Summary
Den nyeste generation af EV-karakteriseringsværktøjer er i stand til enkelt EV-analyse på tværs af flere parametre samtidigt. Nano-flowcytometri måler alle biologiske partikler, der er større end 45 nm uden mærkning, og identificerer specifikke egenskaber ved subpopulationer ved hjælp af en række fluorescerende mærkningsteknikker.
Abstract
Karakterisering af enkeltpartikler er blevet mere og mere relevant for forskning i ekstracellulære vesikler og udvikler sig fra bulkanalyseteknikker og første generations partikelanalyse til omfattende multiparametermålinger såsom nanoflowcytometri (nFCM). nFCM er en form for flowcytometri, der anvender instrumentering specielt designet til nanopartikelanalyse, hvilket gør det muligt at karakterisere tusindvis af elbiler i minuttet både med og uden brug af farvningsteknikker. Påvisning af sidespredning i høj opløsning (SS) gør det muligt at bestemme størrelse og koncentration for alle biologiske partikler, der er større end 45 nm, mens samtidig fluorescens (FL) detektion identificerer tilstedeværelsen af mærkede markører og mål af interesse. Mærkede subpopulationer kan derefter beskrives i kvantitative enheder af partikler / ml eller som en procentdel af de samlede partikler identificeret ved sidespredning.
Her er elbiler afledt af konditionerede cellekulturmedier (CCM) mærket med både et lipidfarvestof for at identificere partikler med en membran og antistoffer, der er specifikke for CD9, CD63 og CD81 som almindelige EV-markører. Målinger af sammenligningsmateriale, en koncentrationsstandard og en størrelsesstandard for silica nanosfærer samt mærket prøvemateriale analyseres i en 1-minuts analyse. Softwaren bruges derefter til at måle koncentrationen og størrelsesfordelingsprofilen for alle partikler, uafhængigt af mærkning, inden man bestemmer de partikler, der er positive for hver af etiketterne.
Samtidig SS- og FL-detektion kan bruges fleksibelt med mange forskellige EV-kilder og mærkningsmål, både eksterne og interne, der beskriver EV-prøver på en omfattende og kvantitativ måde.
Introduction
Hvad er elbiler?
Ekstracellulære vesikler (EV'er) er den samlede betegnelse for en række celleafledte membranøse partikler, der er integreret i mange normale cellulære og vævsaktiviteter. Deres indvirkning på en lang række videnskabelige områder og deres potentielle kliniske relevans har drevet en vækst i ev-forskning og industriel interesse1. Small EV (sEV) forskning fokuserer primært på exosomer, 40-100 nm partikler, der begynder dannelse i de tidlige endosomer før modning og frigivelse gennem fusion af multi-vesikulære legemer (MVB) til plasmamembranen samt mikrovesikler, som springer direkte fra plasmamembranen, der danner 80-1.000 nm partikler2. En tredje EV-population er apoptotiske kroppe, 50-1.500 nm partikler dannet under celledød, hvilket betyder, at deres relative andel til andre elbiler kan være meget variabel3.
Da EV-egenskaber kan repræsentere ændringer, der forekommer i deres celle / væv af oprindelse, er der potentiale for deres anvendelse i diagnostik. Forskellige 'omics' analyser er begyndt at identificere markører for celleoprindelse og sygdomstilstand, hvilket kan muliggøre ikke-invasiv vurdering af patienter ved hjælp af EV-kilder såsom blodplasma / serum, urin, spyt og cerebral spinalvæske (CSF) 4,5. En drivkraft bag disse EV-relaterede innovationer er nye karakteriseringsteknikker, der overvinder tidligere begrænsninger.
Behovet for og udfordringerne ved karakterisering af enkelt-elbiler
Enkelt EV-karakterisering bliver stadig vigtigere for både validering og beskrivelse af EV-isolater samt belysning af nøglefunktioner i disse nanopartikler til progression af EV-baserede terapier og diagnostik6. Afhængigt af EV-kilden og den tilsigtede anvendelse kan analyse af renhed, ofte beskrevet som et forhold mellem EV og ikke-EV-partikler eller som EV til frit protein, kræve betydelige mængder data fra flere analyser7.
Partikeltælling og dimensioneringsmålinger i EV-publikationer har tidligere været stærkt afhængige af Nanopartikelsporing (NTA), resistiv pulsmåling (RPS) og elektronmikroskopi (EM)2. Standard NTA og RPS mangler evnen til at skelne elbiler fra ikke-EV-partikler og har deres egne forbehold såsom langsom gennemstrømning8 og uegnet nedre detektionsgrænse set med NTA 9,10,11.
