاء + ، و tetraspanin + ٪ و Double + ٪ ل C2C12 EVs. (ب) مخطط شريطي يوضح الغشاء + ، و tetraspanin + ٪ و Double + ٪ ل SW620 EVs. (ج) مخططات النقاط الممثلة SS مقابل FITC التي تظهر بوابات للسكان الإيجابيين للغشاء. (د) مخططات نقطية تمثيلية ل FITC مقابل APC تظهر بوابات لمجموعات إيجابية مزدوجة من المركبات الكهربائية من C2C12. (ه) مخططات نقطية تمثيلية ل FITC مقابل APC تظهر بوابات لمجموعات إيجابية مزدوجة من المركبات الكهربائية من SW620. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للقياسات الثلاثية لنفس العينات الموسومة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تقييم التباين في القياسات المتكررة . (أ) مخططات شريطية توضح وضع العلامات على الأجسام المضادة النسبة المئوية للإيجابية مع وبدون وسم غشاء إضافي. (ب) متوسط قياسات شدة التألق للمجموعات الفرعية للمركبات الكهربائية المسورة. (ج) المدرج التكراري لتوزيع متوسط الحجم لمجموعات البيانات الثلاثية للمركبات الكهربائية C2C12. (د) المدرج التكراري لتوزيع متوسط الحجم لمجموعات البيانات الثلاثية لمركبات SW620 EVs. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للقياسات الثلاثية لنفس العينات الموسومة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تفاصيل العينة والكاشف
تم اختيار اثنين من عزلات EV من خطوط الخلايا المنفصلة لإظهار وضع العلامات الفلورية وتحليل nFCM اللاحق. تم تعليق كل من مجموعات EV في PBS وتخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة <3 أشهر ولكن معظم الحالات الأخرى كانت مختلفة بين العزلات. يمثل خط خلايا الكتلة العضلية للفأر C2C12 مقدمة جنينية لخلايا العضلات الهيكلية وتم زراعتها في ثقافة ثنائية الأبعاد ، مع تكييف وسط النمو أكثر من 72 ساعة قبل عزل EV بواسطة الطرد المركزي الفائق. SW620 هو خط خلايا سرطان القولون الغدي البشري وتم زراعته في مفاعل حيوي بدائي ، مما أدى إلى إثراء الوسائط على مدار 7 أسابيع ، مع عزل EV الذي تم إجراؤه بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) والكسور 7-9 التي تم إخراجها من أعمدة السيفروز CL-2B مجتمعة في عينة واحدة.

في حين أن المركبات الكهربائية المعزولة والمركزة من CCM هي أسهل أنواع العينات للعمل معها ، فإن nFCM ينطبق على معظم عزلات EV ، بما في ذلك السوائل الحيوية مثل المصل والبلازما والبول والسائل الدماغي الشوكي. تستفيد تحليلات العينات هذه من الكشف عن nFCM SS لجميع الجسيمات ، مما يسمح بالتأكيد مع NTA و TRPS وتحليلات الجسيمات الأخرى ، مع وصف المجموعات الفرعية EV المسماة بالفلورسنت من الناحية الكمية بالإضافة إلى نسبة من المجموع ، لنهج غير متحيز لتحليل الجسيمات متعددة المعلمات. من الممكن أيضا تحليل العينات منخفضة المعالجة ، مثل البول غير الواضح و CCM المخصب EV مع التحذير من الحاجة إلى بروتين منخفض التلوث.

تهدف صبغة الغشاء المستخدمة هنا إلى الاندماج في الطبقة الثنائية للدهون ، مع مويتي محب للدهون لتحميل الغشاء وصبغة محبة للماء للبقاء في غشاء البلازما25. لا توجد حاليا صبغة مثالية لوضع العلامات على EV ويجب مراعاة العديد من المعايير عند الاختيار ، بما في ذلك خصوصية EVs ، ومدى ملاءمتها مع التثبيت أو التخلل ، وكفاءة وضع العلامات على EV26.