Tetraspaninerne CD9, CD63 og CD81 har historisk set været vigtige identifikatorer for tilstedeværelsen af elbiler i ev-isolationer/præparater. Almindeligvis bruges western blotting (WB) og dot blotting teknikker til at vise berigelsen af disse proteiner i EV-isolater sammenlignet med cellelysat12. Manglen på kvantificering af disse metoder og heterogeniteten af disse EV-markører, hvad angår både visning inden for EV-subpopulationer og celle-, vævs- eller patientrelateret variation, tilskynder imidlertid til avancerede analytiske teknikker, der forener fysisk og fænotypisk karakterisering13.
Nano-flowcytometri som en omfattende EV-analyseteknik
Bestemmelse af ægte EV-koncentrationer kræver identifikation af intakte partikler og en universel markør, især i komplekse partikelisolater, med opløsning, der er i stand til at detektere alle elbiler, samtidig med at de adskiller dem fra ikke-EV-partikler14.
Nano-flowcytometri (nFCM) er en teknik, der tillader umærket analyse af partikler på størrelse mellem 45-1.000 nm, samtidig med at fluorescerende mærkning og detektion anvendes til at identificere partikelunderpopulationer. En vigtig forskel fra konventionel flowcytometri er brugen af udstyr dedikeret til nanopartikelanalyse, hvilket giver mulighed for den største opløsning15. EV-analyse, der bruger konventionel flowinstrumentering, der er genbrugt til analyse af små partikler, forbedres, men kæmper stadig for at opnå opløsningen til at detektere og analysere <100 nm EVs16,17. Perlebaseret flowcytometri er en yderligere tilpasning, der ofte anvendes til EV-analyse, men dette fjerner muligheden for detektion af enkeltpartikler og introducerer indfangningsbaserede bias18.
Ved at drage fordel af en nedre detektionsgrænse på ~ 45 nm i sidespredningskanalen (SS) til EV-analyse bruger nFCM SS-udløsning. Dette kan betragtes som 'partikel først' analyse, da det betyder, at begivenheder skal give et SS-signal, der overskrider en fastsat tærskel før analyse af fluorescensintensiteten. Dette fjerner falske positiver såsom nedbrudte membran- og fluorophoraggregeringer og fokuserer analysen på intakte elbiler15. SS-målinger bruges også til at dimensionere individuelle partikler sammenlignet med en firemodal silica nanosfære standard19. Fluorescensmålingerne foretages på yderligere to detektorer, der gør det muligt at foretage tre samtidige målinger for hver partikel for at beskrive partikelkoncentration, størrelser og tilstedeværelse af markører eller andre mål af interesse for at identificere EV-underpopulationer20.
I det følgende eksperiment bruges SS- og fluorescerende (FL) målinger til at måle >45 nm partikler, vise delmængden af membranpositive elbiler og identificere CD9, CD63, CD81 præsentation på EV-underpopulationer. Både koncentrationen af disse subpopulationer og deres forhold som en del af de samlede partikler målt af SS er beskrevet, ligesom deres størrelsesprofiler.
Protocol
1. Opsætning af nFCM-instrumentet og målinger af nFCM-standarderne
BEMÆRK: Der foretages tre målinger, før dataindsamlingen påbegyndes for prøver for at validere korrekt justering af nFCM-instrumentet og give en stærk sammenligning mellem instrumenterne. Disse er koncentrationsstandarden / kvalitetskontrol (QC), størrelsesstandarden og et tomt.
- Fortynd QC-perlerne 1:100 i destilleret vand i et passende 0,6 μL rør og anbring dem i læsserampen.
- Fra rullemenuen Prøveflow skal du vælge Boost for at introducere QC-prøven i systemet i 45 sekunder for helt at erstatte den forrige prøve-/rengøringsløsning.
- Mens du øger, skal du indstille lasereffekten til den forudindstillede skabelon til QC-perler "250 nm FL QC-standard", f.eks. 10/40 mW for den blå laser, 20/50 mW for den røde laser, med 0,2% SS-henfald.
- Vælg prøveudtagningstrykket i den samme ned-menu for at reducere systemtrykket.
- Indstil det automatiske prøveudtagningstryk til 1,0 kPa for at opretholde et konstant tryk.
- Start analysen på 1 minut ved at vælge Tid til registrering fra anskaffelseskontrolelementerne. Data afbildes på prikplottet, der viser en logskala for SS-intensitet og en valgt FL-intensitet.
- Indsæt filnavnet og eksempelfortyndingen, før du gemmer filen.
- Vælg aflæs for at fjerne røret fra læsserampen. Udskift med 150 μL rengøringsopløsning, og rengør i >30 sek. ved at vælge Boosting , før du fjerner rengøringsopløsningen, ved at vælge Aflæs.
- Fjern overskydende rengøringsopløsning fra kapillærspidsen ved hjælp af et rør indeholdende 150 μL vand.
- Fortynd størrelsesstandardperlerne 1:100 i vand og læg 100 μL i læsserampen, inden prøven boostes i 45 s.
- Indstil lasereffekten til den forudindstillede skabelon "S16 exo 68-155 nm". Denne indstilling gælder både for størrelsesstandarden og prøver, der indeholder elbiler < 200 nm. For eksempel 15/40 mW for den blå laser, 20/50 mW for den røde laser, med 0,2% SS-henfald.
- Vælg Prøveudtagning , og fortsæt med at optage prøven i 1 minut som før.
- Udfør den tredje måling med enten en vand- eller PBS-prøve for at oprette en tom måling af din eluent, der identificerer falske positiver til fjernelse af softwaren. Indtastning af standardmålingerne er beskrevet i det følgende afsnit.
2. Bestemmelse af partikelkoncentrationen af en umærket prøve og generering af en PDF-rapport
- Den umærkede EV-prøve fortyndes i PBS til et passende partikelkoncentrationsområde til nFCM-analyse, 1 x 10 8- 5 x 108 partikler/ml. 10-100 μL af den fortyndede prøve lægges i læsserampen.
- Når partikelkoncentrationen er ukendt, skal du begynde med en 1:100 fortynding af EV-prøven. Prøvekoncentrationen kan hurtigt tilnærmes ved størrelsen af laserpletten på CCD-kameraet under boost eller ved observation af Event Burst Trace under prøveudtagning.
- Boost den indlæste prøve i 45 sekunder, før du vælger Prøveudtagning , og optag i 1 min, og gem som tidligere beskrevet.
- Hvis du vil begynde at analysere disse data, skal du skifte fra fanen Anskaffelse til fanen Analyse . Åbn de gemte nfa-filer.
- For at muliggøre nøjagtig prøvemåling skal du bruge de to standardmålinger, der er foretaget før prøvemåling, til at indstille værdier til sammenligning af prøver samt blindprøven.
- Opret størrelsesstandardkurven for SS til diameterkonvertering ved først at vælge størrelsesstandardfilen og bruge det indstillede tærskelværktøj (også kendt som automatisk tærskel). Tærsklen, der er synlig i tilfælde af sprængspor, identificerer den mindste signalintensitet, der kræves for at en hændelse kan betragtes som signifikant.
- Med tærskelsættet skal du kontrollere, at prikplottet x og y-parametrene er SS-H eller SS-A på x-aksen og FITC-A på y-aksen.
- Åbn standardkurvegenereringsværktøjet, og vælg S16 exo 68-155 nm som størrelsesskabelon . Klik på Find toppe for at identificere de maksimale SS-intensiteter som enten en partikel med en diameter på 68, 91, 113 eller 155 nm.
- Kontroller, om SS til diameterkurven er genereret med en r-værdi tæt på 1, før du lukker vinduet.
- Indstil koncentrationsstandarden ved at vælge den gemte fil og klikke på Tæl STD. Indtast partikelkoncentrationen af standarden.
- Når du har indstillet standardoplysningerne, skal du vælge EV-prøvefilen og indstille tærsklen.
- Vælg den tomme fil, og klik på Indstil tomt for at identificere antallet af falske positiver, der skal fjernes fra prøvetællingen. Dette skal gøres med samme tærskel som din prøve. Gå tilbage til EV-eksempelfilen.
- Åbn PDF-genereringsværktøjet, og vælg Størrelse og koncentration. Indtast fortyndingerne af prøven. Koncentrationen af prøven og størrelsesfordelingen af partiklerne vises.
3. Prøvemærkning
BEMÆRK: To farvningsstrategier kan bruges samtidigt til en omfattende analyse af partiklerne i suspension. Mærkningsprotokoller kræver ofte optimering for nye antistoffer eller prøvekilder.
- En del af EV-prøven fortyndes til en koncentration på 1,25 x 1010 partikler/ml i PBS. 8 μL af den fortyndede EV-prøve inkuberes med 1 μL antistof og 1 μL farvestof til en partikelkoncentration på 1 x 10 10 partikler/ml (partikler i alt vil være 1 x 108 suspenderet i10 μL). Inkubationsforholdet for antistoffet er 1:50 (1 μL af 1:5 antistof) i dette tilfælde.
- Brug mere end tre forskellige koncentrationer af antistof eller farvestof under optimering for at tilvejebringe data, der indikerer, at protokollen giver mulighed for maksimal epitopbinding uden overmætning af den valgte etiket, hvilket kan forringe identifikationen af fluorescenshændelser med lav intensitet. Inkubationskoncentrationen for membranfarvestoffet er 40 nM (1 μL af 400 nM).
- 10 μL-prøven blandes ved hvirveldannelse i 5 s og inkuberes ved RT i 30 minutter i mørke.
BEMÆRK: Anbefalinger til kontroller er inkluderet i diskussionen. - Efter inkubation udtages 1 μL af den mærkede prøve, og 1:50 fortyndes i PBS i et 0,6 ml rør.
- Prøven lægges i læsserampen, og der påføres trykforøgning i 45 s. Sørg for, at laserindstillingerne er korrekte, og at de relevante linser er indlæst.