وقد ثبت أن وسم الأجسام المضادة المترافقة مع الفلورسنت للظواهر السطحية المكشوفة هو طريقة فعالة لتحديد المجموعات الفرعية للمركبات الكهربائية27. أحد الجوانب الرئيسية لتحسين البروتوكول هو تلبية ، وليس تجاوز ، نقطة تشبع الوسم للارتباط بجميع الظواهر المتاحة دون تثبيط الكشف عن جزيئات التألق المنخفضة من خلال السماح للمخزن المؤقت المحيط بملء الجسم المضاد غير المرتبط بالفلورسنت28. بالإضافة إلى ذلك ، من المحتمل أن يتأثر توافر مواقع الربط المكشوفة لوضع العلامات على الأجسام المضادة بعدة عوامل. وقد تبين أن ظروف تخزين المركبات الكهربائية تؤثر على تركيز وحجم المركبات الكهربائية29 مع ملاحظات تشير أيضا إلى التأثيرات على وسم الأجسام المضادة30. قد يكون لوجود بروتينات الهالة السطحية وتعديلات البروتين وتأثيرات تقنيات العزل أيضا تأثيرات على وضع العلامات على الأجسام المضادة في بعض الحالات. في نهاية المطاف، عندما يصبح استخدام وضع العلامات الفلورية أكثر انتشارا لدراسات المركبات الكهربائية، سيصبح التصميم التجريبي والتحسين لتقنيات تحليلية متعددة أكثر دقة.

لزيادة دقة النتائج ، يمكن تضمين العديد من عناصر التحكم مثل (1) PBS + التحكم في الصبغة ، لتقييم تكوين الميسيلات أو الركام في بعض الأصباغ ، والتي يمكن أن تظهر كجزيئات SS + في تحليل nFCM ، (2) PBS + التحكم في الأجسام المضادة ، يمكن أن تحدث المجاميع ، على الرغم من أنها ليست كبيرة بما يكفي في كثير من الأحيان لتشتيت الضوء الكافي للكشف عن SS ، (3) عينة EV + التحكم في الأجسام المضادة IgG ، شائع في قياس التدفق الخلوي ويستخدم لتحديد أي ارتباط غير محدد ، (4) عينة جسيمات غير EV + التحكم في الأجسام المضادة / الصبغة - مهم بشكل خاص عند الحاجة إلى تحديد EVs في عينات الجسيمات المعقدة ، يمكن أن تكون عناصر التحكم مثل جزيئات البروتين الدهني منخفض الكثافة النقية (LDL) أو عينات EV المستنفدة / المستنفدة بمثابة عنصر تحكم سلبي للتحقق من صحة وضع العلامات الانتقائية ، (5) من الصعب تصميم عناصر التحكم الإيجابية ولكن التحقق من صحة الجسم المضاد على الخلايا هو تضمين مفيد.

عرض التتراسبانين على المركبات الكهربائية
يوضح وضع العلامات على الأجسام المضادة والأغشية لهذه التجربة المستوى العالي من البيانات الكمية التي يمكن الحصول عليها في إطار زمني صغير من خلال تحليل nFCM. يؤدي القياس المتزامن للسمات الفيزيائية الرئيسية لقطر/تركيز الجسيمات مع قياسات النمط الظاهري لوجود الغشاء و/أو البروتين إلى أوصاف عالية المستوى للمجموعات الفرعية داخل عزل الجسيمات.

الأهم من ذلك ، تم تحديد مستويات متفاوتة من التتراسبانين الثلاثة "الرئيسية" المتعلقة بالمركبات الكهربائية ، CD9 ، CD63 ، CD81 ، في هاتين العينتين EV. تم تقديم CD9 على أكبر نسبة من EVs لكل من EVs المشتقة من C2C12 و SW620 ، مع كون CD81 و CD63 ثاني البروتينات وأقلها عرضا ، على التوالي.