- Skift til prøveudtagningstryk, og vælg Tid til optagelse. Efter 1 minutters erhvervelse skal du navngive datafilen og gemme.
- Aflæs prøven og udskift med rengøringsopløsning. Øg dette i >30 sekunder, før du indlæser den næste mærkede prøve.
4. nFCM-analyse-PDF-generering til subpopulationsanalyse
- For PDF-generering skal du anvende de samme standarder som tidligere gjort; kun den tomme måling indstilles anderledes.
- Vælg eksempelfilen, og indstil tærsklen. På prikplottet skal du ændre y-aksen for at vise FL-målinger fra den grønne eller røde kanal.
- Vælg kvadratgeringsværktøjet, og brug venstreklik til at tegne en firkant omkring FL+ populationen.
- Åbn den tomme målefil, og klik på Indstil tom, før du vender tilbage til eksempelfilen.
- Åbn PDF-genereringsværktøjet som før, og størrelsesfordelingen, koncentrationen og procentdelen (sammenlignet med alle SS+-hændelser) identificeres for FL+-underpopulationen.
- Gentag for hver delpopulation af interesse identificeret som "Total, P1, P2 osv."
Representative Results
Tetraspaninpræsentation om SW620-afledte elbiler og C2C12-afledte elbiler
Moderne analyse af overfloden af vigtige tetraspaniner CD9, CD63 og CD81 på elbiler fra en række kilder har fremhævet den ekstreme variation i deres tilstedeværelse, både i bulkanalyser og ved analyse af deres præsentation af EV-subpopulationer21. Dette er sandsynligvis relateret til tilgængeligheden af forskellige biogeneseveje såsom de ESCRT-afhængige og uafhængige veje22.
CD9 blev præsenteret på den største procentdel af C2C12 elbiler på ~ 50%, med CD63 præsentation på kun ~ 30%, i figur 1. Når mærkning blev udført med alle tre anti-tetraspaniner i en inkubation, blev ~ 70% af partiklerne vist at præsentere mindst en af EV-markørerne. Gentagne målinger viste laveste standardafvigelse for CD9/63/81-mærkning af C2C12-elbiler på ~ 3,8%, mens dette var ~ 8,1% for CD81-mærkede C2C12-elbiler.
SW620-afledte elbiler viste en anden tetraspaninprofil med en meget større forskel mellem den mest præsenterede CD9 på ~ 40% og den mindst præsenterede CD63 på ~ 7%. I lighed med C2C12-elbilerne var CD9 til stede på størstedelen af den tetraspaninpositive population, da CD9/63/81 kombineret mærkning identificerede ~ 42% af partiklerne som havende mindst en af de tre markører.
Størstedelen af C2C12-afledte partikler, den samlede SS + -population, varierede i størrelse fra 45-120 nm med en median ~ 65 nm diameter. Størrelsesprofilerne for hver af de enkelte tetraspaninmærkede EV-subpopulationer, vist i figur 1, ligner hinanden og viser en større medianstørrelse på ~ 75-85 nm og færre <65 nm elbiler sammenlignet med den samlede partikelpopulation.
SW620-afledte partikler varierede mellem 45-160 nm med en medianstørrelse på ~ 65 nm, hvilket viser en skæv fordeling. De tetraspaninmærkede elbiler viser en mere normal fordeling og større mediandiameter mellem 90-110 nm, med lignende fordelinger mellem individuelle tetraspaninpositive subpopulationer.
Mens de mest og mindst præsenterede tetraspaniner er de samme for disse to cellelinjer, adskiller deres proportionale repræsentation sig meget, og der er en interessant forskel mellem den potentielle co-præsentation af tetraspaniner, der kan observeres fra forskellen i CD9-positivitet og CD9/63/81-positiviteten.
Kombination af EV-membranmærkning med antistofmærkning
Dobbeltlagsmembranen i elbiler giver et mere generisk mærkningsmål, som kan tillade sondring fra lignende størrelse ikke-EV-partikler såsom proteinaggregater og nogle former for LDL med lipidmonolag23. Specificiteten af denne type mærkning skal valideres, da nogle almindelige membranfarvestoffer, der anvendes i EV-forskning, har vist sig at binde sig til ikke-EV-partikler også24.
Membranmærkning viste gentagne gange ~ 80% positivitet af C2C12-afledte elbiler og SW620-elbiler. SS-intensiteten (SS-H) viser god korrelation med FITC-intensiteten på prikdiagrammerne for både C2C12- og SW620-resultaterne vist i figur 2. Dette forventes, da SS-intensiteten er i forhold til partikelstørrelsen og dermed membranens overfladeareal.
Størstedelen af antistofmærkede elbiler var også positive for membranmærkningen, der viste dobbelt positive procentdele (FITC + & APC +), der meget ligner tetraspanin-positive procenter. FITC vs APC dot plots viser lille korrelation mellem membran og tetraspanin mærkning med CD63 mærkning synes at vise den svageste korrelation til membran mærkning. Der blev kun påvist få hændelser, der var positive for antistofmærkning, men negative for membranmærkning.
Reproducerbarhed, dobbelt mærkningseffektivitet og alternative dataoutput
En vigtig overvejelse ved design af nFCM-eksperimenter er fluorophore eller etiketinteraktivitet. Figur 3a viser, at gentagelse af antistofmærkningen med og uden yderligere membranmærkning fører til meget ens % positivitetsmålinger. Især SW620-mærkningen viser meget lidt variation mellem de to målesæt. Dette viser begrænset interferens mellem farvestoffet og antistofbindingen og fremhæver også god reproducerbarhed, når du gentager EV-mærkning.
Intensitetsmålinger, både sidespredning og fluorescens, kan eksporteres til excel for hver enkelt partikel, der måles. Ud fra dette kan vi generere målinger af gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) for at give sammenlignende tilnærmelser af overfloden af vores mærkede mål. MFI for de fluorescerende populationer af C2C12-afledte elbiler tyder på lidt lavere præsentation af CD63 og CD81 med MFI-målinger på henholdsvis ~ 550 og ~ 600 sammenlignet med ~ 850 MFI set for CD9 + EV'er. Måleenhederne for MFI er i dette tilfælde FL-A og er ikke standardiseret mod en fluorescerende kalibrering. Brugen af alle tre antistoffer fremkalder ikke en meget større fluorescens end blot CD9-mærkning. Dette er meget forskelligt fra SW620 MFI-målingerne, som tyder på, at brug af en cocktail af alle tre antistoffer giver et større fluorescenssignal for mærkede elbiler end brugen af et individuelt antistofmærke.
Størrelsesfordelingshistogrammerne produceret af NanoFCM-softwaren kan også eksporteres til excel, hvilket gør det muligt at overlejre tredobbelte datasæt. Størrelsesfordelingsprofilerne i figur 3 svarer til profilerne i figur 1 , men indeholder fejllinjer. Median EV-størrelse af de tetraspaninpositive subpopulationer i C2C12-afledte elbiler viser en median omkring 70 nm, lidt større end gennemsnittet på 60 nm af de samlede partikelpopulationer. SW620 elbiler positive for tetraspanin markører er større, viser toppe ved ~ 100 nm.
Figur 1: CD9, CD63, CD81 positive EV-subpopulationer identificeret ved antistofmærkning . (A) Søjlediagram, der viser procentdelen af mærkede elbiler sammenlignet med de samlede partikler observeret af SS for C2C12-afledte elbiler. (B) Søjlediagram, der viser procentdelen af mærkede elbiler sammenlignet med de samlede partikler observeret af SS for SW620-afledte elbiler. (C) Repræsentative størrelsesfordelingsprofiler for C2C12-afledte elbiler. Hvert histogram er taget fra de PDF-filer, der genereres til den første måling af tredobbelte datasæt. D) Repræsentative størrelsesfordelingsprofiler for SW620-afledte elektriske køretøjer. Hvert histogram er taget fra de PDF-filer, der genereres til den første måling af tredobbelte datasæt. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse for tredobbelte målinger af de samme mærkede prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Membranmærkning og antistofmærkning af CD9, CD63, CD81, der præsenterer EV-subpopulationer . (A) Søjlediagram, der viser membran+ %, tetraspanin+ % og dobbelt+ % for C2C12-elbiler. (B) Søjlediagram, der viser membran+ %, tetraspanin + % og dobbelt + % for SW620 elbiler. (C) Repræsentative SS vs FITC dot plots, der viser gating for membran positiv population. (D) Repræsentative FITC vs APC dot plots, der viser gating for dobbelt positiv population af elbiler fra C2C12. (E) Repræsentative FITC vs APC dot plots, der viser gating for dobbelt positiv population af elbiler fra SW620. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse for tredobbelte målinger af de samme mærkede prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vurdering af variation i gentagne målinger . (A) Søjlediagrammer, der viser antistofmærkning % positivitet med og uden yderligere membranmærkning. (B) Gennemsnitlige fluorescensintensitetsmålinger for lukkede EV-delmængder. (C) Gennemsnitlige størrelsesfordelingshistogrammer for tredobbelte datasæt for C2C12-elbiler. D) Histogrammer med gennemsnitlig størrelsesfordeling for tredobbelte datasæt for SW620-elbiler. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse for tredobbelte målinger af de samme mærkede prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Oplysninger om prøve og reagens
To EV-isolater fra separate cellelinjer blev udvalgt til demonstration af fluorescerende mærkning og efterfølgende nFCM-analyse. Begge EV-sæt blev suspenderet i PBS og opbevaret ved -80 °C i <3 måneder, men de fleste andre forhold var forskellige mellem isolater. C2C12 musens myoblastcellelinje repræsenterer en embryonal forløber for skeletmuskelceller og blev dyrket i 2D-kultur, der konditionerede vækstmediet over 72 timer før EV-isolering ved ultracentrifugering. SW620 er en human kolon adenocarcinom cellelinje og blev dyrket i en rudimentær bioreaktor, berigende medier over 7 uger, med EV-isolering udført ved størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og fraktioner 7-9 elueret fra sepharose CL-2B kolonner kombineret til en enkelt prøve.