على الرغم من بعض أوجه التشابه التي لوحظت هنا في ملفات تعريف tetraspanin للمركبات الكهربائية من مصدرين خلويين مختلفين للغاية ، إلا أن مستويات CD9 و CD63 و CD81 يمكن أن تكون مختلفة جدا بين خط الخلية و EVs31 المشتقة من المريض.

إن الاختلاف في تعبير CD63 بين عينتي EV له أهمية خاصة في المناقشة الجارية حول المعرفات الرئيسية ل "EV-ness". في حين أن عرض CD63 في ~ 8٪ فقط من EVs SW620 قد يكون غير متوقع من قبل البعض ، فقد اقترح CD63 كمعرف ضعيف للأنواع المختلفة من EVs المعزولة حسب الحجم أو الكثافة32 ، وتم تحديد EVs السالبة tetraspanin ، حتى عندما وصفت بأنهاتشبه exosome-like 33.

تحديد المركبات الكهربائية داخل عزلات الجسيمات المعقدة
إن عدم تجانس ملامح رباعي سبانين EV ، في كل من خط الخلايا والمركبات الكهربائية المشتقة من المريض ، يحذر من الاعتماد على التقاط EVs القائم على tetraspanin ويسلط الضوء على الحاجة المستقبلية إلى طرق جديدة لتحديد EV31. يمكن أن يثبت وضع العلامات على EV بشكل مستقل عن بروتينات محددة أنه مفيد للغاية لتحديد EVs من جزيئات غير EV مماثلة الحجم إذا كان من الممكن إثبات أن خصوصية EV عالية جدا. وينطبق هذا بشكل خاص على عزلات المركبات الكهربائية للسوائل الحيوية حيث اقترح أن تركيز المركبات الكهربائية في بلازما الدم البشرية يتراوح بين 1010 جسيمات / مل بينما يتم قياس البروتينات الدهنية عند 1016 لكل مل14,34. حتى عند إثراء EV ، تشير الدراسات التي تقارن إيجابية الجسيمات لعلامات tetraspanin و / أو علامة LDL ApoB إلى وفرة أكبر من LDL بنسبة 50-100x في عينات البلازما الخالية من الصفائح الدموية (PFP) مقارنة ب EV35.

تؤثر تقنية العزل المستخدمة بشكل كبير على نطاق الجسيمات غير EV المعزولة بشكل مشترك مثل البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (VLDL) والبروتينات الدهنية متوسطة الكثافة (IDL) و LDL36. هناك أيضا أوصاف للبروتين الدهني المشترك المعزول المرتبط بالمركبات الكهربائية والتي ، في حين يحتمل أن تلعب دورا بيولوجيا مهما ، تجعل تحقيق عينات EV النقية هدفا صعبا35.

لذلك ، يمكن القول إنه يجب التركيز بشكل أكبر على وصف الجسيمات التي تشكل عينة ، بدلا من تحقيق عزل مجموعة نقية ولكن محدودة من المركبات الكهربائية. إن تحقيق وصف شامل للجسيمات عن طريق قياس وفرة رباعي الأسبان في أعداد السائبة والجسيمات بشكل منفصل يمكن أن يكون غير كاف لتحديد تركيزات EV بدقة ، خاصة من مصادر الموائع الحيوية36,37. إن تحديد المجموعات الفرعية في نهج قائم على الطبقات ، يظهر إجمالي الجسيمات ، والمركبات الكهربائية ، والمركبات الكهربائية التي تقدم بروتينات معينة ، كما هو موضح في هذه التجربة قد يوفر حلا قويا لتوصيف الجسيمات النانوية. كان هذا هو الحال بالنسبة للمشاريع التي تنطوي على تحميل EV مع تصاميم للتطبيقات العلاجية المستقبلية20 وتحديد CD63 + EVs مع البضائع المضيئة مثل الميتوكوندريا38.

nFCM ضمن ذخيرة تحليلات EV
تتمثل إحدى نقاط قوة تحليل nFCM EV في الطريقة التي يمكن للبيانات من خلالها تأكيد تحليلات EV الأكثر شيوعا والبناء عليها وتشكيل جسور بين مجموعات البيانات المادية والمظهرية. ومع ذلك ، يعتمد هذا على بروتوكولات وضع العلامات الدقيقة التي غالبا ما تحتاج إلى تحسينها لكواشف وضع العلامات الفريدة مثل الأصباغ والأجسام المضادة. أحد المعايير الرئيسية للتحليل الدقيق هو وضع علامات على الجسيمات المعلقة في مخزن مؤقت غير فلوري ، والذي يعتمد إما على إزالة الفلوروفور الزائد غير المرتبط أو تحسين البروتوكولات بحيث لا تتجاوز تشبع الظهارة.

أظهرت دراسات المقارنة أن حجم nFCM للمركبات الكهربائية يوفر بيانات تتماشى مع TRPS و cryo-TEM ، وهي تقنيات توصف بأنها أكثر دقة من NTA لتحليل حجم EV10,39. ومع ذلك، وكما هو الحال مع أي طريقة قائمة على البصريات، يجب الاعتراف بتأثير الخصائص البصرية غير المتجانسة التي شوهدت للمركبات الكهربائية والاختلافات بين الخصائص البصرية للمواد المرجعية والمركبات الكهربائية عند تفسير البيانات10.

كان النشاف الغربي طريقة رئيسية للإشارة إلى إثراء EV من خلال تحديد علامات EV40. لكن الرغبة في إثبات وجود مثل هذه العلامات على الجسيمات دفعت إلى التقدم في التحليلات الخلوية للتدفق القائم على EV17. ومع ذلك ، فإن أفضل طريقة حاليا هي الحصول على القرارات اللازمة لتوفير بيانات قوية من خلال أجهزة مخصصة فيما يتعلق بكل من الضوء المتناثر والفلورسنت19.

يوفر nFCM نهجا غير متحيز لوصف جميع الجسيمات غير ذات الصلة بعلامات محددة في البداية ، باستخدام قياس التشتت الجانبي ، مما يسمح بالتأييد مع التقنيات الأكثر شيوعا ل NTA و RPS و TEM1 ، مع إضافة قياس النمط الظاهري في نفس الوقت على غرار WB أو Elisa بطريقة كمية.

Disclosures

A.L.، B.P.، D.A.، R.L، R.T هم موظفون في NanoFCM وتم تقديم مساهماتهم في هذه الورقة كجزء من عملهم.

Acknowledgments

نود أن نشكر مجموعات أوين ديفيز بيك على الاستمرار في تقديم المواد والخبرات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC Anti-CD81 antibody (M38) abcam ab233259 Anti-Human CD81 APC
conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (EM-04) Abcam ab82392 Anti-mouse CD9 APC
conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted abcam ab82389 Anti-Human CD9 APC
conjugated antibody
APC anti-mouse CD63 antibody biolegend 143905 Anti-Mouse CD63 APC
conjugated antibody
APC anti-mouse/rat CD81 antibody biolegend 104909 Anti-Mouse CD81 APC
conjugated antibody
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC invitrogen Via Fisherscientific A15712 Anti-Human CD63 APC
conjugated antibody
Celline AD1000 bioreactor Merck Z688037-5EA
Cleaning solution NanoFCM 17159 In house cleaning solution for nanoanalyser
EVs from C2C12 Gifted Mouse line
EVs from SW620 Gifted Human line
Memglow - Fluorogenic Membrane Probe Cytoskeleton MG01 non toxic cell membrane dye
NanoAnalyzer NanoFCM nano-flow cytometer for measurement of single particles
PBS, pH 7.2 Gibco Via Fisherscientific 12549079 Salt solution for dilution of samples and antibodies
Snaplock Microtubes, 0.60mL Axygen Via Fisherscientific 11371944 Tubes required to load sample into nanoanalyser