Mens elbiler isoleret og koncentreret fra CCM er de nemmeste prøvetyper at arbejde med, er nFCM anvendelig for de fleste EV-isolater, herunder biofluider som serum, plasma, urin og CSF. Disse prøveanalyser drager fordel af nFCM SS-detektion af alle partikler, hvilket giver mulighed for bekræftelse med NTA, TRPS og andre partikelanalyser, samtidig med at de fluorescerende mærkede EV-subpopulationer beskrives kvantitativt såvel som en andel af det samlede antal for en upartisk tilgang til multiparameterpartikelanalyse. Analyse af lavt forarbejdede prøver er også mulig, såsom uafklaret urin og EV-beriget CCM med det forbehold, at der kræves protein med lavt forurenende stof.
Membranfarvestoffet, der anvendes her, er beregnet til at integrere i lipiddobbeltlaget med en lipofil del til membranbelastning og et hydrofilt farvestof til at forblive i plasmamembranen25. Der er i øjeblikket ikke noget perfekt EV-mærkningsfarvestof, og flere kriterier skal overvejes, når du vælger, herunder specificitet til elbiler, egnethed med fiksering eller permeabilisering og effektivitet af EV-mærkning26.
Fluorescerende konjugeret antistofmærkning af overfladeeksponerede epitoper har vist sig at være en effektiv metode til identifikation af EV-subpopulationer27. Et centralt aspekt af protokoloptimering er at møde og ikke overskride mærkningsmætningspunktet for at binde til alle tilgængelige epitoper uden at hæmme påvisning af partikler med lav fluorescens ved at lade den omgivende buffer fyldes med fluorescerende ubundet antistof28. Derudover er tilgængeligheden af eksponerede bindingssteder til antistofmærkning potentielt påvirket af flere faktorer. Opbevaringsforhold for elbiler har vist sig at påvirke koncentrations- og størrelsesprofiler for elbiler29 med observationer, der også indikerer virkninger på antistofmærkning30. Tilstedeværelsen af overfladekoronaproteiner, proteinmodifikationer og virkninger af isolationsteknikker kan også have virkninger på antistofmærkning i nogle tilfælde. I sidste ende, efterhånden som brugen af fluorescerende mærkning bliver mere udbredt til EV-undersøgelser, vil eksperimentelt design og optimering til flere analytiske teknikker blive mere raffineret.
For at øge nøjagtigheden af resultaterne kan flere kontroller inkluderes, såsom (1) PBS + farvestofkontrol, for at vurdere micelle eller aggregeret dannelse i nogle farvestoffer, som kan forekomme som SS + partikler i nFCM-analyse, (2) PBS + antistofkontrol, aggregater kan forekomme, selvom de ofte ikke er store nok til at sprede nok lys til SS-detektion, (3) EV-prøve + IgG-antistofkontrol, almindelig i flowcytometri og bruges til at identificere enhver ikke-specifik binding, (4) ikke-EV-partikelprøve + antistof/ farvestofkontrol - især vigtigt, når man skal identificere EV'er i komplekse partikelprøver, kontroller såsom oprensede LDL-partikler (low-density lipoprotein) eller EV-udtømte / ablated prøver kan fungere som en negativ kontrol for at validere selektiv mærkning, (5) positive kontroller er svære at designe, men validering af et antistof på celler er en nyttig inklusion.
Præsentation af tetraspaniner på elbiler
Antistof- og membranmærkningen af dette eksperiment viser det høje niveau af kvantitative data, der kan opnås inden for en lille tidsramme ved nFCM-analyse. Samtidig måling af de vigtigste fysiske egenskaber ved partikeldiameter/koncentration med de fænotypiske målinger af membran- og/eller proteintilstedeværelse fører til beskrivelser på højt niveau af subpopulationer inden for partikelisolering.
Det er vigtigt, at forskellige niveauer af de tre 'nøgle' EV-relaterede tetraspaniner, CD9, CD63, CD81, blev identificeret i disse to EV-prøver. CD9 blev præsenteret på den største andel af elbiler til både C2C12-afledte elbiler og SW620, hvor CD81 og CD63 var henholdsvis det andet og mindst præsenterede protein.
På trods af nogle ligheder, der er observeret her i tetraspaninprofilerne for elbiler fra to meget forskellige cellekilder, kan niveauer af CD9, CD63 og CD81 være meget forskellige mellem cellelinje og patientafledte elbiler31.
Forskellen i CD63-ekspression mellem de to EV-prøver er særlig relevant for den igangværende diskussion af nøgleidentifikatorer for 'EV-ness'. Mens præsentation af CD63 i kun ~ 8% af SW620-elbilerne kan være uventet af nogle, er CD63 blevet foreslået som dårlig identifikator for de forskellige typer elbiler isoleret efter størrelse eller tæthed32, og tetraspaninnegative elbiler er blevet identificeret, selv når de beskrives som exosomlignende33.
Identifikation af elbiler inden for komplekse partikelisoleringer
Heterogeniteten af EV-tetraspaninprofiler, både i cellelinje- og patientafledte elbiler, advarer mod afhængighed af tetraspaninbaseret indfangning af elbiler og fremhæver det fremtidige behov for nye EV-identifikationsmetoder31. EV-mærkning uafhængig af specifikke proteiner kan vise sig at være yderst gavnlig for at identificere elbiler fra lignende størrelse ikke-EV-partikler, hvis EV-specificitet kan bevises at være meget høj. Dette gælder især for biofluid EV-isolater, da det er blevet foreslået, at koncentrationen af elektriske køretøjer i humant blodplasma ligger i området 10 10 partikler / ml, mens lipoproteiner måles ved10 16 pr. ml 14,34. Selv ved EV-berigelse antyder undersøgelser, der sammenligner partikelpositivitet for tetraspaninmarkører og / eller LDL-markør ApoB, ~ 50-100x større overflod af LDL i blodpladefri plasma (PFP) prøver sammenlignet med EV35.
Den anvendte isolationsteknik påvirker i høj grad rækkevidden af co-isolerede ikke-EV-partikler, såsom lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL), lipoproteiner med mellemdensitet (IDL) og LDL36. Der er også beskrivelser af lipoprotein-co-isolater bundet til elbiler, som, selvom de potentielt spiller en vigtig biologisk rolle, gør opnåelse af EV-rene prøver til et udfordrende mål35.
Derfor kan man argumentere for, at der lægges større vægt på beskrivelsen af partikler, der udgør en prøve, frem for at opnå isolering af et rent, men begrænset udvalg af elbiler. At opnå en omfattende beskrivelse af partikler ved at måle tetraspaninforekomsten i bulk- og partikeltællinger separat kan være utilstrækkeligt til nøjagtigt at bestemme EV-koncentrationer, især fra biofluidkilder36,37. Identifikation af subpopulationer i en niveaubaseret tilgang, der viser samlede partikler, EV'er og EV'er, der præsenterer visse proteiner, som demonstreret i dette eksperiment, kan give en robust løsning på nanopartikelkarakterisering. Dette har været tilfældet for projekter, der involverer EV-lastning med design til fremtidige terapeutiske anvendelser20 og identifikation af CD63+ elbiler med luminal last såsom mitokondrier38.
nFCM inden for repertoiret af EV-analyser
En styrke ved nFCM EV-analyse er den måde, hvorpå data kan bekræfte og bygge videre på de mest almindelige EV-analyser og danne broer mellem fysiske og fænotypiske datasæt. Dette er dog baseret på nøjagtige mærkningsprotokoller, som ofte skal optimeres til unikke mærkningsreagenser såsom farvestoffer og antistoffer. Et nøglekriterium for nøjagtig analyse er at have mærket partikler suspenderet i en ikke-fluorescerende buffer, som er afhængig af enten fjernelse af overskydende ubundet fluorophore eller forfining af protokoller for ikke at overskride epitopmætning.
Sammenligningsundersøgelser har vist, at nFCM-dimensionering af elbiler giver data i overensstemmelse med TRPS og cryo-TEM, teknikker, der beskrives som mere nøjagtige end NTA til EV-størrelsesanalyse10,39. Som med enhver optisk baseret metode skal indflydelsen af heterogene optiske egenskaber, der ses for elbiler, og forskelle mellem referencematerialets og elbilernes optiske egenskaber imidlertid anerkendes ved fortolkningen af data10.
Western blotting har været en vigtig metode til at indikere EV-berigelse gennem identifikation af EV-markører40. Men ønsket om at demonstrere tilstedeværelsen af sådanne markører på partikler har drevet fremskridt inden for EV-baserede flowcytometriske analyser17. De nødvendige beslutninger til at tilvejebringe robuste data opnås dog i øjeblikket bedst gennem dedikeret instrumentering med hensyn til både spredt og fluorescerende lys19.
nFCM giver en upartisk tilgang til indledningsvis at beskrive alle partikler, der er irrelevante for specifikke markører, ved hjælp af sidespredningsmåling, hvilket giver mulighed for bekræftelse med de mest almindelige teknikker i NTA, RPS og TEM1, samtidig med at der tilføjes fænotypisk måling svarende til WB eller Elisa på en kvantitativ måde.
Disclosures
A.L., B.P., D.A., R.L, R.T er ansatte i NanoFCM, og deres bidrag til dette papir blev foretaget som en del af deres ansættelse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke grupperne Owen Davies og Nick Peake for fortsat at levere materiale og ekspertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Anti-CD81 antibody (M38) | abcam | ab233259 | Anti-Human CD81 APC conjugated antibody |
| APC Anti-CD9 antibody (EM-04) | Abcam | ab82392 | Anti-mouse CD9 APC conjugated antibody |
| APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted | abcam | ab82389 | Anti-Human CD9 APC conjugated antibody |
| APC anti-mouse CD63 antibody | biolegend | 143905 | Anti-Mouse CD63 APC conjugated antibody |
| APC anti-mouse/rat CD81 antibody | biolegend | 104909 | Anti-Mouse CD81 APC conjugated antibody |
| CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC | invitrogen Via Fisherscientific | A15712 | Anti-Human CD63 APC conjugated antibody |
| Celline AD1000 bioreactor | Merck | Z688037-5EA | |
| Cleaning solution | NanoFCM | 17159 | In house cleaning solution for nanoanalyser |
| EVs from C2C12 | Gifted | Mouse line | |
| EVs from SW620 | Gifted | Human line | |
| Memglow - Fluorogenic Membrane Probe | Cytoskeleton | MG01 | non toxic cell membrane dye |
| NanoAnalyzer | NanoFCM | nano-flow cytometer for measurement of single particles | |
| PBS, pH 7.2 | Gibco Via Fisherscientific | 12549079 | Salt solution for dilution of samples and antibodies |
| Snaplock Microtubes, 0.60mL | Axygen Via Fisherscientific | 11371944 | Tubes required to load sample into nanoanalyser |
References
- Couch, Y., et al. A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (14), 12144 (2021).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Grant, L. R., Milic, I., Devitt, A. Apoptotic cell-derived extracellular vesicles: structure-function relationships. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 509-516 (2019).
- Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2, 325 (2019).
- Sahoo, S., et al. Therapeutic and diagnostic translation of extracellular vesicles in cardiovascular diseases. Circulation. 143 (14), 1426-1449 (2021).
- Chiang, C. -Y., Chen, C. Toward characterizing extracellular vesicles at a single-particle level. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 9 (2019).
- Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).
- Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLOS ONE. 11 (2), 0149866 (2016).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
- Vogel, R., et al. Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12052 (2021).
- Van Der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
- Hartjes, T. A., Mytnyk, S., Jenster, G. W., Van Steijn, V., Van Royen, M. E. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
- Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs). Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids. 2, 80-103 (2021).
- Johnsen, K. B., Gudbergsson, J. M., Andresen, T. L., Simonsen, J. B. What is the blood concentration of extracellular vesicles? Implications for the use of extracellular vesicles as blood-borne biomarkers of cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1871 (1), 109-116 (2019).
- Zhu, S., et al. Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles. ACS Nano. 8 (10), 10998-11006 (2014).
- Van Der Pol, E., et al. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).
- Lucchetti, D., et al. Measuring extracellular vesicles by conventional flow cytometry: dream or reality. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6257 (2020).
- Suárez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Tian, Y., et al. Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry. ACS Nano. 12 (1), 671-680 (2018).
- Silva, A. M., et al. Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (10), 12130 (2021).
- Dragovic, R. A., Southcombe, J. H., Tannetta, D. S., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Multicolor flow cytometry and nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles in the plasma of normal pregnant and pre-eclamptic women. Biology of Reproduction. 89 (6), 151 (2013).
- Teng, F., Fussenegger, M. Shedding light on extracellular vesicle biogenesis and bioengineering. Advanced Science. 8 (1), 2003505 (2021).
- Laulagnier, K., et al. Mast cell- and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization. Biochemical Journal. 380, 161-171 (2004).
- Simonsen, J. B. Pitfalls associated with lipophilic fluorophore staining of extracellular vesicles for uptake studies. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1582237 (2019).
- Collot, M., et al. MemBright: A family of fluorescent membrane probes for advanced cellular imaging and neuroscience. Cell Chemical Biology. 26 (4), 600-614 (2019).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Tian, Y., et al. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1697028 (2020).
- Mondal, A., Ashiq, K. A., Phulpagar, P., Singh, D. K., Shiras, A. Effective visualization and easy tracking of extracellular vesicles in glioma cells. Biological Procedures Online. 21, 4 (2019).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Jayachandran, M., Miller, V. M., Heit, J. A., Owen, W. G. Methodology for isolation, identification and characterization of microvesicles in peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 375 (1-2), 207-214 (2012).
- Mizenko, R. R., et al. Tetraspanins are unevenly distributed across single extracellular vesicles and bias sensitivity to multiplexed cancer biomarkers. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 250 (2021).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Laulagnier, K., et al. Amyloid precursor protein products concentrate in a subset of exosomes specifically endocytosed by neurons. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (4), 757-773 (2018).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Scientific Reports. 10 (1), 103 (2020).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. -A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Peruzzotti-Jametti, L., et al. Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles. PLOS Biology. 19 (4), 3001166 (2021).
- Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