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couch, Y., et al. A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (14), 12144 (2021).
  2. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
  3. Grant, L. R., Milic, I., Devitt, A. Apoptotic cell-derived extracellular vesicles: structure-function relationships. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 509-516 (2019).
  4. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2, 325 (2019).
  5. Sahoo, S., et al. Therapeutic and diagnostic translation of extracellular vesicles in cardiovascular diseases. Circulation. 143 (14), 1426-1449 (2021).
  6. Chiang, C. -Y., Chen, C. Toward characterizing extracellular vesicles at a single-particle level. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 9 (2019).
  7. Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLOS ONE. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  10. Vogel, R., et al. Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12052 (2021).
  11. Van Der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
  12. Hartjes, T. A., Mytnyk, S., Jenster, G. W., Van Steijn, V., Van Royen, M. E. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
  13. Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs). Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids. 2, 80-103 (2021).
  14. Johnsen, K. B., Gudbergsson, J. M., Andresen, T. L., Simonsen, J. B. What is the blood concentration of extracellular vesicles? Implications for the use of extracellular vesicles as blood-borne biomarkers of cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1871 (1), 109-116 (2019).
  15. Zhu, S., et al. Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles. ACS Nano. 8 (10), 10998-11006 (2014).
  16. Van Der Pol, E., et al. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).
  17. Lucchetti, D., et al. Measuring extracellular vesicles by conventional flow cytometry: dream or reality. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6257 (2020).
  18. Suárez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
  19. Tian, Y., et al. Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry. ACS Nano. 12 (1), 671-680 (2018).
  20. Silva, A. M., et al. Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (10), 12130 (2021).
  21. Dragovic, R. A., Southcombe, J. H., Tannetta, D. S., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Multicolor flow cytometry and nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles in the plasma of normal pregnant and pre-eclamptic women. Biology of Reproduction. 89 (6), 151 (2013).
  22. Teng, F., Fussenegger, M. Shedding light on extracellular vesicle biogenesis and bioengineering. Advanced Science. 8 (1), 2003505 (2021).
  23. Laulagnier, K., et al. Mast cell- and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization. Biochemical Journal. 380, 161-171 (2004).
  24. Simonsen, J. B. Pitfalls associated with lipophilic fluorophore staining of extracellular vesicles for uptake studies. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1582237 (2019).
  25. Collot, M., et al. MemBright: A family of fluorescent membrane probes for advanced cellular imaging and neuroscience. Cell Chemical Biology. 26 (4), 600-614 (2019).
  26. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
  27. Tian, Y., et al. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1697028 (2020).
  28. Mondal, A., Ashiq, K. A., Phulpagar, P., Singh, D. K., Shiras, A. Effective visualization and easy tracking of extracellular vesicles in glioma cells. Biological Procedures Online. 21, 4 (2019).
  29. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
  30. Jayachandran, M., Miller, V. M., Heit, J. A., Owen, W. G. Methodology for isolation, identification and characterization of microvesicles in peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 375 (1-2), 207-214 (2012).
  31. Mizenko, R. R., et al. Tetraspanins are unevenly distributed across single extracellular vesicles and bias sensitivity to multiplexed cancer biomarkers. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 250 (2021).
  32. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  33. Laulagnier, K., et al. Amyloid precursor protein products concentrate in a subset of exosomes specifically endocytosed by neurons. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (4), 757-773 (2018).
  34. Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
  35. Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
  36. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Scientific Reports. 10 (1), 103 (2020).
  37. Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. -A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27269 (2015).
  38. Peruzzotti-Jametti, L., et al. Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles. PLOS Biology. 19 (4), 3001166 (2021).
  39. Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
  40. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).

Tags

علم الأحياء، العدد 185، الحويصلات خارج الخلية، الجسيمات النانوية، قياس التدفق الخلوي النانوي، التتراسبانين، وضع العلامات الغشائية، تحليل السكان الفرعيين، الإكسوسومات
توصيف البروتين عبر الغشاء الحويصلة خارج الخلية بواسطة قياس التدفق الخلوي النانوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lees, R., Tempest, R., Law, A.,… More

Lees, R., Tempest, R., Law, A., Aubert, D., Davies, O. G., Williams, S., Peake, N., Peacock, B. Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (185), e64020, doi:10.3791/64020 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter